DỰ THẢ

O TCVN

TCVN …

1 | 13

TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

DỰ THẢO

TCVN

MỸ PHẨM – PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH - ĐỊNH TÍNH

CÁC STEROID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP

MỎNG (TLC) VÀ SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (HPLC)

Cosmetics – Analytical methods - Identification of steroids by thin layer

chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC)

DỰ THẢ

O TCVN

TCVN …

2 | 13

Lời nói đầu

TCVN ...... được xây dựng trên cơ sở tham khảo ACM 007 - Identification of steroids in cosmetic

products by TLC and HPLC và thực nghiệm.

TCVN ....... do Viện Kiểm nghiệm Thuốc Thành phố Hồ Chí Minh biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng

cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

DỰ THẢ

O TCVN

TCVN …

3 | 13

T I Ê U C H U Ẩ N Q U Ố C G I A TCVN

Mỹ phẩm – Phương pháp phân tích - Định tính các steroid bằng

phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng cao áp

(HPLC)

Cosmetics – Analytical methods - Identification of steroids by thin layer

chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC)

A ĐỊNH TÍNH STEROID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG (TLC)

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lớp mỏng để định tính các steroid (bao gồm

hydrocortison acetat, dexamethason, betamethason, betamethason 17-valerat và triamcinolon

acetonid) trong mỹ phẩm.

2 Nguyên tắc

Sau khi chiết steroid bằng ethyl acetat (đối với mẫu thử dạng lỏng) hoặc methanol (đối với mẫu

thử dạng cream), các steroid được tách bởi phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC và xác định bởi

đèn UV tại bước sóng 254 nm, sử dụng các chất chuẩn tương ứng.

3 Thuốc thử

Tất cả thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích hoặc có chất lượng tương đương.

Nước sử dụng phải là nước đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy

định khác.

CẢNH BÁO: Công việc phân tích phải được tiến hành trong môi trường phòng thử nghiệm

phù hợp, được trang bị bảo hộ cá nhân (ví dụ: kính bảo hộ, quần áo bảo hộ lao động, găng

tay).

3.1. Dicloromethan.

3.2. Ethyl acetat.

3.3. Nước tinh khiết.

3.4. Methanol.

3.5. Anisaldehyd.

3.6. Acid sulfuric đậm đặc.

3.7. Dung dịch acid hydrocloric, 0,5 M.

DỰ THẢ

O TCVN

TCVN …

4 | 13

3.8. Dung dịch amonium hydroxyd, 0,5 M.

3.9. Acid acetic băng.

3.10. Dung môi khai triển, dicloromethan – methanol – nước (95 : 5 : 0,2) (tt/tt/tt)

3.11. Chất đối chiếu:

3.11.1. Hydrocortison acetat (RS).

3.11.2. Dexamethason (RS).

3.11.3. Betamethason (RS).

3.11.4. Betamethason 17-valerat (RS).

3.11.5. Triamcinolon acetonid (RS).

3.12. Dung dịch chuẩn đối chiếu.

Cân chính xác khoảng 10 mg mỗi chất chuẩn đối chiếu vào các bình định mức 10 ml (4.4) riêng

biệt, thêm 5 ml methanol (3.4) siêu âm 5 phút, tiếp tục thêm methanol (3.4) vừa đủ đến vạch, trộn

đều.

3.13. Dung dịch chuẩn đối chiếu hỗn hợp

Cân chính xác khoảng 10 mg mỗi chất chuẩn đối chiếu vào bình định mức 10 ml (4.4), thêm 5 ml

methanol (3.4) siêu âm 5 phút, tiếp tục thêm methanol (3.4) vừa đủ đến vạch, trộn đều. Hút 3 ml

dung dịch vào bình định mức 10 ml (4.4) thêm methanol (3.4) vừa đủ đến vạch.

3.14. Thuốc thử phát hiện (chỉ pha khi dùng)

Lấy chính xác 50 ml acid acetic băng (3.9) vào bình định mức 100 ml (4.4) thêm 0,5 ml

anisaldehyd (3.5), 11 ml acd sulfuric đậm đặc (3.6), lắc nhẹ nhàng.

