if)

v©

Oh

EESTIVABARIIK

PATENDIAMET

(.i) EE-EP 1615 952 Bl(51) Int.CI.

A61K 38/00 (2006.01)

A61K 39/395 (2006.01)

A61P 29/00(2006.01)

C07K 7/00(2006.01)

C07K 14/515 (2006.01)

C07K 16/22(2006.01)

C07K 19/00(2006.01)

(i2)EESTISKEHTIVAEUROOPA PATENDI

PATENDIKIRJELDUSE TOLGE

(10) Registreeringu number:

(11) Patendikirjelduse tdlke

number:

(30) Prioriteediandmed:

(96) Euroopa patenditaotluse

esitamise kuupaev:

(96) Euroopa patendi

taotluse number:

(97) Euroopa patendi valjaand-

misest teatamise kuupaev:

(97) Euroopa patendi number:

Patendikirjelduse tdlke

esitamise kuupaev:

Patendikirjelduse tdlke

avalikustamise kuupSev:

E006260

EE-EP 1615 952

09.04.2003

US 410998

08.04.2004

04759343.9

02.11.2011

EP 1 615 952

01.02.2012

16.04.2012

(73) Patendiomanik:

AMGEN INC.

One Amgen Center Drive,

Thousand Oaks, CA 91320-1799, US

(72) Leiutise autorid:

OLINER, Jonathan, Daniel

959 Golden Crest Avenue,

Newbury Park, CA 91320, US

MIN, Hosung

3875 Conner Court,

Newbury Park, CA 91320, US

(74) Patendivolinik:

Leevi Markus

Patendibflroo KSosaar & Co OU

TShe 94,50107 Tartu, EE

(54) Poletikuliste haiguste ravimeetodid, kasutades inimese angiopoietiin-2 spetsiifilisi sideaineid

EE-EP 1 615 952 Bl

EE - EP1615952 B1

Põletikuliste haiguste ravimeetodid, kasutades inimese angiopoietiin-2 spetsiifilisi sideaineid

See patenditaotlus taotleb täiendust USA patenditaotlusele seerianumbriga

10/269,695, mis registreeriti 10. oktoobril 2002, mis omakorda taotleb täiendust

USA patenditaotlusele seerianumbriga 60/414,155, mis registreeriti 27. septembril 5

2002, ja USA patenditaotlusele seerianumbriga 60/328,624, mis registreeriti 11.

oktoobril 2001.

TEHNIKAVALDKOND

Käesolev leiutis käsitleb spetsiifilisi sideaineid, mis tunnevad angiopoietiin-2 (Ang-

2) ja sellele seonduvad. Veel täpsemalt käsitleb leiutis Ang-2 spetsiifiliselt siduvate 10

spetsiifiliste sideainete ja nende fragmentide tootmist, diagnostilist ja terapeutilist

kasutamist.

TEHNIKA TASE

Angiogenees ehk olemasolevatest veresoontest uute moodustumine on oluline

paljudeks füsioloogilisteks ja patoloogilisteks protsessideks. Tavaliselt on 15

angiogenees pro- ja anti-angiogeensete faktorite poolt rangelt reguleeritud, aga

haiguste nagu vähk, silma neovaskulaarhaigused, artriit ja psoriaas puhul võib see

protsess valesti minna. Folkman, J., Nat. Med., 1:27-31 (1995).

Usutavasti mängib angiogenees olulist rolli põletikulise koe (pannuse) laienemise

jätkamisel reumatoidartiidi puhul (Walsh et al, Artriit Res., 3:147-153 (2001). 20

Tegelikult on hulga haiguseid, mis usutavasti on seotud reguleerimata või

soovimatu angiogeneesiga. Vaata Carmeliet et al, Nature, 407:249-257 (2000).

Taoliste haiguste seas on muuhulgas silma neovaskularisatsioon, nagu

retinopaatiad (sealhulgas diabeetiline retinopaatia), kollatähni ealine taandareng,

psoriaas, hemangioblastoom, hemangioom, arterioskleroos, põletikulised 25

haigused nagu reumaatiline või reumaatiline põletikuline haigus, eriti artriit

(sealhulgas reumatoidartriit) ja teised kroonilised põletikulised häired nagu

krooniline astma, arteriaalne või siirdamisjärgne ateroskleroos, endometrioos ning

neoplastilised haigused, näiteks niinimetatud tahked kasvajad ja vedelad (või

EE - EP1615952 B1 2

hematopoeetilised) kasvajad (nagu leukeemiad ja lümfoomid). Soovimatu

angiogeneesiga seotud teised haigused on antud valdkonnas pädevatele isikutele

ilmsed.

Kuigi paljusid signaali ülekande süsteeme on angiogeneesi reguleerimisse

kaasatud, hõlmab üks paremini iseloomustatud ja kõige endoteelsemaid raku 5

selektiivsüsteeme Tie-2 retseptor-türosiini kinaasi (nimega „Tie-2“ või „Tie-2R“

(samuti nimega „ORK“), hiirte Tie-2 (on ka nimega „tek“) ja selle ligandid

angiopoietiinid (Gale, N. W. ja Yancopoulos, G. D., Genes Dev. 13:1055-1066).

Teadaolevalt on 4 angiopoietiini: angiopoietiin-1 („Ang-1“) kuni angiopoietiin-4

(„Ang-4“). Neid angiopoietiine kutsutakse ka nimega „Tie-2 ligandid“. (Davis, S., et 10

al, Cell, 87:1161-1169; Grosios, K., et al, Cytogenet Cell Genet, 84:118-120;

Holash, J., et al, Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42:1617-1625;

Koblizek, T. I., et al, Current Biology, 8:529-532 ; Lin, P., et al, Proc Natl Acad Sci

USA, 95:8829-8834; Maisonpierre, P. C., et al, Science, 277:55-60;

Papapetropoulos, A., et al, Lab Invest, 79:213-223; Sato, T. N., et al, Nature, 15

375:70-74; Shyu, K. G., et al, Circulation, 98:2081-2087; Suri, C., et al, Cell,

87:1171-1180; Suri, C., et al, Science, 282:468-471; Valenzuela, D. M., et al, USA

ajakiri Proceedings of the National Academy of Sciences, 96:1904-1909;

Witzenbichler, B., et al, J Biol Chem, 273:18514-18521). Kui Ang-1 sidumist Tie-2-

le stimuleerib retseptori fosforüülimist kasvatatud endoteeli rakkudes, on Ang-2 20

puhul täheldatud Tie-2 retseptori nii fosforüülimise talumist kui ka pärssimist

(Davis, S., et al, supra; Maisonpierre, P.C., et al, supra; Kim, I., J.H. Kim, et al,

Oncogene 19 (39): 4549-4552 (2000); Teichert-Kuliszewska, K., P.C.

Maisonpierre, et al, Cardiovascular Research 49(3): 659-70 (2001)).

Geneetiliselt modifitseeritud Tie-2 ja Ang-1 hiirte fenotüübid on sarnased ning 25

viitavad, et Ang-1-stimuleeritud Tie-2 fosforüülimine vahendab tekkivate

veresoonte ümberkujundamist ja stabiliseerimist in utero endoteeli rakutoe

adhesiooni hoidmise kaudu (Dumont, D. J., et al, Genes & Development, 8:1897-

1909; Sato, T. N., et al, Nature, 376:70-74; Suri, C., et al, supra). Ang-1 rolli

veresoonte stabiliseerimisel peetakse kaitstuks täiskasvanutes, kus seda 30

laialdaselt ja konstitutiivselt ekspresseeritakse (Hanahan, D., Science, 277:48-50;

Zagzag, D., et al, Experimental Neurology, 159:391-400). Seevastu Ang-2

EE - EP1615952 B1 3

ekspressioon on võimalik peamiselt vaskulaarse ümberkujunemise kohtadel, kus

see arvatavasti blokeerib Ang-1 funktsioneerimist, põhjustades seeläbi

vaskulaarse plastilisuse staadiumi, mis soodustab angiogeneesi (Hanahan, D.,

supra; Holash, J., et al, Science, 284:1994-1998; Maisonpierre, P. C., et al, supra).

Paljud avaldatud uuringud on arvatavasti näidanud veresoon-selektiivse Ang-2 5

ekspressiooni angiogeneesiga seotud haigusseisundites. Nende patoloogiliste

tingimuste seas on näiteks psoriaas, kollatähni taandareng ning vähk (Bunone, G.,

et al, American Journal of Pathology, 155:1967-1976; Etoh, T., et al, Cancer

Research, 61:2145-2153; Hangai, M., et al, Investigative Ophthalmology & Visual

Science, 42:1617-1625; Holash, J., et al, supra; Kuroda, K., et al, Journal of 10

Investigative Dermatology, 116:713-720; Otani, A., et al, Investigative

Ophthalmology & Visual Science, 40:1912-1920; Stratmann, A., et al, American

Journal of Pathology, 153:1459-1466; Tanaka, S., et al, J Clin Invest, 103:34-345;

Yoshida, Y., et al, International Journal of Oncology, 15:1221-1225; Yuan, K., et

al, Journal of Periodontal Research, 35:165-171; Zagzag, D., et al, supra). 15

Enamus neist uuringutest on keskendunud vähile, mille puhul paljud kasvajatüübid

oletatavasti väljendavad vaskulaarset Ang-2 ekpressiooni. Vastupidiselt selle

ekpressioonile patoloogilises angiogeneesis on Ang-2 ekpressioon normaalsetes

kudedes äärmiselt piiratud (Maisonpierre, P. C., et al, supra; Mezquita, J., et al,

Biochemical and Biophysical Research Communications, 260:492-498). Tavalises 20

täiskasvanus on kolm peamist angiogeneesi kohta munasarjad, platsenta ja

emakas; need on peamised koed normaalsetes (st mitte-vähilises) kudedes, kus

Ang-2 mRNA on täheldatud.

Teatud funktsionaaluuringud näitavad, et Ang-2 osaleb oletatavasti kasvaja

angiogeneesis. Ahmad et al (Cancer Res., 61:1255-1259) kirjeldavad Ang-2 25

üleekspressiooni ning näitavad, et seda seostatakse arvatavasti kasvaja arengu

laienemisega hiire ksenografti mudelil. Vaata ka Etoh et al, supra, ning Tanaka et

al, supra, kus andmed on oletatavasti esitatud nii, et need seostavad Ang-2

üleekspressiooni kasvaja veresoonte hulga suurenemisega (hypervascularity). Ent

seevastu Yu et al (Am. J. Path., 158:563-570 ) on esitanud andmeid, mis näitavad, 30

et Ang-2 üleekspressioon Lewise kopsukartsinoomis ja TA3 rinnakartsinoomi

EE - EP1615952 B1 4

rakkudes arvatavasti pikendas vastavate transfektantidega süstitud hiirte

ellujäämist.

Viimastel aastatel on mitmed väljaanded soovitanud Ang-1, Ang-2 ja/või Tie-2

võimaliku sihtmärgina vähivastaseks raviks. Näiteks USA patendid nr 6,166,185,

5,650,490 ja 5,814,464 kõik avaldavad anti-Tie-2 ligandi antikehade ja 5

retseptorkehade kontseptsiooni. Lin et al (Proc. Natl. Acad. Sci USA, 95:8829-

8834) süstisid hiirtele adenoviirust ekspresseerivat lahustuvat Tie-2; lahustuv Tie-2

alandas arvatavalt hiirte tekitatud kasvajate arvu ja suurust. Sellega seotud

uuringus Lin et al (J. Clin. Invest., 100:2072-2078) süstisid rottidele lahustuval

kujul Tie-2; see ühend arvatavalt alandas rottidel kasvaja suurust. Siemeister et al 10

(Cancer Res., 59: 3185-3189) lõid inimese melanoomi rakuliini, mis

ekspresseerisid Tie-2 rakuvälist domeeni, süstisid neid rakuliine puutumata

hiirtesse ning järeldasid, et lahustuv Tie-2 arvatavasti põhjustas kasvaja arengut ja

kasvaja angiogeneesi „märkimisväärset pidurdumist“. Selle informatsiooni

valguses ja arvestades, et nii Ang-1 kui ka Ang-2 seonduvad Tie-2-le, ei selgu 15

nendest uuringutest, kas Ang-1, Ang-2 või Tie-2 oleksid soovitud sihtmärgiks

vähivastaseks raviks.

Teatud peptiidide sulandumist stabiilsele plasma proteiinile nagu Ig konstantne

piirkond, et nende molekulide poolestusaega parandada on kirjeldatud näiteks

PCT avalikustuses WO 00/24782, mis avaldati 4. mail 2000. 20

Proteiini või selle fragmendi sulandumist stabiilsele plasma proteiinile nagu Ig

konstantne piirkond, et nende molekulide poolestusaega parandada on kirjeldatud

erinevalt (vaata näiteks USA patenti 5,480,981; Zheng et al, J. Immunol.,

154:5590-5600, (1995); Fisher et al, N. Engl. J. Med., 334:1697-1702, (1996); Van

Zee, K. et al, J. Immunol., 156:2221-2230, (1996); USA patent 5,808,029, 25

väljastati 15. septembril 1998; Capon et al, Nature, 337:525-531, (1989); Harvill et

al, Immunotech. 1:95-105, (1995); WO 97/23614, avaldati 3. juulil 1997;

WO/9828427, avaldati 2. juulil 1998; Linsley, J. Exp. Med., 174:561-569, (1991);

WO 95/21258, avaldati 10. augustil 1995). WO/57901, mis avaldati 5. oktoobril

2000, avalikustab neutraliseerivate Anti Ang-2 antikehade kasutamise vaskulaarse 30

permeaabluse alandamiseks ja/või plasma lekkimise kontrollimiseks.

EE - EP1615952 B1 5

Tõhus anti-Ang-2 ravi võib kasu saada vähipatsientide suurest hulgast, sest

enamus tahkeid kasvajaid vajavad neovaskularisatsiooni, et diameetris kasvada

suuremaks kui 1-2 millimeetrit. Taoline ravi võib leida laiemat kasutust ka teiste

angiogeneesiga seotud haiguste puhul nagu retinopaatiad, artriit ja psoriaas.

Praegu on vastamata vajadus tuvastada uusi aineid, mis Ang-2 spetsiifiliselt 5

tunnevad ja seovad. Taolised ained oleksid kasulikud diagnostilisteks uuringuteks

ja terapeutiliseks sekkumiseks haigusstaadiumides, mida seostatakse Ang-2

aktiivsusega.

Seetõttu on käesoleva leiutise eesmärgiks pakkuda Ang-2 spetsiifilisi sideaineid,

mis moduleerivad Ang-2 tegevust. Käesoleva leiutise taolised ained on 10

peptikehade (peptibodies) kujul, st teistele molekulidele nagu antikeha Fc domeen

ühendatud peptiidid, kus peptiidi osa seondub spetsiifiliselt Ang-2-le.

LEIUTISE KOKKUVÕTE

Käesolev leiutis on ühes variandis suunatud peptiididele (nimetatakse siin ka

polpüpeptiidideks), mis seonduvad Ang-2-le ja hõlmavad järjestust, nagu on 15

esitatud JÄRJESTUSE ID-nr-s: 25 koos põletikuvastase ainega, põletikulise

haiguse ravimeetodis kasutamiseks.

Käesoleva leiutise polüpeptiidid võivad olla kanduritele kinnitunud.

Peptiidid võivad olla ühendatud Fc domeenidele, võimaldades seeläbi

peptikehasid. 20

On mõistetav, et leiutis võib käsitleda sulandpolüpeptiidi, mis sisaldab vähemalt

ühte peptiidi, nagu on siin kirjeldatud, ja kandurit, kus polüpeptiid suudab Ang-2-le

seonduda, ning selle füsioloogiliselt sobivaid soolasid. Sulandpolüpeptiidis on

kandur vähemalt üks Fc domeen, polüetüleenglükool, lipiid, kolesteroolrühm,

süsivesik ja oligosahhariid. Teised sobivad kandurid nagu albumiin ja muu 25

sarnane on antud valdkonnas pädevatele isikutele mõistetavad ning kuuluvad

antud leiutise ulatusse.

Antud valdkonnas pädevad isikud mõistavad, et erinevaid molekule on võimalik

spetsiifilise sideaine struktuuri sisestada. Järelikult võib teatud molekuli sisestada

EE - EP1615952 B1 6

näiteks peptiidi ja spetsiifilise sideaine kanduri osade vahele või peptiidi osa enda

sisse, säilitades samas spetsiifilise sideaine soovitud toime. Võimalik on ka lisada

näiteks molekule nagu Fc domeen või selle fragment, polüetüleenglükool või

teised seotud molekulid nagu dekstraan, rasvhape, lipiid, kolesteroolrühm, väike

süsivesik, peptiid, tsütotoksiline aine, kemoterapeutiline aine, siin kirjeldatud 5

tuvastatav osa (sealhulgas fluorestsentsained, radiomärgistused nagu

radioisotoobid), oligosahhariid, oligonukleotiid, polünukleotiid, interferentsi (või

muu) RNA, ensüümid, hormoonid ja muu sarnane. Sellisel moel lisamiseks

sobivad teised molekulid on antud valdkonnas pädevatele isikutele teada ning

kuuluvad leiutise ulatusse. See hõlmab näiteks soovitud molekuli sisestamist kahe 10

järjestikuse aminohappe vahele, mis on soovitatavalt sobiva linkeriga ühendatud.

Näiteks Con4(C) peptikeha järjestuses:

M-Fc-GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMLE (JÄRJESTUSE ID-NR: 23)

suudab antud valdkonnas pädev isik lihtsalt sisestada soovitud molekuli näiteks

kahe kõrvuti asetseva glutamiini („QQ“) jäägi vahele, et saavutada soovitud 15

struktuur ja/või funktsioon, säilitades samaaegselt peptiidi võime Ang-2 siduda.

Järelikult võib seda järjestust järgnevalt modifitseerida:

M-Fc-GGGGGAQ-[molekul]-QEECEWDPWTCEHMLE

Soovi korral võib lisada sobivaid linkeri molekule. Samas on mõistetav, et molekuli

võib sisestada mitmesse kohta molekulil, sealhulgas sobivatele kõrvalahelatele 20

kanduri ja peptiidi järjestuse vahele järgnevalt:

M-Fc-[molekul]-GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMLE

või mis tahes teisele kohale, mida antud valdkonnas pädev isik soovib. Teised

sobivad variandid on antud valdkonnas pädevale isikule ilmselged.

On mõistetav, et leiutis käsitleb leiutise peptikeha kasutamist põletikulise haiguse 25

ravimeetodites, kasutades spetsiifilisi sideaineid, mida on siin kirjeldatud, ning

hõlmab veel vähemalt ühe põletikuvastase aine manustamist. Teatud eelistatud

variandis võib põletikuvastane aine sisaldada DMARD, SAARD ja NSAID seast

vähemalt ühte. Järgmises eelistatud variandis võib põletikuvastane aine sisaldada

vähemalt ühte TNF inhibiitorit, IL-1 inhibiitorit, TACE inhibiitorit, COX-2 inhibiitorit 30

ja P-38 inhibiitorit. Ent eelistatud lisavariandis sisaldab TNF inhibiitor vähemalt

ühte etanertsepti, adalimumaabi, pegsunertsepti (PEG sTNF-R1), onertsepti ja

EE - EP1615952 B1 7

infliksimaabi. Veel ühes eelistatud variandis võib IL-1 inhibiitor olla vähemalt üks

anakinra, IL-1 TRAP, IL-1 antikeha ja lahustuv IL-1 retseptor.

Nagu ka siin kirjeldati, on mõistetav, et manustamine võib olla samaaegne või

mitte-samaaegne.

Leiutis käsitleb peptikeha, mis hõlmab JÄRJESTUSE ID-NR-ga: 25 esitatud 5

aminohappe järjestust, kasutamist põletikulise haiguse ravimeetodis, mis hõlmab

seda vajavale patsiendile terapeutiliselt tõhusas koguses peptiidi või peptikeha

manustamist, et Ang-2 siduda. Kasutamine hõlmab ka vähemalt ühe

põletikuvastase aine manustamist. Manustamine võib olla samaaegne või mitte-

samaaegne. 10

Leiutise teised variandid on lihtsasti mõistetavad käesolevaga esitatud

avalikustusest.

JOONISTE LOETELU

Joonisel Fig 1 on toodud diagramm kasvaja suuruse (y-telg) ja aja (x-telg)

sõltuvuse kohta A-431 kasvajaga hiirtel, keda raviti käesoleva leiutise peptikehaga 15

TN8-Con4-C või fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS). Üksikasju on

kirjeldatud näidetes.

Joonisel Fig 2 on toodud diagramm peptikeha kontsentratsiooni (y-telg) ja

doosijärgse aja (x-telg) sõltuvuse kohta metsiktüüpi hiirtel, keda raviti 2xCon4-C,

L1-7-N või L1-21-N peptikeha 50mg-lise annusega. Üksikasju on kirjeldatud 20

näidetes.

Joonisel Fig 3 on toodud diagramm kasvaja suuruse (y-telg) ja (x-telg) aja

sõltuvuse kohta A431 kasvajaga hiirtel, keda raviti peptikehaga 2xCon4-C

vastavalt käesolevale leiutisele või fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) või

kontrollpeptikehaga. Üksikasju on kirjeldatud näidetes. 25

Joonisel Fig 4 on toodud diagramm, milles on esitatud in vitro kasvatatud

peptikehaga Con4-C vastavalt käesolevale leiutisele, kontroll-peptikehaga ravitud

või töötlemata A431 rakkude areng. Üksikasju on kirjeldatud näidetes.

EE - EP1615952 B1 8

Joonisel Fig 5 on toodud diagramm kasvaja suuruse (y-telg) ja aja (x-telg)

sõltuvuse kohta Colo205 kasvajarakkudes, mida raviti peptikehaga Con4-C,

peptikehaga L1-7-N, peptikehaga L1-21-N või peptikehaga 2xCon4-C vastavalt

käesolevale leiutisele või fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS), anti-Ang-2

antikehaga (Ab536) või Fc-ga. Üksikasju on kirjeldatud näidetes. 5

Joonisel Fig 6 on toodud diagramm kasvaja suuruse (y-telg) ja aja (x-telg)

sõltuvuse kohta Colo205 ksenografti kasvajaga hiirtel, keda raviti erinevates

annustes peptikehaga 2xCon4-C vastavalt käesolevale leiutisele või

fosfaatpuhverdatud soolalahuse (PBS) või Fc-ga. Üksikasju on kirjeldatud

näidetes. 10

Joonisel Fig 7 on toodud diagramm kasvaja suuruse (y-telg) ja aja (x-telg)

sõltuvuse kohta Colo205 ksenografti kasvajaga hiirtel, keda raviti peptikehaga

2xCon4-C vastavalt käesolevale leiutisele või kontroll-peptikehadega. Joonisel Fig

7 on ka toodud diagramm nende peptikehadele mõeldud CD31 märgistatud

ala/kasvaja kogu ala. Üksikasju on kirjeldatud näidetes. 15

Joonisel Fig 8 on toodud diagramm kasvaja suuruse (y-telg) ja aja (x-telg)

sõltuvuse kohta Colo205 ksenografti kasvajaga hiirtel, keda raviti peptikehaga

2xCon4-C vastavalt käesolevale leiutisele või fosfaatpuhverdatud soolalahusega

(PBS) või kontroll-peptikehaga. Üksikasju on kirjeldatud näidetes. See diagramm

näitab, et anti-Ang-2 peptikehad suudavad inhibeerida Colo205 kasvaja arengut 20

annustamise algusest sõltumata.

Joonisel Fig 9 on toodud kokkuvõte täielike vastuste (CR) tasemetest, mis saadi

emastel puutumata hiirtel, kasutades antikeha Ab536 või peptikeha 2xCon4-C nii

A431 kui ka Colo-205 ksenografti mudelitel. Üksikasju on kirjeldatud näidetes.

Joonisel Fig 10A on toodud diagramm kasvaja suuruse (y-telg) ja aja (x-telg) 25

sõltuvuse kohta Colo205 ksenografti kasvajaga hiirtel, keda raviti peptikehaga

2xCon4-C vastavalt käesolevale leiutisele või 2xCon4-C ja taksoteeri (Taxotere)

kombinatsiooniga või fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) või PBS ja

taksoteeriga. Üksikasju on kirjeldatud näidetes.

