I H C KHOA H C T NHIÊN - hus.vnu.edu.vn (25).pdf · Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân Khoa Sinh h ọ c Khóa 2010 - 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân

Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Chử Lƣơng Luân

NGHIÊN CỨU VÀ THỬ NGHIỆM HẠT NANO

KIM LOẠI ĐƢỢC CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT

TRONG CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012



ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Chử Lƣơng Luân

NGHIÊN CỨU VÀ THỬ NGHIỆM HẠT NANO

KIM LOẠI ĐƢỢC CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT

TRONG CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO

Chuyên ngành : Sinh học Thực nghiệm

Mã số : 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC :

PGS. TS. Phan Tuấn Nghĩa

Hà Nội - 2012



LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, tôi luôn nhận được rất

nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và chỉ dẫn tận tình.

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới

PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa, TS. Phạm Bảo Yên và TS. Nguyễn Thị Vân Anh đã tận

tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện

luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Bộ môn Sinh lý thực vật

và Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia

Hà Nội đã mang đến những kiến thức quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi

trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường.

Tôi cũng xin gửi lời cảm các cán bộ viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Khoa

Vi sinh – Viện Quân Y 103 đã cung cấp mẫu cho tôi trong quá trình nghiên cứu.

Qua đây, tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ và tập thể nhóm nghiên

cứu tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein đã nhiệt tình

giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn thạc sĩ.

Luận văn được thực hiện dưới sự tài trợ kinh phí của đề tài mã số

2/2010/HĐ-NCCBUD do GS.TSKH. Nguyễn Hoàng Lương làm chủ trì.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình, người thân

và bạn bè luôn động viên, giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.

Một lần nữa tôi xin trân trọng cảm ơn !

Hà Nội, ngày 21 tháng 12 năm 2012

Học viên

Chử Lương Luân



MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3

1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LAO ........................................................... …3

1.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn lao ................................................................................ 3

1.1.2. Hệ gene vi khuẩn lao ......................................................................................... 4

1.1.3. Khả năng gây bệnh và tình hình bệnh lao ......................................................... 6

1.1.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán vi khuẩn lao ........................................................ 8

1.2. NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ HẠT NANO KIM LOẠI .................. 11

1.2.1. Tính chất của hạt nano kim loại ...................................................................... 11

1.2.2. Một số loại hạt nano kim loại ......................................................................... 13

1.2.3. Ứng dụng của hạt nano kim loại trong y học .................................................. 17

1.3. CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT HẠT NANO TỪ, GẮN KẾT VÀ LÀM

GIÀU TẾ BÀO VI KHUẨN LAO…………………...……..…………………...17

1.3.1. Chức năng hóa bề mặt hạt nano từ .................................................................. 17

1.3.2. Quá trình gắn kết hạt nano từ với kháng thể kháng lao .................................. 19

1.3.3. Làm giàu tế bào vi khuẩn lao bằng từ trƣờng ................................................. 21

CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .......................................... 22

2.1. NGUYÊN LIỆU ................................................................................................ 22

2.1.1. Mẫu đờm lao và vaccine BCG ........................................................................ 22

2.1.2. Hạt nano kim loại có từ tính ............................................................................ 23

2.1.3. Mồi đặc hiệu .................................................................................................... 23

2.1.4. Các loại đệm ................................................................................................... 23

2.1.5. Các hóa chất và nguyên liệu khác ................................................................... 24

2.1.6. Máy móc và thiết bị ......................................................................................... 24



2.2. PHƢƠNG PHÁP .............................................................................................. 24

2.2.1. Phƣơng pháp chấm kết tủa miễn dịch ............................................................. 24

2.2.2. Phƣơng pháp gắn kết hạt nano từ đã đƣợc chức năng hóa bề mặt với kháng

thể kháng vi khuẩn lao .............................................................................................. 26

2.2.3. Phƣơng pháp làm giàu vi khuẩn lao để làm khuôn cho phản ứng PCR…..…27

2.2.4. Phƣơng pháp ly giải tế bào vi khuẩn lao thu ADN…………….……………27

2.2.5. Đánh giá độ bền của phức hệ hạt từ gắn kháng thể kháng lao………………28

2.2.6. Nhân bản đoạn gen đích đặc hiệu bằng PCR .................................................. 29

2.2.7. Điện di trên gel agarose................................................................................... 31

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 32

3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN GẮN KHÁNG THỂ LÊN

BỀ MẶT HẠT NANO TỪ TRÊN BCG ................................................................ 32

3.1.1. Kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng lao .................................................. 32

3.1.2. Kiểm tra hiệu suất phản ứng gắn kết trong các đệm khác nhau……….……34

3.1.3. Kết quả ly giải tế bào vi khuẩn lao bằng các phƣơng pháp khác nhau ........... 38

3.1.4. Tối ƣu hóa nồng độ BCG sử dụng .................................................................. 41

3.1.5. Tối ƣu hóa thời gian phản ứng gắn kết ........................................................... 42

3.1.6. Độ đặc hiệu của phƣơng pháp ......................................................................... 43

3.2. THỬ NGHIỆM CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƢU LÊN MẪU BỆNH PHẨM .... 45

3.3. ĐÁNH GIÁ ĐỘ BỀN CỦA PHỨC HỆ HẠT NANO TỪ GẮN KHÁNG

THỂ KHÁNG LAO ................................................................................................. 49

KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO .................................... 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 54



DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid deoxyribonucleic

AFB Acid Fast Bacilli

AP Đệm gồm 100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, pH

9,5

APTS 3 – aminopropyl triethoxysilane

BCG Bacillus Calmette Guerin

bp Cặp bazơ (base pair)

BSA Albumin huyết thanh bò (Bovine Serum Albumin)

dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate

ĐC Đối chứng

EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

IS Trình tự đoạn chèn vào (Insert Sequence)

kb Kilobase

MES 2 - (N-morpholino) ethanesulfonic acid

MTB Mycobacterium tuberculosis

NP-NH2 Hạt nano từ có gắn nhóm amine

NHS N-hydroxysuccinimide

PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)

PBS Muối chứa đệm phosphate (Phosphate Buffered Saline)

PBS-TBN Đệm PBS pH 7,4 bổ sung 0,01% Tween20; 0,1% BSA và 0,05

M NaN3

TB Lao (Tuberculosis)

TAE Tris base – Acid acetic - EDTA

TE Tris-HCl – EDTA

TET Tris-HCl – EDTA – Triton X-100

WHO Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization)

http://translate.googleusercontent.com/translate_c?depth=1&hl=vi&ie=UTF8&prev=_t&rurl=translate.google.com.vn&sl=en&tl=vi&u=http://en.wikipedia.org/wiki/N-hydroxysuccinimide&usg=ALkJrhisBj8s3OIV46FUxXqGFLe8vaf2Zw



DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng Số trang

Bảng 2.1. Trình tự các mồi dùng trong phản ứng PCR 23

Bảng 2.2. Các thành phần trong phản ứng PCR với vaccine BCG 30

Bảng 2.3. Các thành phần trong phản ứng PCR với mẫu đờm lao 30

Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 31

Bảng 3.1. Kết quả phân tích độ sáng của vết đốm tròn trên màng lai 33

Bảng 3.2. Thành phần và tỷ lệ các chất tham gia gắn kết 35

Bảng 3.3. Đánh giá mức độ gắn kết qua phần mềm Image J 38



DANH MỤC CÁC HÌNH

Tên hình Số

trang

Hình 1.1. Vi khuẩn lao trong tiêu bản nhuộm Ziehl – Neelsen [35] 3

Hình 1.2. Hệ gene của chủng MTB H37Rv [16] 5

Hình 1.3. Một cấu trúc tinh thể từ các phân tử nano vàng [36] 14

Hình 1.4. Hình ảnh hiển vi điện tử của hạt nano từ Fe3O4 [37] 16

Hình 1.5. Hạt nano từ tính Fe3O4 đƣợc chức năng hóa bề mặt bằng nhóm

amine sử dụng APTS [34] 19

Hình 1.6. Quy trình gắn kết hạt nano đƣợc chức năng hóa với kháng thể

[20] 20

Hình 1.7. Nguyên tắc chọn lọc và làm giàu tế bào bằng từ trƣờng [6] 21

Hình 2.1. Vaccine BCG sản xuất tại Việt Nam 22

Hình 2.2. Mô hình hóa phức hệ hạt nano từ đã đƣợc chức năng hóa bề mặt

với kháng thể kháng vi khuẩn lao 26

Hình 3.1. Kết quả kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng lao 33

Hình 3.2. Quy trình đánh giá mức độ phức hệ kháng thể gắn hạt 36

Hình 3.3. Kết quả đánh giá mức độ phức hệ kháng thể gắn hạt 37

Hình 3.4. Kết quả ly giải tế bào vi khuẩn lao bằng các phƣơng pháp khác

nhau 39

Hình 3.5. Kết quả thử nghiệm nồng độ BCG sử dụng 41

Hình 3.6. Tối ƣu hóa thời gian phản ứng gắn kết giữa hạt nano – EDC -

kháng thể kháng lao 42

Hình 3.7. Kết quả thí nghiệm kiểm tra tính đặc hiệu 44

Hình 3.8. Quy trình ứng dụng các điều kiện tối ƣu trên mẫu đờm lao 45

Hình 3.9. Kết quả thử nghiệm các điều kiện tối ƣu trên 7 mẫu bệnh lao 46

Hình 3.10. Kết quả thử nghiệm các điều kiện tối ƣu trên 5 mẫu bệnh lao 47

Hình 3.11. Tối ƣu hóa thời gian ủ mẫu đờm lao 48

Hình 3.12. Quy trình đánh giá độ bền vững của phức hạt nano từ gắn

kháng thể 49

Hình 3.13. Kết quả đánh giá độ bền vững của phức hạt nano từ gắn kháng

thể với mẫu vaccine BCG 50

Hình 3.14. Thử nghiệm độ bền vững của phức hạt nano từ gắn kháng thể

với mẫu đờm lao 51



MỞ ĐẦU

Bệnh lao là một trong ba bệnh truyền nhiễm gây tử vong cao nhất thế giới,

bệnh đƣợc gây ra bởi vi khuẩn lao có tên khoa học là Mycobacterium tuberculosis

(MTB). Tổ chức Y tế thế giới (WHO) ƣớc tính khoảng 1/3 dân số toàn cầu hiện nay

đã bị nhiễm MTB và có khoảng 1,7 triệu ngƣời tử vong do lao hàng năm, tức là

khoảng 4700 ngƣời tử vong mỗi ngày vì lao. Mặc dù công tác tiêm chủng vaccine

BCG, phòng chống và phát triển thuốc chống lại vi khuẩn lao đã có những bƣớc

tiến đáng kể nhƣng cho đến nay bệnh lao vẫn là một vấn đề sức khỏe có tính thách

thức đối với toàn cầu. Bệnh nhân bị nhiễm các chủng vi khuẩn lao nếu phát hiện

muộn sẽ rất khó điều trị và tăng nguy cơ lây truyền sang ngƣời lành. Do đó việc

chẩn đoán sớm các chủng vi khuẩn lao sẽ góp phần đáng kể trong điều trị bệnh lao

[1, 33].

Để chẩn đoán vi khuẩn lao, hiện nay bệnh viện và các cơ sở y tế trong nƣớc

vẫn phải dựa vào các phƣơng pháp cổ điển nhƣ soi trực tiếp, nuôi cấy vi khuẩn…,

yêu cầu số lƣợng vi khuẩn lao lớn hoặc thời gian chẩn đoán lao cần ít nhất 4 – 6

tuần. Với những nhƣợc điểm nhƣ vậy sẽ khó khăn cho công tác điều trị, khó đáp

ứng yêu cầu giám sát và thanh toán bệnh lao [2, 3].

Khắc phục những nhƣợc điểm đó, việc ứng dụng sinh học phân tử kết hợp

công nghệ nano đang tạo ra những đột phá trong chẩn đoán vi khuẩn lao cũng nhƣ

các chủng vi khuẩn khác. Thời gian chẩn đoán có thể rút ngắn xuống còn vài ngày,

với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tạo điều kiện cho việc kiểm soát bệnh lao dễ dàng

hơn [23, 25].

Công nghệ nano ngày nay đang có những bƣớc tiến quan trọng trong chẩn

đoán và hỗ trợ điều trị bệnh nhằm mục đích cải thiện và nâng cao sức khỏe của con

ngƣời. Trong số đó, các hạt nano kim loại đặc biệt là hạt nano kim loại có từ tính

đƣợc chức năng hóa bề mặt đã và đang đƣợc nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi trong



những năm gần đây, ví dụ nhƣ phân tách tế bào, tách chiết acid nucleic (ADN,

ARN), gắn kết với kháng thể…[5, 27].

Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu và thử nghiệm

hạt nano kim loại đƣợc chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán vi khuẩn lao”

với các mục tiêu sau :

Xây dựng quy trình gắn kết hạt nano kim loại có từ tính đã đƣợc chức năng

hóa bề mặt với kháng thể kháng vi khuẩn lao và đánh giá khả năng làm giàu MTB

bằng hạt nano kim loại có từ tính đã đƣợc chức năng hóa bề mặt gắn anti-TB để

phát hiện MTB bằng kỹ thuật PCR.



CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LAO

Vi khuẩn lao do Robert Koch tìm ra năm 1882, vì vậy còn đƣợc gọi là

Bacilie de Koch (viết tắt là BK). Đã hơn một thế kỷ kể từ khi phát hiện ra vi khuẩn

lao, nhờ việc áp dụng các kỹ thuật hiện đại trong hóa sinh, miễn dịch, sinh học phân

tử…cùng với kính hiển vi điện tử, ngƣời ta đã hiểu tƣơng đối rõ về cấu trúc, đặc

điểm sinh học và khả năng gây bệnh của vi khuẩn lao. Tuy nhiên, vi khuẩn lao vẫn

là đối tƣợng nghiên cứu của nhiều công trình khoa học vì sự tinh vi trong siêu cấu

trúc, tính chất phức tạp của các kháng nguyên, sự đa dạng trong hình thức tồn tại,

nhất là những đột biến gen khi vi khuẩn kháng thuốc [2, 3].

1.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn lao

Tác nhân gây bệnh lao là Mycobacterium tuberculosis (MTB), tế bào MTB

dài 3-5µm, rộng 0,3-0,5µm, không có lông, hai đầu tròn, thân có hạt, tế bào đứng

riêng rẽ hoặc xếp thành hình chữ N, Y, V hoặc thành dãy phân nhánh nhƣ cành cây

trên tiêu bản nhuộm Ziehl – Neelsen, không bị cồn và acid làm mất màu đỏ của

fucsin.

Hình 1.1. Vi khuẩn lao trong tiêu bản nhuộm Ziehl – Neelsen [35]

MTB là vi khuẩn hiếu khí, phân chia mỗi lần từ 16 đến 20 giờ, rất chậm so

với thời gian phân chia tính bằng phút của các vi khuẩn khác (trong số các vi khuẩn

phân chia nhanh nhất là một chủng E. coli, có thể phân chia mỗi 20 phút). MTB

MTB



không đƣợc phân loại Gram dƣơng hay Gram âm vì chúng không có đặc tính hoá

học này, mặc dù thành tế bào có chứa peptidoglycan. Trên mẫu nhuộm Gram, tế

bào vi khuẩn cho kết quả nhuộm rất yếu hoặc là không biểu hiện gì cả.

MTB có thể chịu đựng đƣợc chất sát khuẩn yếu và sống sót trong trạng thái

khô trong nhiều tuần nhƣng trong điều kiện tự nhiên, chỉ có thể phát triển trong sinh

vật ký chủ (cấy MTB in vitro cần thời gian dài để có kết quả, nhƣng ngày nay là

công việc bình thƣờng ở phòng xét nghiệm) [2, 3].

Hiện nay xu hƣớng phân loại vi khuẩn lao dựa vào trình tự ADN của chúng

đã đƣợc áp dụng. Ngƣời ta nhận thấy đoạn IS6110 với 1361 cặp base chỉ có ở bốn

loại mycobacteria là M. tuberculosis , M. bovis, M. africanum và M. microti (gọi

chung là M. tuberculosis complex) mà không có ở các mycobacteria khác [17, 31].

