GLICINA NA PREVENÇÃO DA LESÃO INTESTINAL DA … · enterocolitis lesions: experimental study on rats. 1. Intestino. 2. Glicina. 3. Enterocolite necrosante. 4. Rato. UNIVERSIDADE

KARINE FURTADO MEYER USO DA GLICINA NA PREVENÇÃO DAS LESÕES DA ENTEROCOLITE

NECROSANTE NEONATAL: ESTUDO EXPERIMENTAL EM RATOS

Tese apresentada à Universidade Federal de São

Paulo - Escola Paulista de Medicina para

obtenção do Título de Doutor em Ciências.

SÃO PAULO 2006

KARINE FURTADO MEYER USO DA GLICINA NA PREVENÇÃO DAS LESÕES DA ENTEROCOLITE

NECROSANTE NEONATAL: ESTUDO EXPERIMENTAL EM RATOS

Tese apresentada à Universidade Federal de São

Paulo - Escola Paulista de Medicina para obtenção

do Título de Doutor em Ciências.

Orientador: Prof. Dr. José Luiz Martins Co-Orientador: Prof. Dr. Luiz Gonzaga de Freitas Filho

SÃO PAULO 2006

ii

Meyer, Karine Furtado Uso da Glicina na prevenção das lesões da enterocolite necrosante neonatal: estudo experimental em ratos/ Karine Furtado Meyer. -- São Paulo, 2006.

xvii, 64f

Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina.

Programa de Pós-Graduação em Técnica Operatória e Cirurgia Experimental.

Título em inglês: Glycine in the prevention of neonatal necrotizing

enterocolitis lesions: experimental study on rats.

1. Intestino. 2. Glicina. 3. Enterocolite necrosante. 4. Rato.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA - UNIFESP - EPM

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TÉCNICA OPERATÓRIA E

CIRURGIA EXPERIMENTAL COORDENADOR: Prof. Dr. José Luiz Martins

TESE DE DOUTORADO

AUTOR: Karine Furtado Meyer ORIENTADOR: Prof. Dr. José Luiz Martins CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Luiz Gonzaga de Freitas Filho TÍTULO: USO DA GLICINA NA PREVENÇÃO DAS LESÕES DA ENTEROCOLITE NECROSANTE NEONATAL: ESTUDO EXPERIMENTAL EM RATOS BANCA EXAMINADORA Presidente: Prof. Dr. José Luiz Martins

Professor Adjunto Livre Docente- Disciplina de Cirurgia Pediátrica Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina Prof. Dr. Joaquim Murray Bustorff Silva Professor Livre Docente- Disciplina de Cirurgia Pediátrica Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas Prof. Dr. João Luiz Moreira Coutinho de Azevedo Professor Adjunto Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina Prof. Dr. Manoel Carlos Prieto Velhote Doutor em Medicina da Faculdade de Medicina Universidade de São Paulo

Membros Efetivos:

Prof. Dr. Pedro Muñoz Fernandez Professor Adjunto Departamento de Saúde Materno Infantil Faculdade de Medicina da Fundação Universitária do ABC Prof. Dr. Flavio Saad Doutor em Medicina do Departamento de Clínica Cirúrgica II Universidade Luzíadas de Santos

Suplentes:

Prof. Dr. Fábio Luis Peterlini Doutor da Disciplina de Ciurgia Pediátricada Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina

Acredito que o futuro brilhante é baseado em um passado intensamente vivido. Só temos

sucesso na vida, quando perdoamos os erros e as decepções do passado.

Por isso, é tempo de lutar pela felicidade. Ela é um estado de alma que precisamos

aprender a cultivar dentro do nosso coração em todos os momentos de nossa vida. Não está

fora de nós, e nem na presença das pessoas, por mais que as amemos. Está dentro de nós, na

plenitude da vida, quando colocamos nosso amor para fora e enxergamos as coisas boas que

possuímos. É benção a ser conquistada. Ela flui de dentro para fora e independe até das

outras pessoas.

Se você quer ser feliz, esqueça os erros do passado, esqueça sua culpa. Cultive as

bênçãos do presente, e perceberá que a felicidade sempre esteve ao seu lado sem que você a

deixasse entrar. Matheus Furtado

DEDICATÓRIA

Ao meu marido

CLAUDIO HERING MEYER Pelo apoio constante.

Ao meu pai

ADROALDO CERVI FURTADO que sempre vibrou com minhas vitórias e me

incentivou nos momentos difíceis.

À minha mãe INGRID SUZANA FURTADO

que me ensinou que tudo podemos,

basta querer e sorrir.

Aos meus irmãos,

MATHEUS E ISABELLE,

meu amor, respeito e admiração.

Representam muito para mim.

Aos meus colegas

OLGA MARIA GARCIA FERREIRA MAURÍCIO MACEDO e

LUIZ GONZAGA DE FREITAS FILHO que me mostraram o caminho

da realização profissional.

AGRADECIMENTO ESPECIAL

Ao Prof. Dr. JOSÉ LUIZ MARTINS,

Orientador deste trabalho

Um rumo tranqüilo para os menos experientes

Um profissional competente.

Ao Prof. Dr. LUIZ GONZAGA DE FREITAS FILHO,

Co-orientador deste trabalho

Um professor e amigo

AGRADECIMENTOS À Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista De Medicina – UNIFESP-EPM, pela

acolhida.

À FAPESP- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pelo financiamento.

Ao Prof. Dr. Djalma José Fagundes, Ex-Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Técnica

Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM. Bons conselhos nos dão o rumo certo; amizade

que deve durar.

A Profª. Dra. Edna Frason de Souza Montero, Professora Afiliada do Departamento de Cirurgia da

UNIFESP-EPM, pela consideração.

Aos demais professores e colegas do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação da UNIFESP, pela convivência e amizade.

À Profª. Dra. Francy Reis da Silva Patrício, Chefe da Disciplina de Patologia Médica e Coordenadora

do Curso de Pós-Graduação em Patologia da UNIFESP-EPM. Ajuda desinteressada gera admiração.

À Profª. Dra. Maria Luiza Vilela Oliva, Professora Adjunta da Disciplina de Biologia Molecular,

Departamento de Bioquímica da UNIFESP-EPM. Paciente em me ensinar desde os princípios básicos

para que fossem realizadas as dosagens bioquímicas apresentadas.

Ao Dr. Iberê Cauduro Soares, médico patologista do Hospital do Servidor Público Estadual, pela

realização de todas as lâminas para estudo imunohistoquímico, bem como o auxílio na interpretação dos

resultados.

Ao Dr. Maurício Macedo, aluno do curso de pós-graduação em nível de doutorado, pela ajuda na

execução dos exames laboratoriais, análise das lâminas e na dissertação da tese. Foi um companheiro

para todas as horas.

À amiga Dra. Lina Wang, residente de cirurgia pediátrica do Hospital do Servidor Público Estadual, pelo

grande estímulo na execução deste trabalho, mesmo nos momentos em que o cansaço e o desânimo

tentavam ser mais fortes.

À Srta. Ana Cristina Garcia Ferreira, aluna do 6° ano do curso de graduação Medicina, UNIFESP-EPM,

pela ajuda durante a fase experimental da pesquisa.

Ao Sr. Lincohn H.Takeda, aluno do curso de pós-graduação em Biologia Molecular, nível de Doutorado,

pelo auxílio na realização dos exames laboratoriais.

À Sra. Sandra Malagutti, pelo talentoso desempenho na realização da estatística deste trabalho.

À Professora Danusia Apparecida Silva. Querida professora do meu ginásio (Lages, SC) que fez, com

tanto amor, as correções de português.

Aos meus colegas de trabalho do Hospital de Servidor Público Estadual e ao meu colega Dr. Luís Ricardo Longo dos Santos do Hospital do Tatuapé. Sustentaram a minha ausência para que eu

pudesse me dedicar à pós-graduação.

As Sras. Elaine Maria Alves Bazzi Dantas e Valdelice Justiniano Soares, secretárias da Disciplina de

Técnica Operatória e Cirurgia Experimental, pela paciência, amizade ajuda e disponibilidade nos

momentos em que precisei durante a execução deste trabalho.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Molécula da glicina........................................................................................................ 3

Figura 2- Rato recém-nascido...................................................................................................... 6

Figura 3- Esquema de distribuição dos animais nos grupos........................................................ 7

Figura 4- Câmara para sacrifícios de roedores com entrada de gás O2 e CO2.......................................... 8

Figura 5- Segmento de jejuno (A), íleo (B) e cólon (C) retirados para histologia......................... 8

Figura 6- Fotomicrografia de corte histológico de intestino mostrando mucosa sem alterações

(grau 0). (HE- 200x).....................................................……………………………..........

19

Figura 7- Fotomicrografia de corte histológico de intestino mostrando mucosa com vilosidades

bem constituídas, sem lise celular ou processo inflamatório, porém, com formação

do espaço subepitelial de Grunhagen (grau 1). (HE- 200x)..........................................

19

Figura 8- Fotomicrografia de corte histológico de intestino mostrando mucosa com presença

de lises celulares, formação do espaço subepitelial de Grunhagen e espaçamento

aumentado entre as vilosidades (grau 2). (HE- 200x).........................................…......

20

Figura 9- Fotomicrografia de corte histológico de intestino do animal do Grupo H-R mostrando

mucosa com destruição da porção livre das vilosidades, presença de capilares

dilatados e de células inflamatórias (grau 3). (HE- 200x)......…....................................

20

Figura 10- Fotomicrografia de corte histológico de intestino mostrando mucosa com destruição

estrutural das vilosidades, havendo apenas esboço de algumas, formadas por

células inflamatórias e material necrótico, com hemorragia e ulceração glandular

basal (grau 4). (HE- 200x)......…………………………………………………………........

21

Figura 11- Fotomicrografia de corte histológico de intestino mostrando mucosa com destruição

de toda túnica mucosa, não sendo mais observado qualquer estrutura glandular,

mas apenas material amorfo depositado sobre a tela submucosa (grau 5). (HE-

200x)......................................……………………………………………………………….

21

Figura 12- Fotomicrografia representativa da coloração imunohistoquímica com Caspase-3-

Clivada no jejuno dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina (setas

pretas mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom escuro).(400X).......

25


Clivada no íleo dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina (setas pretas

mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom escuro).(400X)..................