EE - EP1615952 B1 9

Joonisel Fig 10B on toodud diagramm kasvaja suuruse (y-telg) ja aja (x-telg)

taksoteeri kohta Colo205 ksenografti kasvajaga hiirtel, keda raviti peptikehaga

2xCon4-C vastavalt käesolevale leiutisele või 2xCon4-C ja 5-FU kombinatsiooniga

või fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) või PBS ja 5-FU-ga. Üksikasju on

kirjeldatud näidetes. 5

Joonisel Fig 11A on esitatud käpa tursumise tasemete (AUC±SE) diagramm

adjuvandiga esilekutsutud artriidi mudelil rottidel, keda raviti peptikehaga 2xCon4-

C vastavalt käesolevale leiutisele või fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) või

kontrollpeptikehaga või normaalsete või artriitkontrollidega. Üksikasju on

kirjeldatud näidetes. 10

Joonisel Fig 11B on esitatud käpa luutiheduse (BMD) diagramm adjuvandiga

esilekutsutud artriidi mudelil rottidel, keda raviti peptikehaga 2xCon4-C vastavalt

käesolevale leiutisele või fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) või

kontrollpeptikehaga või normaalsete või artriitkontrollidega. Üksikasju on

kirjeldatud näidetes. 15

Joonisel Fig 11C on esitatud kehamassi muutuse diagramm adjuvandiga

esilekutsutud artriidi mudelil rottidel, keda raviti peptikehaga 2xCon4-C vastavalt

käesolevale leiutisele või fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) või

kontrollpeptikehaga või normaalsete või artriitkontrollidega. Üksikasju on

kirjeldatud näidetes. 20

Joonisel Fig 12 on kaks diagrammi, kus on esitatud rottidel VEGF-ga tekitatud

sarvkesta angiogeneesi inhibeerimine. Esimesel diagrammil on toodud veresoonte

arv, mis mõõdeti hiirtel, keda raviti veise seerumi albumiiniga (BSA), VEGF ja

fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) või VEGF ja leiutise peptikehaga Con4-

C. Teisel diagrammil on esitatud veresoonte pind (mm2) rottidel, keda raviti BSA-25

ga, VEGF ja fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) või VEGF ja leiutise

peptikehaga Con4-C. Üksikasju on kirjeldatud näidetes.

Joonistel Figs 13A, 13B ja 13C on esitatud täispika Ang-2 (hAng-2) jaoks mõeldud

epitoobi kaardistamise andmed (välisdiameeter 370) inimese hAng-2 N-otsale ning

hAng-2 C-otsale vastavalt peptikehade TN8-Con4-C, L1-7-N ja 12-9-3-C jaoks 30

EE - EP1615952 B1 10

vastavalt leiutisele ning ka kontrollpeptikeha, Tie2-Fc, C2B8 või 5B12 jaoks.

Üksikasju on kirjeldatud näidetes.

Joonis Fig 14 on esitatud (KD) 2xCon-4-C vastavalt leiutisele sidumise afiinsus,

kasutades firma Sapidyne KinExA analüüsi. Üksikasju on kirjeldatud näidetes.

Joonisel Fig 15 on esitatud peptikeha 2xCon4(C) ja põletikuvastase aine PEG 5

sTNF-R1 toime käpa tursumisele roti adjuvandi artriidis. Üksikasju on kirjeldatud

näidetes.

Joonisel Fig 16 on ka esitatud peptikeha 2xCon4(C) ja põletikuvastase aine PEG

sTNF-R1 toime AUC käpa tursumisele roti adjuvandi artriidis. Üksikasju on

kirjeldatud näidetes. 10

Joonisel Fig 17 on ka esitatud peptikeha 2xCon4(C) ja põletikuvastase aine PEG

sTNF-R1 toime kehamassile roti adjuvandi artriidis. Üksikasju on kirjeldatud

näidetes.

LEIUTISE ÜKSIKASJALIK KIRJELDUS

Siin kasutatud tekstiosade pealkirjad on mõeldud ainult struktureerimiseks ning 15

neid ei tohi tõlgendada kui kirjeldatud teemat kitsendavana.

Rekombinantse DNA molekulide, proteiinide ja antikehade valmistamiseks ning

koekultuuri ja raku muundamiseks võib kasutada standardvõtteid. Ensüümsed

reaktsioonid ja puhastusvõtted sooritatakse tavaliselt vastavalt tootja juhistele või

nagu tavaliselt antud valdkonnas tehakse, kasutades tavaprotseduure, nagu on 20

esitanud Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring

Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) või nagu on siin kirjeldatud. Kui

ei ole antud konkreetseid definitsioone, on siin kirjeldatud analüütilise keemia,

sünteetilise orgaanilise keemia ning meditsiini- ja farmaatsiakeemiaga seoses

kasutatud nomenklatuur ning nende laboratoorsed protseduurid ja võtted antud 25

valdkonnas teadaolevad ja tavapäraselt kasutatavad. Standardvõtteid võib

kasutada keemilisteks sünteesideks, keemilisteks analüüsideks, ravimite

valmistamiseks, formuleerimiseks ja kohaletoimetamiseks ning patsientide

ravimiseks.

EE - EP1615952 B1 11

Definitsioonid

Selles spetsifikatsioonis läbivalt kasutatud termid on määratletud järgnevalt, kui

teatud juhtudel ei ole teisiti öeldud.

Termin „Ang-2“ tähistab polüpeptiidi, mis on esitatud USA patendi nr 6,166,185

(„Tie-2 ligand-2“) joonisel Fig 6, või selle fragmente ning ka seonduvaid 5

polüpeptiide, mille seas on alleelsed variandid, ühendatud variandid, derivaadid,

asendused, kustutused ja/või lisamisvariandid, sulandpeptiidid ja –polüpeptiidid

ning liikidevahelised homoloogid. Ang-2 polüpeptiid võib hõlmata või ei pea

hõlmama täiendavaid terminaalseid jääke nt liiderjärjestused, märklaud-järjestus,

amino-otsa metioniin, amino-otsa metioniini ja lüsiini jäägid ja/või märgise või 10

sulandproteiinide järjestused, sõltuvalt viisist, kuidas neid valmistatakse.

Termin „bioloogiliselt aktiivne“ Ang-2 või Ang-2 spetsiifilise sideainega seoses

kasutamisel tähistab peptiidi või polüpeptiide, millel on Ang-2 või Ang-2 spetsiifilise

sideaine vähemalt üks toimeomadus. Ang-2 spetsiifilisel sideainel võib olla

agonist, antagonist või neutraliseeriv või blokeeriv toime seoses Ang-2 vähemalt 15

ühe bioloogilise toimega.

Termin „spetsiifiline sideaine“ tähendab molekuli, soovitatavalt valgulist molekuli,

mis spetsifiiliselt seob Ang-2, ning selle variante ja derivaate, nagu on siin

kirjeldatud. Spetsiifiline sideaine võib olla proteiin, peptiid, nukleiinhape, süsivesik,

lipiid või väikse molekulmassiga ühend, mis eeskätt Ang-2-le seondub. Eelistatud 20

variandis on spetsiifiline sideaine vastavalt käesolevale leiutisele peptiid või

peptikeha ning ka selle fragmendid, variandid või derivaadid kas eraldi või koos

teise aminohappe järjestusega, mida saab teadaolevate võtetega. Taoliste võtete

seas on muuhulgas ensüümne lõhestamine, keemiline lõhestamine, peptiidi

süntees või rekombinantsed võtted. Käesoleva leiutise anti-Ang-2 spetsiifilised 25

sideained suudavad siduda Ang-2 osi, mis moduleerivad, nt inhibeerivad või

soodustavad Ang-2 bioloogilist aktiivsust ja/või muid Ang-2-ga seotud toimeid.

Siin kasutatud termin „variandid“ hõlmab neid peptiide ja polüpeptiidide, kus

aminohappe jäägid lisatakse looduslikult esinevasse (või vähemalt teadaolevasse)

EE - EP1615952 B1 12

aminohappe järjestusse, kustutatakse sellest ja/või asendatakse selles sideaine

jaoks. Leiutise variantide seas on sulandvalgud, nagu kirjeldatakse allpool.

„Derivaatide“ seas on need sideained, mida on keemiliselt modifitseeritud moel,

mis erineb lisamise, kustutamise või asenduse variantidest.

„Spetsiifiliselt seob Ang-2“ tähistab käesoleva leiutise spetsiifilise sideaine (nagu 5

peptikeha või selle peptiidi osa) võimet tunda ja siduda inimese küpseid täispikki

või osalise pikkusega Ang-2 polüpeptiide või selle ortoloogi, kus selle afiinsus

(nagu on määratleti nt ELISA afiinsuse või BIAcore analüüsidega, nagu on siin

kirjeldatud) või neutraliseerimisvõime (nagu määratleti nt ELISA neutraliseerimise

analüüsidega, mida on siin kirjeldatud, või sarnaste analüüsidega) on vähemalt 10 10

korda suurem, aga soovi korral 50 korda suurem, 100, 250 või 500 korda suurem

või isegi vähemalt 1000 suurem nagu samasugune afiinsus või

neutraliseerimisvõime mis tahes muu angiopoietiini või muu peptiidi või

polüpeptiidi jaoks, kus peptikeha peptiidi osa ühendatakse esmalt inimese Fc

osale taolises analüüsis hindamiseks. 15

Termin „epitoop“ tähistab mis tahes molekuli osa, mida spetsiifiline sideaine, nt

peptikeha, suudab tunda või siduda sideaine ühel või mitmel antigeeni sidumisalal.

Epitoobid koosnevad tavaliselt molekulide keemiliselt aktiivsetest pinna

klassifikatsioonidest, nagu näiteks aminohapetest või süsivesiku kõrvalahelatest,

ning neil on spetsiifilised kolmedimensioonilised omadused ja spetsiifilised laengu 20

omadused. Siin kasutatud epitoobid võivad olla omavahel ühendatud või

omavahel mitte ühendatud.

Termin „inhibeeriv ja/või neutraliseeriv epitoop“ on epitoop, kus selle spetsiifilise

sideaine nagu peptikeha poolt sidumise tagajärjel kaob (või vähemalt alaneb)

molekuli, raku või taolist epitoopi sisaldava organismi bioloogiline aktiivsus in vivo, 25

in vitro või in situ. Käesoleva leiutise kontekstis asub neutraliseeriv epitoop Ang-2

bioloogiliselt aktiivsel alal või on sellega seotud. Teisel juhul tähendab termin

„aktiveeriv epitoop“ epitoopi, mis leiutise spetsiifilise sideaine, nagu antikeha, poolt

sidumisel põhjustab Ang-2 aktiveerimise võib vähemalt bioloogiliselt aktiivse

ühtlustumise püsimise. 30

EE - EP1615952 B1 13

Termin „peptikeha fragment“ tähistab peptiidi või polüpeptiidi, mis sisaldab vähem

kui tervet, puutumata peptikeha.

Termin „looduslikult esinev“ seoses bioloogiliste materjalidega nagu nukleiinhappe

molekulid, polüpeptiidid, peremeesrakud ja muu sarnane kasutamisel tähistab

neid, mida looduses leidub ja ei ole inimeste poolt muudetud. 5

Termin „eraldatud“ seoses Ang-2 või Ang-2 spetsiifilise sideainega kasutamisel

tähistab ühendit, mis on vaba vähemalt ühest saastavast polüpeptiidist, või ühend,

mida leidub selle looduslikus keskkonnas ning mis soovitatavalt on vaba mis tahes

muust saastavast imetaja polüpeptiididist, mis häiriks selle terapeutilist või

diagnostilist kasutust. 10

Termin „küps“ seoses Ang-2 peptikeha või selle fragmendiga või mis tahes muu

Ang-2 valgulise spetsiifilise sideainega kasutamisel tähistab peptiidi või

polüpeptiid, millel puudub liider- või signaaljärjestus. Kui leiutise sideainet

ekspresseeritakse näiteks prokarüootses peremeesrakus, võib „küps“ peptiid või

polüpeptiid hõlmata ka aminohappe täiendavaid järjestusi (ent liiderjärjestus ikkagi 15

puudub) nagu amino-otsa metioniin või ühte või mitut metioiini ja lüsiini jääki.

Sedasi loodud peptiidi või polüpeptiidi võib kasutada nii, et need täiendavad

aminohappe jäägid on või ei ole eemaldatud.

Terminid „tõhus kogus“ ja „terapeutiliselt tõhus kogus“ seoses Ang-2 spetsiifilise

sideainega kasutamisel tähistab spetsiifilise sideaine kogust, mis on kasulik või 20

vajalik märgatava muutuse soodustamiseks ühe või mitme Ang-2 bioloogilise

toime tasemes. Muutus võib olla kas Ang-2 toime taseme tõus või alanemine.

Eelistatavalt on muutuseks Ang-2 toime alanemine.

Termin „peptikeha“ tähistab molekuli, mis sisaldab vähemalt ühele peptiidile

kinnitunud antikeha Fc domeeni. Peptikehade tootmist on üldiselt kirjeldatud PCT 25

avalikustuses WO 00/24782, mis avaldati 4. mail 2000.

Siin kasutatud termin „variandid“ hõlmab neid molekule nagu peptiidi või peptiidi-

kandurite kombinatsioone nagu käesoleva leiutise peptikehad, kus aminohappe

jäägid taoliste molekulide jaoks lisatakse aminohappe järjestusse, kustutatakse

EE - EP1615952 B1 14

neist ja/või asendatakse nendes. Variandid, millele on lisatud üks või mitu

aminohapet, hõlmavad sulandvalke, nagu on allpool kirjeldatud.

„Derivaatide“ seas on need peptiidid ja/või peptiidi-kandurite kombinatsioonid nagu

peptikehad, mida on keemiliselt modifitseeritud moel, mis erineb lisamise,

kustutamise või asendamise variantidest. 5

Termin „fragment“ tähistab peptiidi või peptiidi-kandurit kombinatsioonis, mis

sisaldab taoliste peptiidide ja/või peptiidi-kandurite kombinatsioonide vähem kui

täispikkuses aminohappe järjestust. Taoline fragment võib tekkida näiteks amino-

otsal kärpimisest, karboksü-otsast kärpimisest ja/või jäägi(kide) sisemisest

kustutamisest peptiidi või peptiidi-kandurite kombinatsiooni aminohappe 10

järjestusest. Fragmendid võivad tekkida alternatiivsest RNA jätkamisest või in vivo

või in vitro proteaasi toimest. Taolisi fragmente võib konstrueerida ka keemilise

peptiidi sünteesi meetoditega või modifitseerides polünukleotiidi, mis kodeerib

peptiidi, peptiidi-kanduri kombinatsiooni või Fc osa ja/või peptikeha peptiidi osa.

Termin „Fc“ tähistab käesoleva leiutise ühte liiki kandurit ning sisaldab antikeha 15

mitte-antigeeni siduva fragmendi järjestust, mis tuleneb terve antikeha

proteolüütilisest lagundamisest monomeersel või multimeersel kujul. Fc allikas

käesolevas leiutises on soovitatavalt täielikult inimese Fc ning võib olla mis tahes

immunoglobuliin, kuigi eelistatakse IgG1 ja IgG2. Ent Fc, mis on osaliselt inimese

omad või saadud mitte-inimeselt, on ka siia kaasatud. Fc-d koosnevad 20

monomeersetest polüpeptiididest, mis võivad olla ühendatud dimeersetele või

multimeersetele kujudele kovalentse (st disulfiidi sidemete) ja mittekovalentse

seosega. Molekulidevaheliste disulfiidi sidemete arv looduslike Fc molekulide

monomeersete üksuste vahel on vahemikus 1 kuni 4, sõltuvalt klassist (nt IgG,

IgA, IgE) või alaklassist (nt IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 IgGA2). Loodusliku Fc üks 25

näide on disulfiidiga seotud dimeer, mis tuleneb IgG papaiini lagunemisest [vaata

Ellison et al (1982), Nucl. Acids. Res. 10: 4071-9]. Siin kasutatud termin „looduslik

Fc“ üldistab monomeerseid, dimeerseid ja multimeerseid vorme.

Termin „Fc domeen“ hõlmab looduslikke Fc ja Fc variandi molekule ja järjestusi,

nagu määratleti eespool. Nagu Fc variantide ja looduslike Fc-dega hõlmab termin 30

EE - EP1615952 B1 15

„Fc domeen“ molekule monomeersel või multimeersel kujul tervest antikehast

lagundatuna või teisel moel saaduna.

Termin „multimeer“, nagu on rakendatud Fc domeenidele või molekulidele,

hõlmates ka Fc domeene, tähistab molekule, millel on kaks või mitu polüpeptiidi

ahelat, mis on seotud kovalentselt, mittekovalentselt või nii kovalentsete kui ka 5

mittekovalentsete seostega. IgG molekulid moodustavad tavaliselt dimeere, IgM,

pentameere, IgD, dimeere ja IgA, monomeere, dimeere, trimeere või tetrameere.

Multimeere võib moodustada järjestuse ning Fc loodusliku Ig allika saadava toime

rakendamisel või (nagu on määratletud allpool) taolise loodusliku Fc

derivatiseerimisel. 10

Termin „dimeer“, nagu on kasutatud Fc domeenide või molekulidega, mis

sisaldavad Fc domeene, tähistavad molekule, millel kaks polüpeptiidi ahelat on

kovalentselt või mittekovalentselt seotud.

Termin „kandur“ tähistab molekuli, mis takistab degradeerumist ja/või tõstab

poolestusaega, alandab mürgisust ja immunogeensust või tõstab terapeutilise 15

proteiini bioloogilist aktiivsust. Näidiskandurite seas on Fc domeen ning lineaarne

polümeer (nt polüetüleenglükool (PEG), polülüsiin, dekstraan jne), hargnenud

ahelaga polümeer (vaata näiteks USA patenti nr 4,289,872 Denkenwalterile et al,

väljastati 15. septembril 1981; USA patenti nr 5,229,490 Tamile, väljastati 20. juulil

1993; WO93/21259 Frechet’ et al poolt, avaldati 28. oktoobril 1993), lipiid, 20

kolesteroolrühm (nagu steroid), süsivesik või oligosahhariid või mis tahes looduslik

või sünteetiline valk, polüpeptiid või peptiid, mis seondub päästeretseptoriga

(salvage receptor). Kandureid kirjeldatakse veel allpool.

Terminid “derivatiseeriv“ ja „derivaat“ või „derivatiseeritud“ hõlmab vastavalt

protseduure ja saadud ühendeid, kus (1) ühendil on tsükliline osa, näiteks 25

ristsidumine tsüsteinüüli jääkide vahel ühendi sees; (2) ühend on ristseotud või

sellel on ristsidumise koht, näiteks on ühendil tsüsteinüüli jääk ja järelikult

moodustab see kasvatamisel või in vivo ristseotud dimeere; (3) üks või mitu

peptidüüli aheldust asendatakse mitte-peptidüüli aheldusega; (4) N-ots

asendatakse -NRR1, NRC(O)R1, - NRC(O)OR1, -NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR, 30

suktsiinimiidi rühmaga või asendatud või asendamata bensüüloksükarbonüül-NH-

EE - EP1615952 B1 16

ga, kusjuures R ja R1 ja ringi asendajad on siin allpool määratletud; (5) C-ots

asendatakse -C(O)R2 või -NR3R4-ga, kusjuures R2, R3 ja R4 on siin allpool

määratletud; ning (6) ühendid, milles individuaalsed aminohappe osad on ravimise

kaudu modifitseeritud ainetega, mis suudavad reageerida valitud kõrvalahelate või

otsa jääkidega. Derivaate on siin veel täiendavalt järgnevalt kirjeldatud. 5

Termin „peptiid“ tähistab molekule, millel on umbes 3 kuni umbes 75 aminohapet,

kus eelistatud on umbes 5 kuni 50 aminohapet, kus veel eelistatum on 8 kuni 40

ning need, millel on umbes 10 kuni 25 aminohapet, on kõige eelistatumad.

Peptiidid võivad olla looduslikult esinevad või tehislikud (st mitte-looduslikult

esinevad) aminohappe järjestused. Näidispeptiide võib luua siin esitatud mis tahes 10

meetoditega, nagu teostatakse peptiidikogudes (nt faagmeetodi kogu), mis

luuakse keemilise sünteesiga, tuletatakse valkude lagundamisega või toodetakse

rekombinantse DNA võtteid kasutades.

Termin „farmakoloogiliselt aktiivne“ tähendab, et sedasi kirjeldatud ainel on

kindlaksmääratud toime, mis mõjutab meditsiinilist parameetrit (nt vererõhk, 15

vereliblede arv, kolesterooli tase) või haiguse staadiumit (nt vähk,

autoimmuunhäired jne).

Terminid „antagonist-peptiid“ või „inhibiitor-peptiid“ tähistab peptiidi, mis blokeerib

või mõnel moel häirib huvialase seonduva proteiini bioloogilist aktiivsust või millel

on bioloogiline toime, mis on võrreldav teadaoleva huvialuse seonduva proteiini 20

antagonisti või inhibiitoriga. Järelikult hõlmab termin „Ang-2-antagonist peptiid“

peptiide, mida on võimalik pidada või saada kui Ang-2-antagonistilikke omadusi

omavaks.

Lisaks on siia kaasatud ka leiutise ühendite füsioloogiliselt sobivad soolad.

„Füsioloogiliselt sobivate sooladega“ on mõeldud mis tahes teadaolevaid või hiljem 25

farmatseutiliselt sobivateks peetud soolasid. Mõned konkreetsed näited on:

atsetaat, trifluoroatsetaat, hüdrohaliidid nagu vesinikkloriid ja vesinikbromiid,

sulfaat, tsitraat, tartraat, glükolaat ning oksalaat, mesülaat ja fosfaat.

EE - EP1615952 B1 17

Peptikehad

Käesoleva leiutise üks aspekt käsitleb Ang-2 peptikehade arengut. Proteiini ligandi

koostoime oma retseptoriga toimub sageli võrdlemisi suurel üleminekukihil. Ent

nagu näidati inimese kasvuhormooni ja selle retseptori puhul, ainult mõned

põhijäägid üleminekukihil soodustavad sidumisenergiast enamikku. Clackson et al, 5

Science 267: 383-6 (1995). Proteiini ligandi hulk kõigest näitab õiges topoloogias

siduvaid epitoope või sooritab sidumisega mitteseotud funktsioone. Järelikult

saavad ainult „peptiidi“-pikkused molekulid (üldiselt 2 kuni 40 aminohapet)

seonduda teatud suure proteiini ligandi retseptor-proteiinile. Taolised peptiidid

võivad imiteerida suure proteiini ligandi („peptiidi agonistid“) bioaktiivsust või 10

konkureeriva sidumise kaudu inhibeerida suure proteiini ligandi („peptiidi

antagonistid“) bioaktiivsust.

Faagmeetodi tehnoloogia on tekkinud võimsa meetodina, et tuvastada taolisi

peptiidi agoniste ja antagoniste. Vaata näiteks Scott et al, Science 249: 386

(1990); Devlin et al, Science 249: 404 (1990); USA patent nr 5,223,409, mis 15

väljastati 29. juunil 1993; USA patent nr 5,733,731, mis väljastati 31. märtsil 1998;

USA patent nr 5,498,530, mis väljastati 12. märtsil 1996; USA patent nr 5,432,018,

mis väljastati 11. juulil 1995; USA patent nr 5,338,665, mis väljastati 16. augustil

1994; USA patent nr 5,922,545, mis väljastati 13. juulil 1999; WO 96/40987, mis

avaldati 19. detsembril 1996; ning WO 98/15833, mis avaldati 16. aprillil 1998 20

(millest igaüks on siia viidetena kaasatud). Peptiidi faagmeetod kogumites on

võimalik suvalisi peptiidijärjestusi näidata kiulise faagi katteproteiinidega

ühendamisel. Esitatud peptiide saab soovi korral retseptori antikeha-

immobiliseeritud rakuvälise domeeni suhtes afiinsena elueerida. Järele jäänud

faagi võib rikastada järjestikku afiinsus-puhastamise ja taaspaljundamisega. 25

Paremad sidumispeptiidid võib järjestada, et ühe või mitme struktuurselt seotud

peptiidi perekondades põhijääke tuvastada. Vaata nt Cwirla et al, Science 276:

1696-9 (1997), kus tuvastati kaks erinevat perekonda. Peptiidi järjestused võivad

ka viidata, milliseid jääke saab ohutult asendada alaniini skaneerimise või

mutageneesiga DNA tasemel. Mutageneesi kogusid võib luua ja analüüsida, et 30

paremate sidujate järjestust täiendavalt optimeerida. Lowman, Ann. Rev. Biophys.