1.1.2. Hệ gene vi khuẩn lao

Từ năm 1998, nhờ Cole và cộng sự [16], toàn bộ trình tự của chủng MTB

H37Rv đã đƣợc giải mã và phân tích, cung cấp những kiến thức sinh học về loài vi

khuẩn sinh sản chậm này, mở ra những khái niệm mới trong can thiệp phòng và

điều trị bệnh.

Toàn bộ hệ gene gồm 4411529 bp chứa khoảng 4000 gene, với tỷ lệ GC cao

khoảng 65%. Điểm khác cơ bản trong hệ gene giữa MTB với những vi sinh vật

khác là phần lớn các gene mã hoá những enzyme có liên quan đến việc tổng hợp và

phân giải lipid, có 2 họ protein mới (PE và PPE) giàu glycine với cấu trúc lặp lại.

MTB thƣờng kháng ngẫu nhiên với nhiều thuốc làm cho việc điều trị lao trở

nên khó khăn. Sự kháng thuốc này chủ yếu là do vách tế bào kỵ nƣớc tác dụng nhƣ

là rào cản thấm, tuy vậy nhiều yếu tố quyết định sự kháng thuốc đƣợc mã hóa trong

hệ gene vi khuẩn nhƣ là enzyme thủy phân, enzyme biến đổi tác dụng của thuốc

nhƣ β-lactamase, aminoglycoside acetyl transferase…và nhiều hệ thống vận chuyển

thuốc ra ngoài khác.



Hình 1.2. Hệ gene của chủng MTB H37Rv [16]

Vòng tròn ngoài cùng biểu hiện thang cho MTB, 0 – nơi bắt đầu sao chép. Vòng

tròn đầu tiên tính từ ngoài vào cho thấy vị trí gene ARN ổn định, trình tự DR đại diện bằng

hình khối hồng. Vòng tròn thứ 2 bên trong chỉ trình tự mã hoá (theo chiều kim đồng hồ -

xanh lá đậm, ngược chiều kim đồng hồ - xanh lá nhạt). Vòng tròn thứ 3 minh họa trình tự

ADN lặp (trình tự chèn – cam, họ 13E12 REP – hồng đậm, prophage – xanh dương), vòng

tròn thứ 4 chỉ vị trí họ PPE (xanh lá), vòng tròn thứ 5 chỉ họ PE (tím, ngoại trừ PGRS), và

vòng tròn thứ 6 chỉ vị trí trình tự PGRS (đỏ sậm). Biểu đồ tròn khu vực trung tâm biểu hiện

lượng GC, màu vàng chỉ ít hơn 65% GC, khu vực màu đỏ là GC cao hơn 65% [16].

Các nghiên cứu cho thấy nhóm MTB có hệ gene bảo tồn cao. Các thành viên

trong họ MTB có tính đa dạng cao khi xét về kiểu hình hoặc kiểu kí chủ, đây là ví

dụ điển hình cho tính ổn định di truyền giữa các chủng, với tốc độ đột biến vô nghĩa

làm nên điểm đa hình ƣớc tính khoảng 0,01% - 0,03%, nhất là không có bằng chứng

nào cho thấy có sự di truyền ngang vật chất di truyền trong cùng thế hệ giữa các vi

khuẩn lao nhƣ các vi khuẩn khác [16].



1.1.3. Khả năng gây bệnh và tình hình bệnh lao

Về mặt dịch tễ học, tất cả những bệnh nhân lao đều có thể là nguồn lây,

nhƣng mức độ lây rất khác nhau. Đối với các thể lao ngoài phổi (lao màng não,

màng bụng, hạch, xƣơng khớp…) đƣợc gọi là những thể lao “kín”, nghĩa là vi

khuẩn ít khả năng nhiễm vào môi trƣờng bên ngoài. Lao phổi là thể lao dễ đƣa vi

khuẩn ra môi trƣờng bên ngoài. Bệnh nhân lao phổi khác nhau thì khả năng lây

bệnh cho ngƣời khác cũng khác nhau, tùy thuộc vào: số lƣợng vi sinh vật thoát ra

ngoài môi trƣờng, mật độ vi sinh vật trong không khí, thời gian vật chủ phơi nhiễm

không khí đã bị ô nhiễm, tình trạng miễn dịch của từng cá thể. Bệnh nhân nhiễm

HIV và những bệnh nhân rối loạn miễn dịch qua trung gian tế bào thì bệnh càng

trầm trọng khi bị nhiễm MTB. Tuy vậy khả năng lan truyền bệnh của những bệnh

nhân này không cao [2, 3].

MTB tồn tại trong các hạt khí dung nhỏ lơ lửng ngoài không khí. Khi đƣợc

hít vào, vi khuẩn sẽ đi vào phổi, đến phế nang. Tại đây, vi khuẩn sẽ nhân lên hoặc bị

ức chế tuỳ thuộc vào tình trạng hệ thống miễn dịch của cơ thể. Trong vòng 2-10

tuần, các đại thực bào đƣợc hoạt hoá, bao quanh vi khuẩn tạo nên lớp vỏ cứng giúp

kìm hãm và kiểm soát vi khuẩn (giai đoạn lao nhiễm). Nếu hệ thống miễn dịch của

cơ thể không thể kiểm soát đƣợc vi khuẩn, vi khuẩn sẽ nhân lên nhanh chóng và có

thể theo đƣờng máu và đƣờng bạch huyết tấn công vào các bộ phận khác nhau nhƣ

phổi, thận, não, xƣơng (giai đoạn lao bệnh) [2, 3].

MTB có cơ chế đặc biệt để tấn công vào tế bào. MTB có thể gắn trực tiếp

vào thụ thể mannose trên đại thực bào nhờ glycolipid đã đƣợc mannose hoá trên

vách, hoặc nhờ lipoarabinomannan, hay gắn gián tiếp nhờ thụ thể bổ thể, thụ thể Fc.

Thông thƣờng khi vật lạ bị đại thực bào bắt giữ sẽ bị cơ chế thực bào qua trung gian

chất oxy hoá tiêu diệt. MTB biến đổi cơ chế gây độc này, ngăn cản sự kết hợp

phagosome với lysosome. Vách MTB có loại acid mycolic là lipid chuyên biệt

nhánh alpha, những phân tử kị nƣớc mạnh, hình thành lớp vỏ lipid bao quanh vi

sinh vật, ảnh hƣởng đến khả năng thấm vật chất qua bề mặt tế bào. Cho đến nay

ngƣời ta cho rằng acid mycolic là nhân tố chính quyết định độc tính của MTB, có



thể nhờ đó mà MTB tránh đƣợc các protein tích điện dƣơng, lysozyme và các gốc tự

do trong các hốc thực bào, giúp MTB ngoại bào thoát khỏi sự tấn công của các bổ

thể trong huyết thanh. Một trong những sản phẩm liên kết acid mycolic với các chất

lipid phức tạp là cord factor - yếu tố gây độc đối với tế bào động vật có vú. Chủng

MTB độc tính sinh ra rất nhiều nhân tố cord factor. Những lợi điểm giúp MTB gây

bệnh rất phức tạp và chƣa đƣợc hiểu đầy đủ. Chính vì vậy, hiện nay tình hình bệnh

lao trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam đang trở nên nghiêm trọng và có những diễn

biến phức tạp [2, 13].

Theo WHO ƣớc tính trên thế giới có khoảng 1,7 triệu ngƣời tử vong do lao

hàng năm, trong đó có khoảng 380.000 phụ nữ, tức là khoảng 4700 ngƣời tử vong

mỗi ngày vì lao. Tỷ lệ tử vong do lao giảm đi khoảng 35% từ năm 1990 cho đến

nay. Bệnh lao đƣợc tính là một trong 3 nguyên nhân gây tử vong nhiều nhất cho phụ

nữ tuổi 15-44. Về số ngƣời mới mắc hàng năm ƣớc tính khoảng 9,4 triệu, trong đó

3,3 triệu phụ nữ, 1,1 triệu ngƣời có HIV dƣơng tính. Từ năm 2004, tỷ lệ mắc mới

hàng năm đã giảm đi nhƣng tốc độ giảm quá chậm. Thêm nữa, lao đa kháng thuốc

đang là một thách thức rất lớn đối với nhân loại, ƣớc tính khoảng 0,5 triệu bệnh

nhân mắc lao đa kháng thuốc với tỷ lệ 3,3% trong số bệnh nhân lao mới mắc. Theo

điều tra lớn nhất của WHO năm 2010, tỷ lệ lao đa kháng thuốc cao nhất ở một số

khu vực thuộc Liên Xô cũ, tới 28% số bệnh nhân lao mới và nguy hiểm hơn là bệnh

lao siêu kháng đã xuất hiện trên 58 quốc gia, trong đó có Việt Nam. Nhiều quốc gia

đã triển khai kế hoạch quản lý lao đa kháng, tuy nhiên xét trên bình diện thế giới thì

còn ở mức độ rất thấp, còn cách xa yêu cầu kiểm soát bệnh lao [1, 33].

Nhƣ vậy có thể nói rằng, đã qua 130 năm sau khi Robert Kock tìm ra vi

khuẩn lao, bệnh lao mới chỉ khống chế đƣợc một phần về số ngƣời mắc nhƣng lại

nguy hiểm hơn vì đã xuất hiện bệnh lao đa kháng và siêu kháng đang lan rộng trên

quy mô lớn. Cần phải có phƣơng pháp giải quyết mới trƣớc khi quá muộn.

Theo báo cáo của WHO, năm 2011 Việt Nam xếp thứ 12 trong 22 nƣớc có số

lƣợng bệnh nhân lao cao nhất thế giới và thứ 14 trong 27 nƣớc có tình hình lao đa



kháng và siêu kháng cao. Hàng năm ƣớc tính có thêm 180.000 bệnh nhân lao, trong

đó có khoảng 6000 bệnh nhân lao đa kháng và khoảng 7400 bệnh nhân lao/HIV.

Tuy nhiên chúng ta mới chỉ phát hiện đƣợc khoảng 60% số bệnh nhân ƣớc tính tức

là trên dƣới 100.000 bệnh nhân mỗi năm [1, 33].

Điều này cho thấy tăng cƣờng phát hiện tất cả các thể bệnh lao, chẩn đoán vi

khuẩn lao là một ƣu tiên hàng đầu trong công tác chống lao ở Việt Nam hiện nay.

1.1.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán vi khuẩn lao

Phát hiện đƣợc vi khuẩn lao là tiêu chuẩn quyết định để chẩn đoán bệnh lao.

Chẩn đoán vi khuẩn lao đã đƣợc tiến hành từ lâu và gần đây có nhiều kỹ thuật hiện

đại đƣợc áp dụng

1.1.4.1. Các phƣơng pháp cổ điển

Kỹ thuật nhuộm soi kính

Bệnh phẩm thƣờng là đờm, điều quan trọng là phải hƣớng dẫn bệnh nhân lấy

đờm đúng để xét nghiệm. Số mẫu đờm cần thiết thử cho một bệnh nhân nghi lao là

3 mẫu: một mẫu lấy tại chỗ khi bệnh nhân đến khám; một mẫu lấy vào buổi sáng

sau khi ngủ dậy (toàn bộ đờm lao ho khạc trong vòng 2 giờ); mẫu thứ ba lấy tại chỗ

khi bệnh nhân mang mẫu đờm buổi sáng đến khám. Khi trong bệnh phẩm ít vi

khuẩn (thƣờng là dịch màng phổi, màng bụng…) cần tiến hành ly tâm rồi lấy phần

cặn lắng đọng nhuộm thì khả năng tìm thấy vi khuẩn nhiều hơn.

Kỹ thuật Ziehl-Neelsen là kỹ thuật cổ điển sử dụng để phát hiện vi khuẩn

lao. Đánh giá kết quả đang đƣợc sử dụng ở nƣớc ta nhƣ sau:

- Khi không có AFB (Acid Fast Bacilli) trên 100 vi trƣờng : kết quả âm tính.

- Khi có từ 1 đến 9 AFB trên 100 vi trƣờng: dƣơng tính (ghi cụ thể số vi khuẩn).

- Khi có từ 10 đến 99 AFB trên 100 vi trƣờng : dƣơng tính (1+).

- Khi có từ 1 đến 10 AFB trên 1 vi trƣờng : dƣơng tính (2+).

- Khi có trên 10 AFB trên 1 vi trƣờng : dƣơng tính (3+).



Phƣơng pháp soi kính có ƣu điểm là cho kết quả nhanh, chẩn đoán chính xác

bệnh lao và khả năng lây truyền của bệnh nhân cho những ngƣời xung quanh, kỹ

thuật và phƣơng tiện đơn giản có thể tiến hành đƣợc ở tuyến quận, huyện. Nhƣng có

nhƣợc điểm là trong 1 ml đờm phải có từ khoảng 5000 vi khuẩn trở lên mới cho kết

quả dƣơng tính. Phƣơng pháp soi kính chỉ biết đƣợc hình thể của vi khuẩn, không

biết đƣợc vi khuẩn còn sống hay đã chết. Phƣơng pháp này cũng không cho phép

phân biệt đƣợc các chủng vi khuẩn lao [3, 18, 19].

Phƣơng pháp nuôi cấy

Môi trƣờng dùng nuôi cấy vi khuẩn lao là môi trƣờng Loeweinstein – Jensen.

Sau 1 – 2 tháng vi khuẩn lao phát triển thành khuẩn lạc hình súp lơ, màu trắng ngà.

Ƣu điểm của phƣơng pháp nuôi cấy là cho kết quả chính xác, có thể tiến hành các

phản ứng sinh học để phân loại vi khuẩn lao và làm đƣợc kháng sinh đồ giúp chọn

thuốc lao thích hợp điều trị bệnh nhân, nhất là trong những trƣờng hợp bệnh lao có

vi khuẩn kháng thuốc. Phƣơng pháp nuôi cấy đòi hỏi phƣơng tiện và kỹ thuật hiện

đại. Hiện nay ở nƣớc ta, ngoài các tuyến y tế chuyên khoa ở trung ƣơng, kỹ thuật

này cũng đƣợc tiến hành ở một số bệnh viện chuyên khoa (tỉnh, thành phố). Ngày

nay ngƣời ta đã áp dụng kỹ thuật nuôi cấy cho kết quả nhanh từ 5 - 7 ngày, phục vụ

kịp thời cho điều trị bệnh nhân [3, 18, 19].

Phƣơng pháp chụp X Quang

Chẩn đoán lao phổi bằng chụp X quang phổi thƣờng chi phí tốn kém. Tuy có

độ nhạy cao nhƣng độ đặc hiệu thấp. Có nhiều loại bệnh khác có thể có biểu hiện

hình ảnh tổn thƣơng trên phim chụp phổi giống bệnh lao, thêm nữa nhiều khi bệnh

lao phổi dù đã đƣợc điều trị khỏi vẫn để lại di chứng ở phổi suốt đời. Do vậy dùng

X quang rộng rãi để chẩn đoán lao phổi dễ bị nhầm và lãng phí. Thực tế thƣờng vận

dụng chẩn đoán lao phổi trong một số trƣờng hợp: lao phổi AFB (-), ở bệnh nhân

chỉ có một mẫu xét nghiệm đờm (+), và một số trƣờng hợp đặc biệt khác nhƣ các

loại tổn thƣơng có tính chất tƣơng đối đặc thù hay gặp trong lao: vị trí hay gặp ở

vùng đỉnh và hạ đòn, tổn thƣơng thƣờng đa dạng, phối hợp nhiều loại và tiến triển

chậm [3, 19].



1.1.4.2. Một số kỹ thuật hiện đại chẩn đoán vi khuẩn lao

Sử dụng hệ Bactec

Ngƣời ta gắn Carbon phóng xạ vào acid palmitric và acid formic trong môi

trƣờng nuôi cấy vi khuẩn lao. Khi vi khuẩn chuyển hóa sẽ lấy các acid béo này và

giải phóng ra CO2 (có carbon phóng xạ) đƣợc đo bằng máy Bactec 960. Kỹ thuật đo

phóng xạ (hệ thống BACTEC) có thể phát hiện nhanh vi khuẩn. Tuy nhiên giá cả

khá đắt đỏ, không phù hợp với nguồn lực có hạn của nhiều quốc gia [3, 12].

