I metodi cromatografici - unina.it 2013_2014...cromatografia liquida. Essi sono di tipo differenziale, cioè sfruttano il fatto che quando un componente passa attraverso il rivelatore,

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I metodi cromatograficiI metodi cromatografici

HPLCHPLC

Il metodo strumentale della cromatografia liquida ad alta pressione è fruttodell’evoluzione tecnologica delle tecniche di cromatografia su colonna.

I principi sono sempre quelli dell’adsorbimento e della ripartizione, ma le fasi stazionariesono impaccate in colonne chiuse, con materiali di granulometria molto fine (5-10 µm) econtrollata: in tal modo viene aumentata la superficie di contatto fra fase mobile e fasestazionaria e l’impaccamento diviene più omogeneo.

Utilizzando queste colonne è necessario che la fase mobile venga fatta fluire ad altapressione perché, attraverso colonne con impaccamento a granulometria così fine, ilflusso dell’eluente diventa molto lento.

Con l’impiego di pompe particolari,

capaci di applicare pressioni di 50-

150 atm, diventa possibile ottenere

flussi di alcuni ml/min, sufficienti ad

ottenere l’eluizione in tempi

ragionevolmente brevi.

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Il GascromatografoIl Gascromatografo

La fase mobile gassosa non presenta interazioni specifiche con i soluti e con la

fase fissa, cioè è solo una fase trascinante. Il soluto quind i è interessato ad

interazioni specifiche solamente con la fase stazionaria

I rivelatoriI rivelatori

1- Universale/selettivo

A seconda delle applicazioni, un rivelatore deve misurare:

� tutti i componenti chimici che escono dalla colonna ( universale );

� solo un gruppo specifico di componenti ( selettivo ).

La selettività è tanto maggiore quanto minore è il numero di c omposti ai qualirisponde.L’opposto si ha con un rivelatore universale. Il rivelatore universale ideale è quelloche dà esattamente la stessa risposta a qualsiasi composto.

Il rivelatore è definito l’occhio del sistema cromatografico.Un buon rivelatore deve essere:

2 - Sensibile

La sensibilità di un rivelatore è tanto maggiore quanto mino re la quantità delsoluto che riesce a rivelare. Deve "vedere" cioè piccole qua ntità di campione(nanogrammi o picogrammi).

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I rivelatoriI rivelatori

3 - Preciso/Riproducibile

Un rivelatore deve dare un segnale uguale se due analiti iden tici in uguali quantitàpassano attraverso il rivelatore, indipendentemente dal t empo in cui viene fattal'analisi.

4 - Rapido Dopo aver attraversato la colonna i rivelatori dev ono rispondere istantaneamente all’uscita del soluto dalla colonna.

5 - VersatileNon deve essere sensibile ai cambiamenti di composizione de lla fase mobile(eluizione a gradiente), al flusso ed alla temperatura.

6 - SempliceSemplicità d’uso e di costruzione.

7 – Programmabile

Possibilmente si deve poter variare la caratteristica di ri levazione per ottimizzarela sensibilità a composti differenti (es. lunghezza d’onda UV)8 – Non distruttivo Non deve causare la distruzione del soluto

I rivelatori più largamente utilizzati in HPLC sono basati su I rivelatori più largamente utilizzati in HPLC sono basati su

misure di assorbanzamisure di assorbanza

nella regione dell’UVnella regione dell’UV o o del Visibile del Visibile

(rivelatori selettivi)(rivelatori selettivi)

Si basano sull’assorbimento della luce UV da parte dell’ana lita. I rivelatoria lunghezza d’onda FISSA fanno generalmente uso delle righe spettrali a254 e 280 nm originate da una sorgente a mercurio, perché molt i gruppifunzionali organici assorbono in questa regione.

Rivelatori UV a lunghezza d’onda fissa

Rivelatori in HPLCRivelatori in HPLC

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Rivelatori a lunghezza d’onda variabile

Il cut-off dei solventi

Esempio applicativo Esempio applicativo –– rivelatori UVrivelatori UV

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Rivelatori ad indice di rifrazione (il rivelatore UNIVERSALE)

Un altro rivelatore che ha trovato una considerevole applic azione è basato sullevariazioni nell’indice di rifrazione del solvente causato dalle molecole dell’analita.