Biomol. Struct. 26: 401-24 (1997).

EE - EP1615952 B1 18

Proteiin-proteiini koostoime strukturaalset analüüsi võib kasutada, et näidata

peptiide, mis imiteerivad suure proteiini ligandide sidumisaktiivsust. Taolises

analüüsis võib kristallstruktuur näidata suure proteiini ligandi, millest võib peptiidi

kujundada, kriitiliste jääkide omapära ja suhtelist orientatsiooni. Vaata nt Takasaki

et al, Nature Biotech 15: 1266-70 (1997). Neid analüütilisi meetodeid võib ka 5

kasutada, et uurida koostoimet retseptori proteiini ja faagmeetodiga valitud

peptiidide vahel, viidates peptiidide edasisele modifikatsioonile, et sidumisafiinsust

tõsta.

Peptiidi uuringutes konkureerivad faagmeetodiga ka teised meetodid. Peptiidi

kogu võib ühendada lac repressori karboksüül-otsaga ning E. colis 10

ekspresseerida. Teine E. coli põhine võte võimaldab faagmeetodit raku

välismembraanil peptidoglükaaniga seotud lipoproteiiniga (PAL) ühendamisega.

Siitpeale nimetatakse neid ja seonduvaid meetodeid ühiselt „E. coli meetodiks“.

Järgmises meetodis peatatakse suvalise RNA translatsioon vahetult enne

ribosoomi vabastamist, mille tulemuseks on polüpeptiidide kogu, kus nende 15

seonduv RNA on endiselt kinnitunud. Siitpeale nimetatakse seda ja seonduvaid

meetodeid ühiselt „ribosoomi meetodiks“. Teised meetodid rakendavad peptiidide

keemilisi sidemeid RNA-le. Vaata näiteks Roberts and Szostak, Proc Natl Acad

Sci USA, 94: 12297-303 (1997). Siitpeale nimetatakse seda ja seonduvaid

meetodeid ühiselt „RNA-peptiidi uuringuks“. Välja on töötatud keemiliselt tuletatud 20

peptiidi kogusid, kus peptiidid on immobiliseeritud stabiilsetel mittebioloogilistel

materjalidel nagu polüetüleeni kepikesed või lahustit läbilaskvad vaigud. Järgmine

keemiliselt tuletatud peptiidi kogu kasutab fotolitograafiat, et klaasslaididele

immobiliseeritud peptiide skaneerida. Siitpeale nimetatakse neid ja seonduvaid

meetodeid ühiselt „keemilise peptiidi uuringuks“. Keemilise peptiidi uuring võib 25

osutuda kasulikuks, sest see võimaldab kasutada D-aminohappeid ning teisi

mittelooduslikke analooge ja mitte-peptiidi elemente. Nii bioloogilisi kui ka keemilisi

meetodeid on uurinud Wells ja Lowman, Curr. Opin. Biotechnol., 3: 355-62 (1992).

Põhimõtteliselt võib mis tahes proteiini peptiidi mimeetikume leida faagmeetodi

ning teiste eespool nimetatud meetodite abil. Neid meetodeid on kasutatud 30

epitoobi kaardistamiseks, kriitiliste aminohapete tuvastamiseks proteiin-proteiini

koostoimes ning uute raviainete avastamiseks. Vaata nt Cortese et al, Curr. Opin.

EE - EP1615952 B1 19

Biotech. 7: 616-21 (1996). Peptiidi kogusid kasutatakse nüüd kõige enam

immunoloogilistes uuringutes nagu epitoopi kaardistamine. Vaata Kreeger, The

Scientist 10(13): 19-20(1996).

Faagmeetodi kogumi uuringuga tuvastatud peptiide peetakse „juhtnöörideks“

raviainete väljatöötamisel, mitte iseenesest raviaineteks. Nagu ka teiste proteiinide 5

ja peptiidide puhul eemaldatakse need tõenäoliselt kiiresti in vivo kas neerude

filtreerimisel, rakuliste puhastusmehhanismide poolt retikuloendoteliaalsüsteemis

või proteolüütilisel degradatsioonil [Francis, (supra)]. Seetõttu kasutatakse peptiide

antud valdkonnas praegu ravimi sihtmärkide kinnitamiseks või alustellingutena

orgaaniliste ühendite, mida keemilise kogu uuringutega nii kergesti või kiiresti ei 10

tuvastata, loomiseks [Lowman, (supra); Kay et al, (supra)]. Antud valdkonnas

oleks kasu protsessist, millega taolised peptiidid palju lihtsamalt annaksid

saaduseks angiogeneesivastaseid raviaineid.

Peptikehade struktuur

Vastavalt antud leiutisele valmistatud aine koostises võib peptiid olla kinnitunud 15

kandurile peptiidi N- või C-otsa kaudu. Järelikult võib antud leiutise kandur-peptiidi

molekule kirjeldada järgneva viie valemiga ja nende multimeeridega:

(X1)a-F1-(X2)b (VALEM I)

X1-F1 (VALEM II)

F1-X2 (VALEM III)

F1-(L1)c-P1 (VALEM IV)

F1-(L1)c-P1-CL2)d-P2 (VALEM V)

kus:

F1 on kandur (soovitatavalt Fc domeen);

X1 ja X2 valitakse kumbki iseseisvana -(L1)c-P1, -(L1)c-P1-(L2)d-P2, -20

(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3 ja -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4 seast;

P1, P2, P3 ja P4 on kumbki iseseisvana farmakoloogiliselt aktiivsete

peptiidide järjestused, nagu on siin kirjeldatud;

L1, L2, L3 ja L4 on kumbki iseseisvana linkerid; ning

„a“, „b“, „c“, „d“, „e“ ja „f“ on kumbki iseseisvana 0 või 1 tingimusel, et 25

„a“ ja „b“ seast vähemalt üks on 1.

EE - EP1615952 B1 20

Peptiidid

Käesolev leiutis peab võimalikuks peptiide, mis selektiivselt või spetsiifiliselt Ang-

2-le seonduvad. Mis tahes koguses taolisi peptiide saab antud leiutisega seoses

kasutada. Just faagmeetod on kasulik käesolevas leiutises kasutamiseks mõeldud

peptiidide loomisel, nagu on ka näidatud, et suvaliste peptiide kogust pärit 5

afiinsuse valikut saab kasutada peptiidid ligandide tuvastamiseks mis tahes

geeniprodukti mis tahes kohale. Dedman et al, J. Biol. Chem. 268: 23025-30

(1993).

Käesolevas leiutises võib peptiide valmistada antud valdkonnas avaldatud mis

tahes meetoditega. Kasutatud on ühetähelisi aminohappe lühendeid. Mis tahes 10

järjestuses „X“ (ja kogu spetsifikatsioonis läbivalt, kui ei ole teatud juhtudel teisiti

öeldud) tähendab, et eksisteerida võib 20 mis tahes looduslikult esinevat

aminohappejääki või mis tahes loodulikult mitte-esinevat aminohapet (mida on

kirjeldatud „Variantide“ juures). Neist iga peptiid võib olla seotud reastikku (st

üksteise järel), koos linkeritega või ilma nendeta ning reastikku seotud näited on 15

esitatud tabelis. Linkerid on loetletud kui „L“ ning need võivad olla mis tahes siin

kirjeldatud linkerid. Reastikku kordused ja linkerid on selguse huvides esitatud

tühikuga eraldatuna. Tsüsteinüüli jääki sisaldav mis tahes peptiid võib olla seotud

teise Cys-sisaldava peptiidiga, millest üks või mõlemad võivad olla kandurile

seotud. Enam kui ühe Cys-jäägiga peptiid võib ka moodustada peptiidisisese 20

disulfiidi sideme. Neist mis tahes peptiidi võib derivatiseerida, nagu on siin

kirjeldatud. Derivaatide, milles karboksüül-ots võib olla kaetud aminorühmaga,

jaoks on kattev aminorühm NH2. Derivaatide, milles aminohappe jäägid on

asendatud aminohappe jääkidest erinevate osadega, on asendused märgitud

tähega S, mis tähistab mis tahes osa, mida on kirjeldanud Bhatnagar et al, J. Med 25

Chem. 39: 3814-9 (1996), ning Cuthbertson et al, J. Med. Chem. 40: 2876-82

(1997), mis on siia ka viidetena kaasatud. Kõik peptiidid on seotud

peptiidisidemetega, kui ei ole teisiti märgitud.

Kandurid

Ühes variandis võimaldab antud leiutis vähemalt ühel peptiidil vähemalt ühele 30

kandurile (F1, F2) kinnituda N-otsa, C-otsa või peptiidi(de) aminohappe jääkide ühe

EE - EP1615952 B1 21

kõrvalahela kaudu. Kasutada võib ka mitmekordseid kandureid, nt Fc-sid igal otsal

või ühte Fc-d ühel otsal ja PEG rühma teises otsas või kõrvalahelal.

Fc domeen on üks eelistatav kandur. Fc domeeni võib ühendada peptiidide N- või

C-otsadele või nii N- kui ka C-otsadele.

Nagu märgiti eespool, Fc variandid on antud leiutise raames sobivad kandurid. 5

Looduslikku Fc-d võib laiaulatuslikult modifitseerida, et moodustada Fc variant

vastavalt antud leiutisele tingimusel, et sidumine päästeretseptorile säilib. Vaata

näiteks WO 97/34631 ja WO 96/32478. Taolistes Fc variantides võib eemaldada

loodusliku Fc ühe või mitu kohta, mis tagavad strukturaalseid omadusi või

funktsionaalset aktiivsust, mida antud leiutise sulandmolekulid ei vaja. Need kohad 10

võib eemaldada näiteks jääkide asendamise või kustutamisega, jääkide lisamisel

antud kohale või seda kohta sisaldavate osade kärpimisel. Lisatud või asendatud

jäägid võivad olla ka muudetud aminohapped nagu peptidomimeetikumid või D-

aminohapped. Fc variante võib olla vaja mitmel põhjusel, millest mitmeid on ka

allpool kirjeldatud. Fc näidisvariantide seas on molekulid ja järjestused, kus: 15

1. Disulfiidi sideme moodustamisse kaasatud kohad eemaldatakse. Taoline

eemaldamine võib vältida reaktsioone teiste tsüsteiini sisaldavate

proteiinidega, mis esinevad peremeesrakus, mida kasutatakse leiutise

molekulide tootmiseks. Selleks võib tsüsteiini sisaldavat segmenti N-otsal

kärpida või tsüsteiini jäägid võib kustutada või asendada teiste 20

aminohapetega (nt alanüül, serüül). Isegi, kui tsüsteiini jäägid

eemaldatakse, võivad üksiku ahela Fc domeenid endiselt moodustada

dimeerse Fc domeeni, mis mitte-kovalentselt koos püsib.

2. Tuvastatakse looduslik Fc, et seda valitud peremeesrakuga ühtivamaks

teha. Näiteks võib eemaldada PA järjestuse tavalise Fc N-otsa lähedal, 25

mille võib ära tunda E. colis oleva seene ensüümiga nagu proliini

iminopeptidaas. Samas võib lisada N-otsa metionüüli jäägi, eriti siis, kui

molekuli ekspresseeritakse rekombinantselt bakterirakus nagu E. coli.

3. Loodusliku Fc N-otsa portsjon eemaldatakse, et vältida N-otsa

heterogeensust, kui seda ekspresseeritakse valitud peremeesrakus. Sellel 30

EE - EP1615952 B1 22

põhjusel võib kustutada mis tahes esimesed 20 aminohappe jääki N-

terminuses, eriti need, mis asuvad 1., 2., 3., 4. ja 5. positsioonil.

4. Üks või mitu glükosüleerimise kohta eemaldatakse. Tavaliselt võivad

glükosüleeritud jäägid (nt aspargiin) pakkuda tsütolüütilist vastust. Taolised

jäägid võib kustutada või asendada glükosüleerimata jääkidega (nt alaniin). 5

5. Täiendusega koostoimesse kaasatud kohad nagu C1q sidumiskoht

eemaldatakse. Näiteks võib kustutada või asendada inimese IgG1 EKK

järjestuse. Lisandusega täiendamine ei pruugi olla kasulik antud leiutise

molekulide jaoks ning järelikult tuleks seda taolise Fc variandi puhul vältida.

6. Eemaldatakse kohad, mis mõjutavad päästeretseptorist erinevatele Fc 10

retseptoritele sidumist. Looduslikul Fc võib olla kohti koostoimeks teatud

valgete verelibledega, mida ei ole vaja käesoleva leiutise sulandmolekulide

jaoks, ning järelikult võib selle eemaldada.

7. Eemaldatakse ADCC koht. ADCC kohad on antud valdkonnas tuntud.

Vaata näiteks Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992) seoses ADCC 15

kohtadega IgG1 sees. Ka neid kohti ei ole käesoleva leiutise

sulandmolekulidele vaja ning järelikult võib need eemaldada.

8. Kui looduslik Fc tuletatakse mitteinimese antikehast, võib loodusliku Fc

humaniseerida. Loodusliku Fc inimtaoliseks tegemiseks tavaliselt

asendatakse valitud jäägid mitte-inimese loodusliku Fc jääkides, mida 20

tavaliselt leidub inimese looduslikus Fc-s. Antud valdkonnas teatakse

antikeha humaniseerimiseks mõeldud võtteid.

Alternatiivne kandur oleks proteiin, polüpeptiid, peptiid, antikeha, antikeha

fragment või väike molekul (nt peptidomimeetiline ühend), mis suudab

päästeretseptorile seonduda. Näiteks võib kandurina kasutada polüpeptiidi, nagu 25

kirjeldati USA patendis nr 5,739,277, väljastati 14. aprillil 1998 Prestale et al.

Peptiide saab valida ka faagmeetodiga FcRn päästeretseptorile sidumiseks.

Taolised päästeretseptorit siduvad ühendid on kaasatud ka tähenduses „kandur“

ning kuuluvad leiutise raamesse. Taolised kandurid tuleks valida tõstetud

poolestusea (nt vältides proteaaside poolt tuntavaid järjestusi) ning alanenud 30

EE - EP1615952 B1 23

immunogeensuse (nt soodustades mitte-immunogeenseid järjestusi, nagu avastati

antikeha inimtaoliseks tegemisel) jaoks.

Nagu eespool märgiti, võib polümeer-kandureid ka F1 ja F2 jaoks kasutada.

Praegu on kättesaadavad erinevad vahendid kanduritena kasulike keemiliste

osade kinnitamiseks, vaata nt Patendikoostöölepingu (Patent Cooperation Treaty 5

PCT) rahvusvahelist väljaannet nr WO96/11953, mille nimi on „N-Terminally

Chemically Modified Protein Compositions and Methods“. Selles PCT väljaandes

on muuhulgas esitatud vees lahustuvate polümeeride selektiivne kinnitumine

proteiini N-terminusele.

Eelistatud polümeerkandur on polüetüleenglükool (PEG). PEG-rühm võib olla 10

igasuguse käepärase molekulmassiga ja lineaarne või hargnenud. PEG-i

keskmine molekulmass on soovitatavalt vahemikus umbes 2 kilodaltonit („kDa“)

kuni umbes 100kDa, veel soovitatavamalt umbes 5kDa kuni umbes 50 kDa, kõige

soovitatavamalt umbes 5kDa kuni umbes 10kDa. Üldiselt on PEG-rühmad leiutise

ühenditele kinnitunud atsüülimise või redutseeriva alküülimisega reaktiivse rühma 15

kaudu PEG osal (nt aldehüüd, amino, tiool või esterrühm) reaktiivsele rühmale

leiutise ühendil (nt aldehüüd, amino või esterrühm).

Sünteetiliste peptiidide pegüülimise tõhus strateegia hõlmab peptiidi ja PEG-osa

kombineerimist konjugaatseose moodustamise kaudu lahuses, kus igaüks kannab

erifunktsionaalsust, mis põhjustab omavahelist reaktiivsust. Peptiidide saab lihtsalt 20

valmistada antud valdkonnas teadaoleva tavapärase tahke faasi sünteesiga.

Peptiidid „preaktiveeritakse“ sobiva funktsionaalrühmaga spetsiaalsel kohal.

Prekursorid puhastatakse ja eristatakse täielikult enne PEG-osaga reageerimist.

Peptiidi ligeerimine PEG-iga toimub tavaliselt veefaasis ja seda saab lihtsalt

jälgida pöörfaasilise analüütilise HPLC-ga. Pegüülitud peptiide on võimalik hõlpsalt 25

puhastada preparatiivse HPLC-ga ja eristada analüütilise HPLC-ga, aminohappe

analüüsi ja laserdesorptsiooni massispektromeetriaga.

Polüsahhariid-polümeerid on veel üks liik veeslahustuvaid polümeere, mida võib

proteiini modifitseerimiseks kasutada. Dekstraanid on polüsahharid-polümeerid,

mis koosnevad glükoosi üksikutest allüksustest, mis on peamiselt seotud a1-6 30

sidemetega. Dekstraan on iseenesest kättesaadav mitmesugustes molekulmassi

EE - EP1615952 B1 24

vahemikes ning see on hõlpsasti kättesaadav molekulmassi vahemikus umbes

1kDa kuni umbes 70kDa. Dekstraan on sobiv veeslahustuv polümeer käesolevas

leiutises kasutamiseks kandurina iseseisvalt või koos teise kanduriga (nt Fc).

Vaata näiteks patente WO 96/11953 ja WO 96/05309. Teada on terapeutilistele

või diagnostilistele immunoglobuliinidele konjugeeritud dekstraani kasutamine; 5

vaata näiteks Euroopa patenditaotlust nr 0 315 456, mis on käesolevaga ka viitena

kaasatud. Eelistatakse dekstraani molekulmassiga umbes 1kDa kuni umbes

20kDa, kui dekstraani kasutatakse kandurina vastavalt käesolevale leiutisele.

Linkerid

Mis tahes „linker“-rühm on valikuline. Selle olemasolul ei ole keemiline struktuur 10

kriitiline, kuna see toimib peamiselt ruumitäitena. Linker koosneb soovitatavalt

aminohapetest, mis on kokku ühendatud peptiidisidemetega. Eelistatud

variantides koosneb linker järelikult alates 1 kuni 20 aminohappest, mis on seotud

peptiidisidemetega, kusjuures aminohapped valitakse 20 looduslikult esinevast

aminohappest. Üks või mitu seda aminohapet võivad olla glükosüleeritud, nagu 15

antud valdkonnas pädevad isikud teavad. Rohkem eelistatud variandis valitakse 1

kuni 20 aminohapet glütsiini, alaniini, proliini, aspargiini, glutamiini ja lüsiini seast.

Veelgi soovitatavamalt koosneb linker peamiselt aminohapetest, mis on steeriliselt

pärssimata, nagu glütsiin ja alaniin. Järelikult on eelistatud linkerid polüglütsiinid

(eriti (Gly)5, (Gly)8), poly(Gly-Ala) ja polüalaniinid. Eelistatakse ka Gly ja Ala 20

kombinatsioone nagu ka linkerit, millele siin viidatakse kui K1 ja millel on siin

näidetes esitatud aminohappe järjestus.

Võimalikud on ka mitte-peptiidi linkerid. Näiteks alküüllinkerid nagu -NH-(CH2)s-

C(O)-, kusjuures kasutada saab s=2-20. Neid alküüllinkereid võib veel asendada

mis tahes mitte-steeriliselt pärssiva rühmaga nagu madalam alküül (nt C1-C6) 25

madala matsüül, halogeen (nt Cl, Br), CN, NH2, fenüül jne. Mitte-peptiidi linkeri

näide on PEG-linker ning selle molekulmass on 100 kuni 5000kDa, soovitatavalt

100 kuni 500kDa. Peptiidi linkereid võib derivaate moodustamiseks muuta samal

moel, nagu kirjeldati eespool.

30

EE - EP1615952 B1 25

Variandid ja derivaadid

Spetsiifiliste sideainete variandid ja derivaadid on kaasatud käesoleva leiutise

ulatusse. Variantide hulka on kaasatud lisatavad, kustutatavad või

asendusvariandid. On mõistetav, et käesoleva leiutise konkreetne spetsiifiline

sideaine võib sisaldada ühte, kahte või kõiki kolme liiki varianti. Lisatavad või 5

asendusvariandid võivad sisaldada looduslikke aminohappeid, mittelooduslikke

aminohappeid (nagu on esitatud eespool) või mõlemaid.

Teatud variandis on esitatud lisatavad variandid, kus üks või mitu looduslikult

esineva või mitteloodusliku aminohappe jääki täiendavad peptiidi või peptikeha

aminohappe järjestust. Lisandused võivad asuda ka proteiini ühes või mõlemas 10

otsas või peptikeha aminohappe järjestuse seesmistes piirkondades. Ühes või

mõlemas otsas olevate jääkidega lisatavate variantide seas võivad olla näiteks

sulandvalgud ja valgud, mis hõlmavad aminohappe märgiseid või märgistusi.

Lisamisvariantide seas on peptiidid ja peptikehad, kus peptiidi või peptikeha

aminohappe järjestusele või selle fragmendile lisatakse üks või mitu aminohappe 15

jääki.

Leiutise alternatiivsete produktide seas on ka küpsed peptiidid ja peptikehad,

kusjuures liider- või signaaljärjestused eemaldatakse ning saadud proteiinidel on

täiendavad amino-otsa jäägid, kus aminohapped võivad olla looduslikud või

mittelooduslikud. Võimalikuks peetakse aminohappe positsioonil -1 (Met-1-20

peptikeha) täiendava metionüüljäägiga spetsiifilisi sideaineid (nagu peptikehad),

nagu ka positsioonidel -2 ja -1 (Met-2-Lys-1-) täiendava metioniini ja lüsiini jäägiga

spetsiifilisi sideaineid. Täiendava Met, Met-Lys, Lys jäägiga (üldiselt üks või mitu

põhijääki) variandid on eriti kasulikud täiustatud rekombinantse proteiini

tootmiseks bakteri peremeesrakkudes. 25

Leiutis hõlmab ka spetsiifilise sideaine variante, millel on täiendavad aminohappe

jäägid, mis tekivad spetsiifiliste ekspressioonisüsteemide kasutamisest. Näiteks

kommertsiaalselt kättesaadavate vektorite, mis ekspresseerivad soovitud

polüpeptiidi glutatioon-S-transferaasi (GST) sulandprodukti osana, kasutamine

annab soovitud polüpeptiidi, millel on täiendav glütsiini jääk aminohappe 30

positsioonil -1 pärast GST komponendi lõhustamist soovitud polüpeptiidist.

EE - EP1615952 B1 26

Võimalikuks peetakse ka variante, mis tekivad ekspressiooni tagajärjel teistes

vektorsüsteemides, sealhulgas need, kus polühistidiini märgised on kaasatud

aminmohappe järjestusse tavaliselt järjestuse karboksü- ja/või aminootsa.

Lisamisvariantide seas on sulandvalgud, kus peptiidi või peptikeha amino- ja/või

karboksüots ühendatakse teisele polüpeptiidile, selle fragmendile või 5

aminohapetele, mida tavaliselt ei peeta mingi spetsiifilise proteiini järjestuse osaks.

Taoliste sulandvalkude näited on immunogeensed polüpeptiidid, pika ringleva

poolestusajaga nagu immunoglobuliini konstantsed piirkonnad, markervalgud,

valgud või polüpeptiidid, mis lihtsustavad soovitud peptiidi või peptikeha järjestuste

puhastamist, ning polüpeptiidid, mis soodustavad multimeersete proteiinide 10

moodustumist (nagu leutsiiniharu motiivid, mis on dimeeri

moodustumises/stabiilsuses olulised).

Seda tüüpi lisamisvariant hõlmab tavaliselt kogu või märkimisväärset osa, mis on

N- või C-otsale ühendatud, looduslikust molekulist kuni kogu või osa teist

polüpeptiidi. Näiteks sulandvalgud rakendavad tavaliselt liiderjärjestusi teistest 15

liikidest, et võimaldada valgu rekombinantset ekspressiooni heteroloogses

peremeesorganismis. Järgmine kasulik sulandvalk hõlmab immunoloogiliselt

aktiivse domeeni nagu antikeha epitoop lisamist, et lihtsustada sulandvalgu

puhastamist. Lõhestamiskoha kaasamine sulamispunktis või selle lähedal

lihtsustab välise polüpeptiidi eraldamist pärast puhastamist. Teised kasulikud 20

ühendamised hõlmavad funktsionaaldomeenide ühendust nagu ensüümidest

pärinevad aktiivsed kohad, glükosüleerimise domeenid, rakulised sihtsignaalid või

transmembraani piirkonnad.

Leidub erinevaid kommertsiaalselt kättesaadavaid sulandvalgu ekspressiooni

süsteeme, mida võib käesolevas leiutises kasutada. Eriti kasulike süsteemide 25

seas on muuhulgas glutatioon-S-transferaasi (GST) süsteem (Pharmacia),

maltoosi siduva valgu süsteem (NEB, Beverley, MA), FLAG süsteem (IBI, New

Haven, CT) ning 6xHis süsteem (Qiagen, Chatsworth, CA). Need süsteemid

suudavad anda rekombinantseid peptiide ja/või peptikehasid, millel on ainult väike

arv lisa aminohappeid, mis vähetõenäoliselt peptiidi või peptikeha aktiivsust 30

oluliselt mõjutavad. Näiteks nii FLAG süsteem kui ka 6xHis süsteem lisavad ainult

lühikesi järjestusi, millest kumbki on teadaolevalt vähese antigeensusega ja mis ei

EE - EP1615952 B1 27

mõjuta ebasoodsalt polüpeptiid voltumist selle looduslikuks konformatsiooniks.

Järgmine N-otsa ühildamine, mida kasulikuks peetakse, on Met-Lys dipeptiidi

ühildamine valgu või peptiidide N-otsa piirkonnas. Taoline ühildamine võib anda

soodsat kasvu valgu ekspressioonis või aktiivsuses.

Teised fusioonsüsteemid annavad polüpeptiidi hübriide, kus sulandpartner 5

soovitud peptiidist või peptikehast soovitatavalt eemaldatakse. Teatud variandis on

sulandpartner rekombinantsele peptikehale ühendatud peptiidi järjestusega, mis

sisaldab proteaasile spetsiifilist äratundmisjärjestust. Sobivate järjestuste näited on

need, mida Tobacco Etch Virus proteaas (Life Technologies, Gaithersburg, MD)

või faktor Xa (New England Biolabs, Beverley, MA) ära tunneb. 10

Leiutis pakub ka sulandpolüpeptiide, mis sisaldavad käesoleva leiutise kogu või

osa peptikeha või peptiidi koos kärbitud koefaktoriga (truncated tissue factor tTF).

tTF on vaskulaarne märklaudaine, mis hõlmab inimese koagulatsiooni sisaldava

proteiini kärbitud kuju, mis omakorda toimib kasvaja veresoonte hüübiva ainena,

nagu on kirjeldatud USA patentide nr 5,877,289; 6,004,555; 6,132,729; 6,132,730; 15

6,156,321; ja Euroopa patendis nr EP 0988056. tTF ühendamine anti-Ang-2

peptikehale või peptiidile või nende fragmentidele lihtsustab anti-Ang-2

toimetamist sihtrakkudesse.

Asendusvariantide seas on need peptiidid ja peptikehad, kus üks või mitu

aminohappe jääki eemaldatakse ja asendatakse ühe või mitme alternatiivse 20

aminohappega, mis võivad esineda looduslikult või mittelooduslikult.

Asendusvariandid loovad peptiide või peptikehasid, mis on „sarnased“ algsele

peptiidile või peptikehale nii, et neil kahel molekulil on teatud protsendihulgal

identseid aminohappeid. Asendusvariantide seas on 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15,

20, 25 või 30 aminohappe asendused peptiidis või peptikehas, kusjuures 25

asenduste arv võib peptiidi või peptikeha aminohapetest moodustada kuni kümme

protsenti või rohkem. Asendused võivad loomult olla konservatiivsed, ent leiutis

hõlmab ka mitte-konservatiivseid asendusi ja ka mittelooduslikke aminohappeid.

Seonduvate peptiidide ja peptikehade identsust ja sarnasust saab teadaolevate

meetoditega lihtsalt arvutada. Taoliste meetodite seas on muuhulgas need, mida 30

on kirjeldatud raamatutes Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., toim.,

EE - EP1615952 B1 28

Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and

Genome Projects, Smith, D.W., toim., Academic Press, New York (1993);

Computer Analysis of Sequence Data, 1. osa, Griffin, A.M., and Griffin, H.G.,

toim.-d, Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular

Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, 5

Gribskov, M. and Devereux, J., toim.-d, M. Stockton Press, New York (1991); ning

Carillo et al, ajakirjas SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988).

Kahe peptiidi või polüpeptiidi või ühe polüpeptiidi ja peptiidi seotuse või identsuse

protsendimäära tuvastamise meetodid on kujundatud andma suurimat sobivust

testitud järjestuste vahel. Identsuse tuvastamise meetodeid on kirjeldatud avalikult 10

kättesaadavates arvutiprogrammides. Kahe järjestuse vahelise identsuse

tuvastamise arvutiprogrammi meetodid hõlmavad muuhulgas GCG programmi

paketti, sealhulgas GAP (Devereux et al, Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984);

Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI, BLASTP,

BLASTN, ning FASTA (Altschul et al, J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)). BLASTXi 15

programm on avalikult kättesaadav USA Riikliku Biotehnoloogia Informatsiooni

Keskuselt (NCBI) ja teistest allikatest (BLAST Manual, Altschul et al

NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al, supra (1990)). Identsuse

tuvastamiseks võib ka kasutada tuntud Smith-Watermani algoritmi.

Kahe aminohappe järjestuse reastamiseks mõeldud teatud kohakuti 20

reastusskeemide tulemuseks võib olla kahe järjestuse ainult lühikese ala

sobitamine ning sellel väiksel reastatud alal võib olla väga kõrge järjestuse

identsus, kuigi kahe täispika järjestuse vahel ei ole märkimisväärset seost.

Seetõttu on teatud variantides valitud reastusmeetodi (GAP programm)

tulemuseks reastus, mis katab vähemalt kümme protsenti võrreldava sihtmärgist 25

polüpeptiidi täispikkusest, st vähemalt 40 külgnevat aminohapet, kus võrreldakse

vähemalt 400 aminohappe järjestust, 30 külgnevat aminohapet, kus võrreldakse

vähemalt 300 kuni umbes 400 aminohappe järjestust, vähemalt 20 külgnevat

aminohapet, kus võrreldakse vähemalt 200 kuni umbes 300 aminohappe

järjestust, ning vähemalt 10 külgnevat aminohapet, kus võrreldakse vähemalt 30

umbes 100 kuni 200 aminohappe järjestust.

EE - EP1615952 B1 29

Näiteks arvutialgoritmi GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin,

Madison, WI) kasutades reastatakse kaks polüpeptiidi, mille jaoks protsentides

järjestust on vaja tuvastada, nende vastavate aminohapetega optimaalseks

sobivuseks („sobitatud ulatus“, nagu on algoritmiga määratletud). Teatud

variantides kasutatakse koos algoritmiga vahede avamise karistust (gap opening 5

penalty) (mida tavaliselt arvutatakse kui 3x keskmine diagonaal; „keskmine

diagonaal“ on kasutatava võrdlusmaatriksi diagonaali keskmine; „diagonaal“ on

arv või number, mis on igale sobilikule aminohappe paarile teatud võrdlusmaatriksi

poolt määratud) ja vahede pikendamise karistust (gap extension penalty) (mis on

tavaliselt 1/10 korda vahede avamise karistus) ning võrdlusmaatriksit nagu PAM 10

250 või BLOSUM 62. Algoritm kasutab ka standardset võrdlusmaatriksit (vaata

Dayhoff et al, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3) (1978) PAM 250

võrdlusmaatriksi jaoks; Henikoff et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919

(1992) BLOSUM 62 võrdlusmaatriksi jaoks).

Polüpeptiidi järjestuse võrdluseks mõeldud parameetrite seas on järgnev: 15

algoritm: Needleman et al, J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970);

võrdlusmaatriks: BLOSUM 62 Henikoffilt et al, supra (1992);

vahe karistus: 12

vahe pikkuse karistus: 4

sarnasuse piir: 0 20

GAPi programm võib ülaltoodud parameetritega tõhus olla. Teatud variantides on

eespool mainitud parameetrid polüpeptiidi võrdlusteks mõeldud vaikimisi

parameetrid (kus ei ole otsa vahedele mõeldud karistust) GAPi algoritmi

kasutades.

Polünukleotiidi molekuli järjestusele mõeldud parameetrite (vastupidiselt 25

aminohappe järjestusele) võrdluste seas on järgnev:

algoritm: Needleman et al, supra (1970);

võrdlusmaatriks: sobivused = +10, mittesobivused = 0

vahe karistus: 50

EE - EP1615952 B1 30

vahe pikkuse karistus: 3

GAPi programm võib ülaltoodud parameetritega tõhus olla. Eespool mainitud

parameetrid on polünukleotiidi molekuli võrdluste vaikimisi parameetrid.

Kasutada võib teisi näidisalgoritme, vahe avamise karistusi, vahe pikendamise

karistusi, võrdlusmaatrikseid, sarnasuspiire jne, sealhulgas neid, mis on esitatud 5

Wisconsin Package’i programmi juhendis, 9. versioon, september, 1997.

Konkreetsed sooritatavad valikud on antud valdkonnas pädevatele isikutele ilmsed

ning sõltuvad tehtavast spetsiifilisest võrdlusest nagu DNA-DNA-le, valk-valgule,

valk-DNA-le ning täiendavalt sellest, kas võrdlus tehakse järjestuste teatud

paaride (mille puhul on üldjuhul eelistatud GAP või BestFit) või ühe järjestuse ja 10

järjestuste laia andmebaasi (mille puhul on eelistatud FASTA või BLASTA) vahel.

Siin kasutatud kakskümmend tavapärast aminohapet ja nende lühendit järgivad

tavapärast kasutust. Vaata Immunology: A Synthesis (2. köide, E. S. Golub and D.

R. Gren, toim.-d, Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), mis on siia igal

otstarbel viidetena kaasatud. 15

Aminohapetel võib olla kas L- või D-stereokeemia (välja arvatud Gly, mis ei ole L

ega D) ning käesoleva leiutise polüpeptiidid ja koostised võivad sisaldada

stereokeemia kombinatsioone. Ent eelistatakse L stereokeemiat. Leiutis pakub ka

ümberpööratud molekule, kus amino-ots aminohapete karboksü-otsa järjestusele

on vastupidine. Näiteks normaalse järjestusega X1-X2-X3 molekul oleks 20

ümberpööratult X3-X2-X1. Leiutis pakub veel retro-ümberpööratud molekule, kus

nagu eespoolgi on amino-ots aminohapete karboksü-otsa järjestusele

ümberpööratud ning jäägid, mis on tavaliselt „L“-enantiomeerd, muudetakse „D“-

stereoisomeeri kujule.

Kahekümne tavapärase aminohappe, mitteloodusliku aminohappe nagu α-, α-25

diasendatud aminohappe, N-alküül aminohappe, piimhappe ja teiste

mittetavapäraste aminohapete stereoisomeerid (nt D-aminohapped) võivad olla ka

sobivad komponendid käesoleva leiutise polüpeptiidide jaoks. Mittetavapäraste

aminohapte seas on muuhulgas: aminoadipiinhape, beeta-alaniin, beeta-

aminopropioonhape, aminobutüürhape, piperidiinhape, aminokaproonhape, 30

EE - EP1615952 B1 31

aminoheptaanhape, aminoisobutüürhape, aminopimelhape, diaminobutüürhape,

desmosiin (desmosine), diaminopimelhape, diaminopropioonhape, N-etüülglütsiin,

N-etüülaspargiin, hüdroksülüsiin allo-hüdroksülüsiin, hüdroksüproliin,

isodesmosiin, allo-isoleutsiin, N-metüülglütsiin, sarkosiin, N-metüülisoleutsiin, N-

metüülvaliin, norvaliin, norleutsiin, oritiin, 4-hüdroksüproliin, γ-karboksüglutamaat, 5

ε-N,N,N-trimetüüllüsiin, ε-N-atsetüüllüsiin, O-fosfoseriin, N-atsetüülseriin, N-

formüülmetioniin, 3-metüülhistidiin, 5-hüdroksülüsiin, σ-N-metüülarginiin ning

teised sarnased aminohapped ja aminohapped (nt 4-hüdroksüproliin).

Samuti, kui ei ole teisiti öeldud, siis ühekiulise polünukleotiidi järjestuste

vasakpoolne ots on 5’ ots; kahekiulise polünukleotiidi järjestuste vasakpoolset 10

suunda nimetatakse 5’ suunaks. Tärkava RNA transkriptide 5’ kuni 3’ lisanduste

suunda nimetatakse transkriptisooni suunaks; järjestuste piirkondi DNA kiul, millel

on samasugune järjestus nagu DNA-l ning mis on RNA transkripti 5’ kuni 5’

otsaga, nimetatakse „vastassuunalisteks järjestusteks“; järjestuse piirkondi DNA-l,

millel on sama järjestus nagu RNA-l ja mis on RNA transkripti 3’ kuni 3’ otsaga, 15

nimetatakse „pärisuunalisteks järjestusteks“.

On mõistetav, et aminohappe jääke saab nende ühiste kõrvalahela omaduste

põhjal jagada klassidesse:

1. neutraalsed hüdrofoobsed: alaniin (Ala; A), valiin (Val; V), leutsiin (Leu;

L), isoleutsiin (Ile; I), proliin (Pro; P), trüptofaan (Trp; W), fenüülalaniin (Phe; 20

F) ja metioniin (Met, M).

2. neutraalsed polaarsed: glütsiin (Gly; G); seriin (Ser; S), treoniin (Thr; T),

türosiin (Tyr; Y), tsüsteiin (Cys; C), glutamiin (Glu; Q), aspargiin (Asn; N) ja

norleutsiin.

3. happelised: asparagiinhape (Asp; D), glutamiinhape (Glu; E); 25

4) aluselised: lüsiin (Lys; K), arginiin (Arg; R), histidiin (His; H).

Vaata Lewin, B., Genes V, Oxford University Press (1994), lk 11.

Konservatiivsete aminohappe asenduste seas võivad olla mittetavapärased

aminohappe jäägid, mis lisatakse tavaliselt pigem peptiidi keemilise sünteesiga kui

sünteesiga bioloogilistes süsteemides. Nende seas on muuhulgas 30

EE - EP1615952 B1 32

peptidomimeetikumid ja aminohappe osade vastupidised või ümberpööratud

kujud. Mittekonservatiivsed asendused võivad hõlmata nendest klassidest ühe

liikme väljavahetamist teise klassi liikme vastu.

Taoliste muudatuste tegemisel võib arvestada aminohapete hüdropaatilist indeksi

(hydropathic index). Igale aminohappele on määratud hüdropaatiline indeks selle 5

hüdrofoobsuse ja laengu omaduste põhjal. Nendeks on: isoleutsiin (+4,5), valiin

(+4,2), leutsiin (+3,8), fenüülalaniin (+2,8), tsüsteiin/tsüstiin (+2,5), metioniin (+1,9),

alaniin (+1,8), glütsiin (- 0,4), treoniin (-0,7), seriin (-0,8), trüptofaan (-0,9), türosiin

(-1,3), proliin (-1,6), histidiin (-3,2), glutamaat (-3,5), glutamiin (-3,5), aspartaat (-

3,5), asparagiin (-3,5), lüsiin (-3,9) ja arginiin (-4,5). 10

Antud valdkonnas tuntakse hüdropaatilise aminohappe indeksi olulisust

bioloogilise funktsiooni pakkumisel proteiinile. Kyte et al, J. Mol. Biol., 157:105-131

(1982). On teada, et teatud aminohappeid võib asendada mõne teise

aminohappega, millel on sarnane hüdropaatiline indeks või näitaja, kuid säilitada

sarnast bioloogilist toimet. Hüdropaatilise indeksi põhjal muudatuste tegemisel 15

võib kaasata aminohapete asendused, mille hüdropaatilised indeksid on

vahemikus ±2. Kaasata võib ka neid, mis on vahemikus ±1, ning neid, mis on

vahemikus ±0,5.

Samuti on antud valdkonnas mõistetav, et sarnaste aminohapete asendust saab

tõhusalt teha hüdrofiilsuse põhjal, eriti kus sedasi loodud bioloogiliselt 20

funktsionaalne peptikeha või peptiid on mõeldud immunoloogilistes variantides

kasutamiseks, nagu on see käesoleval juhul. Teatud variantides korreleerub valgu

suurim kohalik keskmine hüdrofiilsus, nagu määravad nende kõrvalasuvate

aminohapete hüdrofiilsus, selle immunogeensuse ja antigeensusega, st valgu

bioloogilise omadusega. 25

Järgnevad hüdrofiilsuse väärtused on määratud nendele aminohappe jääkidele:

arginiin (+3,0), lüsiin (+3,0), aspartaat (+3,0±1), glutamaat (+3,0±1), seriin (+0,3),

asparagiin (+0,2), glutamiin (+0,2), glütsiin (0), treoniin (-0,4), proliin (-0,5±1),

alaniin (-0,5), histidiin (-0,5), tsüsteiin (-1,0), metioniin (-1,3), valiin (-1,5), leutsiin (-

1,8), isoleutsiin (-1,8), türosiin (-2,3), fenüülalaniin (-2,5) ja trüptofaan (-3,4). 30

Sarnaste hüdrofiilsuse väärtuse põhjal muudatuste tegemisel võib kaasata

EE - EP1615952 B1 33

aminohapete asendused, kus hüdrofiilsuse väärtused võivad olla vahemikus ±2,

need, mis võivad olla vahemikus ±1, ning need, mis on vahemikus ±0,5. Samuti

võib epitoope primaarsete aminohappe järjestustest tuvastada hüdrofiilsuse

põhjal. Neid piirkondi nimetatakse ka „epitoopide tuumpiirkondadeks“.

Aminohappe asenduste näited on esitatud tabelis 2 allpool. 5

Tabel 2

Aminohappe asendused

Algsed jäägid Asenduste näidised Eelistatud asendused

Ala Val, Leu, Ile Val

Arg Lys, Gln, Asn Lys

Asn Gln, Glu, Asp Gln

Asp Glu, Gln, Asp Glu

Cys Ser, Ala Glu

Gln Asn, Glu, Asp Asn

Glu Asp, Gln, Asn Asp

Gly Pro, Ala Ala

His Asn, Gln, Lys, Arg Arg

Ile Leu, Val, Met, Ala, Phe,

norleutsiin

Leu

Leu Norleutsiin, Ile, Val, Met,

Ala, Phe

Ile

Lys Arg, 1,4 diamino-

butüürhape, Gln, Asn

Arg

Met Leu, Phe, Ile Leu

Phe Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Leu

Pro Ala Gly

Ser Thr, Ala, Cys Thr

Thr Ser Ser

Trp Tyr, Phe Tyr

Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe

Val Ile, Met, Leu, Phe, Ala,

norleutsiin

Leu

EE - EP1615952 B1 34

Antud valdkonnas pädev isik suudab teadaolevate võtetega välja selgitada

polüpeptiidi sobivad variandid, nagu on siin esitatud. Antud valdkonnas pädev

isiku oskab tuvastada molekulide sobivad piirkonnad, mida võib aktiivsust

hävitamata muuta, sihtides piirkondi, mida ei peeta aktiivsuse jaoks oluliseks.

Tuvastada saab molekulide jäägid ja osad, mida säilitatakse sarnaste peptiidide 5

või polüpeptiidide seas. Isegi piirkonnad, mis on bioloogiliseks aktiivsuseks või

struktuuriks olulised, võivad läbida konservatiivseid aminohappe asendusi

bioloogilist aktiivsust hävitamata või polüpeptiidi struktuuri ebasoodsalt

mõjutamata.

Lisaks, antud valdkonnad pädev isik suudab analüüsida struktuuri-funktsiooni 10

uuringuid, mis tuvastavad jääke sarnastes polüpeptiidides, mis on aktiivsuse või

struktuuri jaoks olulised. Taolise võrdluse valguses on võimalik prognoosida

aminohappe jääkide olulisust proteiinis, mis vastab sarnastes proteiinides

aktiivsuse või struktuuri jaoks olulistele aminohappe jääkidele. Antud valdkonnas

pädev isik võib valida keemiliselt sarnased aminohappe asendused taoliste 15

prognoositud oluliste aminohappe jääkide jaoks.

Antud valdkonnas pädev isik oskab ka analüüsida kolmedimensioonilist struktuuri

ja aminohappe järjestust selle struktuuriga seoses sarnastes polüpeptiidides.

Taolise informatsiooni valguses võib antud valdkonnas pädev isik prognoosida

antikeha aminohappe jääkide järjestust selle kolmedimensioonilise struktuuriga 20

seoses. Antud valdkonnas pädev isik võib otsustada mitte teha radikaalseid

muudatusi aminohappe jääkidele, mis eeldatavasti on proteiini pinnal, kuna

taolised jäägid võivad osaleda olulistes toimingutes teiste molekulidega. Lisaks

võib antud valdkonnas pädev isik luua testvariandid, mis sisaldavad üksiku

aminohappe asendust igal soovitud aminohappe jäägil. Seejärel võib variante 25

uurida antud valdkonnas pädevatele isikutele teada aktiivsusanalüüsidega. Taolisi

variante saab kasutada sobivate variantide kohta informatsiooni kogumiseks. Kui

näiteks avastatakse, et konkreetse aminohappe jäägile tehtud muudatuse

tagajärjel hävines, soovimatult vähenes või tekkis soovimatu aktiivsus, võib taolise

muutusega variante vältida. Teisisõnu, taoliste tavapäraste katsetega kogutud 30

informatsiooni põhjal võib antud valdkonnas pädev isik lihtsalt tuvastada

EE - EP1615952 B1 35

aminohapped, kus lisaasendusi eraldi või koos teiste mutatsioonidega tuleks

vältida.

Terve hulk teaduspublikatsioone on pühendatud sekundaarstruktuuri

prognoosimisele. Vaata Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou

et al, Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou et al, Biochemistry, 113(2): 211-5

222 (1974); Chou et al, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978);

Chou et al, Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 ning Chou et al, Biophys. J., 26:367-

384 (1979). Lisaks on praegu kättesaadavad ka arvutiprogrammid, et

sekundaarstruktuuri prognoosimisele kaasa aidata. Üks moodus

sekundaarstruktuuri prognoosimiseks põhineb homoloogia mudeldamisel. Näiteks 10

kahel polüpeptiidil või valgul, mille järjestuse identsus on suurem kui 30% või

sarnasus suurem kui 40%, on sageli sarnased strukturaalsed topoloogiad.

Valkude strukturaalse andmebaasi (PDB) hiljutine areng on võimaldanud

sekundaarstruktuuri paremat prognoositavust, sealhulgas voltide potentsiaalne arv

polüpeptiidis või valgu struktuuris. Vaata Holm et al, Nucl. Acid. Res., 27(1): 244-15

247 (1999). On soovitatud (Brenner et al, Curr. Op. Struct. Biol., 7(3): 369-376

(1997)), et teatud polüpeptiidis või valgus on piiratud arv volte ning kui jõutakse

struktuuride kriitilise numbrini, on strukturaalne prognoosimine tunduvalt täpsem.

Sekundaarstruktuuri prognoosimise lisameetodid hõlmavad „keermestamist“

(threading) (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al, 20

Structure, 4(1):15-19 (1996)), „profiili analüüsi“ (Bowie et al, Science, 253:164-170

(1991); Gribskov et al, Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov et al, Proc.

Nat. Acad. Sci., 84(13):4355-4358 (1987)) ning „evolutsioonilist sidet“ (vaata Holm,

supra (1999), ja Brenner, supra (1997)).