4 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg

4.2 Đèn soi tử ngoại, 254 nm

4.3 Silica gel 60 F254, 10 cm x 20 cm; bề dày 0,25 mm (Merck hoặc tương đương)

4.4 Bình định mức, loại A, dung tích 10 ml, 100 ml

4.5 Bình chiết, loại A, dung tích 100 ml

4.6 Bể điều nhiệt

4.7 Bể siêu âm

4.8 Bình sắc ký

DỰ THẢ

O TCVN

TCVN …

5 | 13

4.9 Dụng cụ phun thuốc thử

4.10 Máy ly tâm, có thể quay ở tốc độ từ 3000 đến 4000 vòng/phút

4.11 Máy lắc

4.12 Máy đo pH

4.13 Màng lọc PVDF, 0,45 µm

4.14 Pipet thủy tinh, với các dung tích khác nhau

4.15 Tủ sấy

5 Cách tiến hành

5.1 Chuẩn bị dung dịch thử

5.1.1. Mẫu thử dạng lỏng: lấy chính xác khoảng 15 ml (4.14) mẫu thử, trung tính hóa đến pH 7

bằng dung dịch acid hydrocloric 0,5 M (3.7) hoặc dung dịch amonium hydroxyd 0,5 M (3.8), chiết 2

lần mỗi lần với 20 ml ethyl acetat (3.2), loại bỏ lớp nước, lọc và tập trung dịch chiết ethyl acetat,

bay hơi và cô cạn trên bể điều nhiệt (4.6), hòa tan cắn trong 5 ml methanol (3.4), lọc qua màng lọc

0,45 µm (4.13)

5.1.2. Mẫu thử dạng kem: cân chính xác khoảng 5000 mg mẫu thử trong ống ly tâm 20 ml, thêm

20 ml methanol (3.4), làm ấm trên bể điều nhiệt (4.6) ở 60 oC khoảng 10 min lắc mạnh trong 5 min.

Ly tâm (4.10) ở 3000 – 4000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó để tủ lạnh 10 phút, bay hơi dung

dịch trong phía trên đến khô trên bể điều nhiệt (4.6), hòa tan cắn trong 5 ml methanol (3.4), lọc qua

màng lọc 0,45 µm (4.13)

5.2 Xác định bằng TLC

5.2.1 Điều kiện sắc ký lớp mỏng

Hoạt hóa bản mỏng (4.3) ở 100 oC trong 10 phút

Bão hòa bình sắc ký (4.8) với hệ dung môi triển khai (3.10)

5.2.2 Phân tích mẫu thử

Chấm lên mỗi bản mỏng (4.3) 20 µl của dung dịch thử; dung dịch chuẩn đối chiếu; dung dịch thử -

dung dịch chuẩn đối chiếu với tỷ lệ (1:1)

Triển khai bản mỏng sắc ký khoảng 15 cm (tránh ánh sáng)

Lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng

Quan sát bản mỏng dưới đèn soi tử ngoại 254 nm (4.2), đánh dấu vị trí của các vết trên bản mỏng

Phun thuốc thử phát hiện (3.14)

Sấy (4.15) ở 120 oC trong 10 phút, quan sát màu của vết nhận được.

DỰ THẢ

O TCVN

TCVN …

6 | 13

6 Đánh giá kết quả

6.1 Tính giá trị Rf, các vết sau khi sắc ký mẫu thử và mẫu chuẩn đối chiếu bằng công thức sau:

a: khoảng cách từ tâm của vết đến vạch xuất phát.

b: khoảng cách từ đường dung môi đến vạch xuất phát

6.2 Quan sát vị trí, hình dạng và màu sắc, các vết sắc ký khi soi đèn và sau khi phun thuốc

thử của mẫu thử và mẫu chuẩn

6.3 Kết quả,

So sánh các vết thu được từ mẫu thử với các vết mẫu chuẩn tương ứng về trị số Rf và màu

sắc sau khi phun thuốc thử.