Kỹ thuật MGIT (Mycobacterium Growth Indicator Tube)

Kỹ thuật ống chỉ thị sự sinh trƣởng của vi khuẩn lao là phƣơng pháp sử dụng

biện pháp đặc biệt để kích thích vi khuẩn lao sinh sản nhanh. Vi khuẩn lao phát

triển sẽ sử dụng oxy và thải CO2. Bằng bộ phận nhạy cảm có phát quang có thể

nhận biết đƣợc CO2. Kết quả đƣợc đọc bằng chiếu tia tử ngoại, MGIT dƣơng tính sẽ

phát quang vàng, da cam. Kết quả dƣơng tính sau 6 ngày, nếu thử kháng sinh đồ thì

dƣơng tính sau 7 ngày. Phƣơng pháp này tốt với nhóm nguy cơ nhiễm HIV và là

phƣơng pháp đƣợc WHO khuyến cáo sử dụng [3, 7, 19].

Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction - PCR)

Kỹ thuật PCR cho phép xác định tác nhân gây bệnh trực tiếp trong bệnh

phẩm nhờ khả năng nhận biết và sao chép để khuyếch đại về mặt số lƣợng đoạn

trình tự đặc hiệu trên genome của vi khuẩn. Đối với MTB, kỹ thuật PCR phát hiện

trình tự 249 bp nằm trên đoạn IS6110, là trình tự gắn đặc hiệu và có khả năng tự sao

chép với số lƣợng lớn trong genome vi khuẩn thuộc nhóm MTB (M. tuberculosis,

M. microti, M. bovis và M. africanum).

Kỹ thuật này có ƣu điểm là cho kết quả nhanh (từ 24 đến 48 giờ), cho kết quả

dƣơng tính cả khi có ít vi khuẩn (dƣới 10 vi khuẩn trong đờm vẫn phát hiện đƣợc)

và còn cho biết vi khuẩn có kháng thuốc lao hay không, vì khi kháng thuốc sẽ có

đột biến trong gen làm thay đổi cấu trúc ADN [3, 18, 19, 31].



1.2. NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ HẠT NANO KIM LOẠI

Hạt nano kim loại là một khái niệm để chỉ các hạt có kích thƣớc nano đƣợc

tạo thành từ các kim loại. Ngƣời ta biết rằng hạt nano kim loại chế tạo từ vàng, bạc

đƣợc sử dụng từ hàng nghìn năm nay. Nổi tiếng nhất có thể là chiếc cốc Lycurgus

đƣợc ngƣời La Mã chế tạo vào khoảng thế kỉ thứ tƣ trƣớc công nguyên và hiện nay

đƣợc trƣng bày ở Bảo tàng Anh. Chiếc cốc đó đổi màu tùy thuộc vào cách ngƣời ta

nhìn nó. Nó có màu xanh lục khi nhìn ánh sáng phản xạ trên cốc và có màu đỏ khi

nhìn ánh sáng đi từ trong cốc và xuyên qua thành cốc. Các phép phân tích ngày nay

cho thấy trong chiếc cốc đó có các hạt nano vàng và bạc có kích thƣớc 70 nm và với

tỉ phần mol là 14:1. Tuy nhiên, phải đến năm 1857, khi Michael Faraday nghiên cứu

một cách hệ thống các hạt nano vàng thì các nghiên cứu về phƣơng pháp chế tạo,

tính chất và ứng dụng của các hạt nano kim loại mới thực sự đƣợc bắt đầu và cho

đến nay đã có rất nhiều loại hạt nano kim loại đƣợc ứng dụng vào thực tiễn mà điển

hình là hạt nano kim loại có từ tính [5].

1.2.1. Tính chất của hạt nano kim loại

1.2.1.1. Tính chất quang học

Kim loại có nhiều điện tử tự do, các điện tử tự do này sẽ dao động dƣới tác

dụng của điện từ trƣờng bên ngoài nhƣ ánh sáng. Thông thƣờng các dao động bị

dập tắt nhanh chóng bởi các sai hỏng mạng hay bởi chính các nút mạng tinh thể

trong kim loại khi quãng đƣờng tự do trung bình của điện tử nhỏ hơn kích thƣớc.

Nhƣng khi kích thƣớc của kim loại nhỏ hơn quãng đƣờng tự do trung bình thì hiện

tƣợng dập tắt không còn nữa mà điện tử sẽ dao động cộng hƣởng với ánh sáng kích

thích. Do vậy, tính chất quang của hạt nano đƣợc có đƣợc do sự dao động tập thể

của các điện tử dẫn đến từ quá trình tƣơng tác với bức xạ sóng điện từ. Khi dao

động nhƣ vậy, các điện tử sẽ phân bố lại trong hạt nano làm cho hạt nano bị phân

cực điện tạo thành một lƣỡng cực điện. Do vậy xuất hiện một tần số cộng hƣởng

phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣng các yếu tố về hình dáng, độ lớn của hạt nano và

môi trƣờng xung quanh là các yếu tố ảnh hƣởng nhiều nhất. Ngoài ra, mật độ hạt



nano cũng ảnh hƣởng đến tính chất quang. Nếu mật độ loãng thì có thể coi nhƣ gần

đúng hạt tự do, nếu nồng độ cao thì phải tính đến ảnh hƣởng của quá trình tƣơng tác

giữa các hạt [5].

1.2.1.2. Tính chất điện

Tính dẫn điện của kim loại rất tốt hay nói cách khác điện trở của kim loại

nhỏ nhờ vào mật độ điện tử tự do cao trong đó. Đối với vật liệu khối, các lí luận về

độ dẫn dựa trên cấu trúc vùng năng lƣợng của chất rắn.

Tập thể các điện tử chuyển động trong kim loại (dòng điện I) dƣới tác dụng

của điện trƣờng (U) có liên hệ với nhau thông qua định luật Ohm: U = IR, trong đó

R là điện trở của kim loại. Định luật Ohm cho thấy đƣờng I-U là một đƣờng tuyến

tính. Khi kích thƣớc của vật liệu giảm dần, hiệu ứng lƣợng tử do giam hãm làm rời

rạc hóa cấu trúc vùng năng lƣợng. Hệ quả của quá trình lƣợng tử hóa này đối với

hạt nano là I-U không còn tuyến tính nữa mà xuất hiện một hiệu ứng gọi là hiệu ứng

chắn Coulomb (Coulomb blockade) làm cho đƣờng I-U bị nhảy bậc với giá trị mỗi

bậc sai khác nhau một lƣợng e/2C cho U và e/RC cho I, với e là điện tích của điện

tử, C và R là điện dung và điện trở khoảng nối hạt nano với điện cực [5].

1.2.1.3. Tính chất từ

Các kim loại quý nhƣ vàng, bạc,… có tính nghịch từ ở trạng thái khối do sự

bù trừ cặp điện tử. Khi vật liệu thu nhỏ kích thƣớc thì sự bù trừ trên sẽ không toàn

diện nữa và vật liệu có từ tính tƣơng đối mạnh.

Các kim loại có tính sắt từ ở trạng thái khối nhƣ các kim loại chuyển tiếp sắt,

cô ban, ni ken thì khi kích thƣớc nhỏ sẽ phá vỡ trật tự sắt từ làm cho chúng chuyển

sang trạng thái siêu thuận từ. Vật liệu ở trạng thái siêu thuận từ có từ tính mạnh khi

có từ trƣờng và không có từ tính khi từ trƣờng bị ngắt đi, tức là từ dƣ và lực kháng

từ hoàn toàn bằng không [5].



1.2.1.4. Tính chất nhiệt

Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của vật liệu phụ thuộc vào mức độ liên kết giữa các

nguyên tử trong mạng tinh thể. Trong tinh thể, mỗi một nguyên tử có một số các

nguyên tử lân cận có liên kết mạnh gọi là số phối vị. Các nguyên tử trên bề mặt vật

liệu sẽ có số phối vị nhỏ hơn số phối vị của các nguyên tử ở bên trong nên chúng có

thể dễ dàng tái sắp xếp để có thể ở trạng thái khác hơn. Nhƣ vậy, nếu kích thƣớc của

hạt nano giảm, nhiệt độ nóng chảy sẽ giảm. Ví dụ, hạt vàng kích thƣớc 6 nm có Tm

= 950°C, 2 nm có Tm = 500°C [5].

1.2.2. Một số loại hạt nano kim loại

1.2.2.1. Hạt nano kim loại quý

Hạt nano vàng

Vàng là tên nguyên tố hoá học có kí hiệu Au và số nguyên tử 79 trong bảng

tuần hoàn, là kim loại chuyển tiếp (hoá trị 3 và 1) mềm, dễ uốn, dễ dát mỏng, màu

vàng và chiếu sáng khi thành khối, nhƣng có thể có màu đen, hồng ngọc hay tía khi

đƣợc cắt nhuyễn. Au không phản ứng với hầu hết các hoá chất nhƣng lại chịu tác

dụng của hỗn hợp dung dịch HNO3 đậm đặc và dung dịch HCl đậm đặc theo tỉ lệ

1:3 để tạo thành acid cloroauric cũng nhƣ chịu tác động của dung dịch xyanua của

các kim loại kiềm. Kim loại này có ở dạng quặng hoặc hạt trong đá và trong các mỏ

bồi tích và là một trong số kim loại đúc tiền, có giá trị vô cùng to lớn trong cuộc

sống của con ngƣời từ xƣa tới nay.

Ngày nay, nhờ vào tiến bộ trong lĩnh vực khoa học Nano, ngƣời ta có thể xác

định thêm nhiều đặc tính khác của kim loại này. Khi khoa học công nghệ phát triển

và nhu cầu sử dụng trong các ứng dụng sinh - y học, thì hạt vàng có thêm ứng dụng

mới trong thực tiễn dƣới dạng đặc biệt đó là đó là: hạt nano vàng.

http://vi.wikipedia.org/wiki/Axit_nitric

http://vi.wikipedia.org/wiki/Ax%C3%ADt_clohi%C4%91ric



Hình 1.3. Một cấu trúc tinh thể từ các phân tử nano vàng [36]

Khi đƣợc chia nhỏ ở trạng thái phân tử có kích thƣớc vài nm, nguyên tố này

có rất nhiều đặc tính riêng biệt. Hạt nano vàng có thể đƣợc điều chế theo phƣơng

pháp khử hoá học, phƣơng pháp từ thực vật…có thể phân tán tốt trong các dung

môi không phân cực hoặc kém phân cực nhƣ toluene, chloroform, dichloromethane,

diethyl ether... Dung dịch hạt nano vàng có màu đỏ tím đặc trƣng, hấp thu tia tử

ngoại ở bƣớc sóng 520 nm (phổ UV-Vis). Kích thƣớc hạt đồng đều, nằm trong

khoảng 2-4 nm.

Hạt nano vàng có thể đƣợc ứng dụng làm xúc tác cho các phản ứng hữu cơ,

làm sensor phân tích kim loại nặng, trong lĩnh vực thiết bị và linh kiện điện tử [28].

Hạt nano bạc

Bạc có ký hiệu là Ag, số nguyên tử 47 thuộc phân nhóm IB trong bảng tuần

hoàn các nguyên tố hóa học, bạc có khối lƣợng phân tử là 107,868 (đơn vị C). Ag

có số oxi hóa là +1 và +2, phổ biến nhất là trạng thái oxi hóa +1. Trong tự nhiên,

Ag tồn tại hai dạng đồng vị bền là Ag – 107 (52%) và Ag – 109 (48%). Ag không

tan trong nƣớc, môi trƣờng kiềm nhƣng có khả năng tan trong một số acid mạnh

nhƣ HNO3, H2SO4 đặc nóng…

Ngày nay những thuộc tính quý của kim loại này đƣợc thể hiện tối đa khi

chúng đƣợc chế tạo bằng công nghệ nano. Và trên thị trƣờng cũng đã xuất hiện



nhiều sản phẩm chứa nano bạc nhƣ băng gạc y tế, nƣớc tẩy trùng bề mặt, nhƣ tủ

lạnh, máy gặt…

Hạt nano bạc đƣợc điều chế theo phƣơng pháp khử hoá học, phƣơng pháp ăn

mòn laser, phƣơng pháp hóa siêu âm… Dung dịch bạc nano có màu vàng đặc trƣng,

hấp thu tia tử ngoại ở bƣớc sóng 420 nm (phổ UV-Vis). Kích thƣớc hạt đồng đều,

nằm trong khoảng 2-5 nm [29].

1.2.2.2. Hạt nano kim loại có tính từ (hạt nano từ)

Bất cứ vật liệu nào đều có sự hƣởng ứng với từ trƣờng ngoài (H), thể hiện

bằng độ từ hóa (từ độ - M). Tỷ số c = M/H đƣợc gọi là độ cảm từ. Tùy thuộc vào

giá trị, độ cảm từ có thể phân ra làm các loại vật liệu từ khác nhau. Vật liệu có c < 0

(~-10-6

) đƣợc gọi là vật liệu nghịch từ. Vật liệu có c > 0 (~10-6

) đƣợc gọi là vật liệu

thuận từ. Vật liệu có c > 0 với giá trị rất lớn có thể là vật liệu sắt từ, ferri từ [4]. Ở

đây, vật liệu từ tính ngụ ý là vật liệu sắt từ, ferri từ hoặc siêu thuận từ.

Ngoài độ cảm từ, một số thông số khác cũng rất quan trọng trong việc xác

định tính chất của vật liệu, ví dụ nhƣ: từ độ bão hòa (từ độ đạt cực đại tại từ trƣờng

lớn), từ dƣ (từ độ còn dƣ sau khi ngừng tác động của từ trƣờng ngoài), lực kháng từ

(từ trƣờng ngoài cần thiết để một hệ, sau khi đạt trạng thái bão hòa từ, bị khử từ).

Nếu kích thƣớc của hạt giảm đến một giá trị nào đó (thông thƣờng từ vài cho đến

vài chục nm), phụ thuộc vào từng vật liệu cụ thể, tính sắt từ và ferri từ biến mất,

chuyển động nhiệt sẽ thắng thế và làm cho vật liệu trở thành vật liệu siêu thuận từ.

Đối với vật liệu siêu thuận từ, từ dƣ và lực kháng từ bằng không. Điều đó có nghĩa

là, khi ngừng tác động của từ trƣờng ngoài, vật liệu sẽ không còn từ tính nữa, đây là

một đặc điểm rất quan trọng khi dùng vật liệu này cho các ứng dụng y sinh học [5].

Hạt nano từ tính có thể đƣợc chế tạo theo các phƣơng pháp thông dụng nhƣ

phƣơng pháp nghiền, phƣơng pháp đồng kết tủa, phƣơng pháp vi nhũ tƣơng…Mỗi

phƣơng pháp đều có những ƣu nhƣợc điểm riêng, tuy nhiên khi đƣợc dùng trong y

sinh học thì chúng cần phải thỏa mãn ba điều kiện sau:

- Tính đồng nhất của các hạt cao.

- Từ độ bão hòa lớn.



- Vật liệu có tính tƣơng hợp sinh học cao (không có độc tính).

Hình 1.4. Hình ảnh hiển vi điện tử của hạt nano từ Fe3O4 [37]

Tính đồng nhất về kích thƣớc và tính chất liên quan nhiều đến phƣơng pháp

chế tạo còn từ độ bão hòa và tính tƣơng hợp sinh học liên quan đến bản chất của vật

liệu. Trong tự nhiên, sắt (Fe) là vật liệu có từ độ bão hòa lớn nhất tại nhiệt độ phòng

(25oC), sắt không độc đối với cơ thể ngƣời và tính ổn định khi làm việc trong môi

trƣờng không khí nên các vật liệu nhƣ ô-xít sắt đƣợc nghiên cứu rất nhiều để làm

hạt nano từ tính ứng dụng trong y sinh học.