Teatud variantides on peptikeha teisendite seas glükosüleerimise variandid, milles 25

peptikehale on lisatud üks või mitu glükosüleerimise kohta nagu N-seotud

glükosüleerimise koht. N-seotud glükosüleerimise kohale on iseloomulik järjestus:

Asn-X-Ser või Asn-X-Thr, kusjuures aminohappe jääk tähistusega X võib olla mis

tahes aminohappe jääk, välja arvatud proliin. Aminohappe jääkide asendamine või

lisamine selle järjestuse loomiseks võimaldab potentsiaalset uut kohta N-seotud 30

süsivesiku ahela lisamiseks. Teisel juhul asendused, mis selle järjestuse

elimineerivad, eemaldavad olemasoleva N-seotud süsivesiku ahela. Samuti

EE - EP1615952 B1 36

pakutakse ümberseatud N-seotud süsivesiku ahelaid, kus üks või mitu N-seotud

glükosüleerimise kohta (tavaliselt need, mis esinevad looduslikult) on elimineeritud

või luuakse üks või mitu uut N-seotud kohta.

Leiutis pakub ka „derivaate“, mille seas on peptikehad, millel on modifikatsioonist

erinevad või sellele lisanduvad aminohappe jääkide täiendused, kustutused või 5

asendused. Soovitatavalt on modifikatsioonid iseloomult kovalentsed ja hõlmavad

näiteks keemilist sidet polümeeride, lipiidide, teiste orgaaniliste ja anorgaaniliste

osadega. Leiutise derivaate võib valmistada peptikeha tsirkuleeriva poolestusea

tõstmiseks või luua peptikeha sihtimisvõime täiustamiseks soovitud rakkudele,

kudedele või organitele. 10

Näidisderivaatide seas on osad, milles on tehtud üks või mitu järgnevat

modifikatsiooni:

• üks või mitu peptidüüli [-C(O)NR-] ühendust (sidet) on asendatud mitte-

peptidüüli ühendusega nagu -CH2-karbamaadi ühendus [-CH2-OC(O)NR-],

fosfonaadi ühendus, -CH2- sulfoonamiidi [-CH2-S(O)2NR-] ühendus, uurea [-15

NHC(O)NH-] ühendus, -CH2-sekundaarse amiini ühendus või alküülitud

peptidüüli ühenduse [-C(O)NR6-, kus R6 on madalam alküül];

• peptiidid, kusjuures N-ots on derivatiseeritud -NRR1 rühmale, -NRC(O)R

rühmale, -NRC(O)OR rühmale, -NRS(O)2R rühmale, -NHC(O)NHR

rühmale, kus R ja R1 on vesinik või madalam alküül tingimusel, et R ja R1 ei 20

ole mõlemad vesinik; suktsiinimiidi rühmale, bensüüloksükarbonüül-NH-

rühmale, millel on 1 kuni 3 asendajat fenüülringil, mis valitakse rühmast,

kuhu kuuluvad madalam alküül, madalam alkoksü, kloor ja broom; ning

• peptiidid, kusjuures vaba C-ots derivatiseeritakse -C(O)R2-le, kus R2

valitakse rühmast, kuhu kuuluvad madalam alkoksü, ja -NR3R4-le, kus R3 ja 25

R4 valitakse iseseisvana rühmast, kuhu kuuluvad vesinik ja madalam alküül.

„Madalam“ all on mõeldud rühma, millel on 1 kuni 6 süsiniku aatomit.

Lisaks võib leiutise polüpeptiididel või koostistel rakendada individuaalsete

aminohapete modifikatsioone, pannes sihtmärgist peptiidi aminohappe jäägid

EE - EP1615952 B1 37

reageerima orgaanilise derivatiseeriva ainega, mis suudab valitud kõrvalahelaga

või terminaaljääkidega reageerida. Järgnev on näidis:

Lüsinüüli ja amino terminaalsed jäägid võib panna reageerima suktsiin- või teiste

karboksüülhappe anhüdriididega. Nende ainetega derivatiseerimise toimel

pöördub ümber lüsinüüli jääkide laeng. Alfa-aminot sisaldavate jääkide 5

derivatiseerimiseks mõeldud teiste sobivate reagentide seas on imidoestrid nagu

metüül-pikoliinimidaat (methyl picolinimidate), püridoksaal-fosfaat, püridoksaal,

kloroboorhüdriid, trinitrobenseensulfoonhape, O-metüüliso-uurea, 2,4-

pentaandioon ja transaminaas-katalüüsitud reaktsioon glüoksülaadiga.

Arginüüli jääke võib modifitseerida ühe või mitme tavapärase reagendiga 10

reageerimisel, nende hulgas fenüülglüoksaaliga, 2,3-butaandiooniga, 1,2-

tsükloheksaandiooniga ja ninhüdriiniga. Arginiini jääkide derivatiseerimine eeldab,

et guanidiini funktsionaalrühma kõrge pKa tõttu toimuks reaktsioon aluselisteks

tingimustes. Lisaks võib neid reagente panna ka reageerima nii lüsiini rühmade kui

ka arginiini guanidino-rühmaga. 15

Türosüüli jääkide konkreetset modifikatsiooni iseennast on laialdaselt uuritud, kus

erilise huvi all on olnud spketraalmärgiste kasutamine türosüüli jääkides

aromaatsete diasooniumühenditega või tetranitrometaaniga reageerimisel. Kõige

sagedamini võib kasutada N-atsetüülimidasooli ja tetranitrometaani, et

moodustada vastavalt O-atsetüül-türosüüli liike ja 3-nitro derivaate. 20

Karboksüül-kõrvalrühmi (aspartüül või glutamüül) võib selektiivselt modifitseerida

karbodiimiididega (R’=N=C=N-R’) nagu 1-tsükloheksüül-3-(2-morfolinüül-(4-etüül)

karbodiimiid või 1-etüül-3-(4-asoonia-4,4-dimetüülpentüül) karbodiimiid

reageerimisel. Lisaks võib aspartüüli ja glutamüüli jäägid asparginüüli ja

glutaminüüli jääkideks konverteerida ammooniumioonidega reageerimisel. 25

Glutaminüüli ja asparginüüli jäägid deamideeritakse sageli vastavateks glutamüüli

ja aspartüüli jääkideks. Teisel juhul võib need jäägid deamideerida mõõdukalt

happelistes tingimustes. Nende jääkide kumbki vorm jääb antud leiutise ulatusse.

Bifunktsionaalsete ainetega derivatiseerimine on kasulik peptiidi või nende

funktsionaalsete derivaatide ristsidumiseks veeslahustuvaks tugimaatriksiks või 30

EE - EP1615952 B1 38

teisteks makromolekulaarseteks kanduriteks. Tavaliselt kasutatavate ristsiduvate

ainete seas on nt 1,1-bis(diasoatsetüül)-2-fenüületaan, glutaaraldehüüd, N-

hüdroksüsuktsiinimiidi estrid, näiteks 4-asidosalitsüülhappega estrid,

homobifunktsionaalsed imidoestrid, sealhulgas disuktsiinimidüüli estrid nagu 3,3’-

ditiobis (suktsiinimidüülpropionaat) ning bifunktsionaalsed maleimiidid nagu bis-N-5

maleimido-1,8-oktaan. Derivatiseerivad ained nagu metüül-3-[(p-asidofenüül)

ditio]propioimidaat annavad saaduseks fotoaktiveeritavad (photoactivatable)

vahesaadused, mis suudavad valguse juuresolekul ristsidemeid moodustada.

Teisel juhul võib proteiinide immobiliseerimiseks rakendada reaktiivseid

veeslahustuvaid matriitse nagu tsüanogeen bromiidiga aktiveeritud süsivesikud ja 10

reaktiivsed substraadid, mida on kirjeldatud USA patentides nr 3,969,287,

3,691,016, 4,195,128, 4,247,642, 4,229,537 ja 4,330,440.

Teiste võimalike modifikatsioonide seas on proliini ja lüsiini hüdroksüülimine,

serüül- või treonüül-jääkide hüdroksüülrühmade fosforüülimine, väävliaatomi

oksüdeerimine Cys sees, lüsiini, arginiini ja histidiini kõrvalahelate 15

alfaaminorühmade metüüli (Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecule

Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, lk 79-86 (1983)), N-terminaalse

amiini atsetüülimine ning mõnel juhul ka C-terminaalsete karboksüülrühmade

amideerimine.

Taolised derivatiseeritud osad soovitatavalt parandavad ühendite ühte või mitut 20

omadust, sealhulgas anti-angioneenset toimet, lahustuvust, absorptsiooni,

bioloogilist poolestusiga ja muud sarnast. Alternatiivselt võivad derivatiseeritud

osad anda ühendeid, millel on samad või põhiliselt samad tunnused ja/või

omadused nagu derivatiseerimata ühendil. Antud osad võivad teisel juhul ühendite

ja muu sarnase mis tahes ebasoodsad kõrvalmõjud kõrvaldada või neid 25

nõrgestada.

Käesoleva leiutise ühendeid võib muuta ka DNA tasemel. Ühendi mis tahes osa

DNA järjestust võib muuta koodoniteks, mis valitud peremeesrakuga paremini

ühtivad. Eelistatava peremeesraku E. coli jaoks teatakse optimeeritud koodoneid.

Koodoneid võib asendada, et eemaldada restriktsioonisaite või kaasata vaikivaid 30

restriktsioonisaite, mis võivad valitud peremeesrakus DNA töötlemisel abiks olla.

Kanduri, linkeri ja peptiidi DNA järjestusi võib modifitseerida, et need hõlmaks mis

EE - EP1615952 B1 39

tahes eelnevaid järjestuse muutusi. Järelikult kehtivad kõik siin käsitletud

modifikatsioonid, asendused, derivatiseerimised jne võrdselt käesoleva leiutise

kõikide aspektidega, muuhulgas peptiididele, peptiidi dimeeride ja multimeeride,

linekrite ja kanduritega.

Lisaks võib antud valdkonnas pädev isik vaadata struktuuri-funktsiooni uuringuid, 5

mis tuvastavad aktiivsuse või struktuuri jaoks olulisi jääke sarnastes peptiidides.

Taolise võrdluse valguses on võimalik prognoosida peptiidis aminohappe jääkide

olulisust, mis vastavad sarnastes peptiidides aktiivsuse või struktuuri jaoks olulisi

aminohappe jääkidele. Antud valdkonnas pädev isik võib peptiidide taolise

prognoositud oluliste aminohappe jääkide jaoks valida keemiliselt sarnase 10

aminohappe asendused.

Antud valdkonnas pädev isik võib analüüsida ka kolmedimensioonilist struktuuri ja

aminohappe järjestust seoses struktuuriga sarnastes polüpeptiidides. Antud

informatsiooni valguses võib antud valdkonnas pädev isik prognoosida peptiidi

aminohappe jääkide järjestust selle kolmedimensioonilise struktuuri suhtes. Antud 15

valdkonnas pädev isik võib otsustada mitte teha radikaalseid muudatusi

aminohappe jääkidele, mis prognoositult on proteiini pinnal, kuna taolised jäägid

võivad osaleda olulistes interaktsioonides teiste molekulidega. Lisaks võib antud

valdkonnas pädev isik koostada testvariante, mis sisaldavad üksiku aminohappe

asendust igal soovitud aminohappe jäägil. Variante võib uurida antud valdkonnas 20

pädevatele isikutele teadaolevate aktiivsusanalüüsidega. Taolisi andmeid võib

kasutada informatsiooni kogumiseks sobivate variantide kohta. Näiteks kui

avastatakse, et konkreetsele aminohappe jäägile tehtud muudatuse tulemuseks oli

hävitatud, ebasoodsalt alanenud võib sobimatu toime, tuleks taolise muudatusega

variante vältida. Teisisõnu, taoliste tavapäraste katsetega kogutud informatsiooni 25

põhjal saab antud valdkonnas pädev isik lihtsalt tuvastada aminohapped, kus

täiendavaid asendusi eraldi või koos teiste mutatsioonidega tuleks vältida.

Hulga teaduslikke publikatsioone on pühendatud sekundaarstruktuuri

prognoosimisele. Vaata Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4): 422-427 (1996), Chou

et al, Biochemistry, 13(2): 222-245 (1974); Chou et al, Biochemistry, 113(2): 211-30

222 (1974); Chou et al, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47: 45-148 (1978);

Chou et al, Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276 ning Chou et al, Biophys. J., 26: 367-

EE - EP1615952 B1 40

384 (1979). Veelgi enam, praegu on kättesaadavad ka arvutiprogrammid, et aidata

kaasa sekundaarstruktuuri prognoosimisele. Üks moodus sekundaarstruktuuri

prognoosimiseks põhineb homoloogia modelleerimisel. Näiteks kahel polüpeptiidil

või valgul, mille järjestuse identsus on suurem kui 30% või sarnasus suurem kui

40%, on sageli sarnased strukturaalsed topoloogiad. Valkude strukturaalse 5

andmebaasi (PDB) hiljutine areng on võimaldanud sekundaarstruktuuri paremat

prognoositavust, sealhulgas voltide potentsiaalne arv polüpeptiidis või valgu

struktuuris. Vaata Holm et al, Nucl. Acid. Res., 27(1): 244-247 (1999). On

soovitatud (Brenner et al, Curr. Op. Struct. Biol., 7(3): 369-376 (1997)), et teatud

polüpeptiidis või valgus on piiratud arv volte ning kui jõutakse struktuuride kriitilise 10

numbrini, on strukturaalne prognoosimine tunduvalt täpsem.

Sekundaarstruktuuri prognoosimise lisameetodid hõlmavad „keermestamist“

(threading) (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3): 377-87 (1997); Sippl et al,

Structure, 4(1): 15-19 (1996)), „profiili analüüsi“ (Bowie et al, Science, 253:164-

170 (1991); Gribskov et al, Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov et al, 15

Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13): 4355-4358 (1987)) ning „evolutsioonilist sidet“ (vaata

Holm, supra (1999), ja Brenner, supra (1997)).

Leiutis hõlmab ka veel tuletatud spetsiifilisi sideaineid, nt peptikehasid, mis on

kovalentselt modifitseeritud, et need sisaldaks ühte või mitut vees lahustuvat

polümeerühendust nagu polüetüleenglükool, polüoksüetüleenglükool või 20

polüpropüleenglükool, nagu on kirjeldatud USA patentides nr: 4,640,835,

4,496,689, 4,301,144, 4,670,417, 4,791,192 ja 4,179,337. Ent teiste antud

valdkonnas kasulike polümeeride seas on monometoksü-polüetüleenglükool,

dekstraan, tselluloos või teised süsivesikupõhised polümeerid, polü-(N-vinüül

pürrolidoon)-polüetüleenglükool, propüleenglükooli homopolümeerid, 25

polüproüleenoksiidi/ etüleenoksiidi kopolümeer, polüoksüetüülitud polüoolid (nt

glütserool) ja polüvinüülalkoholid ning nende polümeeride segud. Eriti eelistatud

on polüetüleenglükooli (PEG) allüksustega kovalentselt modifitseeritud

peptikehad. Veeslahustuvad polümeerid võivad olla seotud teatud positsioonidel,

näiteks peptikehade amino-otsal, või suvaliselt kinnitunud polüpeptiidi ühele või 30

mitmele kõrvalahelale. PEG-i kasutamist terapeutilise võime tõstmiseks

spetsiifiliste sideainete, nt peptikehade ning eriti humaniseeritud antikehade jaoks

EE - EP1615952 B1 41

on kirjeldatud USA patendis nr 6, 133, 426 Gonzalesele et al, väljastati 17.

oktoobril 2000.

Leiutis peab võimalikuks ka ühendite peptiidi ja/või kanduri portsjoni

derivatiseerimist. Taolised derivaadid võivad parandada ühendite lahustuvust,

absorptsiooni, bioloogilist pooliga ja muud sarnast. Osad võivad veel ka ühendite 5

ja muu sarnaste ebasoodsad kõrvalmõjusid kaotada või neid vähendada.

Näidisderivaatide seas on ühendid, kus:

1. Ühend või selle teatud osa on tsükliline. Näiteks võib peptiidi portsjonit

modifitseerida, et see sisaldaks kahte või rohkem Cys-i jääki (nt linkeris),

mida saaks disulfiidi sideme moodustamisega tsükliliseks teha. 10

2. Ühend on ristseotud või tehtud selliseks, et see suudab molekulide vahel

ristsiduda. Näiteks võib peptiidi portsjonit modifitseerida, et see sisaldaks

ühte Cys-i jääki ning seeläbi suudaks sarnase molekuliga

molekulidevahelise disulfiidi sideme moodustada. Ühend võib ka selle C-

otsa kaudu ristseotud olla. 15

3. Üks või mitu peptidüüli [-C(O)NR-] ühendust (sidet) on asendatud mitte-

peptidüüli sidemega. Mitte-peptidüüli ühenduste näited on -CH2-karbamaat

[-CH2-OC(O)NR-], fosfonaat, -CH2-sulfoonamiid [-CH2-S(O)2NR-], uurea [-

NHC(O) NH-], -CH2-sekundaarne amiin ning alküülitud peptiid [-C(O)NR6-,

kus R6 on madalam alküül]. 20

4. N-ots on derivatiseeritud. Tavaliselt võib N-ots olla atsüülitud või

modifitseeritud asendatud amiiniks. N-terminaalsete tuletatud rühmade

näidete seas on -NRR1 (erineb -NH2-st), -NRC(O)R1, -NRC(O)OR1,-

NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR1, suktsiinimiid või bensüüloksükarbonüül-NH-

(CBZ-NH-), kusjuures R ja R1 on mõlemad sõltumatuna vesinik või 25

madalam alküül ning fenüülring võib olla asendatud 1 kuni 3 asendajaga,

mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad C1-C4alküül, C1-C4alkoksü, kloor ja

broom.

5. Vaba C-ots on derivatiseeritud. Tavaliselt on C-ots esterdatud või

amideeritud. Näiteks võib kasutada antud valdkonnas kirjeldatud 30

meetodeid, et antud leiutise ühenditele C-otsas lisada (NH-CH2-CH2-NH2)2.

EE - EP1615952 B1 42

Samamoodi võib kasutada antud valdkonnas kirjeldatud meetodeid, et

antud leiutise ühenditele C-otsas lisada -NH2. C-terminaalsete tuletatud

rühmade näidete seas on näiteks -C(O)R2, kusjuures R2 on madalam

alkoksü, või -NR3R4, kusjuures R3 ja R4 on sõltumatuna vesinik või C1-

C8alküül (soovitatavalt C1-C4alküül). 5

6. Disulfiidi side asendatakse teise, soovitatavalt tunduvalt stabiilsema

ristsiduva osaga (nt alküleen). Vaata nt Bhatnagar (supra); Alberts et al,

Thirteenth Am. Pep. Symp., 357-9 (1993).

7. Üks või mitu individuaalset aminohappe jääki on modifitseeritud. Mitmed

derivatiseerivad ained teadaolevalt reageerivad spetsiaalselt valitud 10

kõrvalahelate või terminaalsete jääkidega, nagu on allpool üksikasjalikumalt

kirjeldatud.

Lüsinüüli jääke ja amino-terminaalseid jääke võib panna reageerima suktsiin- või

teiste karboksüülhappe anhüdriididega, mis lüsinüüli jääkide laengu ümber

pööravad. Alfa-aminot sisaldavate jääkide derivatiseerimiseks mõeldud teiste 15

sobivate reagentide seas on imidoestrid nagu metüül pikoliinimidaat,

püridoksaalfosfaat, püridoksaal, kloroboorhüdriid, trinitrobenseensulfoonhape, O-

metüül-isouurea, 2,4 pentaandioon ning tramsaminaas-katalüüsitud reaktsioon

glüoksülaadiga.

Arginüüli jääke võib modifitseerida reageerimisel ühe või koos mitme tavapärase 20

reagendiga, sealhulgas fenüülglüoksaaliga, 2,3-butaandiooniga, 1,2-

tsükloheksaandiooniga ja ninhüdriiniga. Arginüüli jääkide derivatiseerimine eeldab,

et reaktsioon toimuks guanidiini funktsionaalrühma kõrge pKa tõttu aluselistes

tingimustes. Lisaks võivad need reagendid reageerida nii lüsiini rühmade kui ka

arginiini epsilon-amino rühmaga. 25

Türosüüli jääkide spetsiifilist modifikatsiooni on laialdaselt uuritud, kus erilise huvi

all on olnud türosüüli jääkidel spektraalmärgiste kasutamine aromaatsete

diasoonium ühendite või tetranitrometaaniga reageerimisel. Enamasti kasutatakse

N-atsetüülimidasooli ja tetranitrometaani, et moodustada vastavalt O-

atsetüültürosüüli erimeid ja 3-nitro derivaate. 30

EE - EP1615952 B1 43

Karboksüül-kõrvalahela rühmi (aspartüül või glutamüül) võib selektiivselt

modifitseerida karbodiimiididega (R’-N=C=N-R’) reageerimisel nagu 1-

tsükloheksüül-3-(2-morfolinüül-(4-etüül)karbodiimiid või 1-etüül-3-(4-asoonia-4,4-

dimetüülpentüül)karbodiimiid. Lisaks võib aspartüüli ja glutamüüli jäägid

ammooniumioonidega reageerimisel asparginüüli ja glutaminüüli jääkideks 5

konverteerida.

Glutaminüüli ja asparginüüli jäägid võib deamideerida vastavateks glutamüüli ja

aspartüüli jääkideks. Teisel juhul amideeritakse need jäägid mõõdukalt happelistes

tingimustes. Nende jääkide kumbki vorm langeb antud leiutise ulatusse.

Tsüsteinüüli jääke saab asendada aminohappe jääkide või teiste osadega, et kas 10

elimineerida disulfiidi side või, vastupidi, stabiliseerida ristsidet. Vaata nt

Bhatnagar, (supra).

Derivatiseerimine bifunktsionaalsete ainetega on tõhus peptiidide või nende

funktsionaalderivaatide ristsidumisel vees lahustumatuks tugimaatriksiks või

teisteks makromolekulaarseteks kanduriteks. Tavaliselt kasutatavate ristisiduvate 15

ainete seas on nt 1,1-bis(diasoatsetüül)-2-fenüületaan, glutaaraldehüüd, N-

hüdroksüsuktsiinimiidi estrid, näiteks 4-asidosalitsüülhappega estrid,

homobifunktsionaalsed imidoestrid, sealhulgas disuktsiinimidüülestrid nagu 3,3’-

ditiobis(suktsiinimidüülpropionaat) ning bifunktsionaalsed maleimiidid nagu bis-N-

maleimido-1,8-oktaan. Derivatiseerivad ained nagu metüül-3-[(p-20

asidofenüül)ditio]propioimidaat annavad saaduseks fotoaktiveeritavaid

vahesaaduseid, mis suudavad valguse juuresolekul ristsidemeid moodustada.

Teisel juhul rakendatakse proteiini immobiliseerimiseks reaktiivseid

veelahustumatuid matriitse nagu tsüanogeen-bormiidiga aktiveeritud süsivesikud

ja reaktiivseid subtraate, mida on kirjeldatud USA patentides nr 3,969,287, 25

3,691,016, 4,195,128, 4,247,642, 4,229,537 ja 4,330,440.

Süsivesiku (oligosahhariidi) rühmasid võib lihtsalt kinnitada kohtadele, mis

teadaolevalt on glükosüleerimiskohad proteiinides. Tavaliselt kinnitatakse O-

seotud oligosahhariidid seriini (Ser) või treoniini (Thr) jääkidele, samas kui N-

seotud oligosahhariidid kinnitatakse asparagiini (Asn) jääkidele, kui need on osa 30

Asn-X-Ser/Thr järjestusest, kus X võib olla mis tahes aminohape, välja arvatud

EE - EP1615952 B1 44

proliin. X on soovitatavalt üks 19 looduslikult esinevast aminohappest, välja

arvatud proliin. N-seotud ja O-seotud oligosahhariidide ning igas tüübis leiduvate

suhkrujääkide struktuur on erinev. Üht liiki suhkur, mida tavaliselt kummaski

leidub, on N-atsetüül-neuraminiinhape (nimega siaalhape). Siaalhape on tavaliselt

nii N-seotud kui ka O-seotud oligosahhariidide terminaalne jääk ning tänu oma 5

negatiivsele laengule võib see glükosüülitud ühendile happelisi omadusi anda.

Taolise(i) koha(ti) võib lisada antud leiutise ühendite linkeritele ning soovitatavalt

on need polüpeptiidi ühendite (nt rakkudes nagu CHO, BHK, COS) rekombinantse

tootmise käigus raku poolt glükosüülitud. Käesolevaid taolisi kohti võib veel

glükosüülida antud valdkonnas teadaolevate sünteetiliste või poolsünteetiliste 10

protseduuridega.

Teiste võimalike modifikatsioonide seas on proliini ja lüsiini hüdroksüülimine,

serüüli või treonüüli jääkide hüdroksüülrühmade fosforüülimine, väävliaatomi

oksüdeerimine Cys-i sees ning lüsiini, arginiini ja histidiini kõrvalahelate alfa-amino

rühmade metüülimine [Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. 15

H. Freeman & Co., San Francisco), lk 79-86 (1983)].

Käesoleva leiutise ühendeid võib ka DNA tasemel muuta. Ühendi mis tahes osa

DNA järjestust võib muuta koodoniteks, mis valitud peremeesrakuga paremini

ühtivad. Eelistatava peremeesraku E. coli jaoks optimeeritud koodonid on antud

valdkonnas teada. Koodoneid võib asendada, et eemaldada restriktsioonisaite või 20

kaasata vaikivaid restriktsioonisaite, mis võivad valitud peremeesrakus DNA

töötlemisel abiks olla. Kanduri, linkeri ja peptiidi DNA järjestusi võib modifitseerida,

et need hõlmaks mis tahes eelnevaid järjestuse muutusi.

Afiinsuse küpsemine

Käesoleva leiutise teatud variant hõlmab „afiinsusküpseid“ peptiide ja 25

peptikehasid. Antud protseduur peab võimalikuks käesoleva leiutise peptiidide ja

peptikehade afiinsuse või bioaktiivsuse tõstmist faagmeetodi või teiste

selekteerimisvõtete abil. Konsensusjärjestuse (mis luuakse seotud peptiidide

kogumi jaoks) põhjal saab luua suunatud sekundaarsed faagmeetodi kogumid,

milles „tuum“-aminohappeid (mis on tuvastatud konsensusjärjestusest) hoitakse 30

konstantsetena või need on esinemissageduses nihkes. Teisel juhul saab

EE - EP1615952 B1 45

kasutada individuaalset peptiidi järjestust, et luua nihkes suunatud faagmeetodi

kogum. Taoliste kogumite pesemine (panning) võib anda täiustatud seotusega

Ang-2-le või täiustatud bioaktiivsusega peptiidid (mida saab peptikehadeks

konverteerida).

Mitte-peptiidi analoogid/ proteiini mimeetikumid 5

Lisaks on võimalikuks peetud ka peptiidide mitte-peptiidi analooge, mis pakuvad

stabiliseeritud struktuuri või vähendatud biolagunemist. Peptiidi mimeetikumide

analooge saab valmistada valitud inhibeeriva peptiidi põhjal ühe või mitme jäägi

asendamisel mitte-peptiidi osadega. Soovitatavalt lasevad mitte-peptiidi osad

peptiidil säilitada oma looduslikku konformatsiooni või stabiliseerida eelistatud nt 10

bioaktiivset konformatsiooni, mis annab võime ära tunda ja siduda Ang-2. Teatud

aspektis on saadud analoogil/mimeetikumil suurem sidumisafiinsus Ang-2-le.

Peptiididest mitte-pepdiidi mimeetikumide analoogide valmistusmeetodi ühte

näidet on kirjeldanud Nachman et al, Regul. Pept. 57:359-370 (1995). Soovi korral

võib leiutise peptiide modifitseerida näiteks glükosüleerimise, amideerimise, 15

karboksüülimise või fosforüülimisega või leiutise peptiidide happe liitsoolade,

amiidide, estrite, eriti C-terminaalsete estrite ning N-atsüüli derivaatide

valmistamisel. Peptikehasid saab ka modifitseerida, et need peptiidide derivaate

looksid, moodustades kovalentseid või mittekovalentseid komplekse teiste

osadega. Kovalentselt seotud komplekse saab valmistada keemiliste osade 20

ühendamisel peptikehasid sisaldavatel aminohapete kõrvalahelatel või N- või C-

otsal olevate funktsionaalrühmadega.

Eeskätt eeldatakse, et peptiide saab konjugeerida reporterrühmale, muuhulgas

radiomärgistusele, fluorestseeruvale märgisele, ensüümile (nt sellele, mis

katalüüsib kolorimeetrilist või fluoromeetrilist reaktsiooni), substraadile, tahkele 25

maatriksile või kandjale (nt biotiin või avidiin). Seega pakub leiutis molekuli, mis

sisaldab peptikeha molekuli, kusjuures molekul hõlmab veel reporterrühma, mis on

valitud rühmast, kuhu kuuluvad radiomärgistus, fluorostseeruv märgis, ensüüm,

substraat, tahke maatriks ja kandur. Taolised märgistused on antud valdkonnas

pädevatele isikutele teada, nt biotiini märgiseid peetakse eriti võimalikuks. Antud 30

valdkonnas pädevad isikud teavad taoliste märgiste kasutamist ning seda on

kirjeldatud nt USA patentides nr 3,817,837, 3,850,752, 3,996,345 ja 4,277,437.

EE - EP1615952 B1 46

Teiste kasulike märgiste seas on muuhulgas radiomärgistused, fluorestseeruvad

märgised ja kemoluminestseeruvad märgised. Taolisi märgiseid puudutavate USA

patentide seas on näiteks patendid nr 3,817,837, 3,850,752, 3,939,350 ja

3,996,345. Käesoleva leiutise iga peptikeha võib sisaldada ühte, kahte või enamat

taolist märgistust. 5

Peptiidide valmistusmeetodid

Käesoleva leiutise peptiide saab luua mitmesuguseid antud valdkonnas

teadaolevaid võtteid kasutades. Näiteks saab taolisi peptiide lahuses või tahkes

tugiaines sünteesida vastavalt tavapärastele võtetele. Mitmesugused automaatsed

süntesaatorid on kommertsiaalselt kättesaadavad ning neid on võimalik kasutada 10

vastavalt teadaolevatele eeskirjadele. Vaata näiteks Stewart and Young (supra);

Tam et al, J. Am. Chem. Soc., 105:6442, (1983); Merrifield, Science 232:341-347

(1986); Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, toim.-d,

Academic Press, New York, 1-284; Barany et al, Int. J. Pep. Protein Res., 30:705-

739 (1987); ning USA patent nr 5,424,398, millest igaüks on siia viidetena 15

kaasatud.

Tahke faasi peptiidi sünteesimeetodid kasutavad kopolü(stüreendivinüülbenseeni),

mis sisaldab 0,1-1,0mM amiini/g polümeeri. Need peptiidi sünteesiks mõeldud

meetodid kasutavad alfa-amino rühmade butüüloksükarbonüüli (t-BOC) või 9-

fluorenüülmetüüloksükarbonüüli (FMOC) kaitset. Mõlemad meetodid hõlmavad 20

sammhaaval sünteese, millega igas etapis lisatakse üksik aminohape, alustades

peptiidi C-otsast (vaata Coligan et al, Curr. Prot. Immunol., Wiley Interscience,

1991, 9. peatükk). Keemilise sünteesi lõppemisel saab sünteetiliselt peptiidilt

kaitse eemaldada, et t-BOC või FMOC aminohapet blokeerivaid rühmi eraldada,

ning polümeerist lõhustada happega alandatud temperatuuril töötlemisel (nt vedel 25

HF-10% anisool umbes 0,25 kuni umbes 1 tundi temperatuuril 0 ˚C). Pärast

reagentide aurustumist ekstraktitakse peptiidid polümeerist 1%-lise äädikhappe

lahusega ning seejärel neid lüofiliseeritakse, et anda toormaterjal. Selle saab

tavaliselt puhastada võtetega nagu geelfiltreerimine Sephadex G-15 abil,

kasutades lahustina 5%-list äädikhapet. Kolonni sobivate fraktsioonide 30

lüofiliseerimine annab homogeensed peptiidid või peptiidi derivaadid, mida saab

seejärel eristada standardvõtetega nagu aminohappe analüüs, õhukese kihi

EE - EP1615952 B1 47

kromatograafia, kõrgkvaliteetne vedelkromatograafia, ultraviolett-

absorptsioonspektroskoopia, molaarne rotatsioon, lahustuvus ning kvantifitseerida

tahke faasi Edman lõhustamisega.

Teised meetodid nagu peptiidide valimine faagmeetodi kogust on samuti

kättesaadavad. Kogusid saab valmistada siin kirjeldatud aminohapete 5

komplektidest. Faagmeetod võib olla eriti tõhus vastavalt leiutisele kasulike

peptiidide tuvastamisel. Lühidalt, faagikogu valmistatakse (kasutades nt ml 13, fd

või lambda faagi), näidates lisasid alates 4 kuni 80 aminohappe jäägini. Lisandid

võivad tähistada näiteks täielikult degenereerunud või nihkes jada. Seejärel saab

valida faagi kandvad lisandid, mis soovitud antigeenile seonduvad. Seda protsessi 10

saab korrata soovitud antigeenile seonduva faagi mitme reselekteerimise tsükliga.

Kordusringid viivad faagi kandvate konkreetsete järjestuste rikastumiseni.

Teostada võib DNA järjestuste analüüsi, et ekspresseeritud peptiidide järjestust

tuvastada. Soovitud antigeenile seonduva järjestuse minimaalset lineaarset

portsjonit on võimalik kindlaks määrata. Protseduuri saab korrata nihkes 15

kogumiga, mis sisaldab lisandeid, milles on osa või kogu minimaalne lineaarne

portsjon ning selle üks või mitu lisa degenereerunud jäägi vastassuunda või

pärisuunda. Need võtted võivad tuvastada veel suurema sidumisafiinsusega Ang-

2-le leiutise peptiide kui siin juba tuvastatud ained.

Sõltumata peptiidide valmistusmeetodist, on võimalik luua iga taolist peptiidi ja 20

peptikeha kodeeriv nukleiinhappe molekul, kasutades rekombinantse DNA

standardprotseduure. Taolise DNA molekuli nukleotiidid järjestust saab vastavalt

vajadusele manipuleerida, muutmata nende poolt kodeeritavat aminohappe

järjestust, et põhjendada nukleiinhappe koodi degenereerumist ning koodoni

eelistust teatud peremeesrakkudes. 25

Rekombinantse DNA võtted moodustavad mugava meetodi käesoleva leiutise

täispikkuses peptikehade ja teiste suurte valguliste spetsiifiliste sideainete või

nende fragmentide valmistamiseks. Peptikeha või fragmenti kodeeriva DNA

molekuli võib lisada ekspressioonivektorisse, mille saab omakorda lisada

peremeesrakku, et antikeha või fragmenti toota. 30

EE - EP1615952 B1 48

Üldiselt on võimalik peptiidi või peptikeha kodeeriv DNA molekul saada

protseduuridega, mida on siin näidetes kirjeldatud. Proovid ja tüüpilised

hübridisatsiooni tingimused on need, nagu on esitanud Ausubel et al (Current

Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press). Pärast hübridisatsiooni

saab proovitud laigu pesta sobiva piiratusega, sõltuvalt taolistest faktoritest nagu 5

proovi suurus, proovi eeldatav homoloogia klooniga, vaadeldava kogu liik ning

vaadeldavate kloonide arv. Kõrgpiiranguga analüüside näited on 0,1xSSC ja 0,1

protsendimäär SDS temperatuurivahemikus 50-65 ˚C.

Kasutada võib ka pärmi kaksikhübriidi süsteemi skriinimismeetodeid, et tuvastada

leiutise peptiide, mis Ang-2-le seonduvad. Järelikult saab antigeeni või selle 10

fragmenti kasutada peptiidi kogude skriinimiseks, sealhulgas faagmeetodi kogud,

et tuvastada ja selekteerida käesoleva leiutise Ang-2 sideaineid, nt peptikehasid.

Teisel juhul võib rakendada tervet hulga ekspressiooni vektori/ peremeessüsteemi,

et hoida ja ekspresseerida leiutise peptiide. Need süsteemid hõlmavad muuhulgas

mikroorganisme nagu bakterid, mida on muudetud rekombinantse bakteriofaagi, 15

plasmiidi või kosmiidi DNA ekspressioonivektoritega; pärm, mida on muudetud

pärmi ekspressioonivektoriga; putuka rakusüsteemid, mis on nakatatud viiruse

ekspressioonivektoriga (nt bakuloviirus); taime rakusüsteemid, mis on

transfekteeritud viiruse ekspressioonivektoriga (nt lillkapsa mosaiikviirus CaMV;

tubaka mosaiikviirus TMV) või mida on muudetud bakteri ekspressioonivektoriga 20

(nt Ti või pBR322 plasmiid); või looma rakusüsteemid. Rekombinantse proteiini

tootmises kasulike imetajarakkude seas on muuhulgas VERO rakud, HeLa rakud,

hiina hamstri munasarja (CHO) rakuliinid, COS rakud (nagu COS-7), W138, BHK,

HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 ja 293 rakud. Näidiseeskirju peptiidi

rekombinantseks ekspressiooniks on kirjeldatud siin allpool. 25

Termin „ekspressioonivektor“ tähistab plasmiidi, faagi, viirust või vektorit

polüpeptiidid ekspresseerimiseks DNA (RNA) järjestusest. Ekspressioonivektor

võib hõlmata transkriptsionaalset üksust, milles on komplekt (1) geneetilisest

elemendist või elementidest, millel on reguleeriv roll geeni ekspressioonis, näiteks

promootoritest või tugevdajatest, (2) struktuurist või järjestusest, mis kodeerib 30

mRNA-sse transkribeeritud ja proteiini transleeritud sideainet, ning (3) sobivast

transkriptsiooni algatusest ja lõpetusjärjestusest. Pärmis või eukarüootsetes

EE - EP1615952 B1 49

ekspressioonisüsteemides kasutamiseks mõeldud struktuuriüksused sisaldavad

soovitatavalt liidejärjestust, mis võimaldab transleeritud proteiini rakuvälist eritust

peremeesraku poolt. Teisel juhul, kui ekspresseeritakse rekombinantset proteiini

liider- või transportjärjestuseta, võib see hõlmata amino-otsa metionüüljääki. Jääk

võib või ei pruugi olla järjestikku lõhestatud ekspresseeritud rekombinantsest 5

proteiinist, et lõplikku peptiidiprodukti anda.

Näiteks võib peptiide rekombinantselt pärmis ekspresseerida kommertsiaalselt

kättesaadavat ekspressioonisüsteemi, nt firma Pichia ekspressioonisüsteemi

(Invitrogen, San Diego, CA) kasutades, järgides tootja juhiseid. Süsteem tugineb

ka pre-pro-alfa järjestusel, et suunata sekretsiooni, aga lisandi transkriptsiooni 10

juhib alkoholi oksidaasi (AOX1) promootor pärast esilekutsumist metanooli poolt.

Eritunud peptiid puhastatakse pärmi kasvusöötmest nt meetoditega, mida

kasutatakse peptiidi puhastamiseks bakteri ja imetaja rakusupernatantidest.

Teisel juhul võib peptiidi kodeeriva cDNA kloonida bakuloviiruse

ekspressioonivektoriks pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA). Seda vektorit võib 15

kasutada vastavalt tootja juhistele (PharMingen), et nakatada liblikarakud

(Spodoptera frugiperda) sF9 proteiinivabas söötmes ning toota rekombinantne

proteiin. Rekombinantse proteiini saab söötmest puhastada ja kontsentreerida,

kasutades hepariin-sefaroosi kolonni (Pharmacia).

Teise võimalusena saab peptiidi ekspresseerida putuka süsteemis. Antud 20

valdkonnas pädevad isikud teavad valgu ekspressiooniks mõeldud

putukasüsteeme. Ühes taolises süsteemis saab kasutada Autographa californica

nukleaarset polühedroosi viirust (AcNPV) vektorina, et ekspresseerida võõrgeene

Spodoptera frugiperda rakkudes või Trichoplusia vastsetes. Peptiidi kodeeriva

järjestuse saab kloonida viiruse vähemolulisse piirkonda nagu polühedriini geen 25

ning asetada polühedriini promootori kontrolli alla. Peptiidi edukas lisamine

muudab polühedriini geeni inaktiivseks ning annab rekombinantse viiruse, millel

puudub kattevalgu kate. Rekombinantseid viiruseid saab kasutada S. frugiperda

rakkude või Trichoplusia vastsete, kus peptiidi ekspresseeritakse, nakatamiseks.

Smith et al, J. Virol. 46: 584 (1983); Engelhard et al, Proc. Nat. Acad Sci. (USA) 30

91: 3224-7 (1994).

EE - EP1615952 B1 50

Järgmises näites saab peptiidi kodeerivat DNA järjestust võimendada PCR abil ja

kloonida sobivaks vektoriks näiteks pGEX-3X (Pharmacia). pGEX luuakse

glutatioon-S-transferaasi (GST) sisaldava sulandvalgu, mida kodeerib vektor, ja

proteiini, mida kodeerib vektori kloonimissaidile lisatud DNA fragment, tootmiseks.

PCR jaoks mõeldud praimereid saab luua nii, et need kaasaks näiteks sobivat 5

lõhestuskohta. Kui sulandosa kasutatakse ainult ekspressiooni soodustamiseks

või on teisiti vaatlusaluse ühendusena ebasoovitav, võib rekombinantse

sulandvalgu lõhestada sulandvalgu GST osast. pGEX-3X/spetsiifilise sideaine

peptiidi struktuur muudetakse E. coli XL-1 Blue rakkudeks (Stratagene, La Jolla

CA) ning individuaalsed transformandid eraldatakse ja neid kasvatatakse. 10

Plasmiidi DNA individuaalsetest transformantidest saab puhastada ja osaliselt

järjestada automatiseeritud järjestusseadmega, et kinnitada nukleiinhappe lisandit

kodeeriva soovitud spetsiifilise sideaine olemasolu õiges suunitluses.

Käesoleva leiutise teatud peptiid koostised on need, milles peptikeha on

konjugeeritud mis tahes kasvajavastaseks peptiidiks nagu kasvaja nekroosifaktor 15

(TNF). Ühes eriti eelistatud meetodis TNF-spetsiifilise sideaine peptiidide kimäärid

luuakse rekombinantsete ühendustena peptiidi kodeerivate järjestustega, mis on

sulandatud TNF-d (Novagen, Madison, WI) kodeerivatele järjestustele. Peptiid-

TNF cDNA saab kloonida pET-11b vektoriks (Novagen) ning TNF-peptiidide

ekspressiooni BL21 E. colis saab esile kutsuda vastavalt pET11b tootja juhistele. 20

Lahustuvad TNF-peptiidid saab puhastada bakteri lüsaatidest ammooniumsulfaadi

valmistusega, hüdrofoobsete interaktsioonide kromatograafiaga Phenyl-

Sepharose 6 Fast Flow kolonnil, ioonvahetuskromatograafiaga DEAE-Sepharose

Fast Flow kolonnil ning geelfiltratsiooni kromatograafiaga Sephacryl-S-300 HR

kolonnil. 25

Sulandvalgu, mille võib valmistada lahustumatu sisestuskehana bakteris, saab

puhastada järgnevalt. Peremeesrakud saab surmata tsentrifuugimisel, puhastada

0,15M NaCl-s, 10mM-s Tris-is, pH 8, 1mM-s EDTA-s ning neid saab 15 minutit

toatemperatuuril töödelda 0,1mg/ml lüsosüümiga (Sigma, St. Louis, MO). Lüsaadi

saab puhastada ultrahelitöötlusel ning raku jäätmed saab granuleerida 30

tsentrifuugimisel 10 minutit kiirusel 12 000xg. Sulandvalku sisaldava graanuli saab

resuspendeerida 50mM-s Tris-is, pH 8, ja 10mM-s EDTA-s, kanda 50%-lisele

EE - EP1615952 B1 51

glütseroolile ning tsentrifuugida 30 minutit kiirusel 6000xg. Graanuli saab

resuspendeerida standardses fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS), kus ei ole

Mg++ ega Ca++. Sulandvalku saab veel puhastada resuspendeeritud graanuli

fraktsioneerimisel denatureerivas SDS-PAGE-s (Sambrook et al, supra). Geeli

saab leotada 0,4M KCl-s, et näha proteiini, mille võib eemaldada ja 5

elektroelueerida geelil töötava puhvriga, milles ei ole SDS. Kui GST/sulandvalk

toodetakse bakteris lahustuva proteiinina, saab selle puhastada

puhastusmooduliga GST Purification Module (Pharmacia).

Sulandvalgu võib lagundamisele edastada, et GST leiutise peptiidist lõhestada.

Lagundamisreaktsiooni (20-40mg sulandvalku, 20-30 ühikut inimese trombiini 10

(4000Ü/mg, Sigma) 0,5ml-s PBS-s saab inkubeerida 16-48 tundi toatemperatuuril

ning seada denatureerivale SDS-PAGE geelile, et reaktsiooniprodukte

fraktsioneerida. Geeli võib immutada 0,4M KCl-s, et valguribasid näha. Valguriba,

mis vastab peptiidi eeldatud molekulmassile, identsust saab kinnitada aminohappe

järjestuse analüüsiga automatiseeritud järjestusseadmega (firma Applied 15

Biosystems mudel 473A, Foster City, CA). Teisel juhul saab identsust kinnitada

peptiidide HPLC ja/või massispektromeetria tegemisel.

Teisel juhul saab peptiidi kodeeriva DNA järjestuse kloonida plasmiidi, mis

sisaldab soovitud promootorit ning soovi korral liiderjärjestust [Better et al, Science

240:1041-43 (1988)]. Antud struktuuri järjestuse saab kinnitada automatiseeritud 20

sekventeerimisega. Plasmiidi saab seejärel E. coli tüveks MC1061 muuta,

kasutades standardseid protseduure, mis rakendavad CaCl2 inkubatsiooni ja

bakteri kuumašoki töötlust (Sambrook et al, supra). Transformeeritud baktereid

saab kasvatada LB söötmes, millele on lisatud karbenitsilliini, ning eeldatud

proteiini tootmise saab esile kutsuda sobivas söötmes kasvamisel. Liiderjärjestuse 25

olemasolul saab see peptiidi erituse käivitada ning seda on võimalik sekretsiooni

käigus lõhestada.

Eritunud rekombinantse proteiini saab bakteri kultuurisöötmest puhastada siin

allpool kirjeldatud meetoditega.

Antud valdkonnas pädevad isikud tunnevad hästi rekombinantse proteiini 30

ekspressiooniks mõeldud imetaja peremeessüsteeme. Peremeesraku tüved võib

EE - EP1615952 B1 52

valida teatud võime tõttu toota ekspresseeritud valku või tuua teatud

translatsioonijärgseid modifikatsioone, mis on kasulikud proteiini aktiivsuse

võimaldamisel. Taoliste proteiini modifikatsioonide seas on muuhulgas

atsetüülimine, karboksüülimine, glükosüleerimine, fosforüülimine, lipiidimine ja

atsüülimine. Erinevatel peremeesrakkudel nagu CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38 ja 5

teistel sarnastel on spetsiifilised rakumehhanismid ja iseloomulikud mehhanismid

taolisteks translatsioonijärgseteks toiminguteks ning neid saab valida kasutatud

võõrvalgu õige modifikatsiooni ja töötlemise tagamiseks.

Eelistatakse, et transformeeritud rakke saab kasutada pikaajaliseks saagikaks

valgu tootmiseks ning taolisena soovitakse stabiilset ekspressiooni. Kui taolisi 10

rakke transformeeritakse vektoritega, mis sisaldavad selektsioonimarkereid koos

soovitud ekspressioonikassetiga, võib rakkudel lasta 1-2 päeva rikastatud söötmes

kasvada enne, kui need selektiivsesse söötmesse pannakse. Selektsioonimarker

on loodud pakkuma vastupidavust selekteerimisele ning selle olemasolu

võimaldab kasutatud järjestusi edukalt ekspresseerivate rakkude kasvu ja 15

taastumist. Stabiilselt transformeeritud rakkude resistentseid kogumeid saab

rakule sobivate koekultuuri võtetega paljunema panna.

Mitmeid selektsioonisüsteeme saab kasutada rekombinantse proteiini tootmise

jaoks transformeeritud rakkude taastamiseks. Taoliste selektsioonisüsteemide

seas on muuhulgas HSV tümidiini kinaas, hüpoksantiin-guanidiini 20

fosforibosüültransferaasi ja adeniini fosforibosüültransferaasi geenid vastavalt tk-,

hgprt- või aprt- rakkudes. Samuti saab anti-metaboliidi resistentsust kasutada

selektsiooni alusena DHFR-le, mis annab resistentsuse metotreksaadi suhtes, gpt-

le, mis annab resistentsuse mükofenoolhappe suhtes, neo-le, mis annab

resistentsuse aminoglükosiidi G418 ning klorosulfurooni suhtes, ning hügro-le, mis 25

annab resistentsuse hügromütsiini suhtes. Täiendavate kasulikuks osutuvate

selektiivsete geenide seas on trpB, mis võimaldab rakkudel trüptofaani asemel

indooli rakendada, või hisD, mis võimaldab rakkudel histidiini asemel histinooli

kasutada. Markerite, mis transformantidest visuaalse ülevaate annavad, seas on

antotsüaniinid, β-glükuronidaas ja selle substraat GUS ning lutsiferaas ja selle 30

substraat lutsiferiin.

Spetsiifiliste sideainete puhastamine ja taasvoltimine

EE - EP1615952 B1 53

Mõnel juhul tuleb spetsiifilised sideained nagu antud leiutise peptiidid ja/või

peptikehad „taasvoltida“ ja õigeks tertsiaarstuktuuriks oksüdeerida ning panna

disulfiidi ühendeid looma, et bioloogiliselt aktiivne olla. Taasvoltimine on võimalik

mitme antud valdkonnas teadaoleva protseduuriga. Taoliste meetodite seas on

muuhulgas lahustuvaks tehtud polüpeptiidi aine kokkupuutumine pH-ga, mis on 5

tavaliselt enam kui 7, kaotroopse aine juuresolekul. Kaotroobi valik on sarnane

neile, mida kasutati sisestuskehakese lahustuvaks tegemiseks, ent kaotroopi

kasutatakse tavaliselt madalamal kontsentratsioonil. Kaotroopse aine näidis on

guanidiin. Enamasti sisaldab taasvoltimise/oksüdeerimise lahus ka redutseerivat

ainet ning selle oksüdeeritud kuju teatud suhtes, et luua konkreetne 10

redokspotentsiaal, mis võimaldab tsüsteiini sidemete moodustumiseks disulfiidi

segamisel toimuda. Osa tavaliselt kasutatavate redokspaaride seas on

tsüsteiin/tsüstamiin, glutatioon/ditiobis GSH, vaskkloriid, ditiotreitool DTT/ditiaan

DTT ja 2-merkaptoetanool (bME)/ditio-bME. Enamus juhtudel võib kasutada

kosolventi, et taasvoltimise tõhusust tõsta. Tavaliselt kasutatavate kosolventide 15

seas on erineva molekulmassiga glütserool, polüetüleenglükool ning arginiin.

Võib-olla soovitakse käesoleva leiutise peptiide ja peptikehasid puhastada. Antud

valdkonnas pädevad isikud tunnevad proteiini puhastusvõtteid. Ühel tasandil on

nende võtete seas valguliste ja mittevalguliste fraktsioonide algeline

fraktsioneerimine. Pärast peptiidi ja/või peptikeha eraldamist teistest proteiinidest 20

saab huvialuse peptiidi või polüpeptiidi täiendavalt puhastada kromatograafia ja

elektroforeesi võtetega, et saavutada osaline või täielik puhtus (või puhtus

homogeensuseni). Peptikehade ja peptiidide või käesoleva leiutise valmistamiseks

spetsiaalselt sobitatud analüütilised meetodid on ioonvahetuskromatograafia,

eralduskromatograafia, geelelektroforees polüakrüülamiidis ja isoelektriline 25

fookustamine. Eriti tõhus peptiidide puhastusmeetod on valgu kiire

vedelkromatograafia või isegi HPLC.

Käesoleva leiutise teatud aspektid käsitlevad käesoleva leiutise peptikeha või

peptiidi puhastamist ja teatud variantides nende põhiosas puhastamist. Siin

kasutatud termin „puhastatud peptikeha või peptiid“ on mõeldud tähistama 30

koostisi, mis on teistest komponentidest eraldatavad, kusjuures peptikeha või

peptiid puhastatakse mis tahes tasemeni, mis on seotud selle looduslikult

EE - EP1615952 B1 54

saavutatava kujuga. Järelikult tähendab puhastatud peptiid või peptikeha sellist

peptikeha või peptiidi, mis on vaba keskkonnast, milles see võib looduslikult

esineda.

Üldiselt, „puhastatud“ tähendab peptiidi või peptikeha koostist, mis on läbinud

fraktsioneerimise, et eemaldada erinevaid teisi koostisosi, ning mis põhiliselt 5

säilitab oma ekspresseeritud bioloogilise toime. Kus on kasutatud terminit

„põhiosas puhastatud“, tähendab see määratlus peptiidi või peptikeha koostist, kus

peptikeha või peptiid moodustab enamuse koostise komponendist, nagu

moodustades umbes 50%, umbes 60%, umbes 70%, umbes 80%, umbes 90%,

umbes 95% või rohkem proteiinist koostises. 10

Peptiidi või peptikeha puhastamise taseme kvantifitseerimise erinevad meetodid

on antud valdkonnas pädevatele isikutele teada käesoleva avalikustuse valguses.

Nende seas on näiteks aktiivse fraktsiooni spetsiifilise sidumisaktiivsuse

määramine või peptiidi või peptikeha koguse hindamine fraktsioonis SDS/PAGE

analüüsiga. Peptiidi või peptikeha fraktsiooni puhtuse hindamise eelistatud meetod 15

on arvutada fraktsiooni sidumisaktiivsus, võrrelda seda esialgse ekstrakti

sidumisaktiivsusega ning seeläbi arvutada puhtuse tase, mida on siin hinnatud „-

kordse puhastusnumbriga“. Sidumisaktiivsuse koguse tähistamiseks kasutatud

tegelikud ühikud sõltuvad mõistagi konkreetse analüüsi võtetest, mis valitakse

puhastamise järgimiseks, ning kas peptikehal või peptiidil on või ei ole tuvastatavat 20

sidumisaktiivsust.

Antud valdkonnas pädevad isikud teavad puhastamises kasutamiseks sobivaid

erinevaid võtteid. Nende seas on näiteks ammooniumsulfaadiga, PEG,

antikehadega (immunosadestamine) ja muu sarnasega sadestamine või kuum-

denatureerimisega, millele järgneb tsentrifuugimine, kromatograafia etapid nagu 25

afiinsus-kromatograafia (nt proteiin-A-sefaroos), ioonvahetus-, geelfiltratsiooni,

pöördfaasiline, hüdroksüülapatiit- ja afiinsuskromatograafia, isoelektriline

fookustamine, geel-elektroforees ning taoliste ja teiste võtete kombinatsioonid.

Nagu antud valdkonnas ka teatakse, usutakse, et erinevate puhastusetappide

sooritamise järjekorda võib muuta või on võimalik teatud etappe vahele jätta ning 30

ikkagi saada sobiv meetod tegelikult puhastatud spetsiifilise sideaine

valmistamiseks.

EE - EP1615952 B1 55

Puudub üldnõue, et käesoleva leiutise peptiid või peptikeha oleks alati oma kõige

puhtamal kujul. Tegelikult peetakse võimalikuks, et põhiosas vähem spetsiifilise

sideaine produktidel on teatud variantides ka rakendus. Osalist puhastamist on

võimalik saavutada vähemate puhastusetappide kasutamisel koos või rakendades

sama üldise puhastusskeemi erinevaid vorme. Näiteks on mõistetav, et 5

katioonvahetuse kolonnkromatograafia, mis tehakse HPLC seadmega, annab

üldiselt suurema „-kordse“ puhtuse kui sama võte, mis kasutab madala rõhuga

kromatograafia süsteemi. Suhtelise puhtuse madalama tasemega meetoditel

võivad olla eelised peptiidi või peptikeha kogutaastumises või peptiidi või

peptikeha sidumisaktiivsuse säilitamisel. 10

On teada, et peptiidi või polüpeptiidi liikumine võib SDS/PAGE erinevate

tingimustega ja mõnikord lausa märkimisväärselt varieeruda [Capaldi et al,

Biochem. Biophys. Res. Comm., 76: 425 (1977)]. Seetõttu on mõistetav, et

erinevates elektroforeesi tingimustes võib puhastatud või osaliselt puhastatud

spetsiifilise sideaine ekspressiooni produktide näiv molekulmass varieeruda. 15

Seondumistestid

Immunoloogilised seondumistestid kasutavad tavaliselt haardeainet (capture

agent), et analüüdi sihtmärgist antigeenile spetsiaalselt seonduda ja sageli

immobiliseerida. Haardeaine on osa, mis analüüdile spetsiaalselt seondub.

Käesoleva leiutise teatud variandis on haardeaine peptiid või peptikeha või selle 20

fragment, mis Ang-2 spetsiaalselt seob. Antud valdkonnas on need

immunoloogilised seondumistestid teada [Asai, toim., Methods in Cell Biology, 37.

kd, Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc., New York (1993)].

Immunoloogilised seondumistestid kasutavad sageli märgistusainet, mis

haardeaine ja antigeeni moodustatud seondumiskompleksi olemasolust märku 25

annab. Märgistusaine võib olla üks molekulidest, mis hõlmab

seondumiskompleksi, st see võib olla märgistatud spetsiifiline sideaine või

märgistatud anti-spetsiifilise sideaine antikeha. Teisel juhul võib märgistusaine olla

kolmas molekul, tavaliselt mingi muu antikeha, mis seondumiskompleksile

seondub. Märgistusaine võib olla näiteks märgistust kandev anti-spetsiifilise 30

sideaine antikeha. Teisel antikehal, mis on seondumiskompleksile spetsiifiline,

EE - EP1615952 B1 56

võib märgistus puududa, aga selle võib leida neljanda molekuliga, mis on

spetsiifilised antieha liikidele, milles teine antikeha on liige. Näiteks võib teist

antikeha modifitseerida tuvastatava osaga nagu biotiin, mille võib seejärel siduda

neljas molekul nagu ensüüm-märgistusega streptavidiin. Immunoglobuliini

konstantseid piirkondi nagu proteiin A või proteiin G spetsiifiliselt siduda suutvaid 5

teisi proteiine võib samuti märgistusainena kasutada. Need sideained on

streptokoki bakteri rakuseinte normaalsed koostisosad ning neil on tugev mitte-

immunogeenne reaktiivsus mitmetelt liikidelt pärinevate immunoglobuliini

konstantsete piirkondadega. Akerstrom, J. Immunol., 135:2589-2542 (1985);

Chaubert, Mod. Pathol., 10:585-591 (1997). 10

Testide kestel on võib-olla vaja inkubeerimis- ja/või pesemisetappe pärast iga

reagendi kombineerimist. Inkubeerimisetapp võib varieeruda 5 sekundist kuni

mitme tunnini, soovitatavalt umbes 5 minutist kuni umbes 24 tunnini. Ent

inkubeerimisaeg sõltub testi formaadist, analüüdist, lahuse kogusest,

kontsentratsioonidest ja muust sarnasest. Tavaliselt sooritatakse testid 15

ümbritseval temperatuuril, kuigi neid saab teostada mitmesugustel

temperatuuridel.

A. Mittekonkureerivad seondumistestid:

Immunoloogilised seondumistestid võivad olla mittekonkureerivat tüüpi. Nendel

testidel on teatud koguses haaratud analüüti, mida otseselt mõõdetakse. Näiteks 20

teatud eelistatud kihttehnikal põhinevas testis võib haardeaine (antikeha või

peptikeha) siduda otse tahkele substraadile, kus see immobiliseeritakse. Need

immobiliseeritud haardeained haarduvad (seonduvad) seejärel testi proovis

olevale antigeenile. Sedasi immobiliseeritud proteiin seotakse hiljem

märgistusainele nagu teine antikeha, millel on märgistus. Järgmises eelistatud 25

kihttehnikal põhinevas testis teisel antikehal puudub märgistus, aga selle võib

leida märgistatud antikehal, mis on spetsiifiline liikide antikehadele, millest teine

antikeha tuletatakse. Teist antikeha saab samuti modifitseerida tuvastatava osaga

nagu biotiin, millele saab spetsiifiliselt siduda kolmanda märgistatud molekuli nagu

streptavidiin. Vaata Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 14. 30

peatükk, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988), mis on siia viidetena

kaasatud.

EE - EP1615952 B1 57

B. Konkureerivad seondumistestid:

Immunoloogilised seondumistestid võivad olla konkureerivat tüüpi. Proovis oleva

analüüdi kogus mõõdetakse otse, mõõtes lisatud analüüdi koguse, mis asendati

või tõrjuti haardeainest (antikeha või peptikeha) välja proovis oleva analüüdi poolt.

Teatud eelistatud konkureerivas seondumistestis lisatakse teadaolevas koguses 5

analüüti, mis on enamasti märgistatud, proovile ja proov viiakse seejärel

haardeainega kokkupuutesse. Antikehale seotud märgistatud analüüdi kogus on

pöördvõrdeline proovis oleva analüüdi kontsentratsiooniga (vaata Harlow and

Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 14. peatükk, lk 579-583, supra).

Teises konkureerivas seondumistestis haardeaine immobiliseeritakse tahkel 10

substraadil. Haardeainele seotud proteiini koguse võib määrata proteiini/antikeha

kompleksis oleva valgu koguse mõõtmisel või hoopis allesjäänud mittekompleksse

proteiini koguse mõõtmisel. Proteiini koguse võib tuvastada märgistatud proteiini

võimaldamisega. Harlow and Lane (supra).

Ent veel ühe eelistatud konkureeriva seondumistestiga kasutatakse hapteeni 15

inhibeerimist. Siin teadaolev analüüt immobiliseeritakse tahkel substraadil.

Proovile lisatakse teadaolevas koguses antikeha ning proov ühendatakse

immobiliseeritud analüüdiga. Immobiliseeritud analüüdile seotud antikeha kogus

on pöördvõrdeline proovis oleva analüüdi kogusega. Immobiliseeritud antikeha

kogust võib tuvastada kas antikeha immobiliseeritud fraktsiooni või lahusesse 20

jääva fraktsiooni tuvastamisel. Tuvastamine võib olla otsene seal, kus antikeha on

märgistatud, või kaudne eespool kirjeldatud antikehale spetsiifiliselt seonduva

märgistatud osa järgneva lisamisel.

C. Konkureerivate seondumistestide rakendamine:

Konkureerivaid seondumisteste saab kasutada ristreaktiivsuse tuvastamiseks, et 25

lasta pädeval spetsialistil kindlaks määrata, kas proteiini või ensüümi kompleks,

mille leiutise peptikeha ära tunneb, on soovitud proteiin ega mitte ristuvalt

reageeriv molekul, või tuvastada, kas peptikeha on antigeeni-spetsiifiline ega ei

seondu kõrvalistele antigeenidele. Seda liiki testides saab antigeeni tahkele toele

immobiliseerida ning testile lisatakse tundmatu proteiinimikstuur, mis konkureerib 30

EE - EP1615952 B1 58

peptikehade sidumisega immobiliseeritud proteiinile. Konkureeriv molekul seondub

samuti ühele või mitmele antigeenile, mis ei ole antigeeniga seotud. Proteiinide

võimet konkureerida peptikehade seondumisega immobiliseeritud antigeenile

võrreldakse sama proteiini, mis tahkele toele immobiliseeriti, seondumisega, et

proteiinisegu ristuvat reaktiivsust tuvastada. 5

D. Teised seondumistestid

Käesolev leiutis pakub ka western blot-meetodeid, et tuvastada või kvantifitseerida

Ang-2 olemasolu proovis. Võte hõlmab üldiselt prooviproteiinide eraldamist geeli-

elektroforeesiva molekulmassi põhjal ning proteiinide viimist sobivale tahkele toele

nagu nitrotselluloosfilter, nailonfilter või derivatiseeritud nailonfilter. Proovi 10

inkubeeritakse peptikehade või nende fragmentidega, mis spetsiifiliselt Ang-2

seovad, ning tuvastatakse saadud kompleks. Neid peptikehasid võib otseselt

märgistada või teisel juhul võib neid järgemööda tuvastada märgistatud

antikehadega, mis spetsiaalselt peptikehale seonduvad.

Diagnostilised testid 15

Tuletatud seondumisaineid nagu käesoleva leiutise peptiidid ja peptikehad või

nende fragmendid on tõhusad seisundite või haiguste diagnoosiks, millele on

iseloomulik Ang-2 või allüksuste ekspressioon, või testides, et vaadelda patsiente,

keda ravitakse Ang-2 põhjustajatega, selle fragmentide, agonistide või Ang-2

toime inhibiitoritega. Ang-2 jaoks mõeldud diagnostiliste testide seas on meetodid 20

peptikeha rakendamiseks ning märgistus Ang-2 tuvastamiseks inimese

kehavedelikes või rakkude või kudede ekstraktides. Käesoleva leiutise

peptikehasid saab kasutada modifitseerimisega või ilma. Eelistatud diagnostilises

testis märgistatakse peptikehasid kinnitamisega, nt märgistus- või

reportermolekuliga. Tuntakse hulga märgistusi ja reportermolekuli, millest osa on 25

siin juba kirjeldatud. Käesolev leiutis on eriti kasulik inimhaiguste diagnoosimiseks.

Antud valdkonnas teatakse hulga eeskirju Ang-2 proteiinide mõõtmiseks,

kasutades vastavale proteiinile spetsiifilisi peptikehasid. Näidete seas on ensüüm-

seotud immunosorbenttest (ELISA), radioimmunoanalüüs (RIA) ja fluorestsentsi

aktiveeritav rakkude sorteerimine (FACS). Eelistatakse kahepoolset 30

EE - EP1615952 B1 59

monoklonaalset immunoanalüüsi, mis rakendab monoklonaalseid antikehasid, mis

on kahe Ang-2-l mitte-sekkuva epitoobi suhtes reaktiivsed, aga kasutada võib ka

konkureerivat seondumistesti. Neid teste on kirjeldanud näiteks Maddox et al, J.

Exp. Med, 158:1211 (1983).

Diagnoosile aluse võimaldamiseks sätestatakse inimese Ang-2 ekspressioonile 5

tavaliselt normaalsed või standardväärtused. Taoline tuvastamine on võimalik

normaalsete subjektide, eelistatavalt inimeste kehavedelike või rakuekstraktide

kombineerimisel peptikehaga Ang-2-le antud valdkonnas teadaolevates

tingimustes, mis sobivad kompleksi moodustumiseks. Standardkompleksi

moodustumise kogust saab kvantifitseerida peptikehade Ang-2 proteiini 10

teadaolevate kogustele seondumise võrdlemisel nii kontroll- kui ka haiguse

proovidega. Seejärel saab normaalsetest proovidest saadud standardväärtuseid

võrrelda väärtustega, mis saadi haigusega potentsiaalselt mõjutatud subjektide

proovidest. Hälve standard- ja subjekti väärtuse vahel viitab Ang-2 rollile haiguse

staadiumis. 15

Diagnostiliseks rakenduseks märgistatakse teatud variantides käesoleva leiutise

peptikehad või peptiidid tavaliselt tuvastatava osaga. Tuvastatav osa võib olla

igasugune, mis suudab kas otseselt või kaudselt tuvastatavat signaali tekitada.

Tuvastatav osa võib näiteks olla radioisotoop nagu 3H, 14C, 32P, 35S või 125I,

fluorestsentne või kemiluminestsentne ühend nagu fluorestseiinisotiotsüanaat, 20

rodamiin või lutsiferiin või ensüüm nagu leelisfosfataas, β-galaktosidaas või

mädarõika peroksidaas. Bayer et al, Meth. Enz., 184: 138-163, (1990).

Haigused

Käesolev leiutis pakub seondumisainet, mis on JÄRJESTUSE ID-NR:25 sisaldav

peptikeha, seondub Ang-2-le ning on kasulik inimhaiguste ja patoloogiliste 25

seisundite ravimiseks. Ang-2 seondumisaktiivsust või muud rakutegevust

moduleerivad ained on mõeldud teiste raviainetega koos kasutamiseks, et nende

ravitoimet parandada või potentsiaalseid kõrvalmõjusid alandada.

Teatud aspektis pakub käesolev leiutis reagente ja meetodeid, mis on kasulikud

haiguste ja seisundite, millele on iseloomulik rakus Ang-2 toime ebasoodsad või 30

EE - EP1615952 B1 60

häiritud tasemed, ravimisel. Nende haiguste seas on vähk ja teised

hüperproliferatiivsed seisundid nagu hüperplaasia, psoriaas, kontaktdermatiit,

immunoloogilised häired ning viljatus.

Farmatseutilised koostised

Käsitletud on Ang-2 spetsiifiliste sideainete nagu peptikehad farmatseutilisi 5

koostiseid. Antikehasid sisaldavaid farmatseutilisi koostiseid on üksikasjalikumalt

kirjeldatud USA patendis 6,171,586, Lamile et al, väljastati 9. jaanuaril 2001.

Taolised koostised sisaldavad terapeutiliselt või profülaktiliselt tõhusas koguses

siin kirjeldatud spetsiifilist sideainet koos farmatseutiliselt sobiva ainega.

Farmatseutilised koostised võivad sisaldada antagonisti spetsiifilisi sideaineid, mis 10

osaliselt või täielikult moduleerivad vähemalt ühte Ang-2 bioloogilist toimet, koos

farmatseutiliselt sobiva ainega. Tavaliselt on spetsiifilised sideained loomale

manustamiseks piisavalt puhastatud.

Farmatseutiline koostis võib sisaldada formulatsioonimaterjale, et modifitseerida,

hoida või säilitada näiteks ühendi pH-d, osmolaarsust, viskoossust, selgust, värvi, 15

isotoonilisust, lõhna, steriilsust, stabiilsust või lahustuvuse kiirust või vabanemist,

imendumist või penetratsiooni. Sobivate formulatsioonimaterjalide seas on

muuhulgas aminohapped (nagu glütsiin, glutamiin, asparagiin, arginiin või lüsiin),

antimikroobikumid, antioksüdandid (nagu askorbiinhape, naatriumsulfit või

naatriumvesiniksulfit), puhvrid (nagu boraat, bikarbonaat, Tris-HCl, tsitraadid, 20

fosfaadid, teised orgaanilised happed), täiteained (nagu mannitool või glütsiin),

kelaadimoodustajad [nagu etüleendiamiin tetra-äädikhape (BDTA)],

kompleksitekitid (nagu kofeiin, polüvinüülpürrolidoon, beeta-tsüklodektsriin või

hüdroksüpropüül-beeta-tsüklodektsriin), täidised, monosahhariidid, disahhariidid ja

teised süsivesikud (nagu glükoos, mannoos või dekstriinid), proteiinid (nagu 25

seerumi albuniin, želatiin või immunoglobuliinid), värvained, maitseained ja

lahjendid, emulgaatorid, hüdrofiilsed polümeerid (nagu polüvinüülpürrolidoon),

madala molekulmassiga polüpeptiidid, soola moodustavad vastasioonid (nagu

naatrium), konservandid (nagu bensalkooniumkloriid, bensoehape, salitsüülhape,

timerosaal, fenetüülalkohol, metüülparabeen, propüülparabeen, kloorheksidiin, 30

sorbiinhape või vesinikperoksiid), lahustid (nagu glütseriin, propüleenglükool või

polüetüleenglükool), suhkrualkoholid (nagu mannitool või sorbitool),

EE - EP1615952 B1 61

suspendeerivad ained, surfaktandid või märgavad ained (nagu Pluronics, PEG,

sorbitaanestrid, polüsorbaadid nagu polüsorbaat 20, polüsorbaat 80, triiton,

trometamiin, letsitiin, kolesterool, tüloksapool), stabiilsust tõstvad ained (sukroos

või sorbitool), toonust tõstvad ained (nagu leelismetalli haliidid (soovitatavalt

naatrium- või kaaliumkloriid, mannitoolsorbitool), kandurid, diluendid, ekstsipiendid 5

ja/või farmatseutilised adjuvandid. (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18.

väljaanne, A.R. Gennaro, toim., Mack Publishing Company, 1990).

Optimaalse farmatseutilise koostise määrab antud valdkonnas pädev isik sõltuvalt

näiteks plaanitavast manustamisviisist, annustamisvormist ning soovitud annusest.

Vaata näiteks Remington’s Pharmaceutical Sciences, supra. Taolised koostised 10

võivad mõjutada spetsiifilise sideaine füüsilist staadiumi, stabiilsust, in vivo

vabanemise kiirust ning in vivo kliirensi väärtust.

Primaarkandur või kandja farmatseutilises koostises võib olemuselt olla veepõhine

või mitte-veepõhine. Näiteks võib sobiv kandur või kandja olla vesi süstimiseks,

füsioloogiline soolalahus või kunstlik tserebrospinaalvedelik, millele on võimalusel 15

lisatud teisi materjale, mis on parenteraalseks manustamiseks tavapärased.

Neutraalne puhverdatud soolalahus või seerumi albumiiniga segatud soolalahus

on täiendavad näidiskandurid. Teised farmatseutilised näidiskoostised sisaldavad

Tris puhvrit pH-ga umbes 7,0-8,5 või atsetaatpuhvrit pH-ga umbes 4,0-5,5, mis

võib veel sisaldada sorbitooli või selle sobivat asendajat. Sideaine koostiseid võib 20

valmistada säilitamiseks, segades soovitud puhtusastmega valitud koostise

optimaalsete formulatsiooniainetega (Remington’s Pharmaceutical Sciences,

supra) lüofiliseeritud koogi või veelahuse kujul. Lisaks võib sideaine valmistada

lüofilisaadina, kasutades sobivaid ekstsipiente nagu sukroos.

Farmatseutilised koostised võib selekteerida parenteraalseks manustamiseks. 25

Teisel juhul võib koostisi selekteerida inhaleerimiseks või enteraalseks

manustamiseks nagu suukaudne, kuulmismeelte abil, silma kaudu, rektaalne või

vaginaalne. Taoliste farmatseutiliselt sobivate koostiste preparaadid on antud

valdkonnas teada.

EE - EP1615952 B1 62

Formulatsiooni koostisosad esinevad kontsentratsioonidel, mis manustamiskohale

sobivad. Näiteks kasutatakse puhvreid, et hoida koostist füsioloogilisel pH-l või

veidi madalamal pH-l, kus pH on tavaliselt vahemikus umbes 5 kuni umbes 8.

Kui kaalutakse parenteraalset manustamist, võivad antud leiutises kasutamiseks

mõeldud raviained olla pürogeenivabal parenteraalselt sobiva veelahuse kujul, mis 5

sisaldab soovitud spetsiifilist sideainet farmatseutiliselt sobivas kanduris. Eriti

sobiv kandur parenteraalseks süstiks on steriilne destilleeritud vesi, kus sideaine

formuleeritakse steriilse isotoonilise lahusena, mis on õigesti säilitatud. Ent

järgmine preparaat võib kaasata soovitud molekuli formulatsiooni ainega nagu

süstitavad mikrosfäärid, biolagundatavad osad, polümeersed ühendid 10

(polüpiimhape, polüglükoolhape), graanulid või liposoomid, mis soodustavad

produkti kontrollitud või pidevat vabanemist ning sellel võib olla pideva kestuse

soodustamise toime vereringes. Soovitud molekuli kasutamiseks teiste sobivate

võtete seas on siirdatavad ravimi manustamisseadmed.

Järgmises aspektis võib parenteraalseks manustamiseks sobivaid farmatseutilisi 15

formulatsioone koostada veelahuses, soovitatavalt füsioloogiliselt sobivates

puhvrites nagu Hanki lahus, Ringeri lahus või füsioloogiliselt puhverdatud

soolalahus. Veepõhised süstisuspensioonid võivad sisaldada aineid, mis tõstavad

suspensiooni viskoossust nagu naatriumkarboksüülmetüül-tselluloos, sorbitool või

dekstraan. Lisaks võib toimeühendite suspensioone valmistada sobivate 20

süstitavate õlisuspensioonidena. Sobivate lipofiilsete lahustite või kandurite seas

on rasvhapped nagu seesamiõli või sünteetilised rasvhappe estreid nagu

etüüloleaat, triglütseriidid või liposoomid. Mittelipiidsed polükatiooni

aminopolümeere võib samuti manustamiseks kasutada. Soovi korral võib

suspensioon sisaldada ka sobivaid stabilisaatorieid või aineid, et tõsta ühendite 25

lahustuvust ning võimaldada kõrge kontsentratsiooniga lahustite valmistamist.

Farmatseutilise koostise võib inhaleerimiseks formuleerida. Näiteks võib sideaine

formuleerida kuivpulbrina inhaleerimiseks. Samuti võib valmistada polüpeptiidi või

nukleiinhappe molekuli inhaleerimise lahuseid koos propellandiga aerosooli abil

manustamiseks. Ent lisavariandis võivad lahused olla nebuliseeritud. Bronhiaalset 30

manustamist on veel kirjeldatud PCT taotluses nr PCT/US94/001875, mis kirjeldab

keemiliselt modifitseeritud proteiinide kopsu kaudu manustamist.

EE - EP1615952 B1 63

Samuti on kaalutletud, et teatud formulatsioone võib manustada suu kaudu.

Sedasi manustatud sideaine molekule võib formuleerida koos kandjatega või ilma

nendeta, mida tavaliselt kasutatakse tahke annusevormide segamisel nagu

tabletid ja kapslid. Näiteks võib kapsli moodustada nii, et see vabastaks koostise

toimehulka seedetraktis siis, kui biokättesaadavus on maksimaalne ning 5

presüsteemne degradeerimine minimaalne. Täiendavaid aineid võib kaasata, et

lihtsustada sideaine molekuli imendumist. Kasutada võib ka diluente, maitseaineid,

madala sulamispunktiga vahasid, taimeõlisid, suspendeerimisaineid, tabletti

lahustavaid aineid ning sideaineid.

Suukaudseks manustamiseks mõeldud farmatseutilisi koostisi võib samuti 10

valmistada, kasutades antud valdkonnas teadaolevaid farmatseutiliselt sobivaid

kandureid annustes, mis sobivad suukaudseks manustamiseks. Taolised kandurid

võimaldavad farmatseutilisi koostiseid valmistada tablettide, pillide, dražeede,

kapslite, vedelike, geelide, siirupite, segude, suspensioonidena ja muu sarnasena

patsiendile seedimiseks. 15

Suukaudseks manustamiseks mõeldud farmatseutilisi preparaate võib saada

toimeaine kombineerimisel tahke ekstsipiendiga ja saadud graanulite segu (soovi

korral pärast peenestamist) töötlemisel, et saada tableti või dražee sisu. Soovi

korral võib lisada sobivaid abiaineid. Sobivate ekstsipientide seas on süsivesiku

või proteiini täidised nagu suhkrud, sealhulgas laktoos, sukroos, mannitool ja 20

sorbitool, tärklis maisist, nisust, riisist, kartulist või teistest taimedest, tselluloos,

nagu metüültselluloos, hüdroksüpropüülmetüül-tselluloos või naatriumkarboksü-

metüültselluloos, kummid, sealhulgas kummiaraabik ja tragakant, ning proteiinid

nagu želatiin ja kollageen. Soovi korral võib lisada lagundavaid või lahustuvust

parandavaid aineid nagu ristseotud polüvinüülpürrolidoon, agar ning algiinhape või 25

nende sool nagu naatriumalginaat.

Dražee sisu võib kasutada koos sobivate katematerjalidega nagu kontsentreeritud

suhkrulahused, mis võivad sisaldada ka kummiaraabikut, talki,

polüvinüülpürrolidooni, karbopooli geeli, polüetüleenglükooli ja/või titaandioksiidi,

lakilahuseid ning sobivaid orgaanilisi lahuseid või lahustisegusid. Tableti või 30

dražee kattematerjalidele võib lisada värvaineid või pigmente, et toodet tuvastada

või eristada toimeaine, st annuse kogust.

EE - EP1615952 B1 64

Oraalselt kasutatavad farmatseutilised preparaadid hõlmavad ka želatiinist

valmistatud kokkupandavaid (push-fit) kapsleid ning pehmeid tihendatud kapsleid,

mis on valmistatud želatiinist ja kattematerjalist nagu glütserool või sorbitool.

Kokkupandavad kapslid võivad sisaldada toimeaineid, mis on segatud täiteainete

või sideainetega nagu laktoos või tärklised, lubrikandid nagu talk või 5

magneesiumstearaat ning soovi korral stabilisaatoreid. Pehmetes kapslites võib

toimeained lahustada või suspendeerida sobivates vedelikes nagu rasvõlid või

vedel polüetüleenglükool stabilisaatoritega või ilma nendeta.

Järgmine farmatseutiline koostis võib sisaldada tõhusas koguses sideainet koos

mürgitute ekstsipientidega, mis sobivad tablettide valmistamiseks. Tablettide 10

lahustamisel steriilses vees või muus sobivas kanduris võib lahuseid valmistada

annuseühiku kujul. Sobivate ekstsipientide seas on muuhulgas inertsed diluendid

nagu kaltsiumkarbonaat, naatriumkarbonaat või bikarbonaat, laktoos või

kaltsiumfosfaat või sideained nagu tärklis, želatiin või akaatsia või libesteid nagu

magneesiumstearaat, stearhape või talk. 15

Täiendavad farmatseutilised koostised on antud valdkonnas pädevatele isikutele

ilmsed, sealhulgas formulatsioonid, mis hõlmavad sideaine molekule pideva või

reguleeritava manustamisega formulatsioonides. Teiste pideva või reguleeritud

manustamisvõtete nagu liposoomi kandurid, biolagunevad mikroosakesed või

poorsed graanulid ja depoosüstid formuleerimisvõtted on antud valdkonnas 20

pädevatele isikutele samuti teada. Vaata näiteks PCT/US93/00829, mis kirjeldab

poorsete polümeersete mikroosakeste reguleeritud vabanemist farmatseutiliste

koostiste manustamiseks. Pidevalt vabanevate preparaatide lisanäidete seas on

poolläbilaskvad polümeermaatritsid vormitud kujul nt kiled või mikrokapslid.

Pidevalt vabanevate matriitside seas võivad olla polüestrid, hüdrogeelid, 25

polülaktiidid (USA 3,773,919, EP 58,481), L-glutamiinhappe ja etüül-L-glutamaat-

gamma kopolümeerid [Sidman et al, Biopolymers, 22:547-556 (1983)], polü(2-

hüdroksüetüül-metakrülaat) [Langer et al, J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277,

(1981)] ning [Langer et al, Chem. Tech., 12:98-105(1982)], etüleenvinüülatsetaat

(Langer et al, supra) või polü-D(-)-3-hüdroksübutüühape (EP 133,988). Pidevalt 30

vabanevate koostiste seas on ka liposoomid, mida saab valmistada mis tahes

EE - EP1615952 B1 65

antud valdkonnas teadaoleval moel. Vaata nt Eppstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci.

(USA), 82:3688-3692 (1985); EP 36,676, EP 88,046, EP 143,949.

In vivo manustamiseks mõeldud farmatseutiline koostis peab tavaliselt olema

steriilne. See on saavutatav läbi filtreerimismembraanide filtreerimisega. Kui

koostis lüofiliseeritakse, võib seda meetodit kasutatava steriliseerimise teostada 5

kas enne või pärast lüofilisatsiooni ja taastamist. Parenteraalseks manustamiseks

mõeldud koostist võib hoida lüofiliseeritud kujul või lahuses. Lisaks paigutatakse

parenteraalsed koostised üldiselt mahutisse, millel on steriilne juurdepääsuava,

näiteks intravenoosne lahusekott või kolb, millel on hüpodermilise süstlanõelaga

läbitav sulgur. 10

Pärast farmatseutilise koostise formuleerimist võib seda hoida steriilsetes

anumates lahuse, suspensiooni, geeli, emulsiooni, tahke või dehüdreeritud või

lüofiliseeritud pulbrina. Taolisi formulatsioone võib hoida kas kasutamiseks

valmiskujul või kujul (nt lüofiliseeritud), mis enne manustamist vajab taastamist.

Välja võib töötada komplektid üksikannuse manustamise ühiku tootmiseks. Iga 15

komplekt võib sisaldada nii esimest konteinerit kuiva proteiiniga ja teist konteinerit

veeformulatsiooniga. Komplektid võivad sisaldada üksikuid ja mitmekambrilisi

eeltäidetud süstlaid (nt vedeliku süstlad ja lüofiliseerimisel kasutatavad süstlad

(lyosyringes)).

Terapeutiliseks kasutamiseks mõeldud farmatseutilise koostise tõhus kogus sõltub 20

näiteks ravikontekstist ja eesmärkidest. Antud valdkonnas pädev isik mõistab, et

järelikult varieeruvad ravimiseks sobivad annuse tasemed sõltuvalt osaliselt

manustatud molekulist, näidustusest, mille jaoks sideaine molekuli kasutatakse,

manustamisviisi ning patsiendi suurusest (kehamass, keha pind või organi suurus)

ja seisundist (vanus või üldine tervis). Järelikult võib klinitsist annuse tiitrida ja 25

manustmisviisi modifitseerida, et saada optimaalne ravitoime. Tüüpiline annus

võib olla vahemikus umbes 0,1mg/kg kuni umbes 100mg/kg või rohkem, sõltudes

eespool nimetatud faktoritest. Teistes variantides võib annus olla vahemikus

0,1mg/kg kuni umbes 100mg/kg või 1mg/kg kuni umbes 100mg/kg või 5mg/kg kuni

umbes 100mg/kg. 30

EE - EP1615952 B1 66

Mis tahes ühendile võib terapeutiliselt tõhusa annuse määrata esialgu kas

rakukultuuri analüüsides või loomamudelitel nagu hiired, rotid, jänesed, koerad,

sead või ahvid. Loomamudelit võib kasutada ka sobiva kontsentratsioonivahemiku

ja manustamisviisi määramiseks. Seejärel võib taolist informatsiooni kasutada

inimestel kasulike annuste ja manustamisviiside tuvastamiseks. 5

Täpne annus määratakse ravi vajava subjektiga seotud faktorite valguses. Annust

ja manustamist kohandatakse toimeaine piisavate tasemete võimaldamiseks või

soovitud toime hoidmiseks. Arvestatavate faktorite seas on haigusseisundi

tõsidus, patsiendi üldine tervis, vanus, kehamass ja sugu, manustamise aeg ja

sagedus, ravimi kombinatsioon(de), reaktsiooni tundlikkus ning ravile 10

reageerimine. Pikatoimelisi farmatseutilisi koostiseid võib manustada iga 3 kuni 4

päeva, iga nädala või kord kahe nädala tagant, sõltuvalt konkreetse formulatsiooni

poolestusajast ning kliirensi määrast.

Doseerimise sagedus sõltub kasutatud formulatsioonis oleva sideaine molekuli

farmakokineetilistest parameetritest. Tavaliselt manustatakse koostist seni, kuni 15

saavutatakse doseering, mis annab soovitud toime. Järelikult võib koostist

manustada üksiku annusena või mitmekordsete annustena (samades või

erinevates kontsentratsioonides/doosides) teatud aja jooksul või pideva

infusioonina. Sobivad annused võib kindlaks teha sobivate doosile reageerimise

andmete põhjal. 20

Farmatseutilise koostise manustamisviis vastab teadaolevatele meetoditele, nt

oraalselt, süstiga intravenoosselt, intraperitoneaalselt, intratserebraalselt (intra-

parenhümaalselt), intratserebroventrikaarselt, intramuskulaarselt, silmasiseselt,

intraarteriaalselt, intraportaalselt, intralesionaalselt, intramedullaarselt,

intratekaalselt, intraventrikulaarselt, transdermaalselt, subkutaanselt, 25

intraperitoneaalselt, intranasaalselt, enteraalselt, pindmiselt, sublingvaalselt,

uretraalselt, vaginaalselt või rektaalselt pidevalt vabanevate süsteemidega või

siirdamisseadmetega. Soovi korral võib koostiseid manustada boolussüstina või

pideva infusiooniga või siirdamisseadmetega.

Teisel juhul või täiendavalt võib koostist manustada kohalikult membraani, käsna 30

või muu sobiva materjali siirdamisega, millele soovitud molekul on absorbeeritud

EE - EP1615952 B1 67

või kapseldatud. Kui kasutatakse siirdamisseadet, võib selle siirdada mis tahes

sobivasse koesse või organisse ning soovitud molekuli kohaletoimetamine võib

toimuda difusiooniga, pikaajalise boolusena või pideva manustamisena.

Mõnel juhul soovitakse farmatseutilisi koostisi kasutada ex vivo moel. Taolistel

juhtudel kasutatakse patsiendilt eemaldatud kudedel, rakkudel või organitel 5

farmatseutilisi koostisi, mille järel rakud, koed ja/või organid patsiendile

järgemööda tagasi siirdatakse.

Muul juhul võib käesoleva leiutise sideainet nagu peptikeha manustada teatud

rakkude siirdamisel, mida on geneetiliselt muundatud, kasutades teadaolevaid

meetodeid nagu need, mida on siin kirjeldatud, et ekspresseerida ja eritada 10

polüpeptiidi. Taolised rakud võivad olla looma või inimese rakud ning autoloogsed,

heteroloogsed või ksenogeensed. Soovi korral võivad need rakud olla

inimtaoliseks tehtud. Immunoloogilise reaktsiooni võimalikkuse alandamiseks

võivad rakud olla kapseldatud, et vältida ümbritsevate kudede infiltratsiooni.

Kapseldatud materjalid on tavaliselt bioloogiliselt ühtivad, poolläbilaskvad 15

polümeersed kestad või membraanid, mis võimaldavad proteiinprodukti(de)

vabanemist, aga ennetavad rakkude hävinemist patsiendi immuunsüsteemi poolt

või muude ümbritsevatest kudedest tulenevate kahjulike faktorite poolt.

Polüteraapia

Leiutise spetsiifilisi sideaineid (nagu peptikehad) saab kasutada koos teiste 20

ravimitega Ang-2 ekspressiooniga seostatavate haiguste ravimisel. Nende teiste

ravimite seas on näiteks kiiritusravi, kemoteraapia ja sihtmärgistatud ravimid nagu

Herceptin™, Rituxan™, Gleevec™ ja muu sarnane. Siin eraldi loetlemata

täiendavad polüteraapiad kuuluvad samuti käesoleva leiutise ulatusse.

Järelikult hõlmab leiutis ühe või mitme leiutise spetsiifilise sideaine manustamist 25

samale patsiendile koos ühe või mitme täiendavalt sobiva ainega, millest igaühte

manustatakse vastavalt sellele ravimisele sobivale režiimile. Siia kuulub leiutise

spetsiifilise sideaine ning ühe või mitme sobiva aine samaaegne manustamine.

Siin kasutatud terminid „manustatakse üheaegselt“ ja „üheaegne manustamine“

hõlmab ühe või mitme spetsiifilise sideaine (nagu peptiid või peptikeha) vastavalt 30

EE - EP1615952 B1 68

leiutisele üsna üheaegset manustamist koos ühe või mitme täiendavalt sobiva

ainega.

Siin kasutatud termin „mitte-üheaegne“ manustamine hõlmab ühe või mitme

selektiivse sideaine (nagu peptiid või peptikeha) vastavalt leiutisele ning ühe või

mitme täiendavalt sobiva aine manustamist erinevatel aegadel või mis tahes 5

järjekorras kas kattuvalt või mitte. Siia kuulub muuhulgas järjestikune ravi (nagu

eelravi, järelravi või kattuv ravi) kombinatsioon komponentidega ning ka režiimid,

kus ravimeid vahetatakse välja või kus ühte komponenti manustatakse

pikaajaliselt ning teist(i) manustatakse perioodiliselt. Komponente võib manustada

samades või eraldi koostistes ning samal või erineval manustamisviisil. 10

Kemoteraapiaga ravimine võib rakendata anti-neoplastilisi aineid, sealhulgas

näiteks alküülivaid aineid, sealhulgas: lämmastik-sinepid nagu meklooretamiin,

tsüklofosfamiid, ifosfamiid, melfalaan ja klorambutsiil; nitrosouuread nagu

karmustiin (BCNU), lomustiin (CCNU) ja semustiin (metüül-CCNU);

etüleenimiinid/metüülmelamiin nagu trietüleenamiin (TEM), trietüleen, 15

tiofosforamiid (tiotepa), heksametüül-melamiin (HMM, altretamiin);

alküülsulfonaadid nagu busulfaan; triasiinid nagu dakarbasiin (DTIC);

antimetaboliidid, sealhulgas foolhappe analoogid nagu metotreksaat ja

trimetreksaat, pürimidiini analoogid nagu 5-fluorouratsiil, fluorodeoksüuridiin,

gemtsitabiin, tsütosiin-arabinosiid (AraC, tsütarabiin), 5-asatsütidiin, 2,2’-20

difluorodeoksütsütidiin, puriini analoogid nagu 6-merkaptopuriin, 6-tioguaniin,

asatiopuriin, 2’-deoksükoformütsiin (pentostatiin), erütrohüdroksünonüüladeniin

(EHNA), fludarabiinfosfaat ja 2-klorodeoksüadenosiin (kladribiin, 2-CdA);

looduslikud tooted, sealhulgas antimitootilised ravimid nagu paklitakseel, vinka-

alkaloidid, sealhulgas vinblastiin (VLB), vinkristiin ja vinorelbiin, taksoteer, 25

estramustiin ja estramustiinfosfaat; epipodofüllotoksiinid nagu etoposiid ja

teniposiid; antibiootikumid nagu aktinomütsiin D, daunomütsiin (rubidomütsiin),

doksorubitsiin, mitoksantroon, idarubitsiin, bleomütsiinid, plikamütsiin

(mitramütsiin), mitomütsiin C ja aktinomütsiin; ensüümid nagu L-asparaginaas;

bioloogilise reaktsiooni modifikaatorid nagu interferoon-alfa, IL-2, GCSF ja GM-30

CSF; mitmesugused ained, sealhulgas plaatina koordinatsioonikompleksid nagu

tsisplatiin ja karboplatiin, antratseendioonid nagu mitoksantroon, asendatud uurea

EE - EP1615952 B1 69

nagu hüdroksü-uurea, metüülhüdrasiini derivaadid, sealhulgas N-metüülhüdrasiin

(MIH) ja prokarbasiin, neerupealiste supressandid nagu mitotaan (o,p’-DDD) ja

aminogluteetimiid; hormoonid ja antagonistid, sealhulgas adrenokortikosteroidsed

antagonistid nagu prednisoon ja ekvivalendid deksametasoon ja

aminogluteetimiid; progestiin nagu hüdroksüprogesteroon-kaproaat, 5

medroksüprogesteroon-atsetaat ja megestroolatsetaat; östrogeen nagu

dietüülstilbestrool ja etinüül-estradiooli ekvivalendid; antiöstrogeen nagu

tamoksifeen; androgeenid, sealhulgas testosteroon-propionaat ja

fluoksümesteroon/ekvivalendid; antiandrogeenid nagu flutamiid, gonadotropiini

vabastava hormooni analoogid ja leuproliid; ning mittesteroidsed antiandrogeenid 10

nagu flutamiid.

Kasvufaktoritega kombineeritud ravi võib hõlmata tsütokiine, lümfokiine,

kasvufaktoreid või teisi hematopoeetilisi faktoreid nagu M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-

1, IL-2, IL-3, BL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15,

IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNF0, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, 15

trombopoietiin, tüverakufaktor ja erütropoietiin. Teiste koostiste seas võivad olla

teadaolevad angiopoietiinid, näiteks Ang-1, -2, -4, -Y ja/või inimese Ang-sarnane

polüpeptiid ja/või vaskulaarse endoteeli kasvufaktor (VEGF). Kasvufaktorite seas

on angiogeniin, luu morfogeenne proteiin-1, luu morfogeenne proteiin-2, luu

morfogeenne proteiin-3, luu morfogeenne proteiin-4, luu morfogeenne proteiin-5, 20

luu morfogeenne proteiin-6, luu morfogeenne proteiin-7, luu morfogeenne proteiin-

8, luu morfogeenne proteiin-9, luu morfogeenne proteiin-10, luu morfogeenne

proteiin-11, luu morfogeenne proteiin-12, luu morfogeenne proteiin-13, luu

morfogeenne proteiin-14, luu morfogeenne proteiin-15, luu morfogeenne proteiini-

retseptor IA, luu morfogeenne proteiini-retseptor IB, aju närvikasvufaktor, tsiliaarne 25

neurotroofne faktor, tsütokiini põhjustatud neutrofiili kemotaktiline faktor 1,

tsütokiin-tekitatud neutrofiil, kemotaktiline faktor 2, tsütoküün-põhjustatud neutrofiili

kemotaktiline faktor 2, endoteelraku kasvufaktor, endoteliin