Il rivelatore ad indice di rifrazione è di uso generale piuttosto che selettivo erisponde alla presenza di tutti i soluti. Lo svantaggio di qu esto rivelatore è lalimitata sensibilità.

METODI ACCOPPIATI

La cromatografia liquida ad alta prestazione e la gascromatografia sono spesso accoppiati a tecniche di

rivelazione altamente selettive. Questi metodi sono anche detti, dalla italianizzazione del termine inglese, metodi

ifenati (da hyphen: lineetta di collegamento).

SPETTROMETRIA di MASSA

SPETTROMETRIA INFRAROSSA

I sistemi: HPLC/MS e HPLC/IR

GC/MS e GC/IR

sono in grado di identificare inequivocabilmente gli anali tiall’uscita della colonna HPLC o GC.

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Rivelatore a spettrometria di massa

Questo rivelatore impiega uno spettrometro di massa. L’analita che fuoriesce dallacolonna, è ionizzato e/o frammentato e si ottiene il suo spettro m/z. L’interfacciamentoHPLC-MS (e GC-MS) è ormai più che consolidato. Il riconoscimento degli analiti èaiutato dai database di spettri di massa che possono contenere fino a 250.000 sostanzediverse.

Il potere diagnostico per la LC-MS (e GC-MS) si accoppia con u na sensibilitàelevatissima (fino a 1 pg di analita) e permette quindi il con sumo di quantitàbassissime di campione.

Rivelatori in GCRivelatori in GC

Uno dei punti di forza della tecnica GC è la grande varietà dei rivelatori disponibili.Alcuni sono: aspecifici e quindi di uso generale (universali);altri sono invece molto specifici (selettivi).

I rivelatori utilizzati in gascromatografia sono molto diversi da quelli impiegati nellacromatografia liquida.Essi sono di tipo differenziale, cioè sfruttano il fatto che quando un componente passaattraverso il rivelatore, si ha una variazione delle proprietà del gas di trasporto.Questa variazione viene generalmente rappresentata come un segnale elettrico infunzione del tempo.

I rivelatori in GC oltre ai requisiti generali visti precedentemente, devono poter operarealle diverse temperature (0°C – 400°C).

I rivelatori in GC, inoltre operano con intervalli di linearità molto variabili tra loro: peralcuni, infatti l’intervallo è grande (FID = 107), per altri inferiore (ECD = 104).

Per valori superiori a quelli compresi nell’intervallo lineare la linea tende ad incurvarsi edi rivelatori non danno più una risposta proporzionale.

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Principali rivelatori in GCPrincipali rivelatori in GC

RIVELATORE A CONDUCIBILITA’ TERMICA (TCD RIVELATORE A CONDUCIBILITA’ TERMICA (TCD --ThermalThermal ConductivityConductivity Detector)Detector)

Il rivelatore più universale è quello a conducibilità termica (la

conducibilità termica misura la capacità di una sostanza di

trasportare calore da una zona calda ad una fredda).

Campione Riferimento

Un TCD, è costituito da due filamenticostituiti da leghe speciali (platino, oro, tungsteno) riscaldati elettricamente e mantenuti a temperatura costante. Su uno scorre il gas di trasporto puro, sull'altro scorre il gas in uscita dalla colonna.La temperatura (del filamento) a potenza elettrica costante dipende dalla conducibilità termica del gas che lo circonda e quindi dalla sua composizione.

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RIVELATORE A CONDUCIBILITA’ TERMICA (TCD RIVELATORE A CONDUCIBILITA’ TERMICA (TCD --ThermalThermal ConductivityConductivity Detector)Detector)

Campione Riferimento

L'elio è il gas di trasporto comunemente usato

con il rivelatore a conducibilità termica: infatti,

la sua elevata conducibilità termica (seconda

solo a quella di H 2) fa sì che qualunque analita

mescolato all'elio abbassi la conducibilità del

flusso di gas.