Hạt nano từ dùng trong y sinh học thƣờng ở dạng dung dịch nên còn gọi là

chất lỏng từ. Một dung dịch gồm ba thành phần: lõi là hạt Fe3O4 có kích thƣớc

nano, chất chức năng hóa bề mặt (chất hoạt hóa bề mặt) và dung môi. Trong đó: i)

lõi Fe3O4 có kích thƣớc nano là thành phần duy nhất quyết định đến tính chất từ của

dung dịch từ; ii) chất hoạt hóa bề mặt có tác dụng làm cho hạt nano từ phân tán

trong dung môi, tránh kết tụ với nhau, ngoài ra nó còn có tác dụng “che chở’’ hạt

nano khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch của cơ thể và tạo các mối liên kết

hóa học với các phân tử khác trong điều kiện phù hợp. Dung môi là chất lỏng mang

toàn bộ hệ [4, 15].



1.2.3. Ứng dụng của hạt nano kim loại trong y học

Các ứng dụng đều liên quan đến những tính chất khác biệt của hạt nano.

Những ứng dụng đầu tiên nhƣ chúng ta đã biết là liên quan đến tính chất quang của

chúng. Ngƣời ta trộn hạt nano vàng, bạc vào thủy tinh để chúng có các màu sắc

khác nhau. Gần đây ngƣời ta đã phát hiện ra rất nhiều ứng dụng khả dĩ của hạt nano

vàng để tiêu diệt tế bào ung thƣ. Trong đó, hạt nano vàng đƣợc kích thích bằng ánh

sáng laser xung, do hiện tƣợng hấp thụ cộng hƣởng Plasmon mà hạt nano dao động

có nhiệt độ tăng dần, có khi lên đến nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của vàng.

Quá trình tăng nhiệt này gây ra một sóng xung kích tiêu diệt tế bào ung thƣ trong

bán kính hàng mm. Hạt nano vàng bọc bởi các nguyên tử Gd (có mô men từ nguyên

tử lớn nhất) còn đƣợc dùng để làm tăng độ tƣơng phản trong cộng hƣởng từ hạt

nhân [5, 24, 32].

Hạt nano vàng, bạc đƣợc sử dụng trong y sinh học để đánh dấu tế bào. Nhờ

kích thƣớc của hạt nano nhỏ hơn nhiều bƣớc sóng ánh sáng chiếu vào mà xuất hiện

hiện tƣợng cộng hƣởng Plasmon bề mặt làm cho khả năng tán xạ ánh sáng của các

hạt nano kim loại rất mạnh [32].

Các ứng dụng của hạt nano từ đƣợc chia làm hai loại: ứng dụng ngoài cơ thể

và trong cơ thể. Phân tách và chọn lọc tế bào là ứng dụng ngoài cơ thể nhằm tách

những tế bào cần nghiên cứu ra khỏi các tế bào khác. Các ứng dụng hạt nano từ

trong cơ thể gồm: dẫn thuốc, nung nóng cục bộ và tăng độ tƣơng phản trong ảnh

cộng hƣởng từ [27].

1.3. CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT HẠT NANO TỪ, GẮN KẾT VÀ LÀM

GIÀU TẾ BÀO VI KHUẨN LAO

1.3.1. Chức năng hóa bề mặt hạt nano từ

Hạt nano từ tính có kích thƣớc 10 nm – 20 nm đƣợc chế tạo bằng phƣơng pháp

đồng kết tủa hai ion Fe3+

và Fe2+

bằng OH- tại nhiệt độ phòng hoặc tại 90

oC trong

môi trƣờng khí N2 để tránh oxi hóa. Phép đo quang phổ kế hồng ngoại cho thấy trên

bề mặt hạt nano từ tính trong nƣớc có bao phủ một lớp –OH, đây là một nhóm chức



quan trọng trong việc tạo liên kết với các chất hoạt hóa bề mặt cần thiết cho các ứng

dụng sinh học [14, 15]

Để có thể ứng dụng trong sinh học, các hạt nano cần phải đƣợc chức năng hóa

bề mặt để gắn kết với các đối tƣợng sinh học nhƣ ADN, kháng thể, enzyme. Các

nhóm chức thƣờng gặp là nhóm amine, biotin, streptavidin, carboxyl, thiol. Để có

đƣợc các nhóm chức trên bề mặt hạt nano, ngƣời ta sử dụng nguyên tắc thủy phân

organosilane để tạo ra một lớp polymer trên bề mặt hạt nano [6, 32].

Organosilane là các phân tử có hai nhóm chức có công thức tổng quát là

X-(CH2)n-SiRn(OR’)3-n. Trong đó thì X là nhóm chức cần thiết để có thể gắn kết với

các đối tƣợng sinh học, (CH2)n là nhóm đệm hữu cơ, phụ thuộc vào n mà lớp đệm

này có thể dày hay mỏng. SiRn là nhóm liên kết với nhóm hydroxyl của bề mặt hạt

nano.

Alkoxysilane với rất nhiều nhóm chức X khác nhau đã đƣợc thƣơng mại hóa.

Trong quá trình chức năng hóa bề mặt, với phân tử organosilane, xảy ra hai phản

ứng đồng thời, đó là quá trình thủy phân các nhóm silane alkoxy n thành các nhóm

silanol hoạt tính và quá trình hóa rắn của các silanol với nhóm hydroxyl tự do trên

bề mặt của hạt nano từ tính Fe3O4 để tạo ra các liên kết Si-O-Si bền vững. Điều kiện

của môi trƣờng phản ứng có ảnh hƣởng rất nhiều đến quá trình chức năng hóa bề

mặt. Ví dụ nhƣ ethanol thì thƣờng làm gia tăng quá trình thủy phân và động học hóa

rắn do đó làm tăng cƣờng quá trình chức năng hóa bề mặt, tuy nhiên cồn cũng cạnh

tranh với nhóm silane trên bề mặt bằng liên kết hydro.

Có rất nhiều các nhóm chức khác nhau đƣợc tạo ra tùy theo mục đích thực

nghiệm và trong số đó thì nhóm amine đƣợc sử dụng nhiều nhất trong các ứng dụng

sinh học. Hạt nano từ tính có nhóm amine (NP-NH2) thƣờng đƣợc tạo ra bằng cách

sử dụng 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) [15, 34]



Hình 1.5. Hạt nano từ tính Fe3O4 đƣợc chức năng hóa bề mặt bằng nhóm

amine sử dụng APTS [34]

1.3.2. Quá trình gắn kết hạt nano từ với kháng thể kháng lao

Phức hợp hạt nano từ với kháng thể đặc hiệu có thể đƣợc tạo ra bởi nhiều cơ

chế khác nhau. Theo các nhà nghiên cứu về lĩnh vực công nghệ nano thì hiện nay có

nhiều cách để tạo ra phức hợp này là: gắn kết trực tiếp thông qua liên kết amine –

carboxyl; sử dụng SMCC (Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane - 1-

carboxylate) làm xúc tác tạo cặp sulfhydryl-amine; gắn kết trực tiếp thông qua các

nhóm carbohydrate bị oxy hóa trên phần Fc của kháng thể; gắn kết không hóa trị

của hạt nano silica đƣợc bọc streptavidin với các kháng thể đƣợc biotin hóa... Mỗi

kiểu gắn kết có những ƣu điểm và hạn chế riêng. Nhƣng nhìn chung, nếu có từ 1

đến 3 cầu nối trung gian giữa kháng thể và hạt nano từ thì càng làm cho phức hợp

bền vững hơn và kháng thể không mất hoạt tính lâu hơn [10, 20].

Trong các cách tạo liên kết kể trên thì có thể nói việc gắn trực tiếp thông qua

liên kết amine – carboxyl là đơn giản nhƣng cũng đem lại hiệu quả khá cao. Hạt từ

amine ban đầu có thể kết hợp với một số hợp chất nhƣ các hợp chất chứa aldehyde,

các glycoprotein đã bị oxy hóa hay các hợp chất hoạt hóa este nhóm

N-hydroxysuccinimide (NHS) hoặc các hợp chất biến đổi từ Iodoacetyl. Tuy nhiên

hiện nay cách mà có nhiều ƣu điểm hơn cả đó là việc sử dụng gắn trực tiếp hạt từ

amine với hợp chất chứa nhóm carboxyl thông qua cầu nối trung gian 1-ethyl-3-(3-

dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride.

http://translate.googleusercontent.com/translate_c?depth=1&hl=vi&ie=UTF8&prev=_t&rurl=translate.google.com.vn&sl=en&tl=vi&u=http://en.wikipedia.org/wiki/N-hydroxysuccinimide&usg=ALkJrhisBj8s3OIV46FUxXqGFLe8vaf2Zw



1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride hay EDC

hoặc EDAC là hợp chất carbodiimide phổ biến nhất đƣợc sử dụng để tạo cầu nối

giữa nhóm amine và nhóm carboxyl. EDC là một chất tan trong nƣớc, hoạt động tốt

trong khoảng pH 4,5 và pH 7,5. EDC cũng thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với NHS

hoặc sulfo-NHS để tăng hiệu qủa gắn kết hoặc tạo ra một sản phẩm amine phản ứng

ổn định [20]. Việc gắn kết giữa hạt từ amin với kháng thể thông qua cầu nối trung

gian EDC đƣợc thực hiện qua hai bƣớc nhƣ mô tả tại hình 1.6. Hạt từ amine sẽ phản

ứng với EDC tạo ra một chất trung gian không bền (A), hợp chất này ngay lập tức

sẽ gắn kết với kháng thể thông qua liên kết giữa nhóm amine với carboxyl tạo thành

sản phẩm bền vững và phản ứng ổn định (B).

Hình 1.6. Quy trình gắn kết hạt nano đƣợc chức năng hóa với kháng thể [20]

http://translate.googleusercontent.com/translate_c?depth=1&hl=vi&ie=UTF8&prev=_t&rurl=translate.google.com.vn&sl=en&tl=vi&u=http://en.wikipedia.org/w/index.php%3Ftitle%3DSulfo-NHS%26action%3Dedit%26redlink%3D1&usg=ALkJrhiij29p4zstPNXEMnrzWeS7jCMv0Q



1.3.3. Làm giàu tế bào vi khuẩn lao bằng từ trƣờng

Nhóm chức đƣợc chức năng hóa trên bề mặt không những có thể tạo liên kết

với một vị trí nào đó trên bề mặt tế bào hoặc phân tử mà còn giúp cho các hạt nano

phân tán tốt trong dung môi, tăng tính ổn định của chất lỏng từ. Giống nhƣ trong hệ

miễn dịch, vị trí liên kết đặc biệt trên bề mặt tế bào sẽ đƣợc các kháng thể hoặc các

phân tử khác nhƣ các hormone, acid folic nhận biết. Các kháng thể sẽ liên kết với

các kháng nguyên. Đây là cách rất hiệu quả và chính xác để đánh dấu tế bào. Các

hạt từ tính đƣợc bao phủ bởi các chất hoạt hóa tƣơng tự các phân tử trong hệ miễn

dịch nên có thể tạo ra các liên kết với các tế bào hồng cầu, tế bào ung thƣ phổi, vi

khuẩn, tế bào ung thƣ đƣờng tiết niệu và thể golgi. Đối với các tế bào lớn, kích

thƣớc của các hạt từ đôi lúc cũng cần phải lớn, có thể đạt kích thƣớc vài trăm nm

[27].

Quá trình chọn lọc và làm giàu tế bào đƣợc thực hiện nhờ một gradient từ

trƣờng ngoài. Từ trƣờng ngoài tạo một lực hút các hạt từ tính có mang các tế bào

đƣợc đánh dấu. Các tế bào không đƣợc đánh dấu sẽ không đƣợc giữ lại và thoát ra

ngoài.

Hình 1.7. Nguyên tắc chọn lọc và làm giàu tế bào bằng từ trƣờng [6]

(a) Nam châm được đặt bên ngoài để hút các tế bào đã được đánh dấu và loại bỏ các tế

bào không được đánh dấu; (b) Nam châm có thể đặt vào một dòng chảy có chứa tế

bào cần chọn lọc



CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. NGUYÊN LIỆU

2.1.1. Mẫu đờm lao và vaccine BCG

Các mẫu đờm lao của bệnh nhân bị bệnh lao đƣợc nhận từ Viện Quân Y 103.

Trƣớc đó tất cả các mẫu đờm này đã đƣợc kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn bằng

phƣơng pháp soi trực tiếp.

Dựa trên phƣơng pháp của Kubica và cộng sự [22], Các mẫu đờm sau đó

đƣợc khử nhiễm bằng một thể tích hỗn hợp gồm NaOH 1 M, Sodium citrate 0,1 M

và N-acetyl-L-cystein 30 mM. Lắc cho đờm loãng đều trong 15 phút, chia vào các

ống falcon và sau đó ly tâm tách cặn, 12000 vòng/phút x 10 phút và cuối cùng bảo

quản trong ống eppendorf.

Vaccine BCG (Bacillus Calmette Guerin) do Việt Nam sản xuất đƣợc cung

cấp bởi Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng. Vaccine đƣợc cung cấp là chế phẩm dạng

đông khô (chứa 0,5 mg BCG và 3,0 mg Glutamate natri trong 1 ống) của chủng

Calmette - Guerin giảm độc lực, có nguồn gốc từ vi khuẩn Mycobacterium bovis.

Hình 2.1. Vaccine BCG sản xuất tại Việt Nam



2.1.2. Hạt nano kim loại có từ tính

Hạt nano kim loại có từ tính Fe3O4 có tính chất khá đồng nhất, ít bị kết tụ,

đƣợc bao bọc bởi lớp màng silica có gắn nhóm amine (NP-NH2) có khả năng liên

kết bền vững với kháng thể đặc hiệu trong điều kiện thích hợp.

Loại hạt mà nhóm chúng tôi sử dụng có kích thƣớc khoảng 20 nm, đƣợc chế

tạo bằng phƣơng pháp đồng kết tủa hai ion Fe3+

và Fe2+

bằng OH- trong môi trƣờng

khí N2 tại nhiệt độ 90oC.

Đây là kết quả nghiên cứu chế tạo của nhóm nghiên cứu

thuộc Trung tâm Khoa học vật liệu, Khoa Vật lý, Trƣờng Đại học Khoa học Tự

nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.

2.1.3. Mồi đặc hiệu

Đoạn mồi (primer) IS6110 đƣợc thiết kế để phát hiện vi khuẩn lao trong mẫu

vaccine BCG hay trong mẫu đờm lao bằng kỹ thuật PCR thông thƣờng dựa trên các

trình tự bảo thủ đặc hiệu cho vi khuẩn lao và đƣợc đặt mua từ hãng Invitrogen

(Mỹ). Trình tự cặp mồi IS6110 đƣợc thiết kế nhƣ sau:

Bảng 2.1. Trình tự các mồi dùng trong phản ứng PCR

Mồi Trình tự

Tài liệu

tham

khảo

Kích thƣớc

đoạn nhân

lên

Mồi xuôi 5'-GAACCGTGAGGGCATCGAGG-3'

[23] 249 bp

Mồi ngƣợc 5'-GCG TAGGCGTCGGTGACAAA-3'

2.1.4. Các loại đệm

Dung dịch đệm MES pH 4,5; pH 5,5 và pH 6,5.

Dung dịch đệm Phosphate PBS pH 6,5 và pH 7,4.



Dung dịch đệm Tris-HCl – EDTA (TE: 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA)

pH 7,4.

Dung dịch đệm Tris-HCl – EDTA – Triton X-100 (TET: 50 mM Tris-HCl,

1 mM EDTA, 1% Triton X-100) pH 7,4.

Dung dịch bảo quản PBS-TBN (Đệm PBS pH 7,4 bổ sung 0,01 % Tween 20;

0,1 % BSA và 0,05 M NaN3).

2.1.5. Các hóa chất và nguyên liệu khác

Kháng thể đa dòng kháng vi khuẩn lao (anti-TB) của hãng Abcam, Mỹ.

Chất trung gian tạo phức EDC của hãng Sigma, Mỹ.

Màng Polyvinylidene fluoride (PVDF) của hãnh Bio-Rad, Mỹ.