25


Clivada no cólon dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina (setas


26

Figura 15- Fotomicrografia representativa da coloração imunohistoquímica com Lamina-A-

Clivada no jejuno dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina (setas


29


Clivada no íleo dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina (setas pretas


30


Clivada no cólon dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina (setas


30


Clivada no fígado dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina (setas


28




29




36


Clivada no rim dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina (setas pretas


37

Figura 22- Programa de edição de imagem utilizado para captura das imagens provenientes do

microscópio óptico.........................................................................................................

55

Figura 23- Programa de edição de imagem utilizado para contagem dos corpúsculos

apoptóticos....................................................................................................................

56

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Análise histopatológica das lesões do jejuno................................................................ 14

Tabela 2- Comparações entre os grupos na análise histopatológica das lesões no jejuno.......... 14

Tabela 3- Análise histopatológica das lesões do íleo.................................................................... 15

Tabela 4- Comparações entre os grupos na análise histopatológica das lesões no íleo.............. 16

Tabela 5- Análise histopatológica das lesões do cólon................................................................. 17

Tabela 6- Comparações entre os grupos na análise histopatológica das lesões no cólon........... 17

Tabela 7- Resultado da contagem de corpúsculos apoptóticos pela imunohistoquímica para

Caspase-3-Clivada no jejuno, íleo e cólon dos animais................................................

22

Tabela 8- Comparações entre os grupos na contagem de corpúsculos apoptóticos pela

imunohistoquímica para Caspase-3-Clivada no jejuno, íleo e cólon dos animais........

23


Lamina-A-Clivada no jejuno, íleo e cólon dos animais..................................................

27


imunohistoquímica para Lamina-A-Clivada no jejuno, íleo e cólon dos animais...........

27

Tabela 11- Valores de MDA tecidual no intestino............................................................................ 31

Tabela 12- Comparações entre os grupos na dosagem do MDA tecidual no intestino dos

animais..........................................................................................................................

31


Caspase-3-Clivada no fígado e rim dos animais...........................................................

32


imunohistoquímica para Caspase-3-Clivada no fígado e rim dos animais....................

33


Lamina-A-Clivada no fígado e rim dos animais.............................................................

35


imunohistoquímica para Lamina-A-Clivada no fígado e rim dos animais.....................

36

Tabela 17- Valores de MDA tecidual no fígado............................................................................... 38

Tabela 18- Comparações entre os grupos na dosagem do MDA tecidual no fígado dos

animais..........................................................................................................................

39

Tabela 19- Número de corpúsculos apoptóticos em 6 campos de 400X pelo método da

Caspase-3-Clivada em todos os grupos no jejuno, íleo, cólon, fígado e rim................

58

Tabela 20- Número de corpúsculos apoptóticos em 6 campos de 400X pelo método da Lamina-

A-Clivada em todos os grupos no jejuno, íleo, cólon, fígado e rim...............................

59

Tabela 21- Caracterização dos animais do grupo controle (G1) com as dosagens de proteína e

malondialdeído intestinais.............................................................................................

60

Tabela 22- Caracterização dos animais do grupo hipóxia-reoxigenação (G2) com as dosagens

de proteína e malondialdeído intestinais.......................................................................

61

Tabela 23- Caracterização dos animais do grupo hipóxia-reoxigenação + glicina (G3) com as

dosagens de proteína e malondialdeído intestinais......................................................

62

Tabela 24- Caracterização dos animais do grupo controle (G1) com as dosagens de proteína e

malondialdeído hepáticos..............................................................................................

63

Tabela 25- Caracterização dos animais do grupo hipóxia-reoxigenação (G2) com as dosagens

de proteína e malondialdeído hepáticos........................................................................

63

Tabela 26- Caracterização dos animais do grupo hipóxia-reoxigenação + glicina (G3) com as

dosagens de proteína e malondialdeído hepáticos.......................................................

64

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1- Exame histopatológico no jejuno. Distribuição por grupos........................................ 15

Gráfico 2- Exame histopatológico no íleo. Distribuição por grupos............................................ 16

Gráfico 3- Exame histopatológico no cólon. Distribuição por grupos......................................... 18

Gráfico 4- Caspase-3-Clivada no jejuno. Distribuição por grupos.............................................. 24

Gráfico 5- Caspase-3-Clivada no íleo. Distribuição por grupos.................................................. 24

Gráfico 6- Caspase-3-Clivada no cólon. Distribuição por grupos............................................... 25

Gráfico 7- Lamina-A-Clivada no jejuno. Distribuição por grupos................................................ 28

Gráfico 8- Lamina-A-Clivada no íleo. Distribuição por grupos.................................................... 28

Gráfico 9- Lamina-A-Clivada no cólon. Distribuição por grupos................................................. 29

Gráfico 10- Caspase-3-Clivada no fígado. Distribuição por grupos.............................................. 33

Gráfico 11- Caspase-3-Clivada no rim. Distribuição por grupos................................................... 34

Gráfico 12- Lamina-A-Clivada no fígado. Distribuição por grupos................................................ 36

Gráfico 13- Lamina-A-Clivada no rim. Distribuição por grupos..................................................... 37

Gráfico 14- Curva de proteína construída com o padrão de albumina humana........................... 57

Gráfico 15- Curva de calibração do MDA traçada com 1,3,3 tetra-metoxipropano

malondialdeído bis (acetildimetilo).............................................................................

57

LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS

A........................... absorbância ANOVA................ análise de variância BSA...................... soroalbumina bovina °C......................... graus Celsius CBB...................... coomassie brilhant blue cm........................ centímetro cNOS................... óxido nítrico sintetase constitutiva CO2...................... gás carbônico DNA..................... ácido desoxirribonucléico dp......................... desvio padrão ECN..................... enterocolite necrosante neonatal EPM..................... Escola Paulista de Medicina

et al...................... e colaboradores FAPESP............... Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo G.......................... grupo g........................... grama H2O2 ................... peróxido de hidrogênio H-R....................... hipóxia-reoxigenação IR......................... isquemia-reperfusão kg......................... quilograma µg......................... micrograma M.......................... molar MDA..................... malondialdeído mg........................ miligrama ml......................... mililitros µl............................. microlitro N.......................... número nm……………….. nanômetro nmol..................... nanomol NO........................ óxido nítrico O2......................... oxigênio

OUT..................... outbread pH........................ potencial hidrogênio-iônico PO2...................... pressão de oxigênio RAM .................... rapid access memory RN........................ recém-nascido rpm....................... rotações por minuto TBA...................... ácido tiobarbitúrico TRIS..................... solução tampão de Tris-hidroximetil aminometano UI......................... Unidade Internacional UNIFESP............. Universidade Federal de São Paulo X .......................... vezes

RESUMO

Objetivo: Avaliar o efeito da glicina no intestino e em órgãos à distância num modelo

experimental de enterocolite necrosante neonatal em ratos recém-nascidos.

Métodos: Foram utilizados ratos Wistar recém-nascidos distribuídos em três grupos:

G1: controle, G2: animais submetidos a hipóxia-reoxigenação (H-R), G3: animais

submetidos a hipóxia-reoxigenação após uma infusão intraperitoneal de glicina

5%.Segmentos intestinais foram preparados para análise histológica,

imunohistoquímica com caspase 3 clivada e lamina A clivada, como marcadores para

apoptose e dosagem tecidual de Malondialdeído (MDA). O fígado foi preparado para

avaliação imunohistoquímica e dosagem de malondialdeído tecidual, e os rins foram

preparados para avaliação imunohistoquímica.

Resultados: A dosagem de MDA tecidual mostrou que o grupo de animais submetido a

H-R apresentou valores maiores do que o grupo previamente submetido à injeção

intraperitoneal de glicina (p < 0,05). O índice apoptótico pela avaliação da caspase 3

clivada e lamina A clivada foi maior nos animais submetidos à H-R do que nos animais

que receberam previamente glicina em todos os órgãos examinados, porém nos rins a

avaliação pela lamina A clivada não foi significante, quando da avaliação estatística. A

análise histológica não mostrou diferença estatística entre o grupo H-R e o previamente

submetido à injeção de glicina.

Conclusões: A glicina foi capaz de reduzir os efeitos deletérios da hipóxia-

reoxigenação, quando se considerou como critério de avaliação a dosagem de MDA e

os índices de apoptose celular e não influenciou, estatisticamente, as alterações

histológicas.

ABSTRACT Objective: To evaluate the effect of glycine on the intestine and in distant organs, in an

experimental model of neonatal necrotizing enterocolitis in rats.

Methods: Newborn Wistar rats were utilized, distributed into three groups: G1: control,

G2: animals subjected to hypoxia-reoxygenation (H-R), G3: animals subjected to

hypoxia-reoxygenation after intraperitoneal infusion of 5% glycine. Intestinal segments

were prepared for histological analysis, immunohistochemistry using cleaved caspase-3

and cleaved lamina-A as markers for apoptosis, and tissue assaying for malonaldehyde

(MDA). The liver and kidneys were prepared for immunohistochemical evaluation and

the liver alone for tissue MDA assaying.

Results: Tissue MDA assaying showed that the animals subjected to H-R alone

presented higher values than did those previously subjected to glycine infusion (p <

0.05). The apoptosis index from evaluation of cleaved caspase-3 and cleaved lamina-A

was greater in the animals subjected to H-R alone than in those previously subjected to

glycine infusion, in all the organs examined. However, in the kidneys the findings from

cleaved lamina-A did not present any statistical difference. The histological analysis did

not show any statistical difference between the group with H-R alone and the group

previously subjected to glycine infusion.

Conclusions: Glycine was capable of reducing the deleterious effects from hypoxia-

reoxygenation, when the MDA assay and cell apoptosis index were considered as the

evaluation criteria.