Quando gli analiti emergono dalla colonna

cromatografica l’eluato fluisce sul filamento

caldo di tungsteno, la conducibilità del flusso

di gas diminusce, il filamento si riscalda.

Tale variazione di temperatura si riflette in una

variazione di resistenza, che viene amplificata

e rappresenta il segnale del detector.

MDL = minima quantità determinabile= vantaggi= svantaggi

Specie organiche e inorganiche

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TCD TCD –– esempio di rivelazioneesempio di rivelazione

La figura mostra la risoluzione di tracce di n-esano in un solvente a base dieptano:

Rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID)Rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID)

E’ il più largamente utilizzato in gas-cromatografi a.

Un rivelatore a ionizzazione di fiamma è un rivelatore:

� molto sensibile (riesce a rilevare sostanze presenti inquantità comprese tra 10 -5 e 10-11 g)

� robusto (il suo limite di rivelabilità resta basso anchedopo molte ore di lavoro) pressochè universale per icomposti organici ,

� insensibile ai composti inorganici.

Ma è distruttivo in quanto il campione viene pirolizzato.

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+ -

Fiamma H 2-aria

Parete interna del forno

Collettore rimuovibile

Aria

H2

Colonna

In un rivelatore a ionizzazione difiamma (il gas di trasporto in uscitadalla colonna viene mescolato aidrogeno e ossigeno (aria) ecombusto.Nella fiamma, la maggior parte deicomposti organici eluiti, quandopirolizzati producono ioni ed elettronicon conseguente aumento dellaconducibilità.Gli ioni che vengono raccolti sullasupeficie del detector producendouna corrente elettrica che,amplificata, rappresenta il segnaledel detector.


• La conducibilità elettrica di un gas èdirettamente proporzionale alla concentrazionedi particelle cariche in esso contenute.

• In assenza di composti organici, si formanosoltanto radicali liberi H•, OH• , O•.

• Gas di trasporto: azoto (inerte), genera unadebole corrente di fondo.

• Il potenziale tra gli elettrodi (300 V) deve esserealto in modo da catturare tutte le cariche senzaprovocare ulteriori ionizzazioni.

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Il rivelatore è sensibile soprattutto a composti idrocarburici.

Non è sensibile:�ai composti inorganici �ai gas non combustibili (N 2, Ar, Ne, ecc..)�all’H 2OQueste sostanze, cioè non vengono rivelate nelle condizioni di lavoro del FID in quanto non generano specie cariche e quindi non danno corrente elettrica nel campo elettrico applicato.

Queste proprietà rendono il rivelatore diuso generale ed utile per l’analisi dicampioni organici, inclusi quellicontaminati di H 2O e ossidi di azoto e dizolfo .

FID FID –– esempio di rilevazioneesempio di rilevazione

Nel cromatogramma dell’analisi di un whisky non si vede alcu n segnaledel componente principale, l’acqua perché il FID non la vede , essendoselettivo per le sostanze organiche. Questo rivelatore è qu indi molto utileper l’analisi di componenti in traccia in campioni a base acq uosa:

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Il FID richiede che la fase mobile sia costituita da gasmolto puri, per evitare un fondo dovuto alle impurezzeorganiche per le quali il rivelatore non è selettivo.

Rivelatore fotometrico a fiamma Rivelatore fotometrico a fiamma (FPD (FPD -- FlameFlame PhotometricPhotometric Detector)Detector)

L’FPD è un dispositivo dotato di elevata specificit à per elementi quali lo zolfo ed il fosforo .

L’FPD è in pratica un FID cui sono stati applicati un filtro per lo zolfo (S) o/e fosforo (P).

Il rivelatore a fiamma fotometrica sfrutta l'emissione di u na radiazione dichemiluminescenza prodotta dalla combustione in fiamma di idrogeno dicomposti contenenti zolfo e fosforo.

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Le sostanze contenenti zolfo o fosforo, bruciando in una fia mma prodotta da idrogenomiscelato con il gas vettore e aria, si decompongono formand o ioni radicalici a basedi zolfo e fosforo ad esempio HPO 4

2-.