ADN Taq polymerase, ADN Dream TaqTM

polymerase và thang chuẩn ADN

đƣợc mua từ hãng Fermentas, các dNTP của hãng Promega. Các hóa chất khác đạt

độ tinh khiết dành cho nghiên cứu sinh học phân tử.

2.1.6. Máy móc và thiết bị

Máy PCR của Bio-Rad, bộ điện di agarose, giá hút từ của Promega, máy phá

mẫu bằng sóng siêu âm Sonicator …Các máy còn lại đều đạt độ chính xác dùng

trong thí nghiệm sinh học phân tử. Ngoài ra, trong nghiên cứu cũng sử dụng phần

mềm phân tích độ sáng của ảnh Image J.

2.2. PHƢƠNG PHÁP

2.2.1. Phƣơng pháp chấm kết tủa miễn dịch

Nguyên tắc của phƣơng pháp chấm kết tủa miễn dịch (Dot blot) là dựa

trên sự tƣơng tác đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể tƣơng ứng. Kháng thể

sơ cấp sau khi liên kết với kháng nguyên tạo thành phức hợp KHÁNG NGUYÊN –

KHÁNG THỂ, tiếp tục đƣợc nhận biết bởi kháng thể thứ cấp có gắn enzyme

phosphatase kiềm, cuối cùng phức hợp KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ SƠ

CẤP – KHÁNG THỂ THỨ CẤP đƣợc phát hiện bằng cách cho ủ trong dung dịch



cơ chất. Nhờ sự có mặt của enzyme trên kháng thể thứ cấp mà cơ chất chuyển từ

không màu thành sản phẩm có màu, dễ dàng nhận biết bằng mắt thƣờng. Nồng độ

của protein cũng nhƣ của dịch nuôi tế bào có thể đƣợc định lƣợng không hoàn toàn

thông qua sử dụng phƣơng pháp Dot blot.

Quy trình tiến hành :

- Màng đƣợc cắt với kích thƣớc thích hợp, các ô vuông trên màng đƣợc kẻ

bằng bút chì có kích thƣớc 1x1 cm. Sau đó màng đƣợc ngâm trong methanol

khoảng 3 – 4 phút, rửa methanol bằng nƣớc cất, để trên giấy thấm và mẫu đƣợc

chấm lên bề mặt đƣợc đánh dấu của màng.

- Đầu côn đƣợc dùng để lấy và chấm 2µ mỗi mẫu lên bề mặt màng tại trung

tâm của ô kẻ. Dung dịch mẫu thẩm thấu xuống màng thƣờng có đƣờng kính 3 – 4

mm.

- Màng sau khi sấy khô sẽ đƣợc cố định bởi dung dịch BSA 5% trong

PBS 1X pH 7,4 có bổ sung 0,05% Tween20 bằng cách lắc nhẹ 30 phút đến 1 giờ ở

nhiệt độ phòng.

- Màng đƣợc rửa 3 lần bằng đệm PBS 1X pH 7,4 có bổ sung 0,05% Tween20

để loại bỏ BSA thừa. Màng sau đó đƣợc ủ với kháng thể sơ cấp, lắc nhẹ ít nhất 1

giờ ở nhiệt độ phòng.

- Kháng thể sơ cấp bám không đặc hiệu trên màng đƣợc loại bỏ bằng cách

tráng rửa 3 lần trong đệm PBS 1X pH 7,4 có bổ sung 0,05% Tween20. Sau đó màng

đƣợc ủ với kháng thể thứ cấp thích hợp có gắn enzyme photphatase kiềm. Kháng

thể thứ cấp bám không đặc hiệu cũng đƣợc loại bỏ bằng cách tráng rửa màng trong

đệm PBS 1X pH 7,4 có bổ sung 0,05% Tween20.

- Tiếp đó, cân bằng màng bằng đệm AP (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl,

5 mM MgCl2, pH 9,5).

- Các vết chấm đƣợc hiện màu bằng cách ủ màng trong dung dịch cơ chất

p-nitro blue tetrazolium và 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT/BCIP) pha

trong đệm AP.

- Phản ứng đƣợc làm ngƣng trong nƣớc cất khi vết chấm hiện rõ.



2.2.2. Phƣơng pháp gắn kết hạt nano từ đã đƣợc chức năng hóa bề mặt với

kháng thể kháng vi khuẩn lao

Mục đích: găn kêt khang thê anti -TB lên trên bê măt cua hat nano tƣ có gắn

nhóm amine (NP-NH2) để thử nghiệm trong việc chẩn đoán bệnh lao . Quy trinh bao

gôm hai bƣơc chinh la : hoạt hóa kháng thể sử dụng cầu nối EDC va gắn kháng thể

đa hoat hóa lên trên bề mặt hạt NP-NH2.

Hình 2.2. Mô hình hóa phức hệ hạt nano từ đã đƣợc chức năng hóa bề mặt với

kháng thể kháng vi khuẩn lao

Chi tiêt cac bƣơc thực hiện đƣơc trinh bay dƣơi đây.

- Lắc nhẹ dung dịch chứa hạt NP-NH2 trong 5 – 10 phút để tạo nên một hỗn

hợp đồng nhất.

- Lấy 50 µl hạt NP-NH2 vào 1 ống eppendorf. Hạt từ đƣợc tập trung trên giá

nam châm trong vòng 1 phút và hút bỏ dịch trong.

- Hạt đƣợc rửa hai lần bằng đệm và hút bỏ dịch trong.

- Bổ sung dung dịch đệm, kháng thể anti–TB (7 mg/ml) và EDC (250 mg/ml).

Hỗn hợp đƣợc trộn đều và ủ ở 22oC trong một khoảng thời gian.

- Hạt từ đƣợc tập trung trên giá nam châm trong vòng 1 – 2 phút và hút bỏ

dịch trong. Phức hệ hạt đƣợc sử dụng ngay cho các thí nghiệm tiếp theo.

- Lƣu ý : EDC là chất dễ bị thủy phân trong dung dịch vì vậy nên pha mới

ngay trƣớc khi sử dụng.



2.2.3. Phƣơng pháp làm giàu vi khuẩn lao để làm khuôn cho phản ứng PCR

Mục đích : Thu nhân vi khuân lao dƣa trên liê n kêt khang nguyên va khang

thể. Sau đó tiến hành ly giải và nhận biết sự có mặt của vi khuẩn lao bằng cách sử

dụng mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR nhân đoạn gen đặc hiệu của vi khuẩn lao cho

kích thƣớc 249 bp.

Chi tiêt cac bƣơc cua quy tri nh “Sư dung hat tư đê thu nhân vi khuân lao tư

BCG” đƣơc trinh bay dƣơi đây :

1. Tâp trung phƣc hê hat tƣ đa chuân bi theo quy trinh đã trình bày ở mục

2.2.2 trên gia nam châm va hut bo dich trong .

2. Bô sung 25µl mẫu vaccine BCG hoặc mẫu đờm lao, trôn đều và ủ hỗn hợp

trong 45 phút ở nhiêt đô phong.

3. Hạt từ đƣợc tập trung trên giá nam châm và hút dịch BCG hoặc mẫu đờm

lao sang một ống eppendorf khác, bô sung 25µl đệm ly giải thích hợp.

2.2.4. Phƣơng pháp ly giải tế bào vi khuẩn lao thu ADN

Đối với các kỹ thuật sinh học phân tử có liên quan tới acid nucleic thì các

ứng dụng phụ thuộc rất nhiều vào số lƣợng và chất lƣợng ADN/ARN đƣợc tách

chiết. Điều mà bị ảnh hƣởng bởi số tế bào ly giải, lƣợng ADN/ARN phục hồi và sự

dƣ thừa của một số chất phản ứng hoặc thuốc thử.

Thành tế bào vi khuẩn lao là một trong những thành tế bào vi sinh vật có cấu

trúc phức tạp, điều mà làm cho việc phá vỡ thành tế bào trở lên khó khăn. Nhiều

phƣơng pháp ly giải dựa trên việc sử dụng enzyme, sự va đập vào mẫu do tác động

của sóng siêu âm tạo ra, hay do sự tác động của nhiệt độ tới tế bào…cho kết quả

tách chiết ADN khá tốt nhƣng những phƣơng pháp này lại phụ thuộc khá nhiều vào

loại mẫu sử dụng.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng một số phƣơng pháp ly giải tế

bào khác nhau để thu đƣợc lƣợng ADN cần thiết làm khuôn cho phản ứng PCR.

Các phƣơng pháp ly giải đƣợc trình bày ở dƣới đây:



Phƣơng pháp 1: Phức hạt từ tập trung trong ống eppendorf đƣợc bổ sung

thêm 25 µl nƣớc cất và trộn đều, sau đó đƣợc đun ở 100oC trong 20 phút. Tiếp theo,

hỗn hợp hạt từ đƣợc tập trung trên gia nam châm va hút dịch trong sang một ống

eppendorf, bảo quản ở 4oC.


thêm 25 µl đệm TE (50 mM Tris-HCl và 1 mM EDTA, pH 7,4) và trộn đều, sau đó

hỗn hợp đƣợc làm đông ở -20oC trong 20 phút. Tiếp đó, hỗn hợp đƣợc đun ở 100

oC

trong 20 phút. Cuối cùng hỗn hợp hạt từ đƣợc trên tập trung giá nam châm và hút

dịch trong sang một ống eppendorf, bảo quản ở 4oC.


thêm 25 µl đệm TE (50 mM Tris-HCl và 1 mM EDTA, pH 7,4) và trộn đều, sau đó

đun ở 100oC trong 20 phút. Cuối cùng hỗn hợp hạt từ đƣợc trên tập trung giá nam

châm va hut dich trong sang một ống eppendorf, bảo quản ở 4oC.


thêm 25 µl đệm TET (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA và 1% Triton X-100, pH 7,4)

và trộn đều, hỗn hợp đƣợc đun ở 100oC trong 20 phút. Cuối cùng hỗn hợp hạt từ

đƣợc trên tập trung giá nam châ m va hut dich trong sang m ột ống eppendorf, bảo

quản ở 4oC.

5 µl mẫu từ mỗi phƣơng pháp ly giải đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng

PCR tiếp ngay sau đó.

2.2.5. Đánh giá độ bền của phức hệ hạt từ gắn kháng thể kháng lao

Mục đích: Thử nghiệm độ bền vững của phức hệ hạt nano từ gắn kháng thể

anti-TB nhằm rút ngắn thời gian của quy trình phát hiện vi khuẩn lao và sản xuất

phức hệ gắn giữa hạt nano từ đã đƣợc chức năng hóa bề mặt với kháng thể kháng vi

khuẩn lao.

Chi tiết các bƣớc quy trình đƣợc trình bày dƣới đây :

Bước 1 : Tổng hợp phức hệ 10 phản ứng

1. Lắc nhẹ dung dịch chứa hạt NP-NH2 trong 5 – 10 phút để tạo nên một

hỗn hợp đồng nhất.



2. Lấy 500 µl hạt NP-NH2 vào 1 ống eppendorf. Hạt từ đƣợc tập trung

trên giá nam châm trong vòng 1 phút và hút bỏ dịch trong.

3. Bổ sung dung dịch đệm, kháng thể anti–TB (7 mg/ml) và EDC

( 250mg/ml).

4. Hỗn hợp đƣợc trộn đều và ủ ở 22oC trong một khoảng thời gian.

5. Hạt từ đƣợc tập trung trên giá nam châm trong vòng 1 – 2 phút, hút

bỏ dịch trong và bổ sung 750 µl dung dịch đệm bảo quản PBS-TBN.

Bước 2 : Thử nghiệm khả năng làm giàu của phức hệ theo thời gian

Các mốc thời gian thử nghiệm : 0, 1, 3, 7, 10, 14, 21, 28 ngày.

Tại mỗi mốc thời gian, hút 75 µl dung dịch bảo quản có chứa hạt từ (lắc đều

trƣớc khi sử dụng), tập trung hạt từ trên giá nam châm, hút bỏ dịch trong, bổ sung

mẫu rồi tiến hành các bƣớc tiếp theo nhƣ đã trình bày ở 2.2.3

2.2.6. Nhân bản đoạn gen đích đặc hiệu bằng PCR

PCR là phƣơng pháp đơn giản với giá thành không cao thƣờng đƣợc ứng

dụng trong các phép đo nhanh, thử lần một để có câu trả lời dƣơng tính hay âm tính

đối với một mẫu bệnh phẩm.

Bằng việc sử dụng các đoạn ADN mồi đặt hiệu, các quá trình nhiệt của phản

ứng nhân đôi ADN đƣợc tối ƣu hóa và cho tiến hành trong thời gian từ 2 giờ đến 3

giờ. Các mẫu sau khi kết thúc phản ứng PCR đƣợc tra vào các giếng điện di để xác

định sự có mặt của ADN vi khuẩn gây bệnh. Do trong quá trình chạy PCR đã sử

dụng mồi IS6110 của hãng Invitrogen đối với ADN của vi khuẩn lao nên tính đặc

hiệu rất cao. Nếu trong vaccine BCG hay trong mẫu bệnh phẩm mà cụ thể ở đây là

mẫu đờm lao có chứa ADN của vi khuẩn lao, chúng sẽ đƣợc nhân lên nhiều lần và

sẽ biểu hiện dƣơng tính ở trên gel điện di. Ngƣợc lại, nếu không có ADN của vi

khuẩn lao trong mẫu sẽ không hiện phổ vạch trên bản điện di agarose.

Nhằm đánh giá độ chính xác đồng thời kiểm tra hiệu quả của quy trình gắn

kết hạt nano từ đã đƣợc chức năng hóa bề mặt với kháng thể kháng lao, chúng tôi

tiến hành phản ứng PCR với khuôn là sản phẩm ly giải trong quy trình gắn kết từ

mẫu ban đầu là vaccine BCG và mẫu đờm lao. Với mẫu ban đầu là vaccine BCG thì



enzyme sử dụng là Taq ADN polymerase, còn với mẫu bệnh phẩm ban đầu là mẫu

đờm lao thì enzyme đƣợc sử dụng là ADN Dream taqTM

polymerase của hãng

Fermentas. Sử dụng nƣớc cất hai lần làm đối chứng âm. Mỗi phản ứng gồm các

thành phần sau :

Bảng 2.2. Các thành phần trong phản ứng PCR với vaccine BCG

Thành phần Thể tích (µl)

H2O cất khử trùng, khử ion 12,5 µl

Đệm Taq ADN polymerase 10x 2,5 µl

Hỗn hợp dNTP (2 mM) 2,5 µl

Mồi xuôi (25 ng/µl) 1 µl

Mồi ngƣợc (25 ng/µl) 1 µl

ADN Taq polymerase (5 unit/µl) 0,5 µl

ADN khuôn 5 µl

Tổng thể tích phản ứng 25 µl

Bảng 2.3. Các thành phần trong phản ứng PCR với mẫu đờm lao

Thành phần Thể tích (µl)

H2O cất khử trùng, khử ion 12,8 µl

Đệm Taq ADN polymerase 10x 2,5 µl

Hỗn hợp dNTP (2 mM) 2,5 µl

Mồi xuôi (25 ng/µl) 1 µl

Mồi ngƣợc (25 ng/µl) 1 µl

ADN Dream taqTM

polymerase (5 unit/µl) 0,2 µl

ADN khuôn 5 µl

Tổng thể tích phản ứng 25 µl



Hỗn hợp PCR đƣợc trộn đều và đặt vào máy PCR. Chu trình nhiệt đƣợc điều

chỉnh cẩn thận về nhiệt độ ủ, thời gian ủ và thời gian kéo dài nhƣ ở bảng 2.4 dƣới

đây.

Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

40 chu trình

Giai đoạn biến tính 94oC – 1 phút

Giai đoạn gắn mồi 65oC – 45 giây

Giai đoạn kéo dài 72oC – 1 phút

Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 2%.

2.2.7. Điện di trên gel agarose

Các phân tử ADN là các polyanion nên trong môi trƣờng trung tính và kiềm,

dƣới tác dụng của điện trƣờng chúng sẽ di chuyển về cực dƣơng. Mức độ di chuyển

của các phân tử ADN trong điện trƣờng phụ thuộc chủ yếu vào kích thƣớc của

chúng và nồng độ gel. Phân tử kích thƣớc nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn phân tử kích

thƣớc lớn. Nồng độ agarose cao có khả năng phân tách các đoạn ADN nhỏ, trong

khi đó nồng độ agarose thấp lại cho phép phân tách các đoạn ADN nhỏ hơn.

