Embed Size (px)
Citation preview
Genetikai vizsgálat fogalma
• A vizsgált egyén DNS állományában (genomjában)
történő elkésések kimutatása
• A genetikai vizsgálatot „A humángenetikai adatok
védelméről, a humángenetikai vizsgálatok és
kutatások, valamint a biobankok működésének
szabályairól” szóló 2008. évi XXI. törvény alapján
minden esetben genetikai tanácsadásnak kell
megelőznie
Genetikai vizsgálat céljai
1. Betegség hátterében álló patogén mutációk kimutatása
2. Genetikai rizikófaktorok vizsgálata – hajlamosító és
védő polimorfizmusok elemzése
3. Farmakogenomikai vizsgálatok
4. Személyazonosítás – igazságügyi DNS vizsgálatok
5. Apasági vizsgálatok
6. Prenatális vizsgálat – szűrés, ismert mutációk
kimutatása
7. Szervezetben lévő vírusok, baktériumok kimutatása
8. Transzplantációs genetika – HLA tipizálás
• A talált eltérés patogenitásának eldöntése
– Irodalmi adatok
– Fenotípus – genotípus korreláció vizsgálata
– Kontroll személyekben történő vizsgálat
– Funkcionális vizsgálatok – RNS, fehérje
szinten
Genetikai vizsgálatok főbb
csoportosítása
Citogenetika
Molekuláris genetika
„Biokémiai genetika”
Biokémiai genetika
(protein- és metabolit-
rendellenességek) • Metabolitok:
– hosszú szénláncú zsírsavak
gázkromatográfiája
• Fehérje szerkezet:
– dystrophin Western blot
dystrophinopathiak esetében
• Enzimaktivitás:
– foszforiláz aktivitás – McArdle betegség
– alfa glükozidáz - Pompe kór
Citogenetika
A citogenetika feladata
• Különböző genom- és
kromoszómamutációk
azonosítása a
preimplantációs, pre-
és posztnatális
genetikában.
Citogenetikai módszerek
Kariotipizálás
FISH
CGH
Vizsgálati minták
• Lymphocyta – vér
• Csontvelő
• Fibroblast
• Amnionfolyadék
(NOR)
heterokromatin
Kromoszóma azonosítás
szempontjai
- méret
- centromer helyzete
- másodlagos befűződés helye
- festési mintázat
- heterokromatin eloszlása
eukromatin
Kromoszómák morfológiája
• A számbeli elváltozások – leggyakrabban a nemi kromoszómákat érintik (Turner-,
Klinefelter-szindróma).
– A testi sejteket érintő számbeli (Patau-, Edwards-, Down-szindróma) kromoszóma elváltozások több szerv rendellenességeihez vezetnek.
• Szerkezeti kromoszóma rendellenességek: – kromoszómaszakasz elvesztése (deléció).
– kromoszómadarab áthelyeződése egy másik kromoszómára (transzlokáció)
• Kiegyensúlyozott – a letörött nem vész el (más helyen megvan – másik kromoszómára rátapad) – az adott egyedre nincsen súlyos következményük – ivarsejteknél keletkezhetnek olyan ivarsejtek amelyek hiányos genetikai információval járó sejtek
• Kiegyensúlyozatlan: a letört darab kikerül a rdsz-ből – azon lévő gének hiányoznak (több 100 gén hatása is kieshet
– Kromoszóma szakasz 180 fokos megfordulása (inverzió).
• Kariotípus: – Az egyed kromoszómáinak összessége, iIl. az egyed
kromoszómáinak száma, alak és nagyság szerinti meghatározottsága.
– A kariotípust az idiogramm segítségével rögzítik.
– Az eljárás segítségével felismerhetők egyes kromoszóma rendellenességek illetve öröklődő betegségek.
Kromoszóma sávok:
• G-sávozás: savas-sós Giemsa festés
• R-sávozás: (reverse) emelt hőmérsékleten történő Giemsa festés
• C-sávozás: centroméra specifikus festés
• T-sávozás: teloméra specifikus festés
• Q-sávozás: quinacrin festés (fluoreszcens mikroszkópban vizsgálható)
Kariotipizálás
• Phitohaemoglutinin növényi lektin) Go-G1 fázis átvitelét
segíti
• 1-3 napig tenyésztik
• Colhicin kezelés – gátolja az osztódási orsó működését,
de a mitózisba lépést nem
• Hipotonizálás KCL hatására a sejtek megdúzzadnak,
kromoszómák elkülönülnek egymástól
• Fixálás – metanol-ecetsav keverék
• Gimsa festés
Standard karyotípus
Bármilyen metafázisos sejteket tartalmazó, osztódni képes sejtpopuláció
Általában: lymphocyta (ezek proliferációját könnyű indukálni)
egyéb szövetek – bőr (fibroblastok)
– Csontvelő
– amnion folyadék
– Chorionboholy
– szájnyálkahártya
Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) • A DNS fragmentumokat fluoreszkáló festékkel jelölünk meg és ezáltal
fénymikroszkóppal nem látható kromoszóma részleteket is azonosíthatunk.
• FISH-el kromoszómák, kromoszómaszegmentek, mint különálló egységek, vagy akár gének tehetők láthatóvá.
• Lehet – Direkt FISH - A fluoreszcensen jelölt
– Indirekt FISH - reporter molekula kell
• A módszer használható – Interfázisos sejtmagokban (pl. vérkenet, vagy akár 10-100 mikrométer vastagságú szöveti
metszet)
– Kromoszómapreparátumokon (metafázis)
• Jellemzői:
– Nagy érzékenység
– 100 bázisnyi méret alatti szekvencia is kimutatható
– Lehetséges több DNS-szekvencia egyidejű kimutatása
• A kicsiny kromoszóma részletek kiesésével járó ún. mikrodeléciós kórképek (Prader-Willi-, Angelman-, Williams-, DiGeorge-,Miller-Dieker-, Smith-Magenis-szindróma) célzott FISH vizsgálattal diagnosztizálhatók.
• Az ismeretlen eredetű értelmi fogyatékossággal társuló mikrodeléciókat a kromoszóma végdarabjait elemző szubtelomérikus próbákkal lehet kimutatni
• Tumor specifikus transzlokációk kimutatása
Multikolor FISH
(Spektrális kariotipizálás)
Komparatív genomikus hibridizáció
(CGH)
• Egészséges egyénből származó, tárgylemezen fixált, metafázisban lévő kromoszómákat denaturáljuk és etanolban dehidratáljuk
• A beteg és a referencia DNS 1:1 arányú keverékét szintén denaturáljuk (a DNS – ket előzőleg eltérő fluoreszcens festékkel jelölik)
• Ezt hibridizáltatjuk a normális kromoszómákat tartalmazó preparátumra
• A nem hibridizált DNS-t eltávolítjuk
• A kromoszómákat „antifase”-ban oldott DAPI-val (kék festék, amely a DNS-t specifikusan jelzi és a G-sávozáshoz hasonló mintázatban kötödö molekula: 1,6 diamino-fenil-indol) jelöljük
• E három eredőjeként kapjuk meg a CGH képet
CGH értéklése
• Ha citogenetikai eltérés nem található: a két szín egyenlő arányú kombinációját narancssárga fluoreszcenciaként látjuk
• A fluoreszcencia intenzitás arányából valamennyi kromoszóma anomális feltérképezhető – deléció, duplikáció
• Digitális image analízis: a három fluoreszcencia intenzitást zöld, piros, kék optikai szűrőkkel CCD kamerával rögzítjük.
• A kromoszómák azonosítása a DAPI sávozott image segítségével automatizált színes kariotípus analizáló programmal történik.
• Módszer előnye – A teljes genom vizsgálható egyetlen hibridizáció során
– Sejtkultúra, vagy a vizsgálni kívánt sejtekből származó metafázis indukció nem szükséges
– A korábban nem ismert duplikált vagy deletált DNS szakasz kimutatására is alkalmas
Deléció
Duplikáció
Molekuláris biológiai
módszerek
• PCR alapú technikák
– VNTR meghatározás
– PCR-RFLP
– Multiplex PCR
– Trinukleotid repeat meghatározások
• Real-time PCR
• MLPA
• Fragment elemzés
• Szekvenálási metodikák
– Sanger
– Piroszekvenálás
– Újgenerációs szekvenálás
• GWAS vizsgálatok
PCR (polimeráz
láncreakció)
DNS megsokszorozása
Elektroforézis
A töltéssel rendelkező
makromolekuláknak
(pl. DNS) az a
tulajdonsága, hogy
elektromos erőtér
hatására
elmozdulnak.
A negatív töltésű DNS
a pozitív töltés felé
vándorol
_
+
Nested PCR
• PCR
specificitását
növeli
Multiplex PCR • Egyszerre több primerrel történő PCR vizsgálat
• Pl. homozigóta exoni deléciók kimutatása
(dystrophin)
VNTR vizsgálatok
Trinukleotid repeat kimutatás
Huntington kór
Spinocerebelláris ataxiák (SCA)
Friedreich ataxia
Dystonia myotonica
Huntington kór
CAG repeats
4-es kromoszóma
IT 15 gén - huntingtin protein
RFLP
(restrikciós fragmenthossz polimorfizmus) Enzimatikus hasítás
Bioanalyser
Real-time PCR
• PCR reakció eredménye valós időben követhető
• PCR-t követően olvadáspont analízis is elvégezhető (olvadáspont arányos a DNS összetétellel – GC arány/ és hossz) a fragmensek azonosíthatók
• SyberGreen – interkaláris festék, ha van termék zöld fluoreszcenciát mutat
• TaqMan próba – két hagyományos próba és egy hibridizáló próba a kettő között
• A PCR reakcióban a hibridizáló primer hozzátapad az egyszálúított DNS-hez
• Taq poliemeráz 3’>5’ exonukleáz aktivitással a hibridizáló primert nukleotidokra bontja
• A kioltótó enzim (qencer) nem gátolja a fluorokróm működését
• Nagyon specifikus, könnyen multiplexezhető
TaqMan SNP assay
CC
TT
CT
C allél
T allél
T allél
C allél
Génexpresziós változások mérése
Bcl-2
Bcl-XL Syn1
kontroll
Bcl-2 kezelt
kontroll
Bcl-XL kezelt Bcl-XL kezelt
Bcl-2 kezelt
kontroll
Bax
normoxia
hypoxia
Fluoreszcens fragment analízis
MLPA
• Multiplex ligation-dependent
probe amplification
• Génen belüli nagyobb
kópiaszám változások
kimutatására használható
• Egyszerre több gén is
vizsgálható
Kontroll
PMP22 duplikáció
PMP22 deléció
DNS szekvenáló módszerek
Sanger szekvenálás
Piroszekvenálás
Újgenerációs szekvenálás
Sanger szekvenálás
Felhasználás
• Ismert gének szekvencia
analízise
• Patogén mutációk keresése
Piroszekvenálás • DNS másolásakor beépülő nukleotidról leszakad egy pirofoszfát
• Ezt a luciferáz felvillanása jelzi
Felhasználás
• Mutációk pontos
mozaicizmus rátájának a
megadása (pl. tumorokban
szomatikus mutációk
vizsgálata – KRAS 2.exon
12. és 13. kodon)
• Pontos heteroplazmia
arány
Újgenerációs szekvenálás
• A genomot 50-1000bp közti
darabokban lehet
szekvenálni
• Ezt de novo módszerekkel
lehet összerakni - min 30
millio fragment
• Covarage (lefedettség)
– 1 bp hányszor van előhívva –
humánnál min 10x-es
lefedettség kell
• Sanger szekvenálás
– Max 1000bp
– Nagy pontosság
– Kicsi akapcitás
– Drága
– Munka és időigényes
– Nem multiplexezhető
– Elektroforetikus elvű
• Újgenerációs
– Több millió bp
egyidejű szekvenálása
– gyors
– olcsóbb
– Jól automatizálható
– Nincs elektroforetikus
elválasztás
– multiplexezhető
NGS vizsgálatok felhasználhatósága
• Teljes genom
• Teljes exom
• Teljes transzkriptom
• NGS panelek (enrichment)
– Célzottan, betegségre specifikus gének
egyidejű szekvenálása
NGS szakaszai
• Könyvtárkészítés
– A genomot szekvenálható darabokra bontjuk
– Ismert szekvenciájú oligonukleotidokat mindkét végére
hozzáadjuk - egységessen szekvenálható a minta
– Barcode adható hozzá (megjelöli melyik minta)
• Klonális amplifikáció
– 1 fragmentből kb 1 millió
• Szekvenálás
• Bioinformatikai kiértékelés
Könyvtárkészítés
Klonális amplifikáció
• Emúlziós PCR
– Olajban vízcseppek vannak
(mikroreaktorok) amiben minden
benne van
– Fragmentet juttatjuk bele
– SOLID és Roche
• Bridge amplifikáció
– A komplamenter oligok
üveglemezen vannak és a pH
változás miatt lesz grid képzés
– Illumina
Szekvenálás
• Sanger alapú - Illumina
• Piroszekvenálás alapú – SOLID és Roche
• Proton detektálás - Iontorrent
Blot technikák
Western blot – fehérje
Southern blot - DNS
Northern blot - RNS
Fehérje meghatározás
Western blot
• biomolekulák
komplexében lévő fehérje
kimutatására
• Ez egy analitikus
technológia, a fehérje
expressziójának,
mérésére
• Detektálás:
autoradiográfiával, rtg
filmre
• Kiértékelés:
denzitometrálás
Pl. Qantity One Software
Denzitás meghatározás meghatározás
Kvantifikálás
Northern blot
Southern blot
GWAS
• A fenotípusos jellel (pl. beteg) rendelkező, illetve
kontroll populációt genotipizálnak
• Megkeresik, hogy melyik marker (SNP)
gyakorisága különbözött a két populáció között
• Multifaktoriális jellegek genomikai hátterének
tisztázására
Microarray („génchip”) technológia
• Nagyságrendekkel emelik az egyidejűleg vizsgálható gének számát
• Szerkezeti (nukleotidsorrend) és funkcionális (génkifejeződés-mRNS) információk tömegét képes nyújtani
• A génchipek (génlapok) rendezetten (microarray), sorokban és oszlopokban több tízezer ismert nukleotidszálat tartalmaznak, ezekhez kapcsolódik a jelzett minta nukleinsav
• A fluoreszcens festékekkel láthatóvá tett kötődési mintázatot a komputer értékeli, és ismerve a génlapon levő elrendezést, a pozitív/negatív reakció alapján jellemzi a minta genetikai tartalmát
• Egyszerre több tízezer (akár a teljes genom) gén kifejeződése értékelhető ezzel az eljárással