Trường hợp dương tính: Mẫu thử phải cho vết có hính dạng, màu sắc và Rf tương ứng với

vết của mẫu chuẩn đối chiếu.

Steroid Rf Màu sắc của vết sau khi phun

thuốc thử

Dexamethason Khoảng 0,17 Xanh xám

Betamethason Khoảng 0,15 Xám

Triamcinolon acetonid Khoảng 0,29 Nâu

Hydrocortison acetat Khoảng 0,39 Vàng

Betamethason valerat Khoảng 0,36 Tím đen

Trường hợp dương tính theo phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC), thực hiện thêm phương

pháp HPLC theo mục B để khẳng định.

DỰ THẢ

O TCVN

TCVN …

7 | 13

B ĐỊNH TÍNH STEROID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

(HPLC)

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA để định tính các

steroid (bao gồm prednison, prednisolon, betamethason, dexamethason, cortison, hydrocortison

acetat, mometason furoat, betamethason 17-valerat, và triamcinolon acetonid) trong mỹ phẩm.

2 Nguyên tắc

Mẫu thử được chiết với methanol, làm bay hơi dịch chiết đến khô, cắn được hòa trong methanol

dùng định tính steroid bằng phương pháp HPLC với cột pha đảo và đầu dò PDA.

3 Thuốc thử

Tất cả thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích, dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng

cao hoặc có chất lượng tương đương. Nước sử dụng phải là nước đã khử ion hoặc nước có độ

tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

CẢNH BÁO: Công việc phân tích phải được tiến hành trong môi trường phòng thử nghiệm

phù hợp, được trang bị bảo hộ cá nhân (ví dụ: kính bảo hộ, quần áo bảo hộ lao động, găng

tay).

3.1 Methanol.

3.2 Acetonitril .

3.3 Nước.

3.4 Pha động.

Thời gian (phút) Thành phần pha động %

Acetonitril Nước

0,00 20 80

2,00 25 75

14,00 30 70

18,00 40 60

20,00 50 50

22,00 70 30

30,00 20 80

45,00 20 80

3.5 Chất chuẩn

3.5.1 Prednison.

3.5.2 Prednisolon.

DỰ THẢ

O TCVN

TCVN …

8 | 13

3.5.3 Betamethason.

3.5.4 Dexamethason.

3.5.5 Cortison.

3.5.6 Hydrocortison acetat.

3.5.7 Mometason furoat.

3.5.8 Betamethason 17-valerat.

3.5.9 Triamcinolon acetonid.

3.6 Dung dịch chuẩn.

3.6.1 Dung dịch chuẩn đối chiếu.

Cân chính xác khoảng 5 mg mỗi chất chuẩn đối chiếu, chính xác đến 0,01 mg, cho vào từng bình

định mức 20 ml (4.7), thêm 5 ml methanol (3.1), siêu âm 5 phút, thêm methanol (3.1) đến vạch lắc

đều.

3.6.2 Dung dịch chuẩn hỗn hợp

Lấy 1ml của từng dung dịch chuẩn đối chiếu (3.6.1) vào bình định mức 10 ml (4.7) điền đầy vói

methanol (3.1), lọc qua màng lọc 0,45 µm (4.10).

Dung dịch chuẩn hỗn hợp 0,025 mg/ml.

4 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, đầu dò PDA, được trang bị bơm, bộ bơm mẫu tự

động, bộ điều nhiệt cho cột và máy tính phân tích dữ liệu.

4.2 Cột phân tích HPLC, Phenyl-Hexyl (kích thước 4,6 mm x 150 mm, 3 µm) hay tương đương.

4.3 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg, 0,01 mg.

4.4 Máy lắc.

4.5 Máy ly tâm, có thể quay ở tốc độ từ 3000 đến 4000 vòng/phút.

4.6 Bể điều nhiệt

4.7 Bình định mức, loại A, dung tích 5, 10, 25 và 50 ml.

4.8 Pipet thủy tinh, với các dung tích khác nhau.

4.9 Ống ly tâm, 10 ml, có nắp đậy kín.