Gel agarose 2% đƣợc chuẩn bị trong đệm TAE (Trisbase –Acetic – EDTA)

với nồng độ EDTA 1-2 mM để tránh sự phân cắt ADN bởi nuclease. Mẫu ADN

đƣợc trộn với đệm mẫu có chứa chất chỉ thị màu là bromophenol xanh, xylene

cyanol và 50 µg/ml ethidium bromide sau đó tra vào giếng. Điện di đƣợc tiến hành

với điện thế ổn đinh 10 volt/cm gel và chạy trong vòng 35 – 40 phút. Sau khi kết

thúc điện di bản gel đƣợc lấy ra soi và chụp ảnh dƣới ánh sáng tử ngoại của máy soi

Gel doc (Bio-Rad).



CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN GẮN KHÁNG THỂ LÊN

BỀ MẶT HẠT NANO TỪ TRÊN BCG

Trƣớc tiên chúng tôi kiểm tra sự có mặt của kháng thể anti-TB, sau đó nhằm

đạt hiệu quả cao nhất trong gắn kết kháng thể anti-TB lên trên bề mặt của hạt nano

từ có gắn nhóm amine thông qua cầu nối EDC, chúng tôi đã xác định nồng độ tối ƣu

của các thành phần tham gia đó là EDC, anti-TB và đặc biệt là xác định đƣợc loại

đệm sử dụng thích hợp nhất. Tiếp đó, chúng tôi thu nhận vi khuẩn lao dựa trên liên

kết kháng nguyên – kháng thể, tiến hành ly giải bằng các cách khác nhau để thu

đƣợc ADN của vi khuẩn lao và nhận biết sự có mặt của ADN vi khuẩn lao bằng sử

dụng mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR, sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra thông qua điện

di trên gel agarose. Sau những thí nghiệm đã thực hiện, chúng tôi thu đƣợc những

kết quả nhƣ sau.

3.1.1. Kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng lao

Dot blot là một phƣơng pháp để phát hiện, phân tích và xác định protein. Dot

blot cũng giống nhƣ phƣơng pháp Western blot nhƣng khác ở chỗ rằng mẫu protein

không đƣợc phân tách trên gel bởi điện di mà thay vào đó mẫu protein đƣợc phát

hiện trực tiếp thông qua sự xuất hiện của những vết đốm tròn trên bề mặt của màng

lai [39].

Chính vì vậy, sau khi nhận đƣợc kháng thể từ hãng Abcam (Mỹ), chúng tôi

đã sử dụng phƣơng pháp Dot blot để kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng lao

nhờ sự có mặt của kháng nguyên bề mặt của vi khuẩn lao có trong mẫu vaccine

BCG. Mẫu vaccine BCG đƣợc pha thành nhiều nồng độ khác nhau trƣớc khi tiến

hành thí nghiệm. Đối chứng dƣơng đƣợc sử dụng là kháng thể sơ cấp và dùng đệm

PBS 1x pH 7,4 làm đối chứng âm.



Hình 3.1. Kết quả kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng lao

Ô 1 : Đối chứng dương, Ô 2 : Mẫu vaccine BCG không pha loãng

Ô 10 : Đối chứng âm (không có vaccine BCG)

Ô 3 – 9 : Mẫu vaccine BCG được pha loãng thành các nồng độ khác nhau tương

tứng từ 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:50, 1:100, 1:200.

Kết quả Dot blot ở hình 3.1 đã khẳng định sự có mặt của kháng thể kháng

lao, tuy nhiên mức độ biểu hiện tùy thuộc vào nồng độ BCG đƣợc sử dụng. Ở ô 2

tƣơng ứng với mẫu vaccine BCG không pha loãng độ đậm của vết chấm rất rõ nét,

mặc dù độ đậm không bằng đối chứng dƣơng ở ô 1. Mức độ đậm của vết chấm

giảm dần từ ô 3 đến ô 6 tƣơng ứng với nồng độ pha loãng từ 1:2 đến 1:20 và đến ô

thứ 7 tƣơng ứng với nồng độ pha loãng 1:50 thì gần nhƣ không xuất hiện màu của

phản ứng trên vết chấm và hai ô còn lại là ô 8 và ô 9 tƣơng ứng với nồng độ pha

loãng 1:100 và 1:200 thì không xuất hiện màu của phản ứng, hai ô này kết quả gần

nhƣ với mẫu đối chứng âm ở ô thứ 10. Và để khẳng định một lần nữa phân tích trên

có độ tin cậy cao, chúng tôi sử dụng phần mềm Image J – một phần mềm phân tích

độ sáng của hình ảnh để phân tích vết đốm tròn trên hình 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả phân tích độ sáng của vết đốm tròn trên màng lai

Số ô 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Pha loãng

Đối

chứng

dƣơng

Không

pha

loãng

1:2 1:5 1:10 1:20 1:50 1:100 1:200

Đối

chứng

âm

Mức độ

sáng so

với ĐC

dƣơng

100% 44,22% 37,28

%

25,9

9%

5,6

% 2,4% 0,5% 0% 0% 0%



Kết quả phân tích bằng phần mềm Image J rất phù hợp với những nhận xét ở

trên. Độ sáng của các vết đốm tròn từ những tỷ lệ BCG khác nhau cũng giảm dần từ

nồng độ cao xuống nồng độ thấp. Từ những phân tích trên cho phép chúng tôi kết

luận là kháng thể kháng lao đƣợc cung cấp từ hãng Abcam (Mỹ) rất phù hợp với

nghiên cứu này, kháng thể kháng lao có mặt đặc hiệu với mẫu nghiên cứu.

3.1.2. Kiểm tra hiệu suất phản ứng gắn kết trong các đệm khác nhau

Hermanson [20] đã nghiên cứu phản ứng của EDC hình thành liên kết amide

trong dung dịch nƣớc sử dụng các phân tử cacboxylate đóng góp một một nhóm

hoạt hóa và athylene diamine hoặc benzylamine nhƣ một nhóm chức năng để tạo

liên kết. Kết quả của họ đã chỉ ra rằng, việc hoạt hóa nhóm carboxyl xảy ra hiệu quả

nhất với EDC tại pH 3,5 – 4,5 trong khi liên kết amide đƣợc hình thành hiệu quả

nhất trong phạm vi pH 4,0 – 6,0. Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng

sự thủy phân EDC xảy ra tối đa ở giá trị pH có tính acid với sự ổn định ngày càng

tăng của carbodiimide trong dung dịch có pH bằng hoặc trên 6,5. Và quan trọng là

khi tiến hành thí nghiệm với các chất là protein hoặc peptids thì nhóm tác giả cho

thấy sự hình thành liên kết amide qua cầu nối trung gian EDC xảy ra hiệu quả nhất

trong khoảng pH 4,5 – 7,5. Ngoài khoảng pH này thì sự hình thành liên kết vẫn xảy

ra nhƣng với tốc độ rất chậm và hiệu quả không cao. Hai loại đệm đƣợc sử dụng

trong nghiên cứu này là đệm MES và đệm PBS.

Áp dụng nghiên cứu của tác giả trên, chúng tôi quyết định chọn 2 loại đệm

với các vùng pH khác nhau để tiến hành thử nghiệm gắn kết hạt từ amine với kháng

thể kháng lao qua cầu nối trung gian EDC. Đệm MES đƣợc sử dụng với ba pH khác

nhau pH 4,5; pH 5,5; pH 6,5 và đệm PBS đƣợc sử dụng với hai pH khác nhau là pH

6,5 và pH 7,4.

Cùng với việc lựa chọn loại đệm với pH thích hợp, chúng tôi cũng tiến hành

thí nghiệm với tỷ lệ giữa kháng thể và EDC (v/v) khác nhau nhằm mục đích xác

định tỷ lệ thích hợp nhất và cho hiệu quả gắn hạt cao nhất. Thành phần và tỷ lệ các

chất tham gia gắn kết đƣợc trình bày ở bảng 3.2.



Bảng 3.2. Thành phần và tỷ lệ các chất tham gia gắn kết

STT

Các thành phần Tổng thể tích

(µl) Đệm gắn kết

(µl)

Kháng thể

(µl)

EDC

(µl)

1. 74 0,5 0,5

75

2. 73,5 0,5 1,0

3. 72,5 0,5 2

4. 70,5 0,5 4

5. 73,5 1,0 0,5

6. 73 1,0 1,0

7. 72 1,0 2

8. 75 1,0 4

9. 72,5 2 0,5

10. 73 2 1,0

11. 71 2 2

12. 69 2 4

50 µl hạt NP-NH2 sau khi đƣợc rửa hai lần bằng đệm và hút bỏ dịch trong,

đƣợc bổ sung các thành phần với tỷ lệ nhƣ trên. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 22oC trong

khoảng 30 phút. Kết quả thử nghiệm các tỷ lệ (v/v) khác nhau của thành phần tham

gia phản ứng gắn kết cho chúng tôi thấy rằng tỷ lệ đệm gắn kết : kháng thể : EDC =

71 : 2 : 2 cho kết quả tốt nhất, độ ổn định và tính lặp lại cao nhất khi sử dụng với

những loại đệm khác nhau. Chính vì vậy, chúng tôi đã quyết định chọn tỷ lệ này để

tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.



Mặc dù mô hình phức gắn kết hạt nano từ đã đƣợc chức năng hóa bề mặt với

kháng thể kháng vi khuẩn lao tại 2.2.2 và làm giàu vi khuẩn lao để làm khuôn cho

phản ứng PCR tại 2.2.3 dựa trên nguyên tắc đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể có

tính đặc hiệu rất cao nhƣng nhƣợc điểm của quy trình là không đánh giá đƣợc mức

độ gắn kết giữa các thành phần tham gia phản ứng, chƣa xác định đƣợc loại đệm

nào sẽ giúp cho việc gắn kết đạt hiệu suất cao nhất. Chính vì vậy, chúng tôi đã xây

dựng quy trình đánh giá mức độ phức hệ kháng thể gắn hạt khi sử dụng 5 loại đệm

gắn kết khác nhau là MES pH 4,5; pH 5,5; pH 6,5 và PBS pH 6,5; pH 7,4 dựa trên

nguyên tắc của phƣơng pháp Dot blot.

Hạt từ sau bƣớc “Sƣ dụng hạt từ để thu nhận vi khuẩn lao từ mẫu BCG ”

tại 2.2.3 đƣợc xem là đối tƣợng đánh giá. Cần lƣu ý rằng, trƣớc đó 5 quy trình sử

dụng 5 loại đệm khác nhau đã đƣợc tiến hành. Hình 3.2 biểu thị các bƣớc đánh giá

mức độ gắn của hạt trên các đệm khác nhau.

Hình 3.2. Quy trình đánh giá mức độ phức hệ kháng thể gắn hạt



Một phần dịch BCG thực hiện phản ứng Dot blot nhƣ quy trình 2.2.1, kết quả

của phần dịch BCG này cho thấy một lƣợng không đáng kể kháng thể gắn kết bị

kéo theo dịch BCG bị loại bỏ. Trong khi đó, tất cả các dịch thu đƣợc từ quy trình

trên đều đƣợc chấm lên màng và thử phản ứng màu với thuốc thử. Kết quả đƣợc

thể hiện ở hình 3.3.

Hình 3.3. Kết quả đánh giá mức độ phức hệ kháng thể gắn hạt

Dịch BCG: Dịch thu được sau 45 phút ủ phức hạt với vaccine BCG; Dịch S: Dịch

thu được sau khi ủ phức hạt với kháng thể thứ cấp; Dịch W: Dịch thu được sau khi rửa hạt

bằng đệm PBS 1x 7,4 có 0,05% Tween20; Dịch E: Dịch thu được sau khi cân bằng hạt bởi

đệm AP; Dịch B: Dịch thu được sau khi hạt được thử màu bằng thuốc thử NBT/BCIP

Kết quả đánh giá mức độ gắn kháng thể lên hạt (hình 3.3) cho thấy rằng tất

cả các đệm gắn kết đƣợc sử dụng đều có hiệu quả mặc dù mức độ gắn kết là khác

nhau thể hiện ở độ đậm không giống nhau của các đốm tròn trên màng lai.

Sử dụng phần mềm Image J để đánh giá mức độ đậm hay nhạt của từng phân

đoạn của mỗi loại đệm gắn kết qua đó nhận định đƣợc hiệu suất gắn kết giữa hạt

nano từ với kháng thể kháng lao, chúng tôi đã có kết quả trình bày ở bảng 3.3.



Bảng 3.3. Đánh giá mức độ gắn kết qua phần mềm Image J

Tên phân

đoạn

Đệm MES

pH 4,5

Đệm MES

pH 5,5

Đệm MES

pH 6,5

Đệm PBS

pH 6,5

Đệm PBS

pH 7,4

Dịch BCG 1% 1% 1% 4% 1%

Dịch S 29% 26% 27% 24% 26%

Dịch W 20% 20% 18% 17% 19%

Dịch E 19% 16% 14% 12% 15%

Dịch B 31% 37% 40% 41% 39%

Kết quả thu đƣợc (bảng 3.3) cho thấy hiệu suất gắn kết giữa hạt nano từ với

kháng thể kháng lao dao động từ 31% đến 41%, trong đó cao nhất là đệm PBS pH

6,5 với 41%, tiếp theo là đệm MES pH 6,5; PBS pH 7,4; MES pH 5,5 với các tỷ lệ

tƣơng ứng lần lƣợt là 40%, 39%, 37% và thấp nhất là đệm MES pH 4,5 với 31%.

Qua nhiều lần lặp lại với kết quả tƣơng tự, chúng tôi quyết định sử dụng 3 loại đệm

chính cho các thí nghiệm tiếp theo đó là đệm MES pH 6,5; PBS pH 6,5 và PBS pH

7,4.

3.1.3. Kết quả ly giải tế bào vi khuẩn lao bằng các phƣơng pháp khác nhau

Phức hệ hạt sau khi gắn kết đƣợc bổ sung 25 µl vaccine BCG (10-3

mg/ml),

trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 45 phút. Tiếp theo tập trung từ trên giá

nam châm và hút bỏ dịch BCG. Sau đó bổ sung 25 µl thể tích đệm và tiến hành các

cách ly giải khác nhau để thu nhận ADN, ADN đã tách chiết đƣợc làm khuôn cho

phản ứng PCR. Sản phẩm PCR đƣợc phân tích trên gel agarose 2%.



Hình 3.4. Kết quả ly giải tế bào vi khuẩn lao bằng các phƣơng pháp khác nhau

Giếng (-) : Đối chứng âm, Giếng M : Thang chuẩn ADN 100 bp

Giếng (+) : Đối chứng dương

Giếng 1, 2, 3 : phương pháp ly giải 1, lần lượt với các đệm MES pH 6,5; PBS 6,5

và PBS 7,4


và PBS 7,4


và PBS 7,4

Giếng 10, 11, 12 : phương pháp ly giải 4, lần lượt với các đệm MES pH 6,5; PBS

6,5 và PBS 7,4

Kết quả điện di sản phẩm PCR (hình 3.4) cho thấy mẫu ADN tách chiết đƣợc

nhân lên qua PCR xuất hiện băng có kích thƣớc 249 bp đặc hiệu cho vi khuẩn lao,

đối chứng âm không cho băng ADN nào, có nghĩa là sử dụng quy trình 2.2.2 và

2.2.3 đã cho phép thu nhận đƣợc ADN của vi khuẩn lao. Bên cạnh đó, qua hình 3.4

cũng thể hiện hiệu quả thu nhận ADN của các phƣơng pháp ở 2.2.4 là khác nhau và

ngay cả trong một phƣơng pháp ly giải thì hiệu quả thu nhận ADN cũng khác nhau

khi sử dụng các đệm khác nhau. Trong 4 phƣơng pháp ly giải mà chúng tôi sử dụng



thì phƣơng pháp 1 và phƣơng pháp ly giải 4 cho hiệu quả thấp nhất, các băng ADN

nhân bản xuất hiện không rõ hoặc xuất hiện với mức độ rõ nét không cao ở cả 3 loại

đệm MES pH 6,5, PBS pH 6,5; PBS pH 7,5. Trái ngƣợc với điều này, ở phƣơng

pháp ly giải 2 và đặc biệt khi sử dụng đệm PBS pH 6,5 ở phƣơng pháp ly giải 3

băng ADN nhân bản xuất hiện rất rõ nét.