Il campione decomposto entra successivamente in una second a fiamma, l’elevatatemperatura eccita le molecole con conseguente emissione d i radiazioni di determinatalunghezza d’onda (chemiluminescenza)

Le radiazioni caratteristiche emesse da queste due specie c he si trovano a 394 nm per

lo ZOLFO e a 528 nm per il FOSFORO vengono selezionate da un filtro interferenziale

e raccolte da un tubo fotomoltiplicatore che ne misura l’int ensità, correlata alla

concentrazione della specie determinate.


La sensibilità di questo rivelatore è a livello di subnanogr ammi ed è circa 10 4

maggiore rispetto ad analoghe sostanze non contenenti S o P.

Questo rivelatore viene utilizzato ad esempio per la determ inazione:

� di residui di pesticidi contenenti gruppi fosforati

� per il monitoraggio di inquinanti nell’aria, quali solfuro di idrogeno, diossido

di zolfo.

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FID VS FPDFID VS FPD

Visualizzazione netta dei componenti contenenti zolfo a valori di amplificazione 1000 volte inferiori rispetto al FID

Cromatogramma ottenuto con il rivelatore FID: mostra una se rie numerosa di picchi.

Cromatogramma, ottenuto impiegando il rivelatore FP D impostato a 394 nm.

FPD FPD –– esempio di rilevazioneesempio di rilevazione

1-dodecantioloFunzionamento per la rivelazione dello S

Funzionamento per la rivelazione del P

tributilfosfato

Pentadecano

Parathion

Parathion

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Rivelatore per azoto Rivelatore per azoto –– fosforo fosforo (NPD (NPD -- NitrogenNitrogen PhosphorusPhosphorus Detector)Detector)

Il rivelatore per azoto-fosforo, detto ancherivelatore a fiamma alcalina, è un rivelatore aionizzazione dì fiamma modificato,particolarmente sensibile ai composticontenenti N e P.

La differenza con il FID consiste nellapresenza alla sommità della fiamma di ungranulo di un sale alcalino di rubidio(Rb2SO4) o di cesio in un reticolo di silice.

Questa sferula è fusa ed è riscaldataelettricamente indipendentemente dalnormale riscaldamento del rivelatore cosìche il rubidio o il cesio subiscono unaparziale volatilizzazione e ionizzazione(Rb+ed elettroni).

Rb ↔↔↔↔ Rb+ + e-

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Rivelatore per azoto Rivelatore per azoto –– fosforo fosforo (NPD (NPD -- NitrogenNitrogen PhosphorusPhosphorus Detector)Detector)

Gli ioni alcalini positivi e gli elettroni presenti nella fi amma contribuiscono alla

corrente che fluisce attraverso i due elettrodi del rivelat ore.

La presenza nella fiamma di vapori di sostanze che contengon o azoto o fosforo

provoca in modo tuttora sconosciuto un notevole squilibrio nella ionizzazione del

sale alcalino ,(acquisendo elettroni) con alterazione della corrente elettrica registrata.

Questo rivelatore è circa di due ordini di grandezza più sens ibile per compostiazotati o fosforati rispetto al rivelatore a ionizzazione d i fiamma.

La sua risposta a N e P e 10 4 - 106 volte maggiore della risposta al carbonio.

E’ impiegato nella determinazione di PESTICI ed ER BICIDI sia fosforati che azotati.

NPD NPD –– esempio di rilevazioneesempio di rilevazione

Il cromatogramma mostra l’analisi di sostanze in traccia (p icogrammi diazobenzene, metilparathion e parathion); altri component i, quali l’eptadecano, chenon contengono N o P, producono segnali molto più bassi e quin di non causanointerferenze anche se in concentrazione molto superiore (n anogrammi).

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Rilevatore a cattura di elettroniRilevatore a cattura di elettroni(ECD, electron (ECD, electron CaptureCapture Detector)Detector)

Rilevatore a cattura di elettroniRilevatore a cattura di elettroni(ECD, electron (ECD, electron CaptureCapture Detector)Detector)

E’ un rivelatore particolarmente sensibile ai composti ele ttronegativi:composti contenenti alogeni, carbonili coniugati, nitrit i, nitrocomposti ecomposti organometallici .In genere queste molecole sarebbero scarsamente visibili c on altridetector: ad esempio molti composti alogenati oltre a non bruciare sonoaddirittura estinguenti la fiamma, e porrebbero dei proble mi ad un FID.

Il rivelatore a cattura di elettroni (ECD) è diventato uno de i rivelatori piùusati per campioni ambientali poiché esso risponde in manie ra selettiva aicomposti organici contenenti alogeni, fosforo, azoto ed è quindi moltoutilizzato per la determinazione di tracce di:- PESTICIDI- ERBICIDI- ALOGENODERIVATI ORGANICI quali i POLICLOROBIFENILI

L’ECD è relativamente poco sensibile agli idrocarburi, agl i alcoli e aichetoni.

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I due cromatogrammi mostrano la determinazione diquantità vicine al limite di sensibilità del rivelatore ECD .Nell’esempio è illustrata la determinazione in tracce deipesticidi Lindano, Heptaclor e Aldrin.

La Figura 24-15 mostra un'applicazione nella quale questo rivelatore è utilizzato per determinare composti alogenati ("g as serra") nella bassa atmosfera.

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Il metodo è molto sensibile tanto che è possibile rivelare co mpostieluiti presenti in quantità dell’ordine di 10 -13 g; Il range dinamico èalquanto limitato con un tratto lineare di circa tre ordini d i grandezzaquindi fino a concentrazioni di 10 -10g. Campioni più concentratidevono essere diluiti .

Rivelatore a Fotoionizzazione (PID)Rivelatore a Fotoionizzazione (PID)

In questo tipo di rivelatore, la ionizzazione delle molecol e separate dalla colonnagascromatografica è provocata da una sorgente di radiazion i ultraviolette (adesempio una lampada a scarica di idrogeno) che produce forte emissione nell’UV.Queste radiazioni producono la ionizzazione dei soluti:

RH + hνννν →→→→ RH+ + e-

�RH è una qualunque sostanza organica (prevalentemente arom atica o insatura)

� hνννν è un fotone che deve avere un’energia maggiore di quella indispensabile per

ionizzare RH.

Adiacenti alla sorgente vi sono due elettrodi a cui è applica ta una differenza di

potenziale. A seguito della ionizzazione, tra gli elettrod i si produce un incremento

di corrente proporzionale alla concentrazione dei soluti c he viene registrata.

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Caratteristiche del rivelatore PIDCaratteristiche del rivelatore PID

Questo rivelatore di notevole sensibilità è sensibile a:�composti aromatici e insaturi mentre possiede scarsa rispo sta aidrocarburi saturi e composti alogenati. Tipicamente la radiazione non è ingrado di ionizzare i componenti dell’aria (N 2, O2, CO2, H2O)

GCGC--MSMS

Come rivelatore per un gascromatografo si può utilizzare un o spettrometro di

massa. L'accoppiamento di queste due tecniche fornisce un p otentissimo metodo

di indagine per l'analisi di miscele complesse, in quanto combina le grandi

capacità di separazione della GC con la capacità di identifi cazione e

caratterizzazione della struttura delle molecole tipica d ella spettrometria di massa.

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Tutti i rivelatori finora esaminati segnalano l'uscita di u n solutodalla colonna, ma non danno indicazioni (se non estremamentegeneriche) sull'identità del soluto che viene eluito;

Con la maggior parte degli altri rivelatori (all'in fuori dello spettrofotometro IR) l'unica informazione qualitati va ottenibile è il tempo di ritenzione , il quale non porta però ad individuare univocamente l'identità della sostanza: due sostanz e diverse possono avere lo stesso comportamento cromatografic o con un certo tipo di colonna cromatografica e quindi pr esentare lo stesso t R.Lo spettrometro di massa invece, oltre a segnalare l'eluizione di un soluto, ne fornisce anche lo spettro di massa , dal quale si può risalire all'identità della sostanza.

Spettrometro di massa:

Limite di rivelabilità: da 25 fg (1010--1515 g ) g ) a 100 pg

Intervallo di linearità: 105

Il campione entra nella sorgente di ionizzazione dopo l’interfaccia

Le molecole del campione vengono convertite in ioni e spessovengono frammentate nella sorgente di ionizzazione.

Gli ioni, quindi, passano in un analizzatore dove vengono separatisulla base del loro rapporto massa/carica.

Successivamente, gli ioni separati colpiscono un rivelatore di ioni,dove producono un segnale elettrico che viene registrato ediagrammato dal sistema di acquisizione dei dati.

Schema a blocchi di uno spettrometro di massa

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Esempio: spettro EI della cocaina

� Frammentazione estesa

� Lo Ione Molecolare a m/z 303 è di piccola

entità

SPETTROMETRO DI MASSASPETTROMETRO DI MASSA

Interfacciamento GC/ MS a restrizioni Interfacciamento GC/ MS a restrizioni successivesuccessive

All'uscita del gascromatografo si ha una prima restrizione , laquale provoca una caduta di pressione; il gas entra quindi in uncapillare con pareti porose, all'esterno del capillare si m antieneuna depressione: il gas di trasporto, diffonde all'esternoattraverso i pori del capillare, e viene così in parte elimin ato ;

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Analisi GC/MSAnalisi GC/MS

I dati possono essere analizzati dal sistema di acq uisizione dati in diversi modi:

1) Le abbondanze degli ioni in ciascuno spettro possono esse re sommate, ediagrammate in funzione del tempo, per avere il CROMATOGRAM MA DEGLIIONI TOTALI (TIC = total ion chromatogram):

MH +

1140.5

1320.1

2165.5 T24

K-peptide 2353.6

MHInsulina2668.3

2 2+

6000 5000 4000 3000 2000 1000

MH +

MH +

Insulina 5734.6

Analisi GC/MSAnalisi GC/MS

2) Può essere visualizzatolo spettro di massa ad unparticolare tempo duranteil cromatogramma peridentificare le specie chevengono eluite a queltempo.

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Individuazione mediante raffronto Individuazione mediante raffronto con banche daticon banche dati

In corrispondenza del picco del cromatogramma indicato com e 1,3-

dicloro-benzene lo strumento registra su disco lo spettro d i massa;

su richiesta dell'operatore il calcolatore è in grado di cer care nella libreria gli

spettri che si avvicinano maggiormente a quello della sosta nza incognita

analizzata, eseguendo così delle prove di identificazione .

Il principio è il seguente:

il calcolatore, nello spettro della sostanza incognita ind ividua le masse

corrispondenti ai picchi più intensi, va quindi a cercare ne lla libreria se esistano

spettri che siano simili a quello incognito sulla base delle masse corrispondenti

ai sei picchi più intensi ed alla loro intensità relativa.

La concordanza (purity) tra spettri sperimentali e spettri di sostanze individuate dal calcolatore è

espressa da un parametro percentuale che caratterizza in quale misura i due spettri concordano.

DerivatizzazioneDerivatizzazione

Generalmente consiste nel legare chimicamente alla specie chimica da determinare un raggruppamento chimico che fornisce alla specie in

esame nuove caratteristiche chimico-fisiche allo sc opo ad esempio di:

migliorare i limiti di rivelabilitàrendere i composti

capaci di assorbire le radiazioni visibili od UV

Rendere più volatili i composti poco volatili o

poco stabili nelle condizioni di

temperatura necessarie per l'analisi

gascromatografia

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La reazione che può essere schematizzata come segue:

R-H + D-X → R-D + H-X

• deve essere selettiva

� deve essere rapida

� non deve dare origine a riarrangiamenti o alterazioni strut turali durante laformazione dei derivati

� deve essere completa (le rese delle reazioni di derivatizzazione devonoessere del 90-100 % perché non ci sia perdita di campione)

� deve generare prodotti di reazione stabili

In generale indicando con:R-H la generica struttura dell’analita

D-X il reagente derivatizzante

gruppo uscente

gruppo inserito D


� Le reazioni vengono normalmente effettuate in piccole fial e in cuiviene introdotto il campione da derivatizzare e ad esso siaggiunge la soluzione del reagente derivatizzante.

� Con tale procedimento si possono trattare volumi anche molt opiccoli di campione utilizzando fiale chiuse con una valvola o conun setto poroso forabile con l'ago delle siringhe con cui ven gonointrodotti sia il campione che il derivatizzante.

1 Microfiala per derivatizzazione.2 Microagitatore magnetico

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DerivatizzazioneDerivatizzazione in cromatografiain cromatografia

Con la derivatizzazione (in cromatografia) in generale, si rischia di avere una

separazione non molto efficiente, in quanto anche se si part e da una serie di

componenti con strutture molto diverse , aggiungendo alle molecole delle varie

specie lo stesso raggruppamento si tende a conferire ad esse proprietà simili e

quindi a rendere molto simile il loro comportamento cromato grafico:

i soluti derivatizzati diventano più difficili da s eparare ad

opera della colonna.

DerivatizzazioneDerivatizzazione in in cromatografia liquida (LC)cromatografia liquida (LC)

La derivatizzazione viene fatta in vista dell'impiego di un o specificorivelatore (che generalmente è lo spettrofotometro).

Usualmente i derivatizzanti che vengono usati in cromatogr afia liquidahanno, quindi la funzione di rendere i composti da separare c apaci diassorbire le radiazioni visibili od UV

Le tecniche di derivatizzazione sono divise in due gruppi:

derivatizzazione pre-column

La reazione di derivatizzazione può essere eseguita dirett amente sul campione daanalizzare iniettando poi la miscela di reazione nella colo nna cromatografica.

derivatizzazione post-column

In alternativa la derivatizzazione può essere compiuta dop o la separazionecromatografica, prima della rivelazione.

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DerivatizzazioneDerivatizzazione prepre columncolumn

È sufficiente far avvenire la reazione in una provetta con ta ppo a tenutain un termostato.

1) non ci sono limitazioni per quanto riguarda la scelta del s olvente.

2) le condizioni di reazione non sono restrittive, vale a dir e che ci si puòavvalere anche di una reazione lenta.

1) l'iniezione di un campione complesso può causare la prese nza disegnali dovuti all'eccesso dell'agente derivatizzante, all'eventualecatalizzatore, al tampone, al solvente (tipico l'acetone, che dàassorbimento nell'UV);2) ogni campione richiede una preparazione individuale;3) la riproducibilità è bassa (resa variabile);

DerivatizzazioneDerivatizzazione post post columncolumn

Tra colonna e rivelatore si inserisce un condotto aggiuntiv o costituito daun tubo di arrivo ed una pompa peristaltica; essa miscela, co n i varicomponenti del campione separati dalla colonna, il reagent e necessario aderivatizzarli.

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DerivatizzazioneDerivatizzazione post post columncolumn

Se la reazione è lenta, il tempo durante il quale l'agente der ivatizzante e il

componente sono a contatto nel corso dell'avanzamento dell a fase mobile,

non è sufficiente a rendere completa la reazione.

Si può ovviare a tale inconveniente:prolungando il tratto in uscita e aumentando quindi il tempo di contatto tra ilreagente ed i soluti.laTuttavia questo allungamento di percorso può provocare l'a llargamento deipicchi cromatografici per diffusione longitudinale.

DerivatizzazioneDerivatizzazione di acididi acidi

Derivatizzante: Bromuro di Fenacile (o Bromo acetof enone)

R-COOH + Br-CH2-CO-C6H5 →R-COO-CH2-CO-C6H5 + HBr

Reagisce abbastanza rapidamente con gli acidi carbossilic i (circa 15 minutiriscaldando a 80 °C) dando un derivato fenacilico che presenta un forteassorbimento nell'UV (dovuto alla presenza di un anello ben zenicoconiugato con un gruppo carbonilico).Poichè la reazione provoca liberazione di HBr, la reazione v iene effettuata inambiente debolmente basico e come agente basificante si uti lizza NaHCO3.Rivelatore UV a 254 nm.