SUMÁRIO Dedicatória................................................................................................................... v

Agradecimentos........................................................................................................... vi

Listas........................................................................................................................... ix

Resumo....................................................................................................................... xvi

Abstract........................................................................................................................ xvii

1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 1

2 OBJETIVOS.............................................................................................................. 5

3 MÉTODOS................................................................................................................ 6

3.1 Amostra................................................................................................................. 6

3.2 Experimento........................................................................................................... 7

3.3 Preparo do tecido para histologia.......................................................................... 8

3.4 Exame histopatológico........................................................................................... 9

3.5 Procedimento imunohistoquímico.......................................................................... 10

3.6 Determinação do malondialdeído tecidual............................................................. 11

3.6.1 Dosagem de proteína......................................................................................... 11

3.6.2 Dosagem de malondialdeído.............................................................................. 12

3.7 Estudo estatístico.................................................................................................. 13

4 RESULTADOS......................................................................................................... 14

4.1 Exame histopatológico........................................................................................... 14

4.2 Imunohistoquímica................................................................................................. 22

4.2.1 Caspase-3-clivada.............................................................................................. 22

4.2.2 Lamina-A-clivada................................................................................................ 30

4.3 Determinação de malondialdeído tecidual............................................................. 38

4.3.1 Intestino.............................................................................................................. 38

4.3.2 Fígado................................................................................................................. 39

5 DISCUSSÃO............................................................................................................. 40

6 CONCLUSÕES......................................................................................................... 47

7 REFERÊNCIAS........................................................................................................ 48

8 ANEXOS................................................................................................................... 54

Apêndice

Normas Adotadas

1

1. INTRODUÇÃO

Apesar dos avanços significativos na prática de cuidados neonatais, a enterocolite

necrosante neonatal (ECN) continua sendo a mais importante causa cirúrgica de

mortalidade e morbidade em crianças com baixo peso ao nascer. A ECN é a

emergência gastrointestinal mais comum nas unidades de cuidados intensivos

neonatais; cerca de 5% dos recém-nascidos com baixo peso ao nascer acabam

desenvolvendo ECN (1).

A maior parte dos recém-nascidos (RN) que desenvolvem ECN é tratada com

jejum, nutrição parenteral total, e antimicrobianos de amplo espectro de ação, ficando a

indicação operatória restrita às complicações. O objetivo da cirurgia é atuar antes que

ocorram perfurações intestinais, situação em que a mortalidade cirúrgica pode chegar a

45% (2-3).

Estudos mostram que na ECN, além do trato gastrointestinal, outros órgãos são

envolvidos pela liberação de mediadores inflamatórios na corrente sanguínea, como os

produtos da peroxidação lipídica, que podem levar à disfunção e à falência de múltiplos

órgãos. A deterioração das funções cardiovascular, respiratória, renal, hepática e

hematológica ocorre no momento, ou poucas horas após, o diagnóstico da doença. A

gravidade e o prognóstico da ECN estão correlacionados com o número de sistemas

envolvidos (3).

Crianças submetidas à ressecção de grandes extensões de intestino podem

desenvolver a síndrome do intestino curto, comprometendo o desenvolvimento

pôndero-estatural, e também o desenvolvimento neuro-psico-motor (2).

A ECN permanece como uma doença com causa desconhecida e de patogênese

incerta. O tratamento ainda é baseado em observações empíricas e nenhum método

de prevenção mostrou sucesso absoluto (1).

O recém-nascido prematuro está sujeito a várias intercorrências clínicas

perinatais, como hipotensão, hipotermia, hipóxia e anemia, principalmente quando

associados ao início da alimentação enteral ou ao cateterismo dos vasos umbilicais,

que são rotulados como desencadeantes da lesão isquêmica intestinal levando a uma

redistribuição do fluxo sangüíneo esplâncnico para órgãos vitais como coração e

cérebro e provocando uma diminuição do fluxo sanguíneo da mucosa intestinal (1,4,5).

Essas intercorrências, isoladas ou conjuntamente, lesam a mucosa ao atuarem em

2

uma barreira intestinal imatura. Nesta fase, na barreira mucosa há uma menor

produção de mucina, ausência de bactérias comensais e concomitante proliferação de

bactérias potencialmente patogênicas, uma quantidade menor de antioxidantes e

proteases, oxigenação tecidual deficiente, motilidade intestinal diminuída, resposta

imune pouco desenvolvida e menor capacidade de regeneração e reparo (5).

Vários modelos animais foram propostos utilizando a hipóxia como evento

desencadeante da enterocolite necrosante neonatal (6-15). Barlow et al (6,8) provocaram

lesão intestinal em ratos recém-nascidos alimentados com fórmula artificial e em

seguida submetidos a hipóxia ao serem colocados num saco plástico durante 3 a 5

minutos por dia. Harrison et al (7), utilizando cães recém-nascidos submetidos a hipóxia

com 7% de O2 por duas horas, demonstraram alterações precoces na mucosa

intestinal e nas células capilares endoteliais, quando estes órgãos foram observados à

microscopia eletrônica. Hansbrough et al (9), também utilizando cães recém-nascidos,

provocaram necrose isquêmica intestinal ao produzir hipóxia com O2 a 10% por 2

horas. Da mesma forma, mantendo porcos recém-nascidos a 50% da concentração

normal de PO2 por 30 minutos, Cohen et al (10) observaram lesão da parede intestinal,

através da análise microscópica e macroscópica. Caplan et al (11) conseguiram produzir

ECN alimentando animais com fórmula artificial e submetendo-os a 60 segundos de

asfixia, utilizando 100% de nitrogênio, duas vezes ao dia, seguido por exposição ao

frio. A lesão isquêmica de mucosa intestinal esteve também presente em um modelo

onde ratos recém-nascidos foram submetidos a 5 minutos de hipóxia, seguidos de 5

minutos de reoxigenação (12,13,15).

Vários agentes foram utilizados na prevenção das lesões intestinais em modelos

experimentais de ECN como: leite materno (6), vitamina E (12), suplementação com

bifidobactérias (14), interleucina-10 recombinante humana (15), pentoxifilina (16), óxido

nítrico (17), glutamina (18) e dexametasona (18). Outros agentes como glucagon (19), 21-

amino-esteróides (20), somatostatina (21) e perfluorocarbonos (22) são descritos como

atenuantes das lesões provocadas pela isquemia-reperfusão intestinal em trombose ou

oclusão mesentérica, mas ainda não foram utilizados em modelos experimentais de

ECN. Mais recentemente, também utilizando um modelo de isquemia-reperfusão

intestinal em ratos, a glicina foi testada como agente protetor das lesões intestinais (23-

28).

A glicina é um aminoácido simples, não essencial, formado por uma molécula de

carbono ligada a um grupo amino e a um grupo carboxil (figura 1). Na membrana

3

plasmática, ela ativa um canal de cloro que estabiliza ou hiperpolariza o potencial de

membrana. Como conseqüência, bloqueia a entrada intracelular de cálcio, que vai

estimular a cascata de formação de citocinas (28). A glicina tem efeito antiinflamatório,

imunomodulador e citoprotetor. Ela protege contra o choque causado tanto por

hemorragia como por endotoxinas, previne a lesão por isquemia-reperfusão em uma

variedade de órgãos e tecidos como fígado, rim, coração, intestino e músculo

esquelético, e diminui a lesão renal e hepática causada por drogas (28).

Figura 1: molécula de glicina.

A apoptose que ocorre nas células epiteliais das vilosidades intestinais pode ser

observada em fragmentos histológicos de pacientes submetidos à ressecção intestinal

por ECN (29). Ela ocorre durante a morfogênese, regula a constante renovação dos

enterócitos, e está aumentada em muitas condições patológicas do intestino como na

ECN (29). A apoptose abundante do epitélio intestinal é um evento que antecede e leva

à necrose tecidual ao provocar a quebra da barreira mucosa do intestino (29). Uma

família de proteases, denominada caspase, desempenha um papel importante na

execução da apoptose celular. Estas enzimas estão presentes nas células sob a forma

latente, e são ativadas durante o processo de apoptose (30). Podem ser classificadas

como reguladoras (caspases 2, 7 e 8) ou como efetoras (caspases 3, 6 e 7) (30). A mais

conhecida delas é a caspase-3 e sua ativação demonstra que o evento que leva à

morte celular (apoptose) foi desencadeado (29). A Lamina A é uma proteína de

4

membrana nuclear e é especificamente clivada pela caspase 6, funcionando como

outro marcador do desencadeamento do processo de apoptose.

Os radicais livres de oxigênio desempenham, também, um papel importante no

desencadeamento da ECN (12,13,15,30). Estes radicais livres de oxigênio lesam o tecido

pela peroxidação de lipídeos insaturados presentes na membrana mitocondrial e

celular (30). O malondialdeído (MDA) é o produto final da peroxidação lipídica e é um

parâmetro bem estabelecido para determinar o aumento da formação destes radicais

livres no tecido na presença de lesão intestinal (15).

Tendo em vista os efeitos antiinflamatório, imunomodulador e citoprotetor da

glicina (28), buscou-se avaliar sua capacidade para prevenir as lesões intestinais e de

órgãos distantes (rim e fígado) em modelo experimental já descrito de ECN (12).

5

2. OBJETIVOS

2.1. Geral: buscar um método para prevenção da enterocolite necrosante

neonatal.

2.2. Específico: avaliar o efeito de um aminoácido (glicina) na prevenção das lesões

intestinais de órgãos à distância (fígado e rim) na enterocolite

necrosante neonatal.

6

3. MÉTODOS O experimento foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade

Federal de São Paulo, e aprovado com o protocolo n° 0560/04 (anexo 1).

3.1. Amostra Foram utilizados 50 ratos recém-nascidos da linhagem OUT B EPM-1 Wistar

(Rattus norvegicus albinus, Rodentia mammalia), com peso variando de 4 a 6 gramas

(figura 2). Utilizou-se a ninhada de seis ratas, sendo que, em cada ninhada,

distribuiram-se aleatoriamente os animais nos três grupos estudados. Para

identificação dos animais, eles foram tatuados com diferentes marcas, injetando-se 0,1

ml de tinta nanquim por via subcutânea em uma das patas.

Cinco animais foram canibalizados e, os quarenta e cinco restantes, foram

distribuídos em três grupos (figura 3):

• G1: (N=12): ratos que não foram submetidos à hipóxia-reoxigenação (Grupo

Controle).

• G2: (N=16): ratos que foram submetidos somente à hipóxia-reoxigenação (H-R).

• G3: (N=17): ratos submetidos à hipóxia-reoxigenação e a uma injeção

intraperitoneal prévia e diária de glicina.

Figura 2: Rato recém-nascido.

Agulha insulina

7

Grupo 3 H-R + Glicina

N = 17

Grupo 2 H-R

N = 16

Grupo 1 Controle

N = 12

Amostra N = 45

Figura 3: Esquema de distribuição dos animais nos grupos.

3.2. Experimento Utilizou-se o modelo de ECN descrito por Okur et al (12). Os animais foram

submetidos à hipóxia em uma câmara para sacrifício de roedores (figura 4), onde

receberam um fluxo de gás contendo 100% de gás carbônico (CO2), durante 5 minutos.