4.10 Màng lọc PVDF, 0,45 µm.

4.11 Xylanh, dung tích 5 ml.

DỰ THẢ

O TCVN

TCVN …

9 | 13

4.12 Lọ đựng mẫu cho HPLC, loại 1,5 ml hoặc tương đương (phù hợp thiết bị sử dụng).

5 Cách tiến hành

5.1 Chuẩn bị dung dịch thử

- Cân chính xác khoảng 1,000 g mẫu thử, chính xác đến 0,1 mg, vào vào ống ly tâm (4.9), thêm

5 ml methanol (3.1), Làm ấm trong bể điều nhiệt (4.6) ở 60 oC trong 10 phút, lắc mạnh 10 phút, ly

tâm 3000-4000 vòng/phút, sau đó để lạnh trong 10 phút, lấy dịch trong bay hơi đến khô trên bể

điều nhiệt (4.6) , hòa tan cắn trong 5 ml methanol (3.1).

- Lọc qua màng lọc 0,45 µm (4.10) (nếu cần ly tâm 10 phút

5.2 Điều kiện sắc ký

– Pha động: Chạy theo chế độ gradient (3.4)

– Detector: PAD ở bước sóng 240 nm

– Thể tích mẫu bơm: 10 µl

– Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút

– Nhiệt độ buồng cột: 40 oC

– Thời gian sắc ký: 45 phút

5.3 Tương thích hệ thống

5.3.1 Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp, xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích

hoặc chiều cao pic. RSD phải nhỏ hơn 2 % ở tất cả các chất đối chiếu.

5.3.2 Độ phân giải giữa các đỉnh liền nhau trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn hỗn hợp (3.6.2)

phải lớn hơn 1,5.

5.3.3 Hệ số bất đối xứng của các đỉnh khoảng từ 0,9 – 1,5

5.4 Tiêm lần lượt các dung dịch sau:

5.4.1. Các dung dịch chuẩn đối chiếu.

5.4.2. Dung dịch chuẩn hỗn hợp.

5.4.3 Dung dịch thử

6 Đánh giá kết quả

6.1 Mẫu thử được xác định là dương tính với một hợp chất steroid khi:

- Thời gian lưu của pic tương ứng trong mẫu thử khác biệt không quá 1 % so với thời gian lưu của

pic chính tương ứng trong sắc ký đồ mẫu chuẩn.

DỰ THẢ

O TCVN

TCVN …

10 | 13

- Diện tích hay chiều cao của pic tương ứng trong mẫu thử lớn hơn diện tích hay chiều cao của pic

chính tương ứng trong sắc ký đồ có nồng độ ứng với LOD trong dung dịch chuẩn.

- Pic phải đáp ứng các yêu cầu mục 5.3.2 (nếu cần), mục 5.3.3 và phổ PDA của pic giống với pic

tương ứng trong sắc ký đồ mẫu chuẩn.

6.2. Mẫu thử được xác định là âm tính với một hợp chất steroid khi diện tích hay chiều cao của pic

tương ứng trong mẫu thử nhỏ hơn diện tích hay chiều cao của pic chính tương ứng trong sắc ký

đồ mẫu tự tạo có nồng độ ứng với LOD pha trong dung dịch chuẩn.

7. Ghi chú: thông tin tham khảo

LOD cho tất cả các steroid trong dung dịch chuẩn là 1 µg/mL tương ứng trong mẫu thử 5 µg/g.

Hình 1. sắc ký đồ và thông tin pic của dung dịch chuẩn hỗn hợp

DỰ THẢ

O TCVN

TCVN …

11 | 13

DỰ THẢ

O TCVN

TCVN …

12 | 13

Hình 2. phổ UV các pic chuẩn steroid của dung dịch chuẩn hỗn hợp.

DỰ THẢ

O TCVN

TCVN …

13 | 13

Hình 3. ví dụ sắc ký đồ và thông tin pic của dung dịch tự tạo với chuẩn hỗn hợp có nồng độ

LOD trên nền mẫu kem

Tài liệu tham khảo

[1]. ACM 007 - Modified and approved after the final review in Malaysia on November 28th,

2013, updated on 21st June 2019.