Theo nhiều nghiên cứu thì khi tách chiết ADN, trong đệm gần nhƣ bắt buộc

phải có EDTA vì đây là chất ức chế của hầu hết các nuclease (do tạo phức càng cua

với ion kim loại cần cho hoạt động của nuclease) giúp bảo vệ ADN không bị phân

hủy bởi nuclease. Công trình nghiên cứu của Awua A.K. và cộng sự [11] đã khẳng

định đệm TE là một đệm rất hiệu quả trong việc chuẩn bị ADN của MTB cho phản

ứng PCR. Nghiên cứu cho thấy khi sử dụng phƣơng pháp bổ sung TE và ủ ở nhiệt

độ 95oC trong 30 phút thì kết quả PCR đã thành công với cả 3 cặp mồi

rpoB/KatG/rrs, trong khi các phƣơng pháp khác nhƣ không sử dụng TE chỉ ủ nhiệt

kết quả PCR chỉ thành công với cặp mồi arpsL hoặc bổ sung TE cùng với làm lạnh

ở -20oC sau đó mới ủ 95

oC hoặc sử dụng TET ủ ở nhiệt độ 95

oC không thành công

với tất cả các cặp mồi sử dụng. Bên cạnh đó một số nghiên cứu khác nhƣ: Amita J.

và cộng sự [9] đã chỉ ra rằng xử lý nhiệt là rất cần thiết để làm phá vỡ các liên kết

của các phân tử phospholipid của thành tế bào vi khuẩn lao, kết quả giải phóng

ADN vi khuẩn lao ra ngoài dung dịch. Trong nghiên cứu này cũng trích dẫn kết quả

của Fiss và cộng sự (1992), Cormican và cộng sự (1992) khẳng định rằng xử lý

nhiệt tới 100oC trong bộ đệm thích hợp giúp ly giải ADN của Mycobacterium đạt

hiệu suất cao để sử dụng cho phản ứng PCR. Chính vì vậy có thể nói kết quả ly giải

với các phƣơng pháp khác nhau đặc biệt là sử dụng đệm ly giải TE và hỗn hợp đƣợc

ủ ở 100oC trong 20 phút với đệm gắn kết ban đầu là PBS pH 6,5 là rất có ý nghĩa,

góp phần định hƣớng trọng tâm trong nghiên cứu tiếp theo của chúng tôi.

3.1.4. Tối ƣu hóa nồng độ BCG sử dụng

Để hoàn thiện hơn nữa nghiên cứu, sau khi đã xác định đƣợc đệm gắn kết và

phƣơng pháp ly giải hiệu quả nhất chúng tôi tiến hành đánh giá lƣợng BCG sử dụng



và thời gian cần thiết để hình thành phức hệ hạt nano từ với kháng thể kháng lao

thong qua cầu nối EDC.

Nồng độ BCG sử dụng ban đầu là 10-3

mg/ml sẽ tiếp tục đƣợc pha loãng theo

cấp số 5 (5 lần, 25 lần, 125 lần và 625 lần). Các mẫu pha loãng với nồng độ khác

nhau này sẽ đƣợc bổ sung 25 µl vào phức hệ hạt nano từ - kháng thể theo quy trình

2.2.3.

Hình 3.5. Kết quả thử nghiệm nồng độ BCG sử dụng



Giếng 1, 2, 3, 4, 5: lần lượt với các mẫu không pha loãng, pha loãng 5, 25, 125 và 625 lần

Kết quả điện di sản phẩm PCR để phát hiện BCG ở các nồng độ khác nhau

(hình 3.5) cho thấy các giếng 1 – 3 tƣơng ứng với các mẫu BCG không pha loãng,

pha loãng 5 lần và 25 lần xuất hiện băng ADN có kích thƣớc giống với đối chứng

dƣơng 249 bp, mức độ rõ nét của các băng ADN tƣơng ứng cũng giảm dần và đến



giếng 4 - 5 thì băng ADN xuất hiện rất mờ, bên cạnh đó cũng thấy giếng chạy đối

chứng âm không lên băng ADN nào. Với kết quả thu đƣợc, chúng tôi cho rằng với

nồng độ 4x10-5

mg/ml thì quy trình vẫn cho kết quả mong muốn.

3.1.5. Tối ƣu hóa thời gian phản ứng gắn kết

Cùng với việc đánh giá lƣợng BCG sử dụng trong nghiên cứu, chúng tôi

cũng tiến hành tối ƣu thời gian phản ứng gắn kết giữa hạt nano từ với kháng thể

thông qua cầu nối EDC với các khoảng thời gian 15 phút, 30 phút và 60 phút áp

dụng cho cả 5 nồng độ BCG sử dụng.

Hình 3.6. Tối ƣu hóa thời gian phản ứng gắn kết giữa hạt nano – EDC - kháng

thể kháng lao

Giếng (-) : Đối chứng âm, Giếng M : Thang chuẩn ADN 100 bp và đối chứng

dương.

Giếng 1, 2, 3, 4, 5 : Thời gian ủ phức hạt 15 phút lần lượt với các mẫu không pha

loãng, pha loãng 5, 25, 125 và 625 lần.

Giếng 6,7,8,9,10 : Thời gian ủ phức hạt 30 phút lần lượt với các mẫu không pha

loãng, pha loãng 5, 25, 125 và 625 lần.

Giếng 11, 12, 13, 14, 15 : Thời gian ủ phức hạt 60 phút lần lượt với các mẫu

không pha loãng, pha loãng 5, 25, 125 và 625 lần.



Kết quả điện di ở hình 3.6 cho thấy tại tất cả các thời gian ủ đều xuất hiện

băng ADN kích thƣớc 249 bp giống nhƣ đối chứng dƣơng, tuy nhiên có sự khác

nhau rất lớn khi sử dụng nồng độ BCG khác nhau tại mỗi thời gian ủ. Tại thời gian

ủ 15 hay 60 phút thì chỉ ở nồng độ BCG không pha loãng mới cho băng ADN xuất

hiện rõ, còn ở các nồng độ pha loãng thấp hơn thì không xuất hiện hoặc có xuất hiện

nhƣng rất mờ. Trong khi đó tại thời gian ủ 30 phút, sự xuất hiện băng là rất rõ nét

giảm dần từ nồng độ không pha loãng tới pha loãng 25 lần, phù hợp với kết quả

đánh giá nồng độ BCG sử dụng ở trên.

Từ kết quả trên cho chúng tôi kết luận thời gian ủ phức hệ hạt nano từ - đệm

gắn kết – EDC – kháng thể kháng lao 30 phút mà chúng tôi áp dụng cho các quy

trình trên đã là tối ƣu, và đây là thời gian hợp lý nhất để phức hệ hạt nano từ và

kháng thể kháng lao gắn kết đạt hiệu quả cao nhất.

3.1.6. Độ đặc hiệu của phƣơng pháp

Nhằm mục đích chứng minh tính đặc hiệu của phƣơng pháp đối với vi khuẩn

lao chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm các quy trình 2.2.2 và 2.2.3 trong các điều

kiện tối ƣu với các vi khuẩn khác thuộc chi Bacillus và Pseudomonas. Vi khuẩn

Bacillus licheniformic và vi khuẩn Pseudomonas pseudoalicaligenes đƣợc nuôi

trong môi trƣờng Luria Bertani với thành phần dinh dƣỡng thích hợp [26, 30]. Dung

dịch chứa vi khuẩn sau đó đƣợc dùng làm mẫu thí nghiệm.

Hỗn hợp phức hệ hạt nano từ cùng với 71 µl đệm PBS pH 6,5, 2 µl EDC,

2 µl kháng thể anti-TB đƣợc ủ ở 22oC trong 30 phút. Phức hệ hạt sau khi loại bỏ

dịch trong sẽ đƣợc bổ sung 25 µl mỗi mẫu thí nghiệm: dịch vaccine BCG, dịch nuôi

Bacillus licheniformic và cuối cùng là dịch Pseudomonas pseudoalicaligenes. Ủ

hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 45 phút, sau đó tập trung hạt từ và bổ sung 25 µl

đệm TE, tiến hành ly giải 20 phút tại 100oC. Sản phẩm đƣợc tiến hành PCR và điện

di trên gel agarose 2%.



Hình 3.7. Kết quả thí nghiệm kiểm tra tính đặc hiệu



Giếng 1 : Mẫu vaccine BCG

Giếng 2 : dung dịch chứa vi khuẩn Bacillus licheniformic

Giếng 3 : dung dịch chứa vi khuẩn Pseudomonas pseudoalcaligenes

Nhƣ chúng ta đã biết, cả hai chủng vi khuẩn trên đều là vi khuẩn hiếu khí,

B. lichenifocmic là vi khuẩn gram dƣơng còn P. pseudoalcaligenes là vi khuẩn gram

âm. Đây cũng là hai chủng vi khuẩn điển hình trong nghiên cứu vi sinh vật [26, 30].

Kết quả điện di sản phẩm PCR để đánh giá độ đặc hiệu của hƣơng pháp (hình 3.7)

cho thấy ở mẫu vaccine BCG xuất hiện băng rõ nét tƣơng đƣơng với đối chứng

dƣơng có kích thƣớc 249 bp, trong khi đó đối chứng âm và các mẫu vi khuẩn B.

lichenifocmic và P. pseudoalcaligenes không thấy xuất hiện băng ADN. Điều này

chứng tỏ phƣơng pháp có tính đặc hiệu đối với vi khuẩn lao.



3.2. THỬ NGHIỆM CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƢU LÊN MẪU BỆNH PHẨM

Với những thành công đã đạt đƣợc trong việc nghiên cứu, tối ƣu các điều

kiện gắn kết hạt nano từ với kháng thể kháng lao qua cầu nối EDC và tìm ra phƣơng

pháp hiệu quả nhất để ly giải thu nhận ADN vi khuẩn lao từ mẫu vaccine BCG,

chúng tôi tiếp tục thử nghiệm trên mẫu bệnh phẩm là đờm lao. Mẫu đờm lao của

bệnh nhân bị bệnh lao đƣợc nhận từ Viện Quân y 103. Các mẫu đờm này đã đƣợc

Viện 103 chẩn đoán bằng phƣơng pháp soi trực tiếp.

Ứng dụng các điều kiện tối ƣu thu đƣợc từ nghiên cứu trên chúng tôi tiến

hành thí nghiệm với mẫu đờm lao theo sơ đồ hình 3.8 nhƣ sau.

Hình 3.8. Quy trình ứng dụng các điều kiện tối ƣu trên mẫu đờm lao



Sau khi thu đƣợc các phần dịch làm khuôn cho phản ứng PCR, ban đầu

chúng tôi sử dụng ADN taq polymerase với thành phần phản ứng nhƣ đã trình bày

tại bảng 2.2. Tuy nhiên, kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% không

xuất hiện băng ở hầu hết các mẫu. Chính vì vậy, chúng tôi đã quyết định sử dụng

ADN dream taqTM

polymerase thay cho ADN taq polymerase với thành phần phản

ứng nhƣ đã trình bày tại bảng 2.3. ADN dream taqTM

polymerase là một Taq

polymerase tăng cƣờng sự tối ƣu của phản ứng PCR chuẩn, cho phép tăng độ nhạy

và sản lƣợng sản phẩm PCR trong cùng một điều kiện phản ứng so với ADN taq

polymerase [38].

Hình 3.9. Kết quả thử nghiệm các điều kiện tối ƣu trên 7 mẫu bệnh lao

Giếng (-) : Đối chứng âm

Giếng M : Thang chuẩn ADN 1 kb


Giếng 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 : Các mẫu số 1 đến 7

Giếng 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 : Phần dịch còn lại của các mẫu tương ứng



Hình 3.10. Kết quả thử nghiệm các điều kiện tối ƣu trên 5 mẫu bệnh lao



Giếng 1, 3, 5, 7, 9: Các mẫu số 8 đến 12

Giếng 2, 4, 6, 8, 10: Phần dịch còn lại của các mẫu tương ứng

Kết quả điện di trên gel sản phẩm PCR ở hình 3.9 và 3.10 cho thấy, ở giếng

của đối chứng âm ở cả hai hình không có khuôn nên không cho băng sản phẩm

PCR, còn giếng đối chứng dƣơng với khuôn là ADN của MTB có băng 249 bp. Ở

tất cả các mẫu đƣợc nghiên cứu ở đây thì phần dịch còn lại đều không xuất hiện

băng, điều này có thể đƣợc giải thích do trong phần dịch có thể chứa nhiều chất ức

chế phản ứng PCR hoặc không chứa ADN vi khuẩn lao. Trong khi đó, các mẫu từ

số 1 đến mẫu số 9 đều cho băng ADN có kích thƣớc 249 bp, điều này rất phù hợp

với kết quả soi trực tiếp của Viện 103 đó là các mẫu của bệnh nhân dƣơng tính với

MTB. Tuy nhiên có một điều đáng lƣu ý là trong số 3 mẫu âm tính với MTB mà

chúng tôi tiếp nhận từ Viện 103, mẫu số 10 cũng cho băng ADN có kích thƣớc 249

bp nhƣ với các mẫu dƣơng tính, kết quả lặp lại 4 lần là tƣơng tự. Kết quả này đƣợc



chúng tôi ghi nhận và có thể giải thích rằng do phƣơng pháp chúng tôi sử dụng có

tính nhạy cao hơn so với phƣơng pháp soi trực tiếp của Viện 103. Và để chứng

minh cho điều này thì trong những nghiên cứu trong thời gian tiếp theo, chúng tôi

sẽ nghiên cứu với số lƣợng mẫu nhiều hơn.

Sau khi thử nghiệm các điều kiện tối ƣu trên các mẫu bệnh phẩm, chúng tôi

tiếp tục nghiên cứu tối ƣu thời gian ủ mẫu bệnh phẩm nhằm mục đích tiết kiệm thời

gian hoàn thành quy trình. Các khoảng thời gian đƣợc thử nghiệm ở đây là 15 phút,

30 phút và 45 phút. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.11 dƣới đây.

Hình 3.11. Tối ƣu hóa thời gian ủ mẫu đờm lao



Giếng 1, 2 : Mẫu đờm lao và phần dịch còn lại của thời gian ủ 15 phút

Giếng 3, 4 : Mẫu đờm lao và phần dịch còn lại của thời gian ủ 30 phút

Giếng 5,6 : Mẫu đờm lao và phần dịch còn lại của thời gian ủ 45 phút

Kết quả hình 3.11 đã chỉ ra rằng chỉ cần ủ mẫu đờm lao trong vòng 30 phút

đã cho kết quả băng ADN 249 bp, điều này là rất cần thiết cho việc rút ngắn thời

gian chẩn đoán bệnh.



3.3. ĐÁNH GIÁ ĐỘ BỀN CỦA PHỨC HỆ HẠT NANO TỪ GẮN KHÁNG

THỂ KHÁNG LAO

Theo đánh giá của chúng tôi, việc tạo đƣợc liên kết gắn kết giữa hạt nano từ

với kháng thể thông qua cầu nối EDC đã rất thành công mà minh chứng là ứng

dụng nghiên cứu, thử nghiệm trên mẫu vaccine BCG và mẫu đờm lao đạt kết quả

cao. Tuy nhiên, các phức hệ sinh học rất dễ biến đổi nếu không đƣợc áp dụng các

biện pháp bảo quản thích hợp. Bên cạnh đó, nhằm hƣớng tới việc chế tạo bộ sinh

phẩm phát hiện vi khuẩn lao chúng tôi đã tiến hành bảo quản phức hệ trong dung

dịch PBS-TBN (Đệm PBS pH 7,4 bổ sung 0,01% Tween20; 0,1% và 0,05 M NaN3)

và tiến hành đánh giá độ bền vững của phức hệ trong dung dịch bảo quản này qua

các mốc thời gian : 0, 1, 3, 7, 10, 14, 21, 28 ngày theo quy trình hình 3.12.