Após a hipóxia os animais foram reanimados com fluxo de gás contendo oxigênio (O2)

a 100% durante 5 minutos, e, em seguida, foram mantidos junto às respectivas mães

em ambiente normotérmico. Todos os animais receberam leite materno antes e após o

procedimento.

Nos animais do Grupo 3 utilizou-se 0,2 ml (1,7 a 2,2 mg/g de peso corporal) de

solução de glicina a 5% em solução salina (24,26,27). A injeção de glicina foi administrada

30 minutos antes da hipóxia-reoxigenação e mantida uma vez ao dia até a eutanásia

dos animais.

Todos os animais foram submetidos à eutanásia por decapitação no quarto dia de

vida.

8

Figura 4: Câmara para sacrifícios de roedores com entrada de gás O2 e CO2.

3.3. Preparo do tecido

Foram retirados segmentos de jejuno, íleo e cólon (figura 5), cada um com 1 cm

de comprimento, para análise histológica e imunohistoquímica. Foram também

retiradas amostras de tecido hepático e renal para realização de análise

imunohistoquímica. O material foi fixado em formol a 10%, desidratado, e incluído em

parafina.

Figura 5: Segmento

O restante do int

menos 80°C para poste

A

de jejuno (A), íleo (B) e cólon (C) ret

estino foi removido em bloco e im

rior homogeneização e dosagem de m

B

irados para histologia.

ediatamente congela

alondialdeído tecidua

C

do a

l.

9

Em 6 animais do grupo G1, 8 do grupo G2 e 10 do grupo G3, o fígado foi

removido e imediatamente congelado a menos 80°C para posterior homogeneização e

dosagem de malondialdeído tecidual.

3.4. Exame histopatológico

Fragmentos de 1 cm de intestino (jejuno, íleo e cólon) foram fixados em formol a

10%, desidratados, incluídos em parafina, e corados com hematoxilina-eosina. Foram

realizados cortes de 6 micrômetros em cada fragmento, e as lâminas foram analisadas

à microscopia óptica pelo patologista, sem o prévio conhecimento do grupo a que cada

animal pertencia.

Utilizou-se a classificação de Chiu et al (31), para avaliar o grau de lesão tecidual

intestinal:

Grau Achado

0 mucosa sem alteração

1 vilosidades bem constituídas, sem lise celular ou processo inflamatório,

porém, com formação do espaço subepitelial.

2 presença de lises celulares, formação do espaço subepitelial de

Grunhagen e espaçamento aumentado entre as vilosidades.

3 destruição da porção livre das vilosidades, presença de capilares

dilatados e de células inflamatórias.

4 destruição estrutural das vilosidades, havendo apenas esboço de

algumas, formadas por células inflamatórias e material necrótico, com

hemorragia e ulceração glandular basal.

5 destruição de toda túnica mucosa, não mais sendo observado qualquer

estrutura glandular, mas apenas material amorfo depositado sobre a

tela submucosa.

10

3.5. Procedimento imunohistoquímico

Utilizando-se o material previamente parafinado, foram realizadas novamente

secções de 3 micrômetros, e os cortes foram processados pela técnica da

streptavidina-biotina-peroxidase para pesquisa de Caspase-3-Clivada e Lamina-A-

Clivada.

Seqüência de procedimentos para obtenção das lâminas:

1. Desparafinização em estufa.

2. Desparafinização em xilol.

3. Reidratação em álcool absoluto, em álcool a 70%, lavagem em água corrente e

em água destilada.

4. Recuperação antigênica com tampão citrato 0,01M, pH 6,0, em forno de

microondas, potência máxima, por três ciclos de 5 minutos cada, mantida esta

incubação por mais 20 minutos em temperatura ambiente, seguida por lavagem

em água corrente e água destilada.

5. Bloqueio da peroxidase endógena com uma solução de peróxido de hidrogênio

(H2O2), 10 volumes, por 2 ciclos de 10 minutos, seguida por lavagem em água

corrente e água destilada.

6. Bloqueio de reação inespecífica através da incubação com tampão fosfato, pH

7,2, acrescido de soroalbumina bovina 1% por 15 minutos, desprezando o

excesso após este tempo.

7. Incubação no anticorpo primário Caspase-3-Clivada na diluição de 1:30

(Monoclonal Anti-human/mouse Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1) Antibody -

Cell Signaling Technology) e Lamina-A-Clivada na diluição de 1:50 (Policlonal

Anti-human/mouse Cleaved Lamin A (Small Subunit) Antibody - Cell Signaling Technology), durante a noite, em temperatura de cerca de 8°C.

8. Lavagem em tampão.

9. Incubação em anticorpo secundário biotinilado, em temperatura ambiente, por 30

minutos.


11. Incubação no complexo streptavidina-biotina-peroxidase, em temperatura

ambiente, por 30 minutos.


13. Incubação com o substrato enzimático diaminobenzidina.

11

14. Lavagem em água corrente e água destilada.

15. Contracoloração com hematoxilina de Harris.

16. As lâminas coradas foram analisadas pelo sistema computadorizado de análise

de imagens, constituído por uma vídeo-câmera Sony® CCD-IRIS, acoplada a um

microscópio óptico Olympus (BX 50), com objetivas pancromáticas, que

transmitiram as imagens a um microcomputador Pentium 4, com 512 megabytes

de memória RAM, trabalhando em ambiente Windows 98® e equipado com placa

digitalizadora e o software “Image-Pro-Plus”®, versão 4.1 (anexo 2). Foram

capturadas imagens correspondentes a 6 campos com aumento de 400 vezes (26).

O número de corpúsculos apoptóticos foram contados pelo patologista, sem o

prévio conhecimento do grupo a que cada animal pertencia com o auxílio do

programa de análise de imagem “Image Tool”® (anexo 3).

3.6. Determinação de Malondialdeído Tecidual

Malondialdeído (MDA) é um produto final da peroxidação de lipídeos e é um

parâmetro bem estabelecido para determinar o aumento de radicais livres no tecido

intestinal (11). Para determinar os níveis de MDA foi utilizado o método do ácido

tiobarbitúrico (TBA) proposto por Kohn e Liversedge (32) e os valores foram expressos

como nanomoles de MDA por miligrama de proteína (nmol MDA/mg proteína).

O conteúdo protéico do homogenato foi determinado mediante o uso do

“coomassie brilliant blue” (CBB).

As amostras teciduais foram descongeladas, anotou-se o peso e adicionou-se um

volume correspondente a cinco vezes o peso em gramas, de solução tampão de TRIS

0,01M/pH 7,4. As amostras teciduais foram homogeneizadas em banho de gelo, 4

vezes por trinta segundos, e posteriormente centrifugadas por 5 minutos a 10.000 rpm

a 4° C.

3.6.1. Dosagem de proteína

O reagente CBB interage com a proteína, permitindo sua quantificação, utilizando

uma curva padrão de albumina com concentrações conhecidas.

Preparo do reagente CBB:

1. Agitou-se bem até dissolver 100 mg de CBB em 50 ml de etanol 95%.

12

2. Adicionou-se a seguir 100 ml de ácido fosfórico 85%, com agitação constante,

acrescentando-se água destilada para um volume final de 1 litro.

3. O reagente foi deixado em repouso por 24 horas e, em seguida, filtrado e mantido

em frasco escuro.

Utilizando uma solução estoque de albumina bovina (BSA) 10 mg/ml, preparou-se

200 µl das seguintes soluções: 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,8 mg/ml e 1 mg/ml

(albumina bovina/ml de água) para fazer a curva padrão de albumina bovina (anexo 4).

Colheram-se 25 µl e 50 µl do homogenato, posteriormente diluídos em 5 vezes

em tampão de TRIS 0,01M/pH 7,4, e acrescentaram-se 2,5 ml do CBB. As leituras

foram feitas em 595 nm após 10 minutos da adição do reagente de CBB.

3.6.2. Dosagem de Malondialdeído

Foram coletados 400 µl do sobrenadante do homogenato centrifugado e

adicionados 1 ml de ácido tricloroacético 20% e 400 µl de ácido tiobarbitúrico a 1,6%. A

mistura foi incubada por 30 minutos, a 95°C.

Os lipídeos foram extraídos pela adição de n-butanol (1,6 ml) e vigorosa agitação.

A amostra foi então centrifugada novamente por 10 minutos a 3000 rpm, e a camada

superior foi cuidadosamente separada. A absorbância da camada orgânica foi

determinada em 510, 532, e 560 nm. Para o cálculo dos valores finais utilizou-se a

seguinte equação, proposta para minimizar a interferência dos pigmentos heme e da

hemoglobina na dosagem de MDA (33):

MDA532= 1,22[(A532)-(0,56)(A510)+(0,44)(A560)]

A curva de calibração foi traçada com 1,3,3 tetra-metoxipropano malondialdeído

bis (anexo 5).

13

3.7. Estudo Estatístico

As variáveis quantitativas contínuas foram representadas por média, desvio

padrão da média (dp), valores mínimo e máximo, e as discretas por freqüência absoluta

(N) e relativa (%).

O teste de Kolmogorov-Smirnov foi aplicado para testar a existência de

distribuição normal nas variáveis quantitativas dentro de cada grupo de estudo. Na

comparação entre os grupos de estudo foi utilizada a técnica de Análise de Variância

(ANOVA) com o fator fixo Grupo. As diferenças foram localizadas pelo teste de

comparações múltiplas de Tukey.

Aplicou-se o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis para amostras

independentes na análise do grau de lesão tecidual nas três localizações avaliadas. As

diferenças foram estabelecidas pelo teste de comparações múltiplas de Dunn.

Adotou-se o nível de significância de 0,05 (α = 5%) para rejeição da hipótese de

nulidade, e níveis descritivos (p) iguais ou inferiores a esse valor foram considerados

significantes e representados por um asterisco.

14

4. RESULTADOS

4.1. Intestino 4.1.1. Exame histopatológico

Encontrou-se diferença estatisticamente significante entre os grupos de estudo,

quanto à distribuição do grau de lesão tecidual no jejuno dos animais (p < 0,001).

(tabela 1).

Tabela 1: ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA DAS LESÕES DO JEJUNO

Grupo G1 Grupo G2 Grupo G3

Grau N % N % N %

0 10 83,3 1 6,3 4 23,5

1 1 8,3 1 6,3 3 17,6

2 0 0 3 18,8 3 17,6

3 1 8,3 7 43,8 5 29,4

4 0 0 3 18,8 2 11,8

5 0 0 1 6,3 0 0

Escore 12 10,92* 16 31,16 17 23,85

N= número de ratos. %= porcentagem. Teste de Kruskal-Wallis p < 0,001*

Os animais dos grupos G2 e G3, cujas lesões não diferem de forma significante

entre si, apresentaram graus significantemente maiores de lesão do que os animais do

grupo G1. (tabela 2).

Tabela 2: COMPARAÇÕES ENTRE OS GRUPOS NA ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA

DAS LESÕES DO JEJUNO

Intestino

G2 > G1*

G3 > G1*

G2 = G3

Teste de comparações múltiplas de Dunn.

15

0102030405060708090

100

G1 G2 G3

Grupo

Porc

enta

gem

de

anim

ais

Grau 0 Grau 1 Grau 2 Grau 3 Grau 4 Grau 5

Gráfico 1: Exame histopatológico no jejuno. Distribuição por grupos.

Não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos de

estudo quanto à distribuição do grau de lesão tecidual no íleo (p = 0,310). (Tabela 3 e

4).

Tabela 3: ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA DAS LESÕES DO ÍLEO


Grau N % N % N %

0 9 75 7 43,8 9 52,9

1 1 8,3 2 12,5 2 11,8

2 1 8,3 6 37,5 5 29,4

3 1 8,3 1 6,3 1 5,9

4 0 0 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0 0

Escore 12 18,79 16 25,63 17 23,50

N= número de ratos. %= porcentagem

Teste de Kruskal-Wallis p = 0,310

16


DAS LESÕES DO ÍLEO

Intestino

G1 = G2

G1 = G3

G2 = G3


0

20

40

60

80

100

G1 G2 G3

Grupo

Porc

enta

gem

de

anim

ais


Gráfico 2: Exame histopatológico no íleo. Distribuição por grupos.

Encontrou-se diferença estatisticamente significante entre os grupos de estudo

quanto à distribuição do grau de lesão tecidual no cólon dos animais (p = 0,003).

(Tabela 5).

17

Tabela 5: ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA DAS LESÕES DO CÓLON


Grau N % N % N %

0 10 83,3 2 12,5 5 29,4

1 0 0 2 12,5 3 17,6

2 1 8,3 8 50 5 29,4

3 1 8,3 0 0 3 17,6

4 0 0 2 12,5 1 5,9

5 0 0 2 12,5 0 0

Escore 12 13,17* 16 29,19 17 24,12

N= número de ratos. %= porcentagem.

Teste de Kruskal-Wallis p = 0,003*.

O grupo G1 apresentou graus de lesão significantemente menores do que os

animais dos grupos G2 e G3, cujas lesões não apresentaram diferenças significantes

entre si. (Tabela 6).


DAS LESÕES DO CÓLON

Intestino

G2 > G1*

G3 > G1*

G2 = G3


18

0

20

40

60

80

100

G1 G2 G3

Grupo

Porc

enta

gem

de

anim

ais


Gráfico 3: Exame histopatológico no cólon. Distribuição por grupos.

19

Figura 6: Fotomicrografia de corte histológico de intestino

mostrando mucosa sem alterações (grau 0). (HE- 200x)


mostrando mucosa com vilosidades bem constituídas, sem

lise celular ou processo inflamatório, porém, com formação

do espaço subepitelial de Grunhagen- seta preta (grau 1).

(HE- 200x).

20

Figura 8: Fotomicrografia de corte histológico de

intestino mostrando mucosa com presença de lises

celulares, formação do espaço subepitelial de

Grunhagen e espaçamento aumentado entre as

vilosidades (grau 2). (HE- 200x)

Figura 9: Fotomicrografia de corte histológico de

intestino do animal do Grupo H-R mostrando

mucosa com destruição da porção livre das

vilosidades, presença de capilares dilatados e de

células inflamatórias (grau 3). (HE- 200x)

21


mostrando mucosa com destruição estrutural das vilosidades,

havendo apenas esboço de algumas, formadas por células

inflamatórias e material necrótico, com hemorragia e

ulceração glandular basal (grau 4). (HE- 200x)


mostrando mucosa com destruição de toda túnica mucosa, não

sendo mais observado qualquer estrutura glandular, mas apenas

material amorfo depositado sobre a tela submucosa (grau 5). (HE-

200x).

22

4.1.2. Imunohistoquímica

4.1.2.1. Caspase-3-Clivada A tabela 7 contém os resultados da contagem de corpúsculos apoptóticos em 6

campos de grande aumento (400 vezes) no jejuno, íleo e cólon dos animais,

distribuídos nos três grupos estudados (anexo 6). Através da Análise de Variância

foram constatadas diferenças estatisticamente significantes entre os grupos para as

variáveis analisadas (p < 0,05).

Tabela 7: RESULTADO DA CONTAGEM DE CORPÚSCULOS APOPTÓTICOS PELA

IMUNOHISTOQUÍMICA PARA CASPASE-3-CLIVADA NO JEJUNO, ÍLEO E CÓLON

DOS ANIMAIS

Caspase G1 G2 G3 Comparações

Jejuno p < 0,001* média ± desvio padrão 5,0 ± 2,8 21,3 ± 7,0 5,3 ± 2,1 mediana 5,5 20,5 4,0 mínimo – máximo 1,0–8,0 14,0 - 31,0 4,0 – 8,0 Íleo p < 0,001* média ± desvio padrão 6,5 ± 4,0 22,3 ± 4,2 6,7 ± 1,6 mediana 4,5 21,5 6,5 mínimo – máximo 3,0 – 13,0 18,0 – 27,0 5,0 – 9,0 Cólon p < 0,001* média ± desvio padrão 4,7 ± 3,4 23,2 ± 10,5 5,3 ± 3,0 mediana 4,0 21,5 4,5 mínimo – máximo 1,0 – 11,0 10,0 – 39,0 2,0 – 9,0

Análise de Variância

A Tabela 8 contém os resultados das comparações duas a duas entre os grupos

G1, G2 e G3. O resultado das comparações múltiplas foi o mesmo para os resultados

obtidos no jejuno, íleo e cólon na realização da imunohistoquímica para Caspase-3-

Clivada. O grupo G2 é significativamente maior, em média, do que os grupos G1 e G3.

Entre estes dois últimos não foi encontrada diferença estatisticamente significante.

23

Tabela 8: COMPARAÇÕES ENTRE OS GRUPOS NA CONTAGEM DE

CORPÚSCULOS APOPTÓTICOS PELA IMUNOHISTOQUÍMICA PARA CASPASE-3-

CLIVADA NO JEJUNO, ÍLEO E CÓLON DOS ANIMAIS

Jejuno Íleo Cólon

G2 > G1* G2 > G1* G2 > G1*

G2 > G3* G2 > G3* G2 > G3*

G1 = G3 G1 = G3 G1 = G3

Teste de comparações múltiplas de Tukey.

JEJUNO

G2 G1 G3

Gráfico 4: Caspase-3-Clivada no jejuno. Distribuição por grupos.

24

ÍLEO

G1 G3G2

Gráfico 5: Caspase-3-Clivada no íleo. Distribuição por grupos.

G1 G2 G3

CÓLON

Gráfico 6: Caspase-3-Clivada no cólon. Distribuição por grupos.

25

Figura 12: Fotomicrografia representativa da coloração imunohistoquímica com

Caspase-3-Clivada no jejuno dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina

(setas pretas mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom escuro).(400X)

G2G1 G3


Caspase-3-Clivada no íleo dos animais: G1:controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina

(setas pretas mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom

escuro).(400X)

G2 G3G1

26


Caspase-3-Clivada no cólon dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina

(setas pretas mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom

escuro).(400X)

G1 G3G2

4.1.2.2. Lamina-A-Clivada

A tabela 9 contém os resultados da contagem de corpúsculos apoptóticos em 6

campos de grande aumento (400 vezes) no jejuno, íleo e cólon dos animais,

distribuídos nos três grupos estudados (anexo 7). Através da Análise de Variância

foram constatadas diferenças estatisticamente significantes entre os grupos para as

variáveis analisadas (p < 0,05).

27


IMUNOHISTOQUÍMICA PARA LAMINA-A-CLIVADA NO JEJUNO, ÍLEO E CÓLON

DOS ANIMAIS

Lamina G1 G2 G3 Comparações

Jejuno p < 0,001* média ± desvio padrão. 4,17 ± 1,94 13,5 ± 3,5 4,00 ± 1,41 mediana 3,5 13,0 4,0 mínimo – máximo 2,0 – 7,0 9,0 – 18,0 2,0 – 6,0 Íleo p < 0,001* média ± desvio padrão. 4,83 ± 2,14 15,8 ± 3,2 3,50 ± 2,26 mediana 4,0 15,5 3,5 mínimo – máximo 3,0 – 8,0 11,0 – 21,0 0,0 – 7,0 Cólon p < 0,001* média ± desvio padrão 4,3 ± 2,5 13,8 ± 3,6 2,8 ± 1,6 mediana 4,0 13,0 2,0 mínimo – máximo 1,0 – 8,0 9,0 – 19,0 2,0 – 6,0



G1, G2 e G3. No jejuno, íleo e cólon, o grupo G2 é significativamente maior do que os

outros dois. Entre G1 e G3 não foi constatada diferença estatisticamente significante.

Tabela 10: COMPARAÇÕES ENTRE OS GRUPOS NA REALIZAÇÃO DA

IMUNOHISTOQUÍMICA PARA LAMINA-A-CLIVADA NO JEJUNO, ÍLEO E CÓLON

DOS ANIMAIS

Jejuno Ìleo Cólon

G2 > G1* G2 > G1* G2 > G1*

G2 > G3* G2 > G3* G2 > G3*

G1 = G3 G1 = G3 G1 = G3


28

JEJUNO

Gráfico 7: Lamina-A-Clivada no jejuno. Distribuição por grupos.

G1 G2 G3

G1 G2 G3

ÍLEO

Gráfico 8: Lamina-A-Clivada no íleo. Distribuição por grupos.

29

CÓLON

G1 G3G2

Gráfico 9: Lamina-A-Clivada no cólon. Distribuição por grupos.


Lamina-A-Clivada no jejuno dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina


G3G1 G2

30


Lamina-A-Clivada no íleo dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina (setas

pretas mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom escuro).

G1 G2 G3


Lamina-A-Clivada no cólon dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina


G1 G2 G3

31

4.1.3. Determinação de Malondialdeído Tecidual

Os valores de MDA (anexos 8-10) dos grupos em estudo podem ser observados

na tabela 11. Encontrou-se diferença estatisticamente significante entre os grupos de

estudo, quando se comparou a média da dosagem de MDA nos animais (p = 0,002).

Tabela 11: VALORES DE MDA TECIDUAL NO INTESTINO

nmol MDA/mg de Proteína Grupo

Média Desvio padrão Mínimo Máximo N

G1 1,0539* 0,4916 0,4455 2,0337 12

G2 2,6007* 1,8711 0,5993 6,4034 16

G3 1,1090* 0,6680 0,3189 2,7606 17

Análise de Variância: p = 0,002*

As comparações entre os pares de grupos mostraram que o grupo G2 tem média

significantemente maior do que a do grupo G1 (p = 0,015); os grupos G1 e G3 não

diferiram de forma significante entre si (p = 0,992) e o grupo G2 tem média

significantemente maior do que a do grupo G3 (p = 0,021). (Tabela 12)

Tabela 12: COMPARAÇÕES ENTRE OS GRUPOS NA DOSAGEM DO MDA

TECIDUAL NO INTESTINO DOS ANIMAIS

Intestino

G2 > G1*

G2 > G3*

G1 = G3


32

4.2. Órgãos distantes 4.2.1. Imunohistoquímica

4.2.1.1. Caspase-3-Clivada A tabela 13 contém os resultados da contagem de corpúsculos apoptóticos em 6

campos de grande aumento (400 vezes) no fígado e rim dos animais, distribuídos nos

três grupos estudados (anexo 6). Através da Análise de Variância foram constatadas

diferenças estatisticamente significantes entre os grupos para as variáveis analisadas

(p < 0,05).


IMUNOHISTOQUÍMICA PARA CASPASE-3-CLIVADA NO FÍGADO E RIM DOS

ANIMAIS

Caspase G1 G2 G3 Comparações

Fígado p < 0,001* média ± desvio padrão 5,7 ± 2,6 11,5 ± 4,3 4,7 ± 1,8 mediana 5,0 11,5 4,5 mínimo – máximo 3,0 – 10,0 6,0 – 18,0 2,0 – 7,0 Rim p < 0,001* média ± desvio padrão 5,7 ± 5,3 12,7 ± 4,9 4,2 ± 2,8 mediana 5,0 12,5 4,0 mínimo – máximo 0,0 – 15,0 8,0 – 21,0 1,0 – 9,0



G1, G2 e G3. O resultado das comparações múltiplas foi o mesmo para os resultados

obtidos no fígado e rim na realização da imunohistoquímica para Caspase-3-Clivada. O

grupo G2 é significativamente maior, em média, do que os grupos G1 e G3. Entre estes

dois últimos não foi encontrada diferença estatisticamente significante.

33

Tabela 14: COMPARAÇÕES ENTRE OS GRUPOS NA CONTAGEM DE

CORPÚSCULOS APOPTÓTICOS PELA IMUNOHISTOQUÍMICA PARA CASPASE-3-

CLIVADA NO FÍGADO E RIM DOS ANIMAIS

Fígado Rim

G2 > G1* G2 > G1*

G2 > G3* G2 > G3*

G1 = G3 G1 = G3

FÍGADO


Gráfico 10: Caspase-3-Clivada no fígado. Distribuição por grupos.

34

RIM

Gráfico 11: Caspase-3-Clivada no rim. Distribuição por grupos.


Caspase-3-Clivada no fígado dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina


G1 G2 G3

35


Caspase-3-Clivada no rim dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina


G1 G2 G3

4.2.1.2. Lamina-A-Clivada

A tabela 15 contém os resultados da contagem de corpúsculos apoptóticos em 6

campos de grande aumento (400 vezes) no fígado e rim dos animais, distribuídos nos

três grupos estudados (anexo 7). Através da Análise de Variância foram constatadas

diferenças estatisticamente significantes entre os grupos para as variáveis analisadas

(p < 0,05).


IMUNOHISTOQUÍMICA PARA LAMINA-A-CLIVADA NO FÍGADO E RIM DOS

ANIMAIS

Lamina G1 G2 G3 Comparações

Fígado p < 0,001* média ± desvio padrão 6,3 ± 3,4 15,0 ± 4,0 3,5 ± 2,3 mediana 6,0 15,0 3,5 mínimo – máximo 2,0 – 10,0 9,0 – 21,0 0,0 – 7,0 Rim p = 0,500 média ± desvio padrão 14,0 ± 3,5 19,3 ± 11,8 14,0 ± 9,2 mediana 14,5 15,5 12,0 mínimo – máximo 9,0 – 18,0 8,0 – 41,0 5,0 – 29,0


36


G1, G2 e G3. No fígado, o grupo G2 é significativamente maior do que os outros dois.

Entre G1 e G3 não foi constatada diferença estatisticamente significante. No rim, não

foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos (p > 0,05).

Tabela 16: COMPARAÇÕES ENTRE OS GRUPOS NA REALIZAÇÃO DA

IMUNOHISTOQUÍMICA PARA LAMINA-A-CLIVADA NO FÍGADO E RIM DOS

ANIMAIS

Fígado Rim

G2 > G1* G2 = G1

G2 > G3* G2 = G3

G1 = G3 G1 = G3


G1 G2 G3

FÍGADO

Gráfico 12: Lamina-A-Clivada no fígado. Distribuição por grupos.

37

RIM

G1 G3G2

Gráfico 13: Lamina-A-Clivada no rim. Distribuição por grupos.


Lamina-A-Clivada no fígado dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina


G1 G3G2

38


Lamina-A-Clivada no rim dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina (setas

pretas mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom escuro).(400X)

G2 G3G1

4.2.2. Determinação de Malondialdeído Tecidual no Fígado

Os valores de MDA (anexos 11-13) dos grupos estudados podem ser observados

na tabela 17. Encontrou-se diferença estatisticamente significante entre os grupos de

estudo, quanto se comparou a média da dosagem de MDA no fígado dos animais (p =

0,004).

Tabela 17: VALORES DE MDA TECIDUAL NO FÍGADO.

Grupo nmol MDA /mg proteínas

Média Desvio padrão Mínimo Máximo N

G1 0,8043* 0,2316 0,3483 0,9787 6

G2 1,9328* 1,1099 0,8028 4,2304 8

G3 0,6891* 0,4908 0,1131 1,4560 10

Análise de Variância: p = 0,004*

39

As comparações entre os pares de grupos mostraram que o grupo G2 tem média

significantemente maior do que a do grupo G1 (p = 0,023); os grupos G1 e G3 não

diferiram de forma significante entre si (p = 0,949) e o grupo G2 tem média

significantemente maior do que a do grupo G3 (p = 0,004). (Tabela 18)

Tabela 18: COMPARAÇÕES ENTRE OS GRUPOS NA DOSAGEM DO MDA

TECIDUAL NO FÍGADO DOS ANIMAIS

Fígado

G2 > G1*

G2 > G3*

G1 = G3


40

5. DISCUSSÃO

A enterocolite necrosante neonatal (ECN) é a doença mais freqüente e letal que

afeta o trato gastrointestinal de recém-nascidos (1). Não se sabe ao certo sua

etiopatogenia, porém, a maioria dos investigadores acredita que ela seja fruto de uma

combinação de eventos atuando num recém-nascido de vulnerabilidade variável.

Assim, um recém-nascido prematuro, de muito baixo peso, com uma barreira intestinal

fisiológica e imunologicamente imatura, poderia desenvolver a doença, mesmo em

presença de um só evento desencadeante. Já em um recém-nascido de peso perto do

normal, a doença teria tendência a acontecer somente em presença de diferentes

eventos concomitantes, como hipotensão arterial, hipotermia, hipóxia, anemia ou

cateterismo de vasos umbilicais (34).

A ECN pode desenvolver-se em um só segmento intestinal, estender-se para

quase todo o intestino, ou acometer diferentes segmentos intestinais de forma

descontínua. Os segmentos mais comumente envolvidos são o íleo terminal e o cólon (3).

A lesão microscópica característica da ECN em fase inicial é a necrose de

coagulação da superfície mucosa que se caracteriza pela conversão da célula em um

“arcabouço” acidofílico e opaco. Isso em geral ocorre com a perda do núcleo, mas com

preservação da forma celular básica, permitindo o reconhecimento dos contornos

celulares e arquitetura tissular. Presumivelmente, o padrão resulta da desnaturação

que bloqueia a proteólise da célula, não só das proteínas estruturais como também das

proteínas enzimáticas. (35).

Os achados clínicos da ECN são inespecífícos, tais como febre, letargia, apnéias

recorrentes, bradicardia, hipoglicemia e choque, e representam simplesmente uma

instabilidade fisiológica no recém-nascido. Os sintomas específicos do trato gastro-

intestinal aparecem mais tardiamente e são, fundamentalmente, distensão abdominal,

enterorragia, resíduo gástrico aumentado, vômitos e diarréia (34).

Nos modelos animais utilizados para estudo da etiopatogenia da ECN, ficou

demonstrado que a hipóxia leva a um decréscimo da perfusão intestinal, e a lesão

resultante é desencadeada por um mecanismo de isquemia e reperfusão (6-15). Os

modelos que utilizaram a hipóxia isoladamente, como evento desencadeante,

apresentaram lesão intestinal restrita à camada mucosa (36), com conseqüente quebra

41

da barreira intestinal, mediada por apoptose celular (29), propiciando a entrada de

bactérias e endotoxinas, e o subseqüente desenvolvimento de todo o processo de ECN (29,36).

Diferentes mecanismos estariam envolvidos na progressão desta lesão como o

aumento da produção de radicais livres de oxigênio, aumento de moléculas de adesão

e infiltração de neutrófilos, e aumento da peroxidação lipídica, com a conseqüente

produção de mediadores inflamatórios como as citocinas (3).

Diferentes animais já foram utilizados para o estudo da ECN, porém, escolheu-se

o rato como animal de experimentação, porque as funções intestinais de mamíferos

com curto período de gestação, amadurecem após o parto (37), de forma semelhante ao

que ocorre com o intestino das crianças prematuras. Escolheu-se também o modelo

utilizado por Okur et al (12) em que ratos recém-nascidos eram submetidos a cinco

minutos de hipóxia, seguidos por cinco minutos de oxigenação, provocando doença

semelhante à ECN. Neste modelo os autores injetavam vitamina E por via

intraperitoneal e observaram que as lesões histológicas dos animais que haviam

recebido a vitamina E eram menos intensas e que a produção de radicais livres no

intestino era menor (12).

O modelo utilizado no experimento mostrou-se de fácil reprodução. Apesar de

provocar lesão histológica restrita à camada mucosa, como observada no estudo e já

demonstrada anteriormente (13), o que dificultou avaliar o uso da glicina através do

exame histopatológico, foi um bom modelo para avaliação da liberação de radicais

livres teciduais e para avaliação da apoptose (eventos que antecedem a lesão

tecidual). Uma de suas vantagens é não necessitar da administração de fórmulas

enterais para obtenção de lesão intestinal. Uma limitação para este modelo é o

pequeno tamanho dos animais. Os ratos no primeiro dia de vida pesam entre 4 e 6

gramas o que dificulta o estudo de drogas administradas por via oral e impede o estudo

de drogas utilizadas por via endovenosa. Também, nos animais deste tamanho, não é

possível o estudo de métodos de tratamento.

Vários agentes atenuantes ou preventivos foram testados em modelos

experimentais de ECN. O leite materno, ao contrário das fórmulas artificiais, mostrou-se

eficaz em reduzir o risco de desenvolvimento da doença (6). A Vitamina E e a

interleucina recombinante humana diminuíram a peroxidação lipídica e a lesão

histopatológica no tecido intestinal em ratos recém-nascidos (12,15). A suplementação

com bifidobactérias reduziu o risco de ECN ao diminuir a concentração de endotoxinas

42

plasmáticas e a expressão da fosfolipase A2 intestinal (14). A suplementação com

aminoguanidina, um inibidor da óxido-nítrico-sintetase-indutora, também diminuiu a

reação inflamatória intestinal, reduzindo, portanto, o risco de ECN (17). Agentes como a

glutamina e a dexametasona também demonstraram efetividade ao diminuir a reação

inflamatória intestinal (18). Nenhum destes agentes, no entanto, teve sucesso absoluto

na prevenção da ECN (1).

Diferentes agentes, ainda não testados em modelos experimentais de ECN,

mostraram-se eficazes na prevenção de lesões intestinais por isquemia e reperfusão,

por oclusão da artéria mesentérica, em experimentos utilizando animais adultos (38).

Estão descritos o pré-condicionamento isquêmico, a terapia anticomplemento e

antileucocitária, os perfluorocarbonos, diferentes agentes antioxidantes, e o utilizado

neste estudo, que foi a utilização de glicina (38).

O pré-condicionamento isquêmico é apresentado como a melhor estratégia de

prevenção contra a lesão provocada por isquemia e reperfusão intestinal (38,39). Apesar

de estar demonstrado que ele pode ser realizado induzindo um evento de isquemia e

reperfusão em áreas corporais distantes do local desejado (40), é difícil pensar em sua

aplicabilidade clínica em recém-nascidos com risco de desenvolver ECN. A elucidação

dos mecanismos moleculares que estão envolvidos no pré-condicionamento isquêmico

e a identificação de drogas que mimetizem esta resposta protetora pode, no entanto,

ser a chave da prevenção das lesões por isquemia e reperfusão de vários órgãos no

futuro próximo (38,39).

A glicina, um aminoácido não essencial, já demonstrou sua capacidade de

proteger o intestino contra a lesão causada por isquemia e reperfusão em modelos de

oclusão mesentérica e em transplantes de intestino (23-28). Ela é considerada um agente

antiinflamatório, imunomodulador e com função citoprotetora direta (28). Lee et al (24,25),

em experimento com animais em que se provocou oclusão da artéria mesentérica,

demonstraram que a infusão mesentérica local de glicina aumentou o conteúdo

protéico e de DNA da mucosa, diminuiu a atividade da mieloperoxidase intestinal, e

manteve a atividade da glutaminase na mucosa. Outros dois estudos (26-27), também em

modelo de isquemia e reperfusão intestinal em ratos, demonstraram o efeito protetor da

glicina, usada em infusão intravenosa sistêmica, ao diminuir a apoptose (26), e preservar

a integridade e a contratilidade da parede intestinal (27).

A glicina pode ser facilmente administrada suplementando infusões intravenosas

de manutenção basal do metabolismo ou como componente de soluções de nutrição

43

parenteral total. Pode também ser utilizada por via oral, tendo sido observada uma

excelente resposta nos diferentes estudos realizados (41,42). A dose já descrita de glicina

utilizada para prevenção da lesão causada por isquemia e reperfusão intestinal é de

0,5 a 3 mg por grama de peso corporal (24-28) e, quando administrada por via parenteral,

deve ser diluída em solução salina, pois sua diluição em água pode ser fatal ao induzir

hiponatremia (43,44). Seu uso em doses elevadas também pode levar à morte por

produção aumentada de amônia plasmática (43,44).

Ao analisar os resultados histológicos do experimento observou-se que os

animais submetidos a hipóxia-reoxigenação apresentaram lesões com graduação de

Chiu maior que os animais do grupo controle no jejuno e no cólon, e tenderam a

apresentar lesões com graduação maior no íleo. Os animais que deveriam ter sido

protegidos pela glicina apresentaram lesões histológicas com graduação de Chiu

semelhantes aos dos animais que não receberam a glicina. O resultado observado de

que a infusão de glicina não previne o dano tecidual já havia sido encontrado em

estudos prévios (23,25,27). Diferentes argumentos podem justificar estes achados. Um

deles é que a amostra retirada para exame histopatológico pode não refletir a extensão

global da lesão, pois as alterações morfológicas resultantes da isquemia-reperfusão

não são uniformes, podendo haver áreas histologicamente normais adjacentes a áreas

com necrose (45). É possível também que, como a glicina age na proteção da

membrana celular, a avaliação histológica não seja o critério mais adequado para

estudar seu efeito (23).

Mangino et al (23), avaliando os efeitos da glicina na função e metabolismo

intestinal após lesão por isquemia e reperfusão hipotérmica, observaram que houve

uma melhora do fluxo sanguíneo e do consumo de oxigênio após a reperfusão, uma

menor atividade da mieloperoxidase, e uma menor produção de leucotrieno B4.

Observaram também, porém, que não houve uma proteção efetiva, quando se

considerou como critério de avaliação as lesões histológicas provocadas no intestino.

Lee et al (25), em um modelo utilizando clampeamento da artéria mesentérica, também

não conseguiram observar um efeito protetor da glicina, quando utilizaram como critério

de avaliação as alterações histológicas, mas observaram que a atividade da

mieloperoxidase intestinal estava diminuída, e que a atividade da glutaminase na

mucosa estava mantida. Kallakuri et al (27), utilizando um modelo semelhante ao de Lee

et al, demonstraram que a glicina não foi capaz de evitar a alteração da cobertura

mucosa, porém manteve a espessura total da parede e o raio circunferencial da

44

vilosidade. No presente estudo o modelo animal utilizado não produziu lesão

histológica suficiente o que dificultou a avaliação da proteção oferecida pela glicina

através do exame histopatológico.

A peroxidação lipídica é um processo complexo que pode ocorrer em membranas

biológicas constituídas por ácidos graxos poliinsaturados reagentes ao oxigênio

molecular, levando à produção de hidroperóxidos lipídicos e seus metabólitos. Na

maioria dos casos em que há peroxidação lipídica, ocorre uma reação em cadeia que

se propaga, mediada pela presença de radicais livres (12,13,15). Os hidroperóxidos

lipídicos acumulam-se na membrana, inativando seus receptores e enzimas,

prejudicando suas funções, levando a sua desestabilização, e tornando-a permeável a

íons (12,13,15). Um método simples e de alta sensibilidade para demonstrar esta

peroxidação lipídica é a reação de substâncias que se combinam com o ácido

tiobarbitúrico, como o malondialdeído (MDA). O MDA é, desta forma, um indicador

adequado para medir a peroxidação lipídica provocada por radicais livres (12,13,15).

As lesões intestinais da ECN levam à liberação destes radicais livres e

mediadores inflamatórios na corrente sanguínea, que podem acarretar disfunção e

falência de múltiplos órgãos (3,46), a maior causa de mortalidade nos pacientes

portadores de ECN. O fígado é o primeiro órgão a receber estes mediadores tóxicos (47)

provenientes do intestino, e, por esse motivo, ele foi o órgão escolhido para averiguar a

ação da glicina na peroxidação lipídica em órgãos distantes.

Se as lesões histológicas não permitiram afirmar que a glicina tem um efeito

protetor efetivo no intestino, a dosagem do malondialdeído mostrou que o grupo

submetido à hipóxia-reoxigenação apresentou valores maiores do que o grupo

previamente submetido à infusão de glicina (p = 0,021). Os resultados obtidos são

semelhantes aos estudos de Okur et al utilizando a vitamina E, e os de Öztürk et al

utilizando a interleucina-10 recombinate humana (12,15).

Resultado semelhante encontrou-se no fígado. O grupo submetido à hipóxia-

reoxigenação teve valores médios de MDA hepático significativamente maiores que os

animais previamente protegidos pelo uso de glicina (p = 0,004), demonstrando que a

les. A ausência de diferença entre o grupo controle e o grupo que usou glicina (p =

0,949) demonstra que o nível de proteção fornecido pela glicina foi importante a ponto

de o nível de peroxidação ser semelhante ao dos ratos do grupo controle.

A apoptose do epitélio intestinal precede e induz a lesão tecidual pela quebra da

barreira mucosa (29). Com a progressão do processo, há liberação de mediadores

45

inflamatórios na corrente sanguínea, que provocam morte celular em diferentes órgãos

como fígado e rim. A apoptose pode ser deflagrada por estímulos externos, por meio

de receptores específicos na superfície celular, ou por estímulos internos, como dano

ao DNA, alterações do ciclo celular ou das vias metabólicas. Estas diferentes vias

culminam com a ativação de proteases conhecidas como caspases, que têm papel

fundamental no processo de morte celular (48).

As caspases estão presentes no citosol sob a forma de pró-enzimas inativas,

tornando-se ativas após clivagem proteolítica do ácido aspártico (48). Pelo menos

quatorze membros dessa família já foram identificados nos mamíferos, e estão

envolvidos no processo de inflamação e apoptose (48). Algumas caspases iniciam a

atividade proteolítica e agem como reguladoras da morte celular, enquanto outras,

como a caspase 3 e 6, agem como efetoras na fragmentação celular. A lamina A é uma

proteína de membrana nuclear, e é especificamente clivada pela caspase 6. A

determinação imunohistoquímica da lamina A clivada também, foi, por este motivo,

utilizada, neste estudo, como marcadora da ativação da caspase 6.