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Esempio di Esempio di derivatizzazionederivatizzazione di acididi acidi

Il vino contiene diversi acidi carbossilici (tartarico, ma lico,succinico ecc.).

Questi composti non assorbono nell'UV-Visibile in quanto n onhanno raggruppamenti cromofori con assorbività molaresufficientemente elevata.

Pertanto sarebbe difficile riuscire a dosarli con un rivela torespettrofotometrico UV-Vis, che è uno dei più diffusi, anche sefossero in concentrazioni elevate (dell'ordine di g/L).

derivatizzanteSolvente dideriv. - acetone

Acido citrico

Acido succinico

Acido tartarico

Acido malicocromatogramma di acidicarbossilici in un vino(Dolcetto d'Alba -1983). Gli acidi sonostati derivatizzati pre-column con bromuro difenacile.

La separazione è stataeffettuata in colonna afase inversa (fasestazionaria apolare-fase mobile polare) coneluizione a gradiente

Esempio di Esempio di derivatizzazionederivatizzazione di acididi acidi

derivatizzanteSolvente dideriv. - acetone

Acido succinico

Acido tartarico

Acido malico

L'acidoL'acido tartarico,tartarico, l'acidol'acido

malicomalico ee l'acidol'acido succinicosuccinico

hannohanno tuttitutti quattroquattro atomiatomi didi

carbonio,carbonio, mama esconoescono inin

tempitempi diversidiversi poichépoiché::

HO2CCH(OH)CH(OH)CO2H Acido tartarico ha due gruppi alcolici,

HO2CCH2CH(OH)CO2H Acido malico ha un gruppo alcolico,

HO2CCH2CH2CO2H Acido succinico non ha gruppi alcoolici

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DerivatizzazioneDerivatizzazione di basidi basi

Derivatizzante: Cloruro di dinitrobenzoile (DNBCI).

Rivelatore UV a 254 nm.

Il composto reagisce con amine primarie e secondarie dando a midicon forte assorbimento nell'UV.

La reazione avviene in circa 20 min a 70 °C in ambiente reso basicocon idrogenocarbonato di sodio o con trietilamina allo scop o dineutralizzare l'HCl che si forma

DerivatizzazioneDerivatizzazione di basi di basi –– 22°° esempioesempio

Derivatizzante: Cloruro di Dansile (DANSYL-Cl)

Rivelatore UV a 330 nm

Il derivatizzante reagisce con amine primarie o sec ondarie, come pure con gruppi fenolici.Perchè la reazione avvenga sono necessari:ione idrogenocarbonato per neutralizzare l'acido cl oridrico che si libera; tempo di reazione : 20 min. La reazione non è adatt a, quindi per la derivatizzazione post-column perchè è lenta.

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DerivatizzazioneDerivatizzazione in gascromatografiain gascromatografia

La derivatizzazione in gascromatografia viene effet tuata principalmente per ottenere un:

1) incremento della volatilità. In questa maniera è possibi le diminuirela temperatura alla quale si può analizzare un composto, con ovvivantaggi:

� stabilità del campione alle temperature di esercizi o del gascromatografo (tra 50 e 300 °C).

� maggiore durata della colonna, date le condizioni s perimentali più blande.

2) incremento di sensibilità da parte dei rivelatori (Es rivelatore a cattura di elettroni ECD sensibile ai composti che presentano atomi elettronegativi).

DerivatizzazioneDerivatizzazione in gascromatografiain gascromatografia

Usualmente gruppi funzionali quali:

• alcooli,

• fenoli,

• mercaptani,

• acidi carbossilici,

• amine,

• amidi, ecc.

che possiedono caratteristiche di alta polarità e bassa vol atilità,vengono trasformati in derivati più volatili e termicament e stabili.

Tre sono le classi principali di reazioni sfruttate per derivatizzare le molecole da analizzare:

� silanizzazioni

� alchilazioni

� acilazioni

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I metodi cromatografici - unina.it 2013_2014...cromatografia liquida. Essi sono di tipo differenziale, cioè sfruttano il fatto che quando un componente passa attraverso il rivelatore,