Hình 3.12. Quy trình đánh giá độ bền vững của phức hạt nano từ gắn kháng thể



Các dịch trong thu đƣợc sau ly giải đƣợc bảo quản ở 4oC, đến ngày thứ 28 tất

cả các mẫu đƣợc tiến hành chung trong một phản ứng PCR.

Hình 3.13. Kết quả đánh giá độ bền vững của phức hạt nano từ gắn kháng thể

với mẫu vaccine BCG


Giếng M : Thang chuẩn ADN 1 kb


Giếng 1-8 : Kết quả đánh giá độ bền vững của phức hạt nano từ gắn kháng thể tại

các mốc thời gian 0, 1, 3, 7, 10, 14, 21, 28 ngày

Kết quả điện di ở hình 3.13 cho thấy tất cả các mốc thời gian đều xuất hiện

băng ADN nhân bản có kích thƣớc 249 bp đặc hiệu cho vi khuẩn lao, có nghĩa là

phức hệ hạt từ gắn kháng thể bền vững trong dung dịch bảo quản PBS-TBN hay nói

cách khác dung dịch PBS-TBN rất thích hợp cho việc lƣu giữ phức hệ hạt nano từ

gắn kháng thể.

Sau khi nghiên cứu độ bền vững của phức hệ hạt nano từ gắn kháng thể trong

dung dịch bảo quản PBS-TBN đối với mẫu vaccine BCG chúng tôi cũng tiến hành



thử nghiệm tại ngày 28 với một mẫu đờm lao và kết quả cũng rất thành công khi

xuất hiện băng ADN nhân bản có kích thƣớc 249 bp đặc hiệu cho MTB. Kết quả thể

hiện ở hình 3.14.

Hình 3.14. Thử nghiệm độ bền vững của phức hạt nano từ gắn kháng thể

với mẫu đờm lao


Giếng M : Thang chuẩn ADN 100 bp


Giếng 1 : Thử nghiệm mức độ bền vững của phức hệ đối với mẫu đờm lao tại ngày 28

Giếng 2 : Phần dịch còn lại của mẫu đờm lao tại ngày thử nghiệm 28

Theo nhiều nghiên cứu thì PBS-TBN là dung dịch thƣờng đƣợc sử dụng để

bảo quản những phức hệ sinh học. Công trình nghiên cứu của Ambrosino E. và

cộng sự [8] đã cho thấy rằng PBS-TBN có tác dụng lƣu giữ hoạt tính của phức hệ

giữa peptide bắt nguồn từ protein Starp trong hồng cầu Plasmodium falciparum với

hạt đã đƣợc bọc bởi một lớp kháng nguyên đƣợc 01 tháng, giữa peptide bắt nguồn

từ các protein Lsa1, Lsa3, Glurp, Salsa, Trap, CSP và Pf11.1 trong hồng cầu

Plasmodium falciparum và 2 peptide bắt nguồn từ protein gSG6 trong nƣớc bọt loài



Anopheles gambiae với hạt đã đƣợc bọc bởi một lớp kháng nguyên đƣợc 03 tháng.

Đáng chú ý là phức hệ này cũng đƣợc tạo thông qua cầu nối trung gian EDC và

NHS. Chính vì vậy, có thể nói kết quả đạt đƣợc trong việc sử dụng dung dịch

PBS-TBN lƣu giữ độ bền vững của phức hệ hạt nano từ gắn kháng thể kháng lao có

ý rất quan trọng trong việc định hƣớng phát triển bộ sinh phẩm phát hiện sớm vi

khuẩn lao, góp phần phòng và chống lao trên đất nƣớc Việt Nam cũng nhƣ trên thế

giới.



KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO

KẾT LUẬN

Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi rút ra đƣợc những kết luận nhƣ

sau:

1. Đã xây dựng đƣợc quy trình sử dụng hạt nano kim loại có từ tính đã đƣợc

chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán vi khuẩn lao trên đối tƣợng vaccine BCG,

trong đó đã gắn kết hạt nano kim loại có từ tính đã đƣợc chức năng hóa bề mặt với

kháng thể kháng lao với việc sử dụng cho 1 phản ứng là 71µl đệm PBS pH 6,5; 2µl

kháng thể kháng lao (7 mg/ml); 2 µl EDC (250 mg/ml), hỗn hợp đƣợc ủ ở 22oC

trong 30 phút cho phép phát hiện BCG ở nồng độ 4x10-5

mg/ml.

2. Đã thử nghiệm thành công các điều kiện tối ƣu trên của quy trinh trên các

mẫu bệnh phẩm (đờm lao), sử dụng cặp mồi đặc hiệu IS6110 và ADN Dream taqTM

polymerase. 100% mẫu bệnh lao dƣơng tính đƣợc chẩn đoán có kết quả trùng với

kết quả của Viện Quân Y 103.

3. Phức hệ hạt nano từ gắn kết với kháng thể kháng lao qua cầu nối EDC đƣợc

bảo quản trong dung dịch PBS-TBN có độ bền đến ngày thứ 28 khi thử nghiệm với

mẫu vaccine BCG và mẫu đờm lao.

HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO

1. Tiếp tục thử nghiệm độ chính xác của quy trình chẩn đoán vi khuẩn lao bằng

hạt từ nano đã đƣợc chức năng hóa bề mặt trên số lƣợng lớn mẫu bệnh phẩm

nhiễm lao, đồng thời mở rộng trên các đối tƣợng vi khuẩn, virus khác.

2. Tiến tới chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện vi khuẩn lao và phối hợp với các

phòng xét nghiệm của các bệnh viện để thử nghiệm ứng dụng hạt nano từ

đƣợc chức năng hóa bề mặt chẩn đoán các bệnh liên quan đến vi khuẩn lao.



TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Bộ Y tế (2012), Báo cáo tổng kết chương trình phòng chống lao quốc

gia, Hội nghị tổng kết công tác chống lao giai đoạn 2007 - 2011, định hƣớng hoạt

động giai đoạn 2012 – 2015, Hà Nội ngày 24 tháng 03 năm 2012.

2. Nguyễn Thị Chính, Trƣơng Thị Hòa (2005), Vi sinh vật Y học, NXB

Đại học Quốc gia Hà Nội.

3. Nguyễn Việt Cồ, Trần Văn Sáng, Ngô Ngọc Am, Lê Ngọc Hƣng, Mai

Văn Khƣơng, Nguyễn Xuân Nghiêm, Trần Thị Xuân Phƣơng (2006), Bệnh học lao,

NXB Y học.

4. Nguyễn Hữu Đức, Trần Mậu Danh, Trần Thị Dung (2007), “Chế tạo

và nghiên cứu tính chất từ của các hạt nano Fe3O4 ứng dụng trong y sinh học”, Tạp

chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 23, tr. 231-237.

5. Nguyễn Hoàng Hải (2007), “Các hạt nano kim loại (Metallic

nanoparticles)”, Tạp chí Vật lý Việt Nam, 1(1), tr. 7-10.

6. Nguyễn Hoàng Hải, Nguyễn Châu, Nguyễn Hoàng Lƣơng, Nguyễn

Thị Vân Anh, Phan Tuấn Nghĩa, Mai Anh Tuấn (2007), Ứng dụng của hạt nano

ôxít sắt từ để tách chiết DNA, đếm tế bào bạch cầu, và cải tiến quá trình xử lí nước

nhiễm bẩn, Tuyển tập các báo cáo Hội nghị Vật lý Chất rắn toàn quốc lần thứ 5,

Vũng Tàu, 12-14/11/2007, tr.18-24.

TIẾNG ANH

7. Adikaram C.P., Perera J., Wijesundera S.S. (2012), “The manual

mycobacteria growth indicator tube and the nitrate reductase assay for the rapid

detection of rifampicin resistance of M. Tuberculosis in low resource settings”,

BMC Infect. Dis.12: 326.

8. Ambrosino E., Dumoulin C., Orlandi-Pradines E., Remoue F., Toure

A., Tall A., Sarr J.B., Poinsignon A., Sokhna C., Puget K., Jean T., Pascual A.,

Druilhe P., Fusai T., Rogier C. (2010), “A multiplex assay for the simultaneous



detection of antibodies against 15 Plasmodium falciparum and Anopheles

gambiae saliva antigens”, Malar. J. 9: 317.

9. Amita J., Vandana T., Guleria R.S., Verma R.K. (2002), “Qualitative

Evaluation of Mycobacterial DNA Extraction Protocols for Polymerase Chain

Reaction”, Mol. Biol. Today 3: 43-50.

10. Arruebo M., Valladares M.

(2009), “Antibody-Conjugated

Nanoparticles for Biomedical Applications”, J. Nanomater. 2009: 1-24.

11. Awua A.K., Doe E.D., Gyamfi O.K. (2010), “Evaluation of cost-

effective total nucleic acidsextraction protocols for cultured Mycobacterium

tuberculosis; a comparison by PCR amplification of genes associated with drug

resistance”, BMC Res. Notes 3:48

12. Bemer P., Palicova F., Rusch-Gerdes S., Dugeon H.B., Pfyffer G.E.

(2002), “Multicentre evaluation of fully automatic BACTEC mycobacteria growth

indicator tube 960 system for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis”,

J. Clin. Microbiol. 40: 150-154.

13. Brighenti S., Lerm M. (2012), “How Mycobacterium tuberculosis

Manipulates Innate and Adaptive Immunity – New Views of an Old Topic”,

Pathog. J. 4: 42-53.

14. Bruce I.J., Taylor J., Michael T., Martin J.D., Borioni E., Sangregorio

C., Sen T. (2004), “Synthesis,characterisation and application of silica-magnetite

nanocomposites”, J. Magnet. Magnet. Mater. 284: 145–160.

15. Campo A.D., Sen T., Lelluoche J.P., Bruce I.J. (2005),

“Multifunctional magnetite and silica-magnetite nanoparticles: Synthesis, surface

activation and applications in life science”, J. Magnet. Magnet. Mater. 293: 33–40.

16. Cole S. T., Brosch R., Parkhill J., Garnier T., Churcher C., Harris D.,

Gordon S. V., Eiglmeier K., Gas S., Barry C. E., Tekaia F., Badcock K., Basham

D., Brown D., Chillingworth T., Connor R., Davies R., Devlin K., Feltwell T.,

Gentles S., Hamlin N., Holroyd S., Hornsby T., Jagels K., Krogh A., McLean J.,

Moule S., Murphy L., Oliver K., Osborne J., Quail M. A., Rajandream M.A.,

http://www.hindawi.com/27484615/

http://www.hindawi.com/48503416/



Rogers J., Rutter S., Seeger K., Skelton J., Squares R., Squares S., Sulston J. E.,

Taylor K., Whitehead S., Barrell B.G. (1998), “Deciphering the biology

of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence”, Nature 393:

537-544.

17. Cousins D.V., Bastida R., Cataldi A., Quse V., Redrobe S., Dow S.,

Duignan P., Murray A., Dupont C., Ahmed N., Collins D.M., Butler W.R., Dawson

D., Rodriguez D., Loureiro J., Romano M.I., Alito A., Zumarraga M. (2003),

“Tuberculosis in seals caused by a novel member of the Mycobacterium

tuberculosis complex: Mycobacterium pinnipedii sp”, Int. J. Syst. Evol. Microbiol.

53: 1305-1314.

18. Eichbaum Q., Rubin E.J. (2002), “Tuberculosis: Advances in

Laboratory Diagnosis and Drug Susceptibility Testing”, Am. J. Clin. Pathol. 118:

S3-S17.

19. Emovon O. (2009), “Current trends in the laboratory diagnosis of

Tuberculosis”, Benin J. Postgrad. Med. 11: 80-90.

20. Hermanson G. T. (2008), Bioconjugate techniques 2nd Edition, San

Diego: Academic Press, 1202 p.

21. Kolk A.H.J., Kox L.F.F., Leeuwen J.V., Kuijper S.,Jansen H.M

(1998), “Clinical utility of the polymerase chain reaction in the diagnosis of

extrapulmonary tuberculosis”, Eur. Res. J. 11: 1222–1226.

22. Kubica G.P., Dye W.E., Cohn M.L., Middlebrook G. (1963), “Sputum

digestion and decontamination with N-Acetyl-l-cysteine sodium hydroxide for

culture of bacteria”, Am. Rev. Resp. Dis. 87: 775–779.

23. Kumar N., Kumar P. (2011), “Nanotechnology: A focus on Treatment

of Tuberculosis”, Int. J. Drug Del. 3: 25-42.

24. Letfullin R., Murphy B. (2011), “Application of plasmonic

nanomaterials in Nanomedicine”, Nanomater.: Appl. Prop. 1: 92-96.

http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=02051102

http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=02051102



25. Mathuria J.P. (2009), “Nanoparticles in tuberculosis diagnosis,

treatment and prevention: A hope for future”, Dig. J. Nanomater. Biostr. 4: 309 –

312.

26. Němečková I.. Solichová K., Roubal P., Uhrová B., Šviráková E.

(2011), “Methods for Detection of Bacillus sp., B. Cereus and B. licheniformis in

Raw Milk”, Czech J. Food Sci. 29: S55–S60.

27. Pankhurst Q.A., Connolly J., Jones S.K., Dobson J. (2003),

“Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine”, J. Physic. D: Appl. Physic

36: 167-181.

28. Pooja M.T., Komal V., Vida A., Shree R. (2011), “Functionalized

Gold Nanoparticles and Their Biomedical Applications”, Nanomater. 1: 31-63.

29. Rai M., Yadav A., Gade A. (2009), “Silver nanoparticles as a new

generation of antimicrobials”, Biotechnol. Adv. 27: 76-83.

30. Shi B., Xia X. (2003), “Morphological changes of Pseudomonas

pseudoalcaligenes in response to temperature selection”, Current. Microbiol. 46:

120–123.

31. Shukla I., Varshney S., Malik A. (2011), “Evaluation of nested PCR

targeting IS6110 of Mycobacterium tuberculosis for the diagnosis of pulmonary and

extra-pulmonary tuberculosis”, Biol. and Med. 3: 171-175.

32. Sounderya N., Zhang Y. (2008), “Use of Core/Shell Structured

Nanoparticles for Biomedical Applications”, Rec. Pat. Biomed. Engin. 1: 34-42.

33. WHO (2012), Global Tuberculosis report, WHO report 2012.

34. Wu W., He Q., Jiang Q. (2008), “Magnetic Iron Oxide Nanoparticles:

Synthesis and Surface functionalization strategies”, Nanoscale. Res. Lett. 3:397–

415.



TÀI LIỆU INTERNET

35. http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Mycobacterium_tuberculosis_Zi

ehl-Neelsen_stain_02.jpg

36. http://www.rsc.org/chemistryworld/news/2007/october/18100702.asp

37. http://openi.nlm.nih.gov/

38. http://www.thermoscientificbio.com/pcr-enzymes-master-mixes-and-

reagents/dreamtaq-dna-polymerase/

39. http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Dot%20blot%20protocol.pdf

http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Mycobacterium_tuberculosis_Ziehl-Neelsen_stain_02.jpg

http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Mycobacterium_tuberculosis_Ziehl-Neelsen_stain_02.jpg

http://www.rsc.org/chemistryworld/news/2007/october/18100702.asp

http://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=3289442_ijn-7-781f1&query=the&fields=all&favor=none&it=none&sub=none&uniq=0&sp=none&req=4&simCollection=1568982_envhper00462-0084-c&npos=36&prt=3

http://www.thermoscientificbio.com/pcr-enzymes-master-mixes-and-reagents/dreamtaq-dna-polymerase/

http://www.thermoscientificbio.com/pcr-enzymes-master-mixes-and-reagents/dreamtaq-dna-polymerase/

Documents

I H C KHOA H C T NHIÊN - hus.vnu.edu.vn (25).pdf · Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân Khoa Sinh h ọ c Khóa 2010 - 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI