UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Marija Pešić

Histopatološke promene glomerula pacova

posle 30-dnevnog tretmana pirimetanilom

Master rad

Niš, 2019

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Master rad

Histopatološke promene glomerula pacova

posle 30-dnevnog tretmana pirimetanilom

Kandidat: Marija Pešić 270 Mentor: Dr Perica Vasiljević

Niš, 2019

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND EKOLOGY

Masterʼs thesis

Histopathological changes of rat glomeruli after

30 days of pyrimethanil treatment

Candidate : Marija Pešić 270 Mentor: PhD Perica Vasiljević

Niš, 2019

Biografija kandidata

Marija Pešić je rođena 4. januara 1995. godine u Nišu. Osnovnu školu ,,Branko

Miljković” u Nišu završava 2010. godine kao nosilac Vukove diplome. Iste godine upisuje

srednju medicinsku školu ,,Dr Milenko Hadžić” u Nišu, smer medicinka sestra-tehničar koju

završava 2014. godine kao nosilac Vukove diplome.

Nakon završetka srednje škole upisuje osnovne akademske studije Prirodno-

matematičkog fakulteta u Nišu na Departmanu za biologiju i ekologiju. Osnovne akademske

studije završava 2017. godine sa zvanjem Biolog. Iste godine upisuje master akademske

studije,smer biologija, koje završava 2019. godine sa zvanjem Master biolog.

ZAHVALNICA

Ogromnu zahvalnost dugujem mom mentoru profesoru Perici

Vasiljeviću na savetima, podršci, strpljenju i ukazanom poverenju

prilikom studiranja i izrade master rada.

Zahvaljujem koleginicama Aleksandri i Višnji na razumevanju,

savetima, i pomoći prilikom izrade master rada.

Neizmernu zahvalnost dugujem mojim roditeljima na ogromnoj

podršci, ljubavi i osloncu koje su mi pružili prilikom studiranja.

Sažetak

Cilj ovog rada je bio da se utvrdi uticaj pirimetanila na broj i građu glomerula pacova

soja Wistar posle 30-dnevnog tretmana. Pirimetanil je anilinopirimidinski fungicid koji se

koristi prvenstveno za kontrolu sive plesni na hortikulturalnim i ukrasnim kulturama. Pacovi

su tretirani fungicidom 30 dana oralno koncentracijama: 500 mg/kg, 750 mg/kg, 1000 mg/kg i

2000 mg/kg. Histološka analiza je obuhvatala merenje površine glomerula i kapsularnog

prostora i određivanje broja glomerula po vidnom polju i broja podocita po glomerulu. Kod

kontrolne grupe životinja tretirane fiziološkim rastvorom površina glomerula iznosi 6062,43 ±

647,00 μm ², najveća vrednost je zabeležena pri dozi od 1000 mg/kg i iznosi 6338,52 ± 411,82

μm ², dok je najmanja površina glomerula izmerena pri dozi od 2000 mg/kg i iznosi 5648,55 ±

452,72 μm ². Površina kapsularnog prostora kod kontrolne grupe životinja iznosi 1916,30 ±

342,54 μm ², najveća vrednost je zabeležena pri dozi pirimetanila od 750 mg/kg i iznosi

1989,03 ± 160,43 μm ², a najmanja pri dozi od 2000 mg/kg i iznosi 1860,60 ± 486,19 μm ².

Iako je došlo do smanjenja površine glomerula i kapsularnog prostora u odnosu na kontrolu

ANOVA ne pokazuje statistički značajnu razliku (p>0,05). Broj glomerula se sa povećanjem

doze pirimetanila smanjuje. Najveći broj glomerula se javlja u kontrolnoj grupi i iznosi 8,42 ±

0,82 glomerula po vidnom polju, dok se najmanji broj javlja pri dozi od 1000 mg/kg i iznosi

6,53 ± 0,42 glomerula po vidnom polju. ANOVA pokazuje statističku značajnost dobijenih

rezultata (p<0,05). ANOVA je praćena t-testom koji pokazuje statistički značajnu razliku

između kontrolne grupe životinja i grupa tretiranih koncentracijama 500 mg/kg, 750 mg/kg i

1000 mg/kg (P<α/3), dok ne postoji statistički značajna razlika između kontrolne i grupe

tretirane dozom od 2000 mg/kg (P>α/3). Broj podocita po glomerulu se nije mnogo menjao

pod uticajem različitih doza pirimetanila. U kontrolnoj grupi broj podocita je 45,73 ± 7,63

podocita po glomerulu, najveća vrednost se javlja pri dozi od 1000 mg/kg i iznosi 50,90 ± 3,07

podocita po glomerulu dok je najmanja vrednost zabeležena pri dozi od 750 mg/kg i iznosi

45,07 ± 12,16 podocita po glomerulu. ANOVA nije pokazala statistički značajnu razliku

(p>0,05).

Istraživanje je pokazalo da pirimetanil nakon 30-dnevnog tretmana dovodi do promene

u broju i građi glomerula.

Ključne reči: glomerul, pirimetanil, pacov, Wistar.

Abstrakt

The aim of this study was to determine the effect of pyrimethanil on the number and

structure of glomeruli of Wistar rats after 30 days of treatment. Pyrimethanil is an

anilinopyrimidine fungicide used primarily to control gray mold on horticultural and

ornamental crops. Rats were treated with fungicide for 30 days orally at concentrations of 500

mg/kg, 750 mg/kg, 1000 mg/kg and 2000 mg/kg. Histological analysis included measuring the

glomerular surface and capsular space and determining the number of glomeruli per field of

view and the number of podocytes per glomerulus. In the control group of saline treated

animals, the glomerulus area was 6062.43 ± 647.00 μm², the highest value was recorded at the

dose of 1000 mg/kg and was 6338.52 ± 411.82 μm², while the smallest glomerular surface was

measured at the dose of 2000 mg/kg and was 5648.55 ± 452.72 µm². The area of the capsular

space in the control group of animals was 1916.30 ± 342.54 μm², the highest value was

recorded at a dose of pyrimethanil 750 mg/kg and was 1989.03 ± 160.43 μm², and the smallest

at a dose of 2000 mg/kg was 1860.60 ± 486.19 μm². Although there was a decrease in

glomerular surface and capsular space relative to the control ANOVA did not show a

statistically significant difference (p>0.05). The number of glomeruli decreases with increasing

dose of pyrimethanil. The largest number of glomeruli occurred in the control group and

amounted to 8.42 ± 0.82 glomeruli per field of view, while the smallest number occurred at the

dose of 1000 mg/kg and was 6.53 ± 0.42 glomeruli per field of view. ANOVA showed

statistical significance of the obtained results (p<0.05). The ANOVA was followed by a t-test

showing a statistically significant difference between the control group of animals and the

groups treated with concentrations of 500 mg/kg, 750 mg/kg and 1000 mg/kg (P<α/3), while

there was no statistically significant difference between the control and groups treated with a

dose of 2000 mg/kg (P>α/3). The number of podocytes per glomerulus did not change much

under the influence of different doses of pyrimethanil. In the control group, the number of

podocytes is 45.73 ± 7.63 podocytes per glomerulus, the highest value occurs at a dose of 1000

mg/kg and is 50.90 ± 3.07 podocytes per glomerulus, while the lowest value is recorded at a

dose of 750 mg/kg and is 45.07 ± 12.16 podocytes per glomerulus. ANOVA showed no

statistically significant difference (p>0.05).

The study showed that after 30 days of treatment, pyrimethanil leads to a change in the

number and structure of glomeruli.

Keywords: glomerul, pyrimethanil, rat, Wistar.

Sadržaj:

1. UVOD ................................................................................................................................................. 1

1.1. Fungicidi ..................................................................................................................................... 1

1.1.1. Istorijski razvoj fungicida .................................................................................................. 1

1.1.2. Podela fungicida .................................................................................................................. 2

1.1.3. Toksičnost fungicida ........................................................................................................... 4

1.1.4. Anilinopirimidini ................................................................................................................. 4

1.1.4.1. Pyrus 400SC ................................................................................................................. 5

1.1.4.2. Pirimetanil .................................................................................................................... 6

1.1.4.2.1. Način delovanja pirimetanila ............................................................................... 6

1.1.4.2.2. Toksičnost pirimetanila ........................................................................................ 7

1.2. Bubreg ......................................................................................................................................... 8

1.2.1. Funkcije bubrega ................................................................................................................ 9

1.2.2. Građa bubrega .................................................................................................................... 9

1.2.2.1 Nefron ........................................................................................................................... 11

1.2.3. Značajnost istraživanja bubrega u toksikologiji ............................................................ 15

1.2.4. Izlučivanje toksina putem bubrega ................................................................................. 16

1.2.5. Toksično delovanje otrova na bubrege ........................................................................... 16

1.2.5.1. Biohemijski mehanizmi nefrotoksičnosti ................................................................. 17

1.2.5.1.1. Oksidativni stres .................................................................................................. 17

1.2.5.1.2. Povećanje koncentracije Ca⁺⁺ u ćeliji ................................................................ 17

1.2.5.1.3. Poremećaji funkcije mitohondrija ..................................................................... 18

1.2.5.1.4. Održavanje zapremine ćelija i homeostaza jona .............................................. 18

1.2.5.2. Akutno i hronično oštećenje bubrega ....................................................................... 18

1.2.6. Mehanizmi kompenzacije i adaptacije bubrega na oštećenja nastala pod uticajem

otrova ........................................................................................................................................... 19

2. Cilj rada ........................................................................................................................................... 20

3. Materijal i metode ........................................................................................................................... 21

3.1. Materijal ................................................................................................................................... 21

3.2. Metode ....................................................................................................................................... 21

3.2.1. Tretiranje eksperimentalnih životinja fungicidom u konstantnim eksperimentalnim

uslovima i žrtvovanje životinja .................................................................................................. 21

3.2.2. Priprema tkiva................................................................................................................... 22

3.2.2.1. Fiksacija tkiva ............................................................................................................ 22

3.2.2.2. Dehidratacija tkiva .................................................................................................... 22

3.2.2.3. Kalupljenje tkiva ........................................................................................................ 23

3.2.2.4. Sečenje tkiva i izrada trajnih preparata .................................................................. 25

3.2.3. Bojenje preparata ............................................................................................................. 25

3.2.3.1. Hematoksilin - eozin bojenje ..................................................................................... 25

3.2.4. Posmatranje preparata pod mikroskopom i statistička obrada rezultata ................... 26

4. Rezultati i diskusija ......................................................................................................................... 27

4.1 Histološka građa ........................................................................................................................ 27

4.2. Morfometrija ............................................................................................................................ 32

5. Zaključak ......................................................................................................................................... 35

6. Literatura......................................................................................................................................... 36

1

1. UVOD

1.1. Fungicidi

Fungicidi su neorganska, organska, biotehnička, biotehnološka jedinjenja, ili živi

organizmi (gljive, bakterije, virusi) koji sprečavaju klijanje spora, usporavaju vegetativni

porast, ili ih u potpunosti uništavaju (Vuković, 2014).

Sama reč fungicid potiče od latinskih reči fungus - gljiva i cedere - ubiti. Većina

fungicida poseduje i baktericidno dejstvo ali ima i izuzetaka. Zato se pod pojmom fungicid

podrazumevaju i jedinjenja koja deluju i na bakterije. Kada su u pitanju fungicidi razlikujemo:

fungicidno i fungistatično delovanje. U prvom slučaju se radi o jedinjenjima koja izazivaju

potpuno uginuće gljiva, a u drugom o jedinjenjima koja samo zaustavljaju rast gljiva. Kod

nekih fungicida i sama koncentracija utiče na to koje dejstvo će biti ispoljeno, odnosno jedno

isto jedinjenje može ispoljiti u nižoj koncentraciji fungistatično, a u višoj fungicidno dejstvo. I

fungistatično delovanje se u praksi, u pojedinim slučajevima, može uspešno koristiti. U nekim

slučajevima je dovoljno da se postigne fungistatično delovanje jer se tako patogena gljiva

privremeno zaustavlja u rastu pa ne može inficirati biljku. Dok se gljiva oporavi i počne da

raste, biljka je već prošla fazu kojoj je gljiva može inficirati (Vojinović, 2011).

1.1.1. Istorijski razvoj fungicida

Za razvoj primene fungicida navode se tri vremenska perioda.

1) Prvi period ili „Sumporna era“, od praistorije do 1882. godine.

Hiljadu godina pre nove ere, Homer je govorio o sumporu kao sredstvu protiv bolesti.

Kasnije, pored sumpora, Demokrit i Plinije mlađi preporučili su primenu taloga koji se dobija

ceđenjem maslinovog ulja za suzbijanje plamenjače (Vojinović, 2011).

U XVII veku, navode se podaci o dezinfekciji semena pšenice protiv prouzrokovača

glavnice primenom hlorida. U sledećem, XVIII veku, preporučuje se impregnacija drveta

živinim sublimatom, a dezinfekcija semena pšenice obavlja se bakarnim sulfatom. U XIX veku

sumpor se masovno primenjuje za suzbijanje pepelnice na breskvi i na vinovoj lozi, a takođe i

protiv prouzrokovača kovrdžavosti lista breskve. Upravo ovaj period se karakteriše relativno

zastupljenom primenom sumpora, naročito tokom XIX veka (Vojinović, 2011).

2) Drugi period ili „Period bakra“, od 1882. do 1934. godine.

Iako je bakar, kao bakarni sulfat preporučivan u XVIII veku (1761, 1783, i 1799.

godine), a takođe i u XIX veku ( 1845, 1866, 1873. godine) kao početak ovog perioda se

označava 1882. godina, kada je francuski istraživač, botaničar, Millardet utvrdio fungicidno

dejstvo mešavine bakra i kreča (Vojinović, 2011).

2

S obzirom da je to bio početak intenzivne i veoma masovne primene jedinjenja na bazi

bakra, razumljivo je što je on vezan za ime istraživača Millardeta (1838-1902). Njegovi

rezultati su u značajnom stepenu uticali ne samo na masovnu primenu jedinjenja na bazi bakra,

već i na razvoj hemijskog suzbijanja biljnih bolesti, a takođe i na industrijsku proizvodnju

fungicida i drugih pesticida (Vojinović, 2011).

3) Treći period ili „Period organskih fungicida“, posle 1934. godine.

Sve intenzivnji razvoj naučno istraživačkog rada u oblasti hemijskog suzbijanja štetnih

bioloških agenasa, uslovljen neophodnošću masovne primene fungicida, doprineo je otkrivanju

novog jedinjenja, prvo na bazi ditiokarbaminske kiseline, a zatim i čitavog niza drugih

jedinjenja, koja se ne primenjuju samo u agronomiji i šumarstvu, kao što je to bio slučaj sa

jedinjenjima na bazi sumpora, bakra i žive, već i u drugim oblastima ljudske delatnosti

(stočarstvo, prehrambena industrija, komunalna higijena, tekstilna industrija, elektronska i

farmaceutska industrija, građevinarstvo, brodogradnja i dr.) (Vojinović, 2011).

1.1.2. Podela fungicida

Podela fungicida se može izvršiti na osnovu nekoliko kriterijuma.

1) Prema hemijskom sastavu fungicidi se dele na:

- neorganske;

- organske.

Od XVII veka započinje „neorganska era“, odnosno primena neorganskih jedinjenja

(arsen, živin sublimat, bakar-sulfat itd.). Tokom XIX veka počinju se intenzivno primenjivati

sumpor i bakar, a 1882. godine, pronalazak „Bordovske čorbe“ predstavlja i početak

industrijske proizvodnje fungicida. Četrdesetih godina XX veka počinje era organskih

fungicida (Vuković, 2014).

2) Prema delovanju na parazite (gljivu, bakteriju) fungicidi mogu biti:

- preventivni (protektivni) - suzbijaju patogena pre ostvarene infekcije;

- kurativni - suzbijaju patogena posle ostvarene infekcije;

- eradikativni - sprečavaju sporulaciju patogena.

Savremeni fungicidi mogu ispoljavati jedno od pomenutih načina delovanja, dva ili

ispoljavaju sve pomenute (Inđić i Vojinović, 2012).

U grupu preventivnih (protektivnih) fungicida spada većina fungicida. Oni štite biljku

da ne dođe do zaraze. Ovim fungicidima nije moguće lečiti obolelu biljku, odnosno kad je

izmedju biljke i parazitske gljive došlo do kontakta i kada se bolest razvila u biljci. Osnova za

primenu preventivnih fungicida je poznavanje biologije parazita i prognoza njihove pojave.

Drugi nedostatak protektivnih fungicida je što se oni nalaze na površini biljnih organa, pa ih

različiti spoljni faktori (kiša, sunce) isperu i tako degradiraju. Zato se na biljkama stalno mora

održavati određena koncentracija fungicida (depozit), što znači da se tretiranja moraju

3

ponavljati sve dok traje, u toku vegetacije, opasnost od prouzrokovača određene bolesti

(Vojinović, 2011).

Fungicidi sa kurativnim delovanjem deluju u inkubacionom periodu, između infekcije

i reprodukcije (stvaranja spora) (Soldatović i dr, 1980). Takvi fungicidi su nezavisni od

meteoroloških faktora, a deluju i terapeutski, jer leče biljku od hifa gljiva koje se nalaze u biljci

(Vojinović, 2011). Pri ostvarenoj infekciji, ciljanom primenom fungicida koji ispoljava

kurativno delovanje, odnosno prodorom u sporu ili miceliju gljive, one bivaju uništene

(usmrćene) (Inđić i Vojinović, 2012).

Fungicidi sa eradikativnim delovanjem deluju u periodu pred završetak inkubacionog

perioda, tj. u periodu nastajanja spora, kad jedinjenja sa kurativnim delovanjem nisu više

efikasna, jer uništavaju samo spore, ali ne i micelijum gljive (Soldatović i dr, 1980).

3) Prema načinu delovanja u odnosu na biljke fungicidi se mogu podeliti na:

- kontaktne - površinske, nesistemične (ne kreću se u biljci);

- sistemične, translokacione (ascedentno, descedentno kretanje u biljci);

- ograničene sistemike, lokalsistemike (kreću se ograničeno u biljci, oko mesta primene u

okviru lista) (Vuković, 2014).

Kontaktni fungicidi deluju na mestu kontakta. Oni se ne transportuju u biljci. U tkivu u

kom se nalaze deluju fungicidno i fungistatično na hifu od infekcie do frutifikacije (Vojinović,

2011). Sistemični fungicidi prodiranjem u biljku dospevaju do fitopatogenih gljiva, uništavaju

ih ili ometaju njihov dalji razvoj. Oni dospevaju u biljku preko korena ili nadzemnih delova i

vaskularnim sistemom se raznose po celoj biljci. Nedostaci upotrebe ovih fungicida su teškoće

usklađivanja koncentracija potrebnih za fungicidni efekat, a istovremeno podnošljivih za

biljku, kao i problem njihove stabilnosti u zemljištu. Poseban značaj korišćenja sistemičnih

fungicida se ogleda u lečenju biljnih oboljenja kod kojih su ektoterapijska sredstva bez efekata,

jer se prouzrokovač oboljenja već razvio u biljci (nekroza, uvenuće, sušenje bljke) (Soldatović

i dr, 1980). Sistemični fungicidi imaju neke prednosti u odnosu na kontaktne, ali treba ih

koristiti racionalno. Posledica česte primene ovih fungicida je stvaranje sojeva gljiva

rezistentnih na određena jedinjenja, čime se smanjuje aktivnost fungicida. Zbog toga

sistemične fungicide treba primenjivati samo kada obezbeđuju prednost u odnosu nesitemike

(kišni period, visoki pritisak infekcionog materijla). Treba ih primenjivati naizmenično sa

fungicidima koji ispoljavaju površinsku aktivnost, ili sa sistemičnim fungicidima koji imaju

različit mehanizam dejstva, kako bi se vek upotrebe određenih fungicida produžio (Vuković,

2014).

4) Prema načinu primene fungicidi se dele na:

- fungicide ze tretiranje semena, lukovica, rizoma, gomolja;

- fungicide za suzbijanje prouzrokovača oboljenja u zemljištu;

- fungicide ze tretiranje nadzemnih delova biljaka - folijarna primena (Vuković, 2014).

5) Prema patogenima koje suzbijaju fungicidi mogu biti:

- tileticidi (suzbijaju patogene roda Tilletia);

4

- venturicidi (suzbijaju patogene roda Venturia);

- botricidi (suzbijaju patogene roda Botrytis) (Vuković, 2014).

1.1.3. Toksičnost fungicida

Većina fungicida ima nisku do umerenu toksičnost. Zabeležen je samo mali broj

smrtnih slučajeva povezanih sa pesticidima od strane fungicida. Neki fungicidi narušavaju

endokrini sistem i mogu dovesti do poremećaja reprodukcije i razvoja (Gypta, 2018). Neki

fungicidi su opasni po ljudsko zdravlje kao što je vinclozolin, koji je uklonjen iz upotrebe

(Hrelia, 1996).

Procenjeno je da 80% svih onkogenih rizika od upotrebe pesticida dolazi od samo

nekoliko fungicida. Fungicidi su odgovorni za samo 5% smrtnih slučajeva koji su povezani sa

pesticidima (Rouabhi, 2010).

Fungicidi se veoma razlikuju u njihovom potencijalu za izazivanje štetnih efekata kod

ljudi. U istoriji su neke od najtragičnijih epidemija nastale zbog pogrešne upotrebe semena koja

su tretirana organskom živom ili heksahlorobenzenom. Pored sistemskih trovanja fungicidi kao

klasa izazivaju iritativne povrede kože i sluznica i dermalnu senziblizaciju (Roberts and

Reigart, 2013).

1.1.4. Anilinopirimidini

Anilinopirimidini su fungicidi koji ometaju biosintezu metionina i drugih

aminokiselina i inhibiraju izlučivanje hidrolitičkih enzima (pektinaze, celulaze i proteaze) koji

su povezani sa patogenezom, ali njihovo primarno mesto delovanja još nije poznato. Dokazana

je unakrsna rezistencija između jedinjenja ove grupe (Petsikos-Panayotarou et al., 2003).

Anilinopirimidini imaju malo efekata na klijanje spora, ali snažno inhibiraju rast

micelije. Zbog toga što se sistemski premeštaju kroz biljno tkivo, oni se koriste i kao zaštitna

sredstva i kao lek (Kanetis et al., 2007).

Anilinopirimidini (pirimetanil, ciprodinil, melampirum) su fungicidi visoke

efikasnosti u suzbijanju brojnih askomiceta. Na siromašnim hranljivim podlogama ova

jedinjenja pri veoma malim koncentracijama snažno inhibiraju i klijanje konidija i rast micelije.

Na kompleksnim podlogama bogatim hranljiivim materijama toksičnost je varijabilna, jer su

gljivi dostupna jedinjenja koja utiču na toksičnost anilnopirimidina. Druga zajednička

karakteristika svih anilinopirimidina je inhibicija sekrecije hidrolitičkih enzima patogenih

gljiva (celulaza, kutinaza, lipaza, proteaza) neophodnih za ostvarenje infekcije. Tačan

mehanizam uticaja anilinopirimidina na sintezu proteina nije poznat (Tanović et al., 2011).

5

1.1.4.1. Pyrus 400SC

Pyrus 400SC je sistemični i protektivni fungicid koji je namenjen suzbijanju

prouzrokovača sive truleži vinove loze (Botrytis cinerea) kao i prouzrokovača krastavosti ploda

jabuke (Venturia inaequalis). Deluje tako što inhibira sintezu metionina što dovodi do

sprečavanja lučenja enzima nephodnih za infekciju i prodor micelije u ćeliju biljke domaćina.

Aktivna materija je pirimetanil (https://www.agromarket.rs/srb/proizvod/70/Fungicidi/PYRUS-400-

SC ).

Slika 1.1. Botrytis cinerea pod

mikroskopom

(http://bioref.lastdragon.org/anamorphic_fungi

/Botrytis_cinerea.html)

Slika 1.2. Venturia inaequalis pod

mikroskopom (http://coinme.pw/apple-scab-

conidia.html)

6

1.1.4.2. Pirimetanil

Pirimetanil (4,6-dimethyl-N-phenyl-2-pyrimidinamine) (Navalon et al., 2002) je

predstavljen 1990. godine i klasifikovan od strane USEPA kao fungicid smanjenog rizika koji

se koristi prvenstveno za kontrolu sive plesni koju izaziva Botrytis cinerea, na hortikulturalnim

i ukrasnim kulturama (Smilanick et al., 2006). Registrovan 1998. godine za kontrolu sive plesni

u Kini (Sun et al., 2010).

Slika 1.3. Struktura pirimetanila (https://www.fishersci.co.uk/shop/products/metabolite-

pyrimethanil-cyclohexane-100-g-ml/12976533)

Pirimetanil je anilinopirimidinski fungicid koji je posebno aktivan protiv sive plesni

(Botrytis cinerea), čađave krastavosti (Venturia inaequalis i Venturia pirina) na grožđu,

jagodama, paradajzu, voću, povrću, ukrasnim biljkama u plastenicima i na otvorenom prostoru

(Kinani et al., 2013).

Razvijen je kao folijarni fungicid za kontrolu sive plesni (Botrytis cinerea) na grožđu,

voću i povrću. Pirimetanil je visoko efikasan protiv svih sojeva Botrytis-a i nije pokazao

unakrsnu rezistenciju na komercijalno dostupne botricide (Neumann, et al., 1992).

1.1.4.2.1. Način delovanja pirimetanila

Pirimetanil deluje tako što inhibira sekreciju enzima koji razgrađuju ćelijski zid od

strane Botrytis-a, i na taj način deluje kao inhibitor patogeneze. Pirimetanil deluje i kao zaštitno

sredstvo i kao lek. Kada se prskanje sadnice jabuka vremenski podudara sa ključnim fazama

diferencijacije u ranoj patogenezi V. inaequalis, pokazano je da pirimetanil zaustavlja razvoj

V. inaequalis u trenutku kada patogen počinje brzo da se širi iz diskretne primarne

subkutikularne rezerve. Ovaj način delovanja takođe omogućava anitisporulativnu aktivnost

pirimetanila kada se primenjuje pre nego što se pojave simptomi, što posledično sprečava

nastanak lezije (Daniels et al., 1994).

Efekat pirimetanila na nivou ćelijskog zida je takav da degradira enzime koje izlučuje

Botrytis cinerea. Nije primećena značajna inhibicija rasta kod upotrebe različitih koncentracija

pirimetanila. Pirimetanil ne inhibira enzime direktno, niti inhibira sintezu citosolnih proteina,

zbog čega se smatra da pirimetanil inhibira izlučivanje proteina u posttranslacionoj fazi

sekretornog puta (Milling and Richardson, 1995).

7

1.1.4.2.2. Toksičnost pirimetanila

Pirimetanil ispoljava toksičnost na sledeći način:

1. Akutna toksičnost:

- oralna LD-50: za pacova 4,150-5,971 mg/kg, za miša 4,665-5,359 mg/kg;

- dermalna LD-50: za pacova (oba pola) > 5000 mg/kg;

- inhalaciona LC-50: za pacova (oba pola) > 1,98 mg/l.

2. Hronična toksičnost:

- NOEL: za pacova (oba pola) >17-22mg/dan, za miša 20-25 mg/kg/dan;

- ADI: za čoveka 0,06 mg/kg/dan (Mitić, 1998).

Ekotoksičnost pirimetanila:

1) Toksičnost za organizme u vodi:

- EC-50 : za alge 1,20 mg/l;

- EC-50 : za dafnije 2,9 mg/l;

- LC-50 : za ribe: šarana: 35,3 mg /l, pastrmka 10,5 mg/l.

2) Toksičnost za ptice (LD-50): za patku i prepelicu > 2000 mg/kg.

3) Toksičnost za pčelu (oralna i kontaktna LD-50) >100 μg/pčela.

4) Toksičnost za organizme u zemljištu:

- LC-50 za kišnu glistu 625 mg/kg zemljišta (Mitić, 1998).

Nisu zapaženi štetni efekti na ljudima tokom primene. Ispitivanje genotoksičnosti ne

ukazuje na štetna delovanja (kancerogenost, mutagenost, teratogenost), kao ni na reproduktivni

ciklus. Ne iritira kožu i ne deluje nadražajno na sluznicu oka (Mitić, 1998).

Procena toksičnog efekta pirimetanila je vršena ispitivanjem oštešećenja DNK u

mononuklearnim leukocitima farmera koji su bili izloženi ovom fungicidu. Nije primećen

značajan efekat na vitalnost ćelija niti na hematološke parametre (Lebailly et al., 1998).

Fungicid dat oralno pacovima se brzo apsorbuje i ekskretuje iz organizma pacova, oko

72% za 96 sati. Podleže aromatičnoj oksidaciji do fenola i konjugaciji sa glukoronskom

kiselinom i sulfatima i kao takav se ekskretuje putem urina. Najveće koncentracije pirimetanila

se održavaju u tkivima bubrega, jetre, štitne i nadbubrežne žlezde, slezine i jajnicima (Dellarko,

2007)

8

1.2. Bubreg

Bubrezi su parni organi koji se nalaze u retroperitonealnom prostoru, na zadnjem zidu

trbušne duplje, omotani masnim tkivom. Dužina bubrega je 10-12 cm, širina 5-6 cm, a debljina

3-4 cm. Težina jednog bubrega iznosi 120-150 gr. Bubreg ima dve strane: facies anterior i

facies posterior; dve ivice: margo medialis i margo lateralis; i dva pola: extremitas superior s.

cranialis i extremitas inferior s. caudalis. Spoljašnja ivica bubrega je konveksna, dok je

unutrašnja ivica konkavna. Na unutrašnjoj ivici bubrega se nalazi otvor, hilus renalis, preko

koga u bubreg ulaze arterije i živci, a izlaze vena, limfni sudovi i ureter (Mršević i Popović,

1979).

Bubreg je po površini omotan tankim ali snažnim vezivno-tkivnim omotačem. Tkivo

bubrega okružuje široku šupljinu, Sinus renalis, u kojoj je smeštena bubrežna karlica, Pelvis

renalis. Bubrežna karlica ima oblik levka i nastavlja u bubregu gornji kraj uretera. Sa šireg

kraja bubrežne karlice pružaju se 3-4 velika izvrata - velike čašice, Calices majores, a od ovih

7-14 manjiih izvrata - male čašice, Calices minores. Šupljinu sinusa oko bubrežne karlice

ispunjava rastresito, vezivno i masno tkivo kroz koje prolaze krvni sudovi i živci na svom putu

za bubrežni parehim (Mršević i Popović, 1979).

Bubrezi su priljubljeni uz bok kičmenog stuba u visini XII grudnog i I i II slabinskog

pršljena. Oni leže koso, tako da su uzdužne ose oba bubrega upravljene koso nagore i unutra

(rastojanje između gornjih polova iznosi oko 7 cm, a između donjih polova oko 12 cm). Desni

bubreg leži nešto niže od levog bubrega (oko 1,25 cm) (Mršević i Popović, 1979).

Bubreg je najvažniji organ mokraćnog sistema - Apparatus uropoeticus-a, koji ima

ulogu da prečišćava krv od raznih produkata metabolizma i da reguliše koncentraciju mnogih

sastavnih delova telesne tečnosti. Sem ekskrecione bubreg ima i endokrinu ulogu. Bubreg

stvara i luči u krvotok jedan humoralni agens, koji utiče na eritropoezu (eritropoetin), i drugi,

koji utiče na krvni pritisak (renin) (Mršević i Popović, 1979).

Ekskretorna i regulatorna funkcija bubrega postiže se zajedničkom saradnjom triju

odvojenih procesa. Prvi od ova tri procesa je filtracija, koja se odigrava na nivou glomerula

bubrega; drugi je selektivna resorpcija različitih materija iz glomerularnog ultrafiltrata za

vreme dok ultrafiltrat prolazi kroz pojedine segmente nefrona; a treći proces se sastoji u

sekreciji različitih supstanci u ultrafiltrat putem epitelnih ćelija nefrona. Tečnost koja napušta

mokraćni sistem je rezultat ovih triju procesa i naziva se mokraća. Kod čoveka u toku 24 sata

biva profiltrirano preko bubrežnih korpuskula u lumen nefrona 150-180 litara ultrafiltrata, od

čega se stvori samo 1-2 litara mokraće, dok preostali, najveći deo ultrafiltrata biva resorbovan

od strane epitelnih ćelija zida nefrona i vraćen krvotoku (Mršević i Popović, 1979).

9

1.2.1. Funkcije bubrega

Najznačajnija funkcija bubrega je održavanje adekvatnog balansa vode i elektrolita.

Održavanjem adekvatnih koncentracija u vodi rastvorenih materija daje se doprinos održavanju

homeostatskih uslova unutrašnje sredine (Veljković, 2012).

Bubreg svojom aktivnošću održava ravnotežu između unosa i eliminacije pojedinih

materija, odnosno elektrolita. Ako se eliminacija neke materije umanji i bude niža od unosa,

količina te materije će se povećati. Važi i obrnuto. (Veljković, 2012).

Podešavanjem eliminacije pojedinih neorganskih jona (Na, K, Ca, Cl, ...), bubreg

održava osmolarnost plazme u fiziološkim granicama. Bubreg podešava sastav ECT i plazme

regulišući obim eliminacije pojedinih materija. Smanjujući obim eliminacije materija čija je

koncentracija snižena, bubreg daje doprinos konzervaciji tih materija (Veljković, 2012).

Pored održavanja osmolarnosti plazme i ECT, bubreg održava stalnim i volumen ovih

prostora. Time se omogućava normalno funkcionisanje KVS i normalno snabdevanje krvlju i

hranljivim materijama svih naših tkiva (Veljković, 2012).

Bubreg ima važnu ulogu u eliminaciji pojedinih nepotrebnih metaboličkih produkata

(ureja, kreatinin, urati, sulfati, metaboliti hemoglobina). Pored ovih produkata, bubreg daje

značajan doprinos ukljanjanju materija koje se koriste u prehrambenoj industriji kao aditivi i

lekova i njihovih metabolita (Veljković, 2012).

Bubreg je organ koji ima važnu endokrinu ulogu. Bubreg doprinosi eliminaciji brojnih

hormona (posebno hormona sa relativno malom molekulskom težinom). Značajnija endokrina

uloga bubrega se ogleda u tome što je on mesto gde se pojedini hormoni sintetišu ili je jedan

segment njihovog stvaranja vezan za bubreg. U bubregu se sintetiše eritropoetin, hormon bitan

za produkciju crvenih krvnih zrnaca (Veljković, 2012).

U bubregu se oslobađa renin, enzim koji participira u stvaranju angiotenzina II (i

aldosterona), hormona koji učestvuju u regulaciji krvnog pritiska i balansu Na⁺ i K⁺. Enzimi

bubrega pomažu pri pretvaranju vitamina D3 u kalcitriol. Kalcitriol je odgovoran za balans

kalcijuma (Veljković, 2012).

Bubrezi doprinose regulaciji acidobazne ravnoteže. Kada se pH ekstracelularne tečnosti

kreće ka acidozi, bubrezi eliminišu H⁺ jone i zadržavaju HCO3⁻. Kada procesi idu u suprotnom

smeru - ka alkalozi, bubrezi eliminišu HCO3⁻ i zadržavaju H⁺ jone. Na taj način bubrezi

koriguju acidobazne poremećaje (Veljković, 2012).

1.2.2. Građa bubrega

Bubreg (slika 1.4) gradi bubrežno tkivo, ili bubrežni parenhim, koji je u potpunosti

obavijen tankim omotačem, izgrađenim od fibroznog vezivnog tkiva, koji se naziva fibrozna

10

čaura (capsula fibrosa). Na preseku bubrega mogu se makroskopski razlikovati dva dela

bubrežnog parenhima: centralni deo koji opkoljava bubrežni sinus sive je boje i naziva se srž

bubrega (medulla renis), i drugi, periferni deo crevenkasto smeđe boje, koji predstavlja koru

bubrega (cortex renis) (Draganić i dr. 1991).

Slika 1.4. Građa bubrega (https://www.researchgate.net/figure/Anatomy-of-the-human-kidney-cut-

to-show-internal-structures-Arteries-and-veins-are_fig1_308433714)

Srž bubrega (medulla renis), grade Malpigijeve bubrežne piramide (pyramides

renales), kojih u jednom bubregu ima obično 8-10 (sa varijacijama od 8-18). Na frontalnom

preseku bubrega one imaju izgled trougla, čiji je vrh upravljen ka bubrežnom sinusu, a baza

okrenuta ka spoljašnjoj ivici bubrega (Draganić i dr. 1991).

Vrhovi Malpigijevih piramida prodiru u bubrežni sinus, prouzrokujući na njegovim

zidovima ispupčenja zvana bubrežne kvržice (papillae renales). Na svakoj od papila nalazi se

15-20 tačkastih papilarnih otvora (foramina papillaria), koji na vrhu piramide formiraju

rešetkasto polje (area cribrosa) (Draganić i dr. 1991).

U bubrežnom sinusu leže početni delovi mokraćnih izvodnih kanala, tj. male i velike

čašice i deo bubrežne karlice. Vrh Malpigijeve piramide, tj. renalna papila prodire u šupljinu

jedne male čašice (calix minor). Mokraća, koja nadolazi kroz kanaliće unutar Malpigijeve

piramide, izliva se kroz papilarne otvore na vrhu piramide u šupljinu male čašice (Draganić i

dr. 1991).

11

Medijalno, po sredini bubrega se nalazi renalni hilus. Renalni hilus je visok 3-4 cm, a

širok oko 1cm. Kroz hilus prolaze: renalna arterija i vena, limfni sudovi bubrega, vegetativni

živčani splet i bubrežna karlica (Veljković, 2012).

Bubrezi dobijaju krv preko renalne arterije. Renalna arterija se grana na: interlobarne

arterije, arkuatne arterije, interlobulske arterije i aferentne arteriole. Aferentna arteriola se u

glomerulu grana na glomerulske kapilare. Krv iz glomerulskih kapilara se odvodi eferentnom

arteriolom. Iz eferentne arteriole se odvaja sekundarna kapilarna mreža - mreža peritubulskih

kapilara. Venski sudovi prate paralelno arterijske sudove (interlobularne vene, arkuatne vene,

interlobarne vene i renalna vena) (Veljković, 2012)

Bubrežni parenhim grade mokraćni kanalići, vezivno tkivo, krvni sudovi i živci.

Mokraćni kanalići, sadržani u bubrežnom parenhimu, imaju svoja dva segmenta, koja se

razlikuju u morfološkom i u funkcionalnom smislu. Početni deo mokraćnih kanalića

predstavljaju nefroni, u kojim se stvara mokraća, dok završni deo mokraćnih kanalića

predstavljaju sabirni i papilarni kanali, koji u uglavnom služe za odvođenje mokraće do malih

bubrežnih čašica. Nefroni se nalaze delom u korteksu a delom u meduli, dok se odvodni

kanalići nalaze celom dužinom u bubrežnoj meduli (Draganić i dr. 1991).

1.2.2.1 Nefron

Nefron (slika 1.5) predstavlja funkcionalnu, sekretornu jedinicu bubrežnog parenhima.

U oba bubrega ima 2-3 miliona nefrona. (Draganić i dr. 1991) Na nefronu se razlikuje više

segmenata od kojih svaki ima karakterističnu građu i zauzima određeno mesto u kori ili meduli

bubrega. Svaki segment nefrona obložen je specijalnim tipom ćelija, koje su specijalizovane

za određene funkcije u stvaranju mokraće (Mršević i Popović, 1979).

Nefron se sastoji iz:

1) Malpigijevog tela:

- glomerulus

- Boumanova kapsula

2) tubulskog (kanalikularnog) tela:

- proksilamalni tubul

- Henleova petlja

- distalni tubul

- sabirni tubul (Veljković, 2012).

12

Slika 1.5. Građa nefrona (https://magoosh.com/mcat/mcat-review-topic-kidneys-and-renal-system/)

Glomerulus (slika 1.6) je sastavljen od kapilarne mreže. Kapilarna mreža glomerula

dobija krv iz aferentne arteriole. Klupko glomerulskih kapilara je uronjeno u Boumanovu

kaspsulu. Krv napušta kapilarnu mrežu gomerula preko eferentne arteriole. Eferentna arteriola

pruža veliki otpor protoku krvi. Iz tih razloga je kapilarna mreža glomerula, mreža pod visokim

pritiskom. Pošto je pritisak u glomerulskim kapilarima visok, oni se celom dužinom ponašaju

(i rade) kao arterijski delovi kapilara u drugim tkivima, tj. neprekidno filtriraju tečnost u

Boumanovu kapsulu iz koje ona otiče sistemom kanalića (Veljković, 2012).

Slika 1.6. Građa glomerulusa (http://science-naturalphenomena1.blogspot.com/2009/11/bowman-

capsule.html)

13

Glomerulska membrana preko koje se vrši filtracija plazme i stvara primarna mokraća

ima tri sloja:

- endotelne ćelije

- bazalna membrana

- podociti

Endotelne ćelije su na krvnoj strani glomerulske membrane. Imaju brojne fenestre

(otvore) koje ih čine jako permeabilnim strukturama. Ove ćelije su permeabilne za vodu i u

njoj rastvorene elektrolite, za male molekule (ureja, glukoza) i pojedine male proteine.

Endotelne ćelije imaju na svojoj površini negativno naelektrisane glikoproteine. Ovo negativno

naelektrisanje umanjuje fiiltraciju anjonskih proteina (i nekih drugih negativno naelektrisanih

čestica (Veljković, 2012).

Bazalna membrana predstavlja spoj bazalne membrane visceralnog lista Boumanove

kapsule i bazalne membrane glomerularnih kapilara. Njena debljina iznosi oko 3 mikrona, a

izgrađena je uglavnom od glikoproteida i kolagena (Draganić i dr. 1991).

Uloga bazalne membrane u glomerularnoj filtraciji je od izuzetnog značaja. Ova

membrana predstavlja glavni glomerularni filtar. Zajedno sa njom filtracionu barijeru čine još

i izvan bazalne membrane, podociti i epitelne ćelije visceralnog lista Boumanove kaspsule, a

unutra od bazalne membrane - endotel glomerularnih kapilara (Draganić i dr. 1991).

Prostor između krvnih sudova glomerula naziva se mezangijum. Ćelije mezangijuma

su nepravilnog oblika sa brojnim pseudopodama, koje su u vezi sa bazalnom membranom

glomerula. U ćelijama mezangijuma nalaze se aktinomiozin i tropomiozin, zahvaljujući kojima

one imaju kontraktilnu sposobnost. Glavni zadaci ovih ćelija su regulisanje hemodinamike u

glomerulima i stvaranje mezangijumskog martriksa, koji ima sposobnost da menja fenotip

mezangijumskih ćelija, kao i da preuzima i otklanja makromolekule iz glomerula (Petrović,

2019).

Mezangijalne ćelije okružuju glomerulske kapilare i služe kao njihova potpora. Po

strukturi su slične monocitima. Imaju fagocitnu sposobnost i sekretuju ekstracelularni matriks.

Mezangijalne ćelije izlučuju prostaglandine i citokine koji imaju različite uloge u organizmu.

(Veljković, 2012.)

Mezangijalne ćelije se naslanjaju na glomerulske kapilare. Ove ćelije svojim

kontrakcijama mogu da utiču na glomerulsku filtraciju. Kontrakcijom mezangijalnih ćelija se

komprimuju glomeruski kapilari pa se smanji protok krvi kroz njih. Krajnji efekat je smanjenje

glomerulske filtracije u datom glomerulu (Veljković, 2012).

Mezangijalne ćeije (između aferentne i eferentne arteriole) izlaze izvan glomerula. Ove

ćelije se označavaju kao ekstraglomerulske mezangijalne ćelije. Ekstraglomerulske

mezangijalne ćelije pokazuju značajnu fagocitnu aktivnost (Veljković, 2012).

Boumanova kapsula (capsula glomeruli) ima dva lista -spoljašnji ili parijetalni (paries

externa), i unutrašnji, ili visceralni (paries interna). Između ta dva lista nalazi se šupljina

Boumanove kapsule (lumen capsulae). Parijetalni i visceralni list Boumanove kapsule

razlikuju se međusobno po građi (Draganić i dr. 1991).

14

Parijetalni list gradi jednoslojni pločasti epitel, čije ćelije su mnogougaonog oblika a

leže na tankoj bazalnoj membrani. Po spoljašnjoj površini parijetalnog lista Boumanove

kapsule rasprostrta je tanka mreža retikulinskih vlakana. Sa duboke strane parijetalnog lista

preminiraju u lumen kapsule jedra ćelija pločastog epitela, koje ovaj list grade (Draganić i dr.

1991).

Visceralni list Boumanove kapsule gradi bazalna membrana, na kojoj leže izmenjene

epitelne ćelije, zvane podociti (podocytus). Podociti (slika 1.7 i 1.8) imaju razgranat oblik. Od

tela ćelije polazi veliki broj citoplazmatičnih produžetaka, koji daju sekundarne produžetke.

Tela podocita udaljena su od bazalne membrane oko 1 mikrometar, dok njihovi produžeci

dopiru do bazalne membrane. Sekundarni produžeci podocita imaju oblik stopala (foot

processes), i prepliću se međusobno, gradeći duž bazalne membrane poseban sloj. U ovom

sloju, između susednih stopalastih produžetaka postoje pukotine prečnika od 20 do 50 nm

zvane filtracione pukotine. (Draganić i dr. 1991). Na snimcima elektronskog mikroskopa vidi

se da su ove pukotine premošćene jednom tankom gustom membranom, koja je debljine oko

60 A, ili još manje. Smatra se da je ova membrana po svojoj građi slična tankim dijafragmama,

koje zatvaraju pore fenestriranih krvnih kapilara u nekim drugim organima (Mršević i Popović,

1979). U telu podocita nalazi se jedro neravne površine, a u citoplazmi leži dobro razvijen

Goldžijev aparat, cisterne granuliranog endoplazmatičnog retikuluma, brojni slobodni

ribozomi, mikrofilamenti i tubuli (Draganić i dr. 1991).

Slika 1.7. Šematski prikaz podocita

(http://www.siumed.edu/~dking2/crr/rnguide.h

tm#distal)

Slika 1.8. Podocite pod elektronskim

mikroskopom

(http://www.siumed.edu/~dking2/crr/rnguide.h

tm#distal)

Bubrežni tubul se nastavlja na Boumanovu kapsulu i povezuje je sa sabirnim kanalićem.

On ima oblik savijene cevi i obložen je epitelnim ćelijama. Histološki se na njemu mogu

razlikovati cetiri zone, od kojih svaka ima posebna funkcionalna svojstva. Ćelije bubrežnog

tubula stvaraju i oslobađaju komponente komplementa, citokine, faktore rasta, vazoaktivne

medijatore i aktivno učestvuju u imunskim i zapaljenskim procesima (Petrović, 2019).

Proksimalni tubul je većim delom smešten u korteksu bubrega, a samo se završni deo

spušta prema meduli gde prelazi u Henleovu petlju (Petrović, 2019). Glomerularni ultrafiltrat,

15

nakupljen u šupljini Boumanove kapsule, prolazi kroz vrat nefrona i prelazi u proksimalni

tubul. Taj glomerularni ultrafiltrat sadrži sastojke koji se nalaze i u definitivnoj mokraći, ali

sadrži i glikozu i belančevine, kojih u njoj nema. Po dolasku u proksimalni tubul, iz

glomerularnog ultrafiltrata se reapsorbuju delimično voda i hloridi, a u potpunosti glikoza i

belančevine (Draganić i dr. 1991).

Distalni segment nefrona se sastoji od dužeg izvijuganog i kraćeg pravog dela

sačinjenih od izoprizmatičnih ćelija nejasnih granica, optički svetle citoplazme, okruglog

nukleusa sažetog hromatina. Pod regulativnim dejstvom aldosterona ćelije izvijuganog dela

distalnog segmenta reapsorbuju Na⁺ u zamenu za K⁺ i H⁺, čime regulišu cirkulišući nivo Na⁺ i

volumen krvi. Ćelije distalnog segmenta u mokraću šalju H⁺ u zamenu za bikarbonate, čime

regulišu aciditet mokraće. Ćelije ovog segmenta nefrona stvaraju i odašilju amonijumske jone.

Na ćelije distalnog segmenta deluje i adiuretin regulišući apsorbciju vode, odnosno

koncentraciju mokraće (Milin, 1995).

Henleova petlja se nastavlja na proksimalni tubul i ima oblik latiničnog slova U. Glavna

funkcija Henleove petlje je da stvara visok osmotski pritisak u vanćelijskoj tečnosti bubrežne

medule, što omogućava uspostavljanje osmotske ravnoteže tubulske tečnosti (Petrović, 2019).

Sabirni tubul se nastavlja na zavšni deo nefrona tj, distalni tubul. Sabirni tubul ne služi

samo za odvod mokraće, već ima važnu ulogu u njenom formiranju. U njemu se vrši definitivno

koncentrisanje mokraće kao i održavanje acido-bazne ravnoteže krvi, prelaskom Na⁺ jona iz

urina u krv i K⁺ jona iz krvi u urin (Draganić i dr. 1991).

1.2.3. Značajnost istraživanja bubrega u toksikologiji

Najznačajniju ulogu u eliminaciji otrova i njihovih metabolita iz tela imaju bubrezi.

Bubrezi su veoma efikasni u eliminaciji otrova i njihovih metabolita iz organizma, pri čemu se

koriste isti mehanizmi kojim se uklanjaju proizvodi metabolizma iz tela, kao što su

glomerularna filtracija, tubularna ekskrecija pasivnoim difuzijom i aktivna tubularna sekrecija

(Jokanović, 2001).

Kapilari glomerula imaju velike pore (70 nm) kroz koje mogu da prođu jedinjenja

molekulske težine od 60000, uključujući i proteine koji su manji od albumina. Stepen vezivanja

otrova za proteine može da bude značajan, jer su neki kompleksi proteina i otrova previše veliki

da bi mogli da prođu kroz pore. Otrovi koji su odvojeni filtracijom u glomerulima mogu da

ostanu u lumenu tubula i da budu izlučeni putem urina, ili mogu posle ponovne resoprcije ući

u krvotok. Principi na kojima se zasniva ponovna resorpcija otrova u bubrežnim tubulima su

isti kao i za difuziju kroz druge ćelijske membrane. Dobro se resorbuju liposolubilne supstance,

dok se hidrosolubilna, polarna jedinjenja, i joni izlučuju putem urina. Otrovi mogu da pređu iz

krvi u urin pasivnom difuzijom kroz tubule, ali ovaj proces ima manji značaj , jer se filtracija

odvija većom brzinom nego ekskrecija difuzijom. Otrovi se takođe mogu izlučiti u urin

aktivnom sekrecijom u čemu učestvuju dva tubularna sekretorna transportna sistema

(Jokanović, 2001).

16

1.2.4. Izlučivanje toksina putem bubrega

U izlučivanju toksičnih supstancija i njihovih metabolita kroz bubrege učestvuju tri

mehanizma: filtracija, reapsorpcija i sekrecija (Milošević i Vitorović, 2002).

Filtracija toksikanta se odvija u glomerulima kroz veoma porozne zidove kapilara i

veoma tanku membranu glomerula koja odvaja ,,unutrašnju sredinu“ organizma od spoljne

sredine. Kroz ovu membranu lako prolaze u bubrežne kanaliće svi slobodni molekuli rastvoreni

u krvnoj plazmi, sem proteina i molekula vezanih za proteine. Kod normalnog čoveka (70 kg)

u jednj minuti se filtrira 120 ml ili 180 l na dan. U slučaju otežane filtracije usled oboljenja

bubrega, izlučivanje toksičnih supstancija je usporeno i postoji opasnost od kumulacije

supstancije u organizmu (Milošević i Vitorović, 2002).

Reapsorpcija - posle filtracije toksikanta, iz primarne mokraće se reapsorbuje oko 90%

vode i elektrolita, usled čega se koncentracija toksikanta u mokraći višestruko povećava.

Zahvaljujući takvom koncentracionom gradijentu, liposolubilni molekuli difunduju kroz

epitelne ćelije bubrežnih kanalića i ponovo dospevaju u krv, tako da se, praktično, zanemarljiva

količina izluči u mokraći . Otuda se liposolubilne supstancije mogu izlučiti u mokraći tek pošto

se u procesu biotransformacije preobrate u polarne metabolite koji sporo difunduju ili uopšte

ne difunduju kroz lipidnu membranu u zidu bubrežnih kanalića (Milošević i Vitorović, 2002).

Slabe organske kiseline i baze menjaju svoju liposolubilnost sa stepenom jonizovanja.

Brzina njihovog izlučivanja zavisi prema tome od pH mokraće. Kisela mokraća ubrzava

uzlučivanje slabih organskih baza, dok se slabe organske kiseline brže izlučuju u alkalnoj

mokraći (Milošević i Vitorović, 2002).

Fiziološke supstancije koje su rastvorljive u vodi (glikoza, aminokiseline i dr.)

reapsorbuju se aktivnim transportom (Milošević i Vitorović, 2002).

Sekrecija je aktivan proces. Veliki broj organskih kiselina i baza se transportuje iz krvi

u lumen bubrežnih kanalića zahvaljući sekretornoj aktivnosti ćelija u početnom delu bubrežnih

tubula. U lumenu kanalića ova jedinjenja su jonizovana i stoga se ne reapsorbuju, već se

izlučuju u mokraći (Milošević i Vitorović, 2002).

1.2.5. Toksično delovanje otrova na bubrege

Otrovi koji deluju na bubreg mogu da deluju na bilo koju funkciju bubrega, ali je njihov

efekat najčešće izražen kao smanjena eliminacija proizvoda metabolizma (Jokanović, 2001).

Korteks predstavlja najveći deo bubrega, koji prima većinu krvi koja prolazi kroz

bubreg, a sa njom i rastvorene supstance kao što su hranljive materije, kiseonik, metaboliti

otrovi itd. Zbog toga veliki deo otrova koji se nalazi u krvi prolazi kroz bubreg, eventualno

izazivajući toksične eftekte na području korteksa ili znatno ređe medule. Međutim, zbog

anatomske strukture medule i manjeg protoka krvi, neki otrovi se mogu zadržati u tom delu

bubrega i tu postizati najveće koncentracije (Jokanović, 2001).

17

Svaki anatomski deo nefrona ima specifične funkcije na koje mogu da utiču toksični

agensi. Količina krvi koja prolazi kroz bubrege je oko 25% od ukupne količine koju izbaci

srce. Obzirom da se u glomerulima vrši reapsorpcija soli i vode iz filtrata, supstance koje ostanu

u urinu (uključujući i potencijalne otrove) mogu da imanju veću koncentraciju u tubulima.

Prema tome netoksične koncentracije nekih supstanci u plazmi mogu da budu nefrotoksične,

jer se povećava njihova koncentracija u urinu, pri čemu neke ćelije u proksimalnim tubulima

mogu da budu posebno ugrožene. U nekim delovima tubula mođe doći do taloženja

nerastvorljivih supstanci i do začepljenja tubula (Jokanović, 2001).

1.2.5.1. Biohemijski mehanizmi nefrotoksičnosti

Otrovi mogu da izazovu oštećenja ćelija u bubrezima na različite načine. Neke

supstance mogu da reaguju sa makromolekulima u ćelijama kao što su živa i drugi teški metali

koji se vezuju za sulfhidrilne grupe na proteinima. Da bi neki otrovi ispoljili toksične efekte

moraju se metabolisati u reaktivne intermedijere. Kovalentno vezivanje ovih metabolita u

ćelijama utiče na njhovo normalno funkcinisanje usled čega nastaju povrede ćelija (Jokanović,

2001).

1.2.5.1.1. Oksidativni stres

Neki otrovi mogu da deluju na ćelije indirektno izazivajući oksidativni stres preko

formiranja slobodnih radikala kiseonika kao što su superoksidni anjon (O2⁻), vodonik peroksid

i hidroksil radikali (OH⁻) koji reaguju sa ćelijskim konstituentima inicirajući toksične efekte.

Slobodni radikali kiseonika deluju na sledeće načine: izazivaju lipidnu peroksidaciju koja može

da promeni propustljivost ćelijske membrane i aktivnost enzima koji se nalaze u membrani;

inaktiviraju neke enzime iz ćelija oksidacijom njihovih sulfhidrilnih ili amino grupa,

razgrađuju polisaharide, izazivaju prekide u DNK i hromozomu (Jokanović, 2001).

1.2.5.1.2. Povećanje koncentracije Ca⁺⁺ u ćeliji

Otrovi mogu da dovedu do povećanja količine Ca⁺⁺ u ćelijama olakšavanjem njegovog

ulaska u ćeliju. Povećana koncentarcija Ca⁺⁺ u ćelijma izaziva toksične efekte tako što prazni

energetske rezerve ćelije, remeti funkcionisanje mikrofilamenata i aktivira hidrolitičke enzime

koji razgrađuju proteine (proteinaze), fosfolipide (fosfolipaze) i nukleinske kiseline

(Jokanović, 2001).

18

1.2.5.1.3. Poremećaji funkcije mitohondrija

Mitohondrije su ćelijske organele u kojima se vrši prenos elektrona, odnosno ćelijsko

disanje i sinteza energetskih izvora kao što je ATP, pa poremećaj njihove funkcije pod uticajem

otrova nastaje inhibicijom ovih procesa (Jokanović, 2001).

1.2.5.1.4. Održavanje zapremine ćelija i homeostaza jona

Održavanje zapremine ćelije i homeostaza jona su važne u reapsorpciji jona u epiteliu

tubula. Otrovi najčešće menjaju zapreminu ćelije i koncentraciju jona interakcijom sa

membranama posle čega se povećava propustljivost za neke jone ili inhibicijom energetskog

metabolizma. Nedostatak ATP-a inhibira prenosioce jona u membrani koji održavaju

ravnotežu jona u ćeliji i van nje kao što je aktivnost Na⁺, K⁺ ATPaze zbog čega se povećava

koncentracija Na⁺ i Cl⁻ u ćeliji, smanjuje koncentracija K⁺ i nastaje povećanje zapremine i liza

ćelije (Jokanović, 2001).

1.2.5.2. Akutno i hronično oštećenje bubrega

Nefrotoksični efekti se najčešće manifestuju kao akutno oštećenje bubrega koje se

karakteriše smanjenjem glomerularne filtracije i oštećenjem proksimalnih tubula. Razvoj

akutnog oštećenja bubrega može se podeliti u tri faze. U početnoj fazi dolazi do izlaganja

bubrega otrovu sa promenama u njihovoj funkciji, u drugoj fazi su te promene znatno

izraženije. Ukoliko nastale promene nisu suviše teške nastaje faza obnavljanja funkcije

proliferacijom ćelija (Jokanović, 2001).

Veliki broj faktora može da utiče na nastajanje akutnog oštećenaja bubrega. Smanjenje

glomerularne filtracije može da nastane zbog promene u broju i veličini otvora kroz koje se

vrši filtracija. Ovaj efekat mogu indirektno da izazovu i otrovi koji oštećuju tubule jer

povećavaju propustljivost njihovog epitela, pa dolazi do vraćanja filtrata u cirkulaciju

(Jokanović, 2001).

Hronično oštećenje bubrega nastaje posle dugotrajne primene lekova. Jedan od uzroka

nastajanja hroničnog oštećenja bubrega su promene u hemodinamičkim faktorima u

glomerulima, kao što su krvni pritisak i količina krvi koja prođe kroz njih. Kao rezultat tih

promena nastaju hronični tubulointersticijalni nefritis sa progresivnim gubitkom funkcije

bubrega i skleroza glomerula (Jokanović, 2001).

19

1.2.6. Mehanizmi kompenzacije i adaptacije bubrega na

oštećenja nastala pod uticajem otrova

Bubreg ima efikasne mehanizme kojima moze da kompenzuje neke tosične efekte.

Međutim ovi kompenzatorni mehanizmi imaju ograničen efekat, pa toksični efekti na bubreg

nastaju tek onda kad oštećenja tkiva budu veća od onih koja se mogu otkloniti na ovaj način.

Oporavku bubrega posle toksičnih oštećenja može doprineti regeneracija tkiva u koje se

neoštećene ćelije u neposrednoj blizini diferenciraju i proliferišu, preuzimajući funkciju

oštećenog tkiva. Tada se zapaža povećana sinteza DNK u bubrezima, kojoj značajno doprinose

brojni faktori rasta koji do povređenog mesta stižu iz bubrega ili iz krvi (Jokanović, 2001).

20

2. Cilj rada

Cilj ovog istraživanja je da se utvrdi uticaj pirimetanila na broj i građu glomerula posle

30-dnevnog tretmana.

21

3. Materijal i metode

3.1. Materijal

U eksperimentu je korišćen sledeći materijal:

- eksperimentalne životinje, pacovi soja Wistar

- bubreg pacova

- fungicid Pyrus 400SC

- fiziološki rastvor

3.2. Metode

Eksperiment je izvođen u nekoliko faza:

- Tretiranje eksperimentalnih životinja fungicidom u konstantnim eksperimentalnim

uslovima;

- Žrtvovanje životinja;

- Priprema tkiva: fiksacija, dehidratacija, kalupljenje, sečenje;

- Izrada trajnih mikroskopskih preparata;

- Bojenje preparata;

- Posmatranje preparata pod mikroskopom;

- Statistička obrada rezultata.

3.2.1. Tretiranje eksperimentalnih životinja fungicidom u

konstantnim eksperimentalnim uslovima i žrtvovanje

životinja

Vršen je hronični tretman Pyrus-om 400-SC u trajanju od 30 dana. Eksperiment je

izveden u vivarijumu Medicinskog fakulteta u Nišu. Pacovi su imali slobodan pristup hrani i

vodi tokom trajanja eksperimenta. Životinje su tretirane per os jednom dnevno. Tretirano je 30

muških jedinki pacova soja Wistar, starosti 12 nedelja. Životinje su bile podeljene u 5 grupa sa

22

po 6 jedniki pacova. Svaka grupa je dobijala određenu koncentraciju fungicida Pyrus 400-SC

dok je kontrolna grupa dobijala fiziološki rastvor.

I grupa je tretirana fungicidom Pyrus 400-SC u koncentraciji od 500 mg/kg;

II grupa je tretirana fungicidom Pyrus 400-SC u koncentraciji od 750 mg/kg;

III grupa je tretirana fungicidom Pyrus 400-SC u koncentraciji od 1000 mg/kg;

IV grupa je tretirana fungicidom Pyrus 400-SC u koncentraciji od 2000 mg/kg;

V grupa je dobijala fiziološki rastvor.

Nakon završetka tretmana životinje su anestezirane ketamidorom i žrtvovane. Potom

su uzeti uzorci bubrega za histološku analizu i stavljeni u staklene bočice sa zatvaračima u koje

je sipan fiksativ (formalin) do oko 2/3 zapremine bočice, kako bi ceo uzorak tkiva bio potopljen

u formalinu.

3.2.2. Priprema tkiva

3.2.2.1. Fiksacija tkiva

Fiksacija tkiva je proces čiji je cilj da u ćeliji stabilizuje proteinsku osnovu od koje je

ćelija izgrađena, da očuva morfologiju ćelije, njenu veličinu, kao i lokalizaciju hemijskih

supstancija u stanju sličnom prirodnom (Švob, 1974).

Fiksator ima ulogu da inaktivira proteolitičke enzime, spreči rast mikroorganizama, da

ne oštećuje tkivo, da očuva normalan oblik tkiva i lokalizaciju njegovih sastojaka (Švob, 1974).

Materijal za obradu je fiksiran u 4% formalinu i čuvan 3 dana, a drugog dana je izvršena

zamena formalina svežim.

3.2.2.2. Dehidratacija tkiva

Uloga procesa dehidratacije je istiskivanje vode iz tkiva, jer na mestima gde je voda

zaostala u tkivu ne može prodreti parafin. Dehidratacija ne sme biti nagla jer oštećuje tkivo,

već se mora izvoditi postepeno. Vrši se tako što se tkivo prenosi iz dehidrirajućeg sredstva

manje koncentracije, kroz veće koncentracije, sve do potpuno koncentrovanog dehidrirajućeg

sredstva (Švob, 1974).

Dehidratacija se vrši upotrebom serije rastuće koncentracije etil alkohola: 70%, 80%,

96%, 100%. Iz boca sa uzorcima se odlije formalin doda se 70% etanol u kome uzorci stoje 2

sata, uz zamenu alkohola svežim nakon jednog sata. Nakon toga se odlije 70% etanol i doda se

80% etanol, u kome tkiva stoje 2 sata, uz zamenu alkohola svežim nakon jednog sata. Potom

se odlije 80% etanol i doda 96% etanol, koji stoji 2 sata, uz zamenu svežim posle prvog sata.

23

Zatim se 96% etanol zamenjuje apsolutnim alkoholom, u kom uzorci tkiva stoje preko noći, uz

zamenu svežim apsolutnim alkoholom ujutru, u kom uzorci stoje još jedan sat.

Pošto parafin nije rastvorljiv ni u vodi ni u alkoholu, neophodno je primeniti još jedno

dehidrirajuće sredstvo koje rastvara parafin i omogućava njegovo prodiranje u tkivo, a takođe

se meša sa dehidrirajućim sredstvom i istiskuje ga iz tkiva (Švob, 1974). U ovom eksperimentu

je za tu namenu korišćen toluol. Uzorci tkiva se iz bočica sa apsolutnim alkoholom prebacuju

u nove bočice u koje se sipa toluol. Tkiva u toluolu stoje dva sata, nakon čega se toluol menja

svežim u kom stoje još jedan sat.

Nakon toga se odlije toluol i u bočice sa uzorcima tkiva sipa smeša paraplasta i toluola

u odnosu 1:1, u kojoj stoje 2 sata na 64 ºC. Zatim se uzorci prebacuju u čist parapalast u kom

stoje celu noć. Ujutru se paraplast zameni svežim, i njemu uzorci stoje još jedan sat, nakon

čega se vrši kalupljenje tkiva.

Slika 3.1. Fiksacija, dehidratacija i kalupljenje tkiva ( http://paraffinwaxco.com/paraffin-tissue-

block/)

3.2.2.3. Kalupljenje tkiva

Nako što je parafin infiltrirao tkivo i prožeo sve njegove pore, tkivo se zajedno sa

parafinom treba uobličiti u blok pogodan za rezanje na mikrotomu. Pri tome se tkivo treba

pravilno orijentisati u parafinu (Švob, 1974).

Slika 3.2. Nalivanje parafina (levo) Orijentacija tkiva u parafinu (desno)

(http://paraffinwaxco.com/paraffin-tissue-block/)

24

Kalupljenje se izvodi na specijalnom aparatu za kalupljenje modela Leica EG1150,

koji poseduje sistem za zagrevanje i nanošenje parafina i rashladnu ploču. Za formiranje

parafinskih blokova se koristi metalni kalup sa plastičnom mrežicom. Tkivo se pravilno

orijentiše u metalni kalup, prelije toplim parafinom prekrije mrežicom i prebaci na ploču za

hlađenje.

Slika 3.3. Aparat za kalupljenje modela Leica EG1150

(https://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/histology-embedding-centers-

accessories/products/leica-eg1150/)

Slika 3.4. Kalup za parafin

(https://www.tedpella.com/Embedding_html/P

eel-AWay_Disposable_Histology_Molds.htm)

Slika 3.5. Mrežice za kalupljnje

(https://www.tedpella.com/embedding_html/ti

ssue_processing_cassettes.htm)

25

3.2.2.4. Sečenje tkiva i izrada trajnih preparata

Pre rezanja parafinski blokovi se oblikuju tako da se napravi pravilni pravougaonik čije

su stranice paralelne. Oko tkiva ne treba da ostane više od 1-2 mm široki pojas parafina. Kod

modeliranja bloka ne treba odrezati odjednom mnogo parafina jer može ceo blok pući, već

treba oštrim nožićem polako obrezivati tkiva. Sečenje se vrši na mikrotomu, aparatu koji

omogućava pravljenje preseka debljine od 5-10 μm Nakon toga se napravljeni preseci potope

je u vodeno kupatilo. U vodi se rezovi restegnu (isprave) i postanu glatki i ravni (Švob, 1974).

Potom sledi montiranje napravljenih preseka na predmetna stakla.

Slika 3.6. Sečenje na mikrotomu (https://www.leicabiosystems.com/pathologyleaders/an-

introduction-to-specimen-preparation/)

3.2.3. Bojenje preparata

Bojenje tkiva se koristi da se istaknu važne karakteristike tkiva, kao i da se poboljša

kontrast tkiva (Alturkistani et al., 2016). Pre bojenja preparata neophodno je izvršiti

deparafinizaciju tkivnih preseka, odnosno uklanjanje parafina, jer bojenje u suprotnom ne bi

bilo moguće (Kostić, 1953). Deparafinizacija se vrši u toluolu, koji rastvara parafin, tako da na

pločici ostaje samo pesek tkiva. Nakon toga je neophodno ukloniti toluol iz tkiva što se vrši

ispiranjem tkiva u seriji alkohola opadajuće koncentracije (apsolutni alkohol, 96% alkohol,

70% alkohol) i na kraju u destilovanoj vodi (Švob, 1974).

3.2.3.1. Hematoksilin - eozin bojenje

Hematoksilin je bazna boja koja kisele komponente ćelije (jedro) boji u plavo-

ljubičasto, dok je eozin kisela boja koja boji bazne komponente (citoplazma) u crveno-ružičasto

(Mccan, 2015).

Postupak bojenja:

26

- Bojenje Harisovim hematoksilinom 10 min;

- Ispiranje tekućom vodom 5 min;

- Bojenje eozinom 2 min;

- Ispiranje destilovanom vodom i serijom rastuće koncentracije alkohola (70%, 96%, 100%);

- Sušenje u termostatu 5 min;

- Potapanje u toluol 10 min;

- Stavljanje pokrovnih stakala.

3.2.4. Posmatranje preparata pod mikroskopom i

statistička obrada rezultata

Trajni histološki preparati su posmatrani pod svetlosnim mikroskopom (Leica

DM2500) i slikani kamerom koja je povezana sa kompijuterskim softverom. Morfometrijska

merenja su vršena u imagej-u, programu za obradu slika. Određivani su prosečan broj

glomerula po vidnom polju, površina glomerula, površina kapsularnog prostora i broj podocita

po glomerulu. Dobijeni rezultati su statistički obrađeni u Microsoft office exell-u. Korišćen je

statički test ANOVA koji je praćen t - testom.

27

4. Rezultati i diskusija

4.1 Histološka građa

U kontrolnoj grupi (Slika 4.1) tretiranoj fiziološkim rastvorom bubreg pokazuje

normalnu histološku građu. Glomeruli su normalnog izgeda sa očuvanom Boumanovom

kapsulom. Krvni sudovi su normalno razvijeni. Distalni i proksimalni tubuli imaju normalan

izgled sa očuvanim epitelom.

Slika 4.1. Histološki presek bubrega, kontola (H&E, 100X, 400X)

28

Kod životinja tretiranih koncentracijom od 500 mg/kg glomeruli i Boumanova kapsula

su očuvani (Slika 4.2). Krvni sudovi pokazuju normalan izgled. Zapaža se sporadična pojava

intersticijumskog krvarenja. Proksimalni i distalni tubuli imaju očuvan oblik.

Slika 4.2. Histološki presek bubrega, 500 mg/kg (H&E, 100X, 400X)

29

Koncentracija pirimetanila od 750mg/kg dovodi do atrofije nekih glomerula, iako

većina ima očuvan oblik, i očuvanu Boumanovu kapsulu (Slika 4.3). Krvni sudovi imaju

normalan izgled. Prisutno je više krvnih elementa u intersticijumu bubrega u odnosu na nižu

koncentraciju. Distalni i proksimalni tubuli su dilatirani i oučava se vakuolizacije citoplazme

epitela tubula.

Slika 4.3. Histološki presek bubrega, 750 mg/kg (H&E, 100X, 400X)

30

Doza od 1000 mg/kg (Slika 4.4) pri hroničnom tretmanu izaziva još veće smanjenje

broja glomerula u odnosu na prethodne grupe. Intersticijumsko krvarjenje je izraženije.

Vakuolizacija distalnih i proksimalnih tubula je veća što dovodi do degeneracije epitela tubula.

Slika 4.4 Histološki presek bubrega, 1000 mg/kg (H&E, 100X, 400X)

31

Hronični tretman pirimetanilom dozom od 2000 mg/kg izaziva najveće promene u

histološkoj građi bubrega (Slika 4.5) Atrofija glomerula je intenzivnija. Ćelije distalnih i

proksimalnih tubula su sa izraženijom vakuolizacijom. Vakuole ispunjavaju sve veću

zapreminu ćelije i na nekim mestima dovode do rupture ćelijske membrane i smrti ćelije.

Intersticijelna krvarenja su izraženija. Ona nastaju najverovatnije zbog oštećenja krvnih sudova

oko tubula.

Slika 4.5. Histološki presek bubrega, 2000mg/kg (H&E, 100X, 400X)

32

4.2. Morfometrija

Morfometrijska merenja su vršena u imagej-u, programu za obradu slika. Određivani

su broj glomerula po vidnom polju, površina glomerula, površina kapsularnog prostora i broj

podocita po glomerulu. Dobijeni rezultati su statistički obrađeni u Microsoft office exell-u.

Korišćen je statički test ANOVA koji je praćen t - testom.

Broj glomerula se sa povećanjem doze pirimetanila smanjuje (Tabela 4.1). Najveći broj

glomerula se javlja u kontrolnoj grupi i iznosi 8,4 ± 0,82 glomerula po vidnom polju, dok se

najmanji broj javlja pri dozi od 1000 mg/kg i iznosi 6,53 ± 0,42 glomerula po vidnom polju.

Statistička analiza pokazuje statističku značajnost dobijenih rezultata (p<0,05). ANOVA je

praćena post hoc t-testom koji pokazuje statistički značajnu razliku između kontrolne grupe

životinja i grupa tretiranih koncentracijama 500 mg/kg, 750 mg/kg i 1000 mg/kg (P<α/3), dok

ne postoji statistički značajna razlika između kontrolne i grupe tretirane dozom od 2000 mg/kg

(P>α/3).

Smanjenje broja glomerula može biti posledica oksidativnog stresa. Istraživanja su

pokazala da živa povećava unutarćelijski nivo reaktivnih vrsta kiseonika i izaziva oksidativni

stres. Toksičnost žive je povezana sa stvaranjem radikala superoksida i iscrpljivanjem

glutationa. Promene u aktivnosti antioksidativnih enzima su posledica reaktivnih vrsta

kiseonika što dovodi do povećanja nivoa peroksidacije lipida i iscrpljivanja glutationa.

Iscrpljivanje glutationa i in vitro peroksidacija lipida su uzrok oštećenja bubrega (Akgul et al.,

2016).

Kod akutnog tretmana pirimetanilom, broj glomerula se kreće od 8,120 ± 3,127

glomerula po vidnom polju kod kontrolne grupe životinja, do 6,540 ± 4,072 glomerula po

vidnom polju kod životinja tretiranih najvećom dozom pirimetanila. Statistička analiza ne

pokazuje statistički značajnu razliku u smanjenju broja glomerula sa povećanjem doze

(Todorović, 2018).

Ispitivanjem površine glomerula i površine kapsularnog prostora utvrđeno je da

različite koncentracije pirimetanila ne utiču značajno na promenu površine (Tabela 4.1) Kod

kontrolne grupe životinja tretirane fiziološkim rastvorom površina glomerula iznosi 6062,43 ±

647,00 μm², najveća vrednost je zabeležena pri dozi od 1000 mg/kg i iznosi 6338,52 ± 411,82

μm², dok je najmanja površina glomerula izmerena pri dozi od 2000 mg/kg i iznosi 5648,55 ±

452,72 μm². Statistička analiza ne pokazuje statističku značajnost dobijenih vrednosti (p>0,05).

Slično je i sa površinom kapsularnog prostora. Kod kontrolne grupe životinja površina

kapsularnog prostora iznosi 1916,30 ± 342,54 μm², najveća vrednost je zabeležena pri dozi

primetanila od 750 mg/kg i iznosi 1989,03 ± 160,43 μm², a najmanja pri dozi od 2000 mg/kg i

iznosi 1860,60 ± 486,19 μm². Statistička analiza nije pokazala statističku značajnu razliku

dobijenih rezultata (p>0,05).

Kod akutnog tretmana u trajanju od 7 dana najveća površina glomerula je zabeležena

pri dozi 600 mg/kg (6975,42 ± 2295,72 μm²), dok najmanju površinu imaju glomeruli životinja

tretiranih dozom od 1000 mg/kg (5994,74 ± 2317,00 μm²). Površina glomerula se nije

značajnije menjala kod drugih ispitivanih koncentracija u odnosu na kontrolu. Ovi rezultati

33

pokazuju da se u tako kratkom vremenskom periodu tretmana ne dešavaju promene koje mogu

da izazovu značajno smanjenje površine glomerula (Todorović, 2018).

Upoređivanjem površine glomerula nakon akutnog i hroničnog tretmana

pirimetanilom može se zaključiti da je nakon tridesetodnevnog tretmana došlo do većeg

smanjena površine glomerula u odnosu na akutni tretman iako statistička analiza ne pokazuje

statističku značajnost.

Broj podocita po glomerulu se nije mnogo menjao pod uticajem različtih doza

pirimetanila (Tabela 4.1). U kontrolnoj grupi broj podocita je 45,73 ± 7,63 podocita po

glomerulu, najveća vrednost se javlja pri dozi od 1000 mg/kg i iznosi 50,90 ± 3,07 podocita po

glomerulu dok je najmanja vrednost zabeležena pri dozi od 750 mg/kg i iznosi 45,07 ± 12,16

podocita po glomerulu. Statistička analiza nije pokazala statistički značajnu razliku (p>0,05).

Tabela 4.1. Površina glomerula, površina kapsularnog prostoraroj glomerula po vidnom polju

i broj podocita po glomerulu u zavisnosti od doze pirimetanila

Doza

(mg/kg)

Kontrola

(AV±SD)

500

(AV±SD)

750

(AV±SD)

1000

(AV±SD)

2000

(AV±SD) P

Površina

glomerula

(μm²)

6062,43 ±

647,00

6026,44 ±

567,82

6241,6 ±

353,33

6338,52 ±

411,82

5648,45 ±

452,72 0,54

Površina

kapsularnog

prostora

(μm²)

1916,30 ±

342,54

1893,6 ±

258,24

1989,0 ±

160,43

1913,86 ±

222,95

1860,60 ±

486,19 0,99

Broj

glomerula

po vidnom

polju

8,42 ±

0,82

6,67 ±

1,33

6,93 ±

1,00

6,52 ±

0,42

8,03 ±

0,55 0,02

Broj

podocita po

glomerulu

45,73 ±

7,62

49,85 ±

6,20

45,07 ±

12,16

50,9 ±

3,07

49,3 ±

4,94 0,70

Legenda: AV-srednja vrednost, SD-standardna devijacija, P-nivo značajnosti

Pirimetanil je pokazao toksično dejstvo na tkivo bubrega. Pri hroničnom tretmanu broj

glomerula se smanjivao idući od kontrole ka višim koncentracijama pirimetanila. Atrofija

glomerula je izraženija na većim koncentracijama pirimetanila. Javlja se hemoragija u

intersticijumu bubrega koja je najverovatnije posledica oštećenja kapilara u bubregu. Došlo je

do dilatacije distalnih i proksimalnih tubula. Ćelije pojedinih tubula su vakuolizirane pri čemu

je usled velike vakuolizacije nekih ćelija došlo do njihovog pucanja i izlivanja njhovog

sadržaja.

Dosadašnja istraživnija uticaja pirimetanila na građu bubrega su pokazala slične

rezultate. Jedan od najčešćih efekata pirimetanila je upalna reakcija povezana sa infiltracijom

makrofaga i mononunklearnih ćelija, sa prisustvom krvarenja i apoptotičkih tela. Bubrežni

tubuli pokazuju oštećenja, kao što je dilatacija, hidroskopski edem sa i bez citoplazmatske

vakuolizacije. Pirimetanil često dovodi do nakupljanja proteina u lumenu tubula koje

karakteriše homogeni tamno ružičasti materijal. Izaziva uništenje ivice epitela lumena

34

proksimalnih tubula, proširenje Boumanovog prostora, kao i skupljanje kapilara (Bernabo,

2017).

Organofosforni pesticid diziazon izaziva degeneraciju bubrežnih tubula i atrofiju

glomerula. Toksičnost diziazona se ostvaruje kroz inhibicuju enzima acetilholinesteraze čija je

biološka uloga zaustavljanje prenosa impulsa u holinergičkim sinapsama nervnog sistema

brzom hidrolizom neurotransmitera acetilholina. Nefrotoksičnost diziazona je posledica

oksidativnog stresa koji izaziva. Tretman pacova diziazonom značajno povećava peroksidaciju

bubrežnih lipida što je praćeno smanjenjem aktivnosti bubrežnih antioksidativnih enzima

(katalaze, glutation peroksidaze, glutation reduktaze, glukoza-6-fosfat dehidrogenaze) i

smanjenjem nivoa glutationa (Sarhan and Al-Sahhaf, 2011).

Oksidativni stres povećava proizvodnju slobodnih radikala i smanjuje endogene

antioksidante. Slobodni radikali imaju veliku aktivnost i reaguju sa različitim molekulima. Oni

takođe mogu narušiti strukturu i funkciju proteina i enzima. Poznato je da oksidativni stres ima

ulogu u patogenezi bubrežne toksičnosti mnogih toksina i lekova. Diziazon izaziva oksidativni

stres i disfunkciju bubrega, povećava serumski kreatinin i ureu. Koncentracija kreatinina je

marker funkcije bubrega, pa je njegovo povišenje je posledica oštećenja bubrega. Kreatinin u

serumu takođe pokazuje klirens bubrega pa je povećanje kreatinina rezultat oštećenja bubrega

i smanjenja klirensa zbog dejstva diziazona (Boroushaki et al., 2013).

Pesticidi i njihovi metaboliti se izlučuju uglavnom preko bubrega (Eid, 2017). Poznato

je da reaktivne vrste kiseonika posreduju kod mnogih oštećenja bubrega uzrokovanih toksinima

(Poovala et al., 1999). Oštećenje bubrega hemikalijama se može manifestovati na različte

načine u zavisnosti od vrste ciljnog mesta, obima i trajanja oštećenja. Neke hemikalije ciljaju

specifične anatomske regije bubrega i mogi uticati samo na jednu ćelijsku vrstu. Bubreg je

meta toksičnih hemikalija jer ima visok protok krvi, metabolički je aktivan, može da stvara

reaktivne intermedijere, koncentriše hemikalije i osetljiv je na imune reakcije (Satar et al.,

2005). Kao važan organ u izradi imunološkog odgovora, morfološke promene bubrega mogu

izazvati promene sistema odbrane šteteći homeostazi organizma i zdravlju (Leite et al., 2002).

35

5. Zaključak

Nakon 30-dnevnog tretmana pirimetanilom na pacovima Wistar soja može se zaključiti

sledeće:

- pirimetanil je doveo je do statistički značajnog smanjenja broja glomerula, pri čemu postoji

statistički značajna razlika između kontrolne grupe životinja i grupa tretiranih koncentracijama

500 mg/kg, 750 mg/kg i 1000 mg/kg, dok razlika između kontrolne i grupe tretirane dozom od

2000 mg/kg nije statistički značajna;

- pirimetanil nije izazvao statistički značajnu razliku u površini glomerula, površini

kapsularnog prostora i broju podocita po glomerulu;

- doveo je do histoloških promena u tkivu bubrega kao što su atrofija glomerula koja je

izraženija na većim koncentracijama pirimetanila, hemoragija u intersticijumu bubrega koja je

najverovatnije posledica oštećenja kapilara u bubregu, dilatacije distalnih i proksimalnih

tubula, vakuolizacije nekih ćelija pri čemu je usled velike vakuolizacije došlo do pucanja nekih

ćelija i izlivanja njhovog sadržaja.

- istraživanje je pokazalo da pirimetanil nakon 30-dnevnog tretmana dovodi do promene u

broju i građi glomerula.

36

6. Literatura

1. Akgul, N., Altunkaynak, B.Z., Altunkaynak, M.E., Deniz, O.G., Unal, D. Akgul, H.M.

(2016): Inhalation of mercury vapor can cause the toxic effects on rat kidney. Renal Failure,

38 (3): 465-473.

2. Alturkistani, H.A., Tashkandi, F.M., Mohammedsaleh, Z.M. (2016): Histological Stains: A

Literature Review and Case Study. Glob J Health Sci, 8(3): 72–79.

3. Bernabo, I., Guardia, A., Macirella, R., Tripepi, S., Brunelli, E. (2017): Chronic exposures

to fungicide pyrimethanil: multi-organ effects on Italian tree frog (Hyla intermedia). Scientific

reports, 7-6869.

4. Boroushaki, M.T., Arshadi, D., Jalili-Rasti, H., Asadpour, E., Hosseini, A. (2013): Protective

Effect of Pomegranate Seed Oil Against Acute Toxicity of Diazinon in Rat Kidney . Iran J

Pharm Res, 12 (4): 821-827.

5. Daniels, A., Birchmore, R.J., Winter, E.H. (1994): Activity of pyrimethanil on Venturia

inaequalis. British Crop Protection Council, 2: 525-532.

6. Dellarco, V. (2007): Pyrimethanil 445–486 Jmpr 2007. United States, and Environmental

Protection.

7. Draganić, V., Petronić, V., Lazić, J., Derežić, D. (1991): Bubreg i retroperitoneum. Naučna

knjiga, Beograd.

8. Eid, R.A. (2017): Apoptosis of rat renal cells by organophosphate pesticide, quinalphos:

Ultrastructural study, 28(4):725-736.

9. Gupta, P.K. (2018): Toxicity of Fungicides. Veterinary Toxicology (Third Edition) Basic

and Clinical Principles: 569-58, Chapter 45.

10. Hrelia, P., Fimognari, C., Maffei, F., Vigagni, F., Mesirca, R., Pozzetti, L., Paolin, M.,

Cantelli Forti, G. (1996): The genetic and non-genetic toxicity of the fungicide Vindozoiin.

Mutagenesis. 11(5): 445-453.

11. Inđić, D.V., Vuković, S.M. (2012): Praktikum iz fitofarmacije. Univerzitet u Novom Sadu,

Poljoprivredni fakultet.

12. Jokanović, M. (2001): Toksikologija. Beograd: Elit medica.

13. Kanetis, L., Forster, H., Adaskaveg, J.E. (2007): Comparative efficacy of the new

postharvest fungicides azoxystrobin, fludioxonil, and pyrimethanil for managing citrus green

mold. Plant Disease, 91 (11): 1502-1511.

14. Kinani, A., Rifai, A., Bourcier, S., Jaberb, F., Bouchonneta,S. (2013): Sructural

characterization of photoproducts of pyrimethanil. J Mass Spectrom, 48, 983-987.

15. Kostić, A. (1953): Osnovi histološke tehnike. Medicinska knjiga Beograd Zagreb.

16. Lebailly, P., Vigreux, C., Lechevrel, C., Ledemeney, D., Godard, T., Sichel, F., LeTalaer,

J.Y., Henry-Amar, M., Gauduchon, P. (1998): DNA damage in mononuclear leukocytes of

37

farmers measured using the alkaline comet assay: modifications of DNA damage levels after a

one-day field spraying period with selected pesticides Cancer Epidemiology, Biomarkers &

Prevention, 7: 92-940.

17. Leite da Veiga, M., De Lara Rodrigues, E., Fabio Juliano Pacheco, F.J., Jose Tavares

Ranzani-Paiva, M. (2002): Histopathologic Changes in the Kidney Tissue of Prochilodus

lineatus Valenciennes, 1836 (Characiformes, Prochilodontidae) Induced by Sublethal

Concentration of Trichlorfon Exposure. B. raz. arch. biol. technol. 45 (2).

18. Mccann, M.T. (2015): Automated Histology Analysis: Opportunities for signal processing.

Signal Processing Magazine, 32(1): 78-87.

19. Milenković, M.P., Vitorović, S.Lj. (1992): Osnovi toksikologije sa elementima

ekotoksikologije. Naučna knjiga, Beograd.

20. Mitić, N., (1998): 21. Milin, J. (1995): Histologija. Ortomedic , Novi Sad.

21. Milling, R.J., Richardson, C.J. (1995): Mode of action of the anilino-pyrimidine fungicide

pyrimethanil. 2. Effects on enzyme secretion in Botrytis cinerea. Pesticide Science 45 (1):43-

48.

22. Mitić, N.(1992): Pesticidi u poljoprivredi i šumarstvu u Jugoslaviji. Poslovni sistem Grmeč,

Beograd.

23. Mršević, D., Popović, S. (1979): Bubreg razviće i struktura.

24. Navalon, A., Prieto, A., Araujo, L., Jose Luis, J. (2002): Determination of pyrimethanil and

kresoxim-methyl in green groceries by headspace solid-phase microextraction and gas,

chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 975. 355–360.

25. Neumann, G.L., Winter, E.H., Pitts, J.E. (1992): Pyrimethanil: A new fungicide. British

Crop Protection Council, 1: 395-402.

26. Petrović, S. (2019): Lekovi i bubreg u kliničkoj praksi. Fakultet medicinskih nauka

Univerziteta u Kragujevcu.

27. Petsikos-Panayotarou, N., Markellou, A.E., Kalamarakis, D., Kyriakopoulou, N.E.,

Malathrakis (2003): In vitro and In vivo Activity of Cyprodinil and Pyrimethanil on Botrytis

cinerea Isolates Resistant to other Botryticides and Selection for Resistance to Pyrimethanil in

a Greenhouse Population in Greece, 109 (2): 173–182.

28. Poovala, V.S., Huang, H., Salahudee,A.K. (1999): Role of Reactive Oxygen Metabolites

in OrganophosphateBidrin-Induced Renal Tubular Cytotoxicity. Soc Nephrol, 10 (8): 1746–

1752.

29. Roberts, J.R ., Reigart, J.R. (2013): Recognition and management of pesticide poisonings.

30. Rouabhi, R. (2010): Fungicides - Introduction and toxicology of fungicides, Larbi Tebessi

University, Biology department, Tebessa Algeria.

31. Sarhan O.M.M. and Al-Sahhaf. Z.Y. (2011): Histological and Biochemical Effects of

Diazinon on Liver and Kidney of Rabbits. Life. Science Journal. 8(4): 1183-1189.

38

32. Satar, S., Satar, D., Mete, U.O., Suchard, J.R., Topal, M., Kaya M., (2005): Ultrastructural

Effects of Acute Organophosphate Poisoning on Rat Kidney. Renal Failure, 27 (5): 623-627.

33. Smilanick, L., Mansour, M.F., Gabler, M.F., Goodwine, W.R. (2006): The effectiveness of

pyrimethanil to inhibit germination of Penicillium digitatum and to control citrus green mold

after harvest. Postharvest Biology and Technology, 42(1): 75–85.

34. Soldatović D.R. i saradnici (1980): Toksikologija pesticida sa analitikom. Privredni

pregled, Beograd.

35. Sun, H.-Y., Wang, H.-C., Chen, Y., Li, H.-X., Chen, C.-J., Zhou, M.-G. (2010). Multiple

resistance of Botrytis cinerea from vegetable crops to carbendazim, diethofencarb,

procymidone, and pyrimethanil in China. Plant Dis, 94 (5): 551-556.

36. Tanović, B., Hrustić, J., Mihajlović, M., Grahovac, M., Delibašić, G., Vukšaž, P. (2011):

Suzbijanje Botrytis cinerea i problem rezistentnosti na fungicide. Pestic. fitomed. (Beograd),

26(2), 99–110.

37. Todorović, M. (2018): Uticaj akutnog tretmana pirimetanilom na histološku građu bubrega

pacova wistar soja.

38. Veljković, S. (2012): Fiziologija bubrega. Medicinski fakultet, Niš.

39. Vojinović, M. (2011): Opšta fitofarmacija. Visoka poljoprirveredno- prehrambena škola

strukovnih studija, Prokuplje.

40. Vuković, S.M. (2014): Fungicidi u zaštiti bilja. Poljoprivredi fakultet, Univerzitet u Novom

Sadu.

41. Švob, M., (1974): Histološke i histokemijske metode. Svetlost, Sarajevo.

Internet izvori:

(https://www.agromarket.rks/srb/proizvod/70/Fungicidi/PYRUS-400-SC ).

(http://bioref.lastdragon.org/anamorphic_fungi/Botrytis_cinerea.html)

(http://coinme.pw/apple-scab-conidia.html)

(https://www.researchgate.net/figure/Anatomy-of-the-human-kidney-cut-to-show-internal-structures-

Arteries-and-veins-are_fig1_308433714)

(https://magoosh.com/mcat/mcat-review-topic-kidneys-and-renal-system/)

(http://science-naturalphenomena1.blogspot.com/2009/11/bowman-capsule.html)

(http://www.siumed.edu/~dking2/crr/rnguide.htm#distal)

(http://www.siumed.edu/~dking2/crr/rnguide.htm#distal)

(http://paraffinwaxco.com/paraffin-tissue-block/)

(https://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/histology-embedding-centers-

accessories/products/leica-eg1150/)

(https://www.tedpella.com/Embedding_html/Peel-AWay_Disposable_Histology_Molds.htm)

(https://www.tedpella.com/embedding_html/tissue_processing_cassettes.htm)

39

(https://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/histology-embedding-centers

accessories/products/leica-eg1150/ )

40

Прилог 5/1

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Ре

дни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: Монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Марија Пешић

Ментор, МН: Перица Васиљевић

Наслов рада, НР: Хистопатолошке промене гломерула пацова после 30-дневног третмана пириметанилом

Језик публикације, ЈП: Српски

Језик извода, ЈИ: Енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2019.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

52 тр. ; 10 слиka 1 табеla

Научна област, НО: Биологија

Научна дисциплина, НД: Токсикологија

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: гломерул, пириметанил, пацов, Wistar

УДК 591.8[599.324.2+591.4+615.282]

Чува се, ЧУ: Библиотека

Важна напомена, ВН:

Прилог 5/1

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

41

Извод, ИЗ: Циљ овог рада је био да се утврди утицај пириметанила на број и грађу гломерула пацова соја Wistar после 30-дневног третмана. Пириметанил је анилинопиримидински фунгицид који се користи првенствено за контролу сиве плесни на хортикултуралним и украсним културама. Пацови су третирани фунгицидом 30 дана орално концентрацијама: 500 mg/kg, 750 mg/kg, 1000 mg/kg i 2000 mg/kg. Хистолошка анализа је обухватала мерење површине гломерула и капсуларног простора и одређивање броја гломерула по видном пољу и броја подоцита по гломерулу. Код контролне групе животиња третиране физиолошким раствором површина гломерула износи 6062,43 ± 647,00 μm², највећа вредност је забележена при дози од 1000 mg/kg и износи 6338,52 ± 411,82 μm², док је најмања површина гломерула измерена при дози од 2000 mg/kg и износи 5648,55 ± 452,72 μm². Површина капсуларног простора код контролне групе животиња износи 1916,30 ± 342,54 μm², највећа вредност је забележена при дози пириметанила од 750 mg/kg и износи 1989,03 ± 160,43 μm², а најмања при дози од 2000 mg/kg и износи 1860,60 ± 486,19 μm². Иако је дошло до смањења површине гломерула и капсуларног простора у односу на контролу ANOVA не показује статистички значајну разлику (p>0,05). Број гломерула се са повећањем дозе пириметанила смањује. Највећи број гломерула се јавља у контролној групи и износи 8,42 ± 0,82 гломерула по видном пољу, док се најмањи број јавља при дози од 1000 mg/kg и износи 6,53 ± 0,42 гломерула по видном пољу. ANOVA показује статистичку значајност добијених резултата (p<0,05). ANOVA је праћена т-тестом који показује статистички значајну разлику између контролне групе животиња и група третираних концентрацијама 500 mg/kg, 750 mg/kg и 1000 mg/kg (P<α/3), док не постоји статистички значајна разлика између контролне и групе третиране дозом од 2000 mg/kg (P>α/3). Број подоцита по гломерулу се није много мењао под утицајем различитих доза пириметанила. У контролној групи број подоцита је 45,73 ± 7,63 подоцита по гломерулу, највећа вредност се јавља при дози од 1000 mg/kg и износи 50,90 ± 3,07 подоцита по гломерулу док је најмања вредност забележена при дози од 750 mg/kgи износи 45,07 ± 12,16 подоцита по гломерулу. ANOVA није показала статистички значајну разлику (p>0,05).

Истраживање је показало да пириметанил након 30-дневног третмана доводи до промене у броју и грађи гломерула.

Датум прихватања теме, ДП: 01.10.2019.

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник: др Љубиша Ђорђевић

Члан: др Јелена Виторовић

Члан, ментор: др Перица Васиљевић

Образац Q4.09.13 - Издање 1

42

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: Monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: Master thesis

Author, AU: Marija Pešić

Mentor, MN: Perica Vasiljević

Title, TI: Histopathological changes of rat glomeruli after 30 days of pyrimethanil treatment

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2019

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

52 p. ; 10 pictures, 1 table

Scientific field, SF: Biology

Scientific discipline, SD: Toxicology

Subject/Key words, S/KW: glomerul, pyrimethanil, rat, Wistar

UC 591.8[599.324.2+591.4+615.282]

Holding data, HD: Library

Note, N:

Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

43

Abstract, AB: The aim of this study was to determine the effect of pyrimethanil on the number and structure of glomeruli of Wistar rats after 30 days of treatment. Pyrimethanil is an anilinopyrimidine fungicide used primarily to control gray mold on horticultural and ornamental crops. Rats were treated with fungicide for 30 days orally at concentrations of 500 mg/kg, 750 mg/kg, 1000 mg/kg and 2000 mg/kg. Histological analysis included measuring the glomerular surface and capsular space and determining the number of glomeruli per field of view and the number of podocytes per glomerulus. In the control group of saline treated animals, the glomerulus area was 6062.43 ± 647.00 μm², the highest value was recorded at the dose of 1000 mg/kg and was 6338.52 ± 411.82 μm², while the smallest glomerular surface was measured at the dose of 2000 mg/kg and was 5648.55 ± 452.72 µm². The area of the capsular space in the control group of animals was 1916.30 ± 342.54 μm², the highest value was recorded at a dose of pyrimethanil 750 mg/kg and was 1989.03 ± 160.43 μm², and the smallest at a dose of 2000 mg/kg was 1860.60 ± 486.19 μm². Although there was a decrease in glomerular surface and capsular space relative to the control ANOVA did not show a statistically significant difference (p>0.05). The number of glomeruli decreases with increasing dose of pyrimethanil. The largest number of glomeruli occurred in the control group and amounted to 8.42 ± 0.82 glomeruli per field of view, while the smallest number occurred at the dose of 1000 mg/kg and was 6.53 ± 0.42 glomeruli per field of view. ANOVA showed statistical significance of the obtained results (p<0.05). The ANOVA was followed by a t-test showing a statistically significant difference between the control group of animals and the groups treated with concentrations of 500 mg/kg, 750 mg/kg and 1000 mg/kg (P<α/3), while there was no statistically significant difference between the control and groups treated with a dose of 2000 mg/kg (P>α/3). The number of podocytes per glomerulus did not change much under the influence of different doses of pyrimethanil. In the control group, the number of podocytes is 45.73 ± 7.63 podocytes per glomerulus, the highest value occurs at a dose of 1000 mg/kg and is 50.90 ± 3.07 podocytes per glomerulus, while the lowest value is recorded at a dose of 750 mg/kg and is 45.07 ± 12.16 podocytes per glomerulus. ANOVA showed no statistically significant difference (p>0.05).

The study showed that after 30 days of treatment, pyrimethanil leads to a change in the number and structure of glomeruli.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 01.10.2019.

Defended on, DE:

Defended Board, DB: President: dr Ljubiša Đorđević

Member: dr Jelena Vitorović

Member, Mentor: dr Perica Vasijević

Образац Q4.09.13 - Издање 1