O índice apoptótico, quando determinado pela reação da caspase-3-clivada, foi

maior nos animais submetidos à hipóxia-reoxigenação do que nos animais previamente

protegidos pela glicina, em todos os órgãos examinados. O mesmo resultado foi

observado, quando o índice apoptótico foi medido pela reação da lamina-A-clivada, em

todos os órgãos examinados, porém no rim o resultado não foi significante quando da

análise estatística.

A comprovada diminuição da peroxidação lipídica e da apoptose celular nos

animais tratados com glicina decorre, provavelmente, de seu mecanismo de ação na

membrana plasmática, onde ativa um canal de cloro que estabiliza ou hiperpolariza o

potencial de membrana, bloqueando o acréscimo intracelular de cálcio que vai

desencadear todo o processo de lesão celular (28).

A glicina foi capaz de reduzir os efeitos deletérios da hipóxia-reoxigenação,

quando se considerou como critério de avaliação a dosagem de MDA e os índices de

apoptose celular. As lesões histológicas, incapazes de mostrar as alterações mais

precoces, talvez não configurem o melhor marcador, quando se quer detectar os

fenômenos patológicos numa fase mais inicial.

Como a glicina pode ser administrada em qualquer solução intravenosa ou

mesmo por via oral, é provável que a recomendação de seu uso rotineiro nas unidades

46

neonatais de terapia intensiva seja uma boa prática e, quem sabe, seja esta a

mensagem mais importante deste trabalho.

47

6. CONCLUSÕES

No modelo experimental de ECN a injeção de glicina:

1. não é capaz de, estatisticamente, prevenir as alterações histológicas;

2. diminui a peroxidação lipídica no intestino e no fígado, avaliada pela dosagem de

malondialdeído tecidual;

3. diminui a apoptose celular no intestino, rim e fígado, quando se considera a

determinação da Caspase-3-Clivada;

4. diminui a apoptose celular no intestino e fígado, quando se considera a

determinação da Lamina-A-Clivada.

48

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54

8. ANEXOS

Anexo 1: Carta de aprovação da Comissão de Ética em Pesquisa:

55

Anexo 2:

Figura 22: Programa de edição de imagem utilizado para captura das imagens

provenientes do microscópio óptico.

56

Anexo 3:

Figura 23: Programa de edição de imagem utilizado para contagem dos

corpúsculos apoptóticos.

57

Anexo 4:

Curva de Proteína

0

0,5

1

1,5

0 0,1 mg/ml 0,2 mg/ml 0,4 mg/ml 0,8 mg/ml 1,0 mg/ml

Concentração

Abs

orbâ

ncia

Curva de proteína

Gráfico 14: Curva de calibração de proteína construída com o padrão de albumina

humana.

Anexo 5:

Curva de MDA

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0 1,5 3 6 12 24

nmol MDA

Abs

orbâ

ncia

Curva de MDA

Gráfico 15: Curva de calibração do MDA traçada com 1,3,3 tetra-metoxipropano

malondialdeído bis (acetildimetilo).

58

Anexo 6: Tabela 19: NÚMERO DE CORPÚSCULOS APOPTÓTICOS EM 6 CAMPOS DE 400X

PELO MÉTODO DA CASPASE-3-CLIVADA EM TODOS OS GRUPOS NO JEJUNO,

ÍLEO, CÓLON, FÍGADO E RIM

Jejuno Íleo Cólon Fígado Rim Grupo G1 Grupo G1 Grupo G1 Grupo G1 Grupo G1

N Total N total N total N total N total 1 8 1 13 1 1 1 10 1 7 2 7 2 4 2 4 2 4 2 0 3 1 3 5 3 5 3 7 3 3 4 4 4 10 4 11 4 6 4 15 5 7 5 4 5 4 5 3 5 2 6 3 6 3 6 3 6 4 6 7

Total 30 Total 39 Total 28 Total 34 Total 34 Jejuno Íleo Cólon Fígado Rim

Grupo G2 Grupo G2 Grupo G2 Grupo G2 Grupo G2 N Total N Total N Total N Total N Total 1 14 1 24 1 19 1 18 1 14 2 28 2 19 2 24 2 14 2 14 3 31 3 27 3 39 3 12 3 21 4 14 4 18 4 16 4 8 4 11 5 20 5 19 5 10 5 6 5 8 6 21 6 27 6 31 6 11 6 8



Total 32 Total 40 Total 32 Total 28 Total 25

59

Anexo 7: Tabela 20: NÚMERO DE CORPÚSCULOS APOPTÓTICOS EM 6 CAMPOS DE 400X

PELO MÉTODO DA LAMINA-A-CLIVADA EM TODOS OS GRUPOS NO JEJUNO,

ÍLEO, CÓLON, FÍGADO E RIM

Jejuno Íleo Cólon Fígado Rim Grupo G1 Grupo G1 Grupo G1 Grupo G1 Grupo G1

N total N total N total N total N total 1 6 1 3 1 6 1 2 1 15 2 7 2 4 2 8 2 4 2 11 3 3 3 8 3 3 3 10 3 17 4 4 4 7 4 5 4 10 4 18 5 3 5 4 5 3 5 4 5 9 6 2 6 3 6 1 6 8 6 14





Total 24 Total 21 Total 17 Total 21 Total 84

60

Anexo 8: Tabela 21: CARACTERIZAÇÃO DOS ANIMAIS DO GRUPO CONTROLE (G1) COM

AS DOSAGENS DE PROTEÍNA E MALONDIALDEÍDO INTESTINAIS.

N Peso órgão g MDA nmol/ml Proteínas mg/ml nmol MDA/mg proteína

1 0,61 2,63 2,9 0,90

2 0,55 2,32 3,46 0,67

3 0,59 5,09 3,31 1,53

4 0,62 3,61 2,86 1,26

5 0,54 3,08 2,52 1,22

6 0,63 1,45 1,89 0,76

7 0,68 1,39 3,12 0,44

8 0,58 5,18 3,14 1,64

9 0,66 1,18 2,35 0,50

10 0,6 2,19 2,48 0,88

11 0,56 3,62 1,78 2,03

12 0,52 1,77 2,31 0,76

61

Anexo 9: Tabela 22: CARACTERIZAÇÃO DOS ANIMAIS DO GRUPO HIPÓXIA-

REOXIGENAÇÃO (G2) COM AS DOSAGENS DE PROTEÍNA E MALONDIALDEÍDO

INTESTINAIS

N Peso órgão g MDA nmol/ml Proteínas mg/ml nmol MDA/mg proteína

1 0,81 4,34 2,7 1,60

2 0,85 16,42 3,29 4,99

3 0,72 10,43 3,75 2,78

4 0,83 5,45 2,89 1,88

5 0,96 9,97 2,94 3,39

6 0,4 4,13 2,71 1,52

7 0,63 4,39 1,53 2,86

8 0,75 6,38 2,7 2,36

9 0,5 3,66 1,21 3,02

10 0,39 15,24 2,38 6,40

11 0,34 14,41 2,28 6,32

12 0,36 5,89 5,84 1,00

13 0,64 8,52 6,99 1,21

14 0,53 6,4 6,76 0,94

15 0,33 4,05 5,98 0,67

16 0,28 3,68 6,14 0,59

62


REOXIGENAÇÃO + GLICINA (G3) COM AS DOSAGENS DE PROTEÍNA E

MALONDIALDEÍDO INTESTINAIS.

N Peso órgão (g) MDA nmol/ml Proteínas mg/ml nmol MDA/mg proteína

1 0,87 1,44 2,7 0,53

2 0,97 2,34 3,53 0,66

3 0,93 4 2,88 1,38

4 0,94 5,63 3,11 1,81

5 0,93 4,66 2,82 1,65

6 0,81 3,92 5,58 0,70

7 0,62 1,5 4,52 0,33

8 0,8 1,36 1,44 0,94

9 0,72 4,24 10,1 0,41

10 0,73 1,55 4,86 0,31

11 0,47 5,88 2,13 2,76

12 0,2 4,16 2,31 1,80

13 0,26 11,33 6,7 1,69

14 0,54 7,67 6,42 1,19

15 0,2 6,98 6,03 1,15

16 0,3 5,09 6 0,84

17 0,22 4,46 7,03 0,63

63

Anexo 11: Tabela 24: CARACTERIZAÇÃO DOS ANIMAIS DO GRUPO CONTROLE (G1) COM

AS DOSAGENS DE PROTEÍNA E MALONDIALDEÍDO HEPÁTICOS.

N Peso órgão g MDA nmol/ml Proteínas mg/ml nmol MDA/mg proteínas

1 0,3 2,56 7,35 0,34

2 0,33 6,3 7,2 0,87

3 0,25 5,52 5,64 0,97

4 0,33 3,4 4,17 0,81

5 0,28 5,56 6,5 0,85

6 0,21 4,26 4,47 0,95


REOXIGENAÇÃO (G2) COM AS DOSAGENS DE PROTEÍNA E MALONDIALDEÍDO

HEPÁTICOS.


1 0,42 9,73 2,3 4,23

2 0,48 6,43 3,9 1,64

3 0,44 7,11 4 1,77

4 0,47 7,4 5,33 1,38

5 0,25 3,99 4,97 0,80

6 0,3 5,67 4,21 1,34

7 0,3 4,47 1,53 2,92

8 0,27 7,47 5,55 1,34

64


REOXIGENAÇÃO + GLICINA (G3) COM AS DOSAGENS DE PROTEÍNA E

MALONDIALDEÍDO HEPÁTICOS.


1 0,43 7,43 5,103 1,45

2 0,39 6,01 5,6826 1,05

3 0,29 7,4 5,44 1,36

4 0,4 5,84 6,73 0,86

5 0,42 4,62 5,99 0,77

6 0,44 4,77 16,45 0,28

7 0,26 1,97 17,42 0,11

8 0,31 3,96 9,07 0,43

9 0,43 9,17 21,68 0,42

10 0,28 1,83 15,82 0,11

Documents

GLICINA NA PREVENÇÃO DA LESÃO INTESTINAL DA … · enterocolitis lesions: experimental study on rats. 1. Intestino. 2. Glicina. 3. Enterocolite necrosante. 4. Rato. UNIVERSIDADE