Headline Goes Here - Waters Corporation · 2016. 7. 27. · 每年实验室溶剂和人力成本将节省 573,415.00元 ©2016 Waters Corporation 5 事：海正药业采用UPCC对某仿制药原料药进行分析方法验证,新药申报资料

©2016 Waters Corporation 1

沃特世科技（上海）有限公司

手性分离的最佳解决方案 —超临界流体色谱（SFC）

Ultra Performance Convergence Chromatography


手性化合物分离-联萘酚对映异构体

HPLC正相分离结果

时间长、峰形差

20min

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0

Rs=1.67NPLC

AU

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

Minutes

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0

Rs=2.61UPC2


手性化合物分离-联萘酚对映异构体

UPC2分离结果

3min


UPC2和正相分析的成本对比

成本计算

Waters UPC2 &

正相分离结果对比

系统名称 Waters UPC2 正相HPLC

单个样品的分析时间 5分钟 20分钟

仪器流速 1.6ml/min 2ml/min

流动相组成 CO2:正己烷/ 85：

15 几乎100%正己烷

一天可以分析样品的个数 180个 48个

分析每个样品的溶剂成本（正己烷 125元/升，CO2 5元/升

） 0.30元 7.5元

分析180个样品的人工成本（以100元/8小时计算）

100元 375元

每年分析样品的任务是65700个需要的仪器数量 1台 4台

每年溶剂的成本 19,710.00

元 492,750.00元

每年的人力成本 36,500.00

元 136,875.00元

每年实验室溶剂和人力成本将节省 573,415.00元


事件：海正药业采用UPCC对某仿制药原料药进行分析方法验证,新药申报资料已提交到国家新药审评中心,通过审批后UPCC将做为海正药业对于该仿制药原料药GMP放行方法

用户挑战：仿制药为典型的手性药物,用户在研发初期采用LC的分析方法,峰拖尾严重、分离度差、塔板数低、重现性差

沃特世方案：UPCC相对LC方法峰形尖锐，分离度和塔板数显著提高，重现性优异，分离时间和成本低五倍

2015UPCC在国内制药领域的突破


样品信息

A1

A2


色谱柱：SUPELCO CYCLOBOND I 2000 RSP，250*4.6 mm, 5 μm；

缓冲液：50 mM甲酸铵水溶液，氨水调节pH=7.5；

波长：225 nm；流速: 0.8ml/min; 柱温: 25℃；进样量: 5 μL；

稀释液：60%甲醇-水(先用1mlTHF溶解)

样品浓度: 0.4mg/ml；

•缓冲液：甲醇=45：55

min0 5 10 15 20 25

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

VWD1 A, Wavelength=225 nm (D:\DATA\BDKL-YGT-20140731 2014-07-31 15-08-21\201407310000002.D)

7.519

8.604

存在问题：分离度1.88，较小，理论塔板数均在3000以下，拖尾严重

客户采用条件


UPCC实验条件

检测器：ACQ-PDA

扫描波长范围：210 - 450nm

检测波长：225nm

色谱柱： Daicel-IC 手性柱(4.6*150mm, 3um)

柱温：35℃

Back pressure：2000psi

流动相：A：CO2，B：IPA/ACN=3:1+0.2%NH3.H2O ; 流速:2.5mL/min

梯度条件:


UPCC结果谱图


样品6针重现性谱图和结果



案例二：默沙东将UPCC用于GMP的QC方法







维生素异构体分析

维生素E主要有四种衍生物，按甲基位置分为α、β、γ和δ四种。

维生素E结构：

UPC2

流速 (mL/min) 2.5

流动相A/B CO2/甲醇（98:2至95:5，1.5min）

背压（psi） 1885

温度 (oC) 50

色谱柱 ACQUITY UPC2 BEH，3.0 x 100mm，1.7μm

前处理异辛烷溶解过滤直接进样

监测器 PDA


UPC2分析维生素E四种异构体


叶黄素（Xanthophyll ）

β-胡萝卜素（ β-Carotene）

玉米黄质（Zeaxanthin）

辣椒红素（Capsanthin）

隐黄质（ β-Cryptoxanthin）

五种结构类似色素的分析

挑战1：LC分析需要60分钟

挑战2：结构非常相似很难获得好的分离度


UPC2分析结果

β-胡萝卜素

隐黄质

叶黄素

玉米黄质

辣椒红素

5 min


维生素D代谢产物分析


LC-MS/MS分析

WAA05203:22:01

30-Jan-2012

Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50

%

0

100

Jan 28 DEQAS 405 2 Sm (Mn, 3x8) 2: MRM of 2 Channels ES+ 383.35 > 257.25 (25-OH-D3)

4.99e5Area

3.7346015

3.5439207

6.5

1. 异构体分离度不佳

2. 分析时间6.5分钟


UPC2 Xevo TQD分析

25 d3 0.5ng/ul in Waters Hexane MRM of 3epi25D3 in in 1min 2min run 100uL M/U CSH FP column

Time0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25

%

0

100

27July2012_069 Sm (Mn, 2x3) 1: MRM of 3 Channels ES+ 383.35 > 257.32 (25 D3 15v)

1.97e51.38

1.26 2.5

1. 异构体基线分离

2. 分析时间2.5分钟


手性农药残留分析

采用传统的正相条件分析手性化合物，面临以下挑战：

1、农残分析MRM质谱定量，正相溶剂的质谱兼容性差

2、正相分析方法的局限性：等度分析时间长、分离度不佳、方法重现性差

分析成本高，对环境和人体有害

三唑醇

﹡ ﹡


UPC2 MS MS分析结果

UPC2

流速

(mL/min) 2.5

流动相 CO2 : 甲醇

95:5\80:20(2min)

背压 2000psi

温度 (oC) 30

色谱柱 Chiralpak IC-3 4.6x150mm

进样体积 (µL) 2

电离模式： ESI+

MRM 296-〉70

三唑醇 UPC2-MS\MS 仪器方法

SZC_HG_1ppm

Time1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50

%

0

100

SZC-N18 MRM of 1 Channel ES+ 296 > 70 (SZC)

7.95e5

1.22296.0

1.80296.0

0.001ppb

0.03ppb

0.1ppb

3分钟完成定量分析

黄瓜基质加标样品分析结果


听沃特世讲过去的事情

什么是超临界流体

超临界流体是指物质在高于临界压力和临界温度时的一种物质状态，它既不是气体也不是液体


超临界流体具有接近气体的低黏度、类似液体的溶解性、接近于气体的高扩散性

超临界流体的性质


超临界流体色谱

超临界流体色谱理论由Klesper等在1961年首次提出

商品化仪器于上世纪80年代用于分析领域

超临界流体色谱：超临界流体做流动相,依靠流动相的溶剂化能力来进行分离、分析的色谱过程。

分离机理：吸附和解吸附，利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。

主要流动相：超临界CO2（化学惰性、温和临界状态、绿色环保、低成本、易获得）

改变选择性、溶解性, 改善峰形，可以适当加入一定量的不同极性的有机溶剂和缓冲盐。

辅助溶剂：

固定相：非极性和极性填料


正相色谱应用优缺点：选择性好（更多流动相和固定相供选择），有机溶剂直接进样工作流程简单；分离度、方法耐用性不佳，流动相价格昂贵毒性大，仅限于不挥发化合物，质谱兼容性有限

反相色谱应用优缺点：方法耐用性好，溶剂价格相对便宜毒性较小，质谱兼容性好；仅限于不挥发化合物，对脂溶性化合物、结构类似物分离有挑战

GC应用优缺点：气体流动相黏度低、扩散性好、分离效率高，可以利用长色谱柱；仅限于挥发性化合物，低挥发性化合物需要衍生，很难用于制备

SFC结合LC、GC优点

突破瓶颈的部分：

正相和反相流动相和固定相都可用选择性好（水为辅助溶剂比例通常要低于5%）；有机溶剂直接进样简化工作流程；流动相成本低、没有毒性；方法耐用性好，与各种质谱兼容；CO2的低黏度和高扩散性可获得分离的高效率；非挥发、挥发性化合物都适合

超临界流体色谱特点


SFC的瓶颈：

SFC技术对温度、压力稳定性控制要求很高，传统的SFC仪稳定性达不到，分离重现性和稳定性很差。

SFC技术对CO2泵和辅助溶剂泵的稳定性和精度要求高，传统的SFC仪的精度和稳定性不好，导致分离的重现性、稳定性和分离度不佳。


UPC2的突破：

UPC2继承了传统SFC的原理和所有优势。

UPC2采用沃特世成熟而稳定的硬件设计，保证了对温度和压力的精确而稳定的控制，以及CO2和辅助溶剂泵的精度，从而使色谱分离的重现性和稳定性达到最佳状态。

UPC2结合了UPLC技术，采用1.7um小颗粒技术，可以获得更高的分离度、灵敏度，更短的分离时间。


近距离走进UPC2

二元泵

样品管理器

UPC2

管理器

色谱柱管理器

监测器


Peak1 -

4.4

41

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.20

0.22

0.24

0.26

Minutes

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00

Injection RT 1 4.432 2 4.441 3 4.428 4 4.434 5 4.431 6 4.433 Mean 4.433 Std. Dev. 0.0044 % RSD 0.098

Isocratic 99.0% CO2 : 1.0% Methanol

Peak1 -

2.5

39

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.20

0.22

0.24

0.26

0.28

0.30

0.32

0.34

0.36

Minutes

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00



Peak1 -

1.8

06

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.20

0.22

0.24

0.26

0.28

0.30

0.32

0.34

0.36

0.38

0.40

0.42

0.44

0.46

Minutes

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00



Peak1 -

1.4

46

AU

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0.55

Minutes

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00



2.1X150 mm UPC2 Hybrid @ 1 mL/min

UPC2优秀的精密度、重现性


1-Coum

arin - 0

.840

2-Flav

one - 1

.116

3-Caffe

ine - 1

.247

4-Thym

ine - 1

.584 5-P

apaver

ine - 1

.664

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.20

0.22

0.24

Minutes

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70 1.80 1.90 2.00

1-Coum

arin - 0

.788

2-Flavo

ne - 1.

072

3-Caffe

ine - 1.

209

4-Thym

ine - 1.

559

5-Papa

verine

- 1.641

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.20

0.22

0.24

Minutes

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70 1.80 1.90 2.00

RT %RSD: <0.15 Area %RSD: <0.67

1-20% B back to 1% B

RT %RSD: <0.34 Area %RSD: <0.69

1.5-20% B back to 1.5% B

Viridis® BEH 2-Ethylpyridine, 3 x 100 mm, 1.7 µm 2.00 mL/min, 55 °C, 1958 psi (135 Bar)

Injection Volume = 3 µL, 10 repeated injections PDA 280 nm compensated (500-600 nm) 20 Hz, TC = 0.2 sec

UPC2优秀的精密度、重现性


八角茴香油的分析

30min

反式茴脑

GC分析

挑战1：分析时间太长

挑战2：蒸馏法不能获得期望的纯度，气相不能制备


UPC2分析

反式茴脑

分析时间2.5分钟

UPC2分析


UPC2分析结果放大到制备型SFC

循环进样模式，半天时间制备2.5克目标物

反式茴脑


纯化后的反式茴脑分析

反式茴脑


SFC 100 MS or UV Directed

Investigator

完备的SFC制备系统

Investigator

Prep 100 SFC

SFC 80

SFC 200

SFC 350

Scale mgs to grams to Kilo Grams


UPC² 简易性的工作流程： –缩短样品前处理和分析时间 o 有机溶剂/提取物可直接进样分析

UPC² 分离“相似”的化合物 –手性, 位置异构, 结构相似,共轭化合物

UPC² 的正交性 –实验室其他分析手段的补充 –更为全面的样品表征

如果您拥有了UPC²，您将得到…


UPC² 简易性的工作流程： –缩短样品前处理和分析时间 o 有机溶剂/提取物可直接进样分析

UPC² 分离“相似”的化合物 –手性, 位置异构, 结构相似,共轭化合物

UPC² 的正交性 –实验室其他分析手段的补充 –更为全面的样品表征

如果您拥有了UPC²，您将得到…

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Headline Goes Here - Waters Corporation · 2016. 7. 27. · 每年实验室溶剂和人力成本将节省 573,415.00元 ©2016 Waters Corporation 5 事 ： 海正药业采用UPCC对某仿制药原料药进行分析方法验证,新药申报资料

Headline Goes Here - Waters Corporation · 2016. 7. 27. · 每年实验室溶剂和人力成本将节省 573,415.00元 ©2016 Waters Corporation 5 事：海正药业采用UPCC对某仿制药原料药进行分析方法验证,新药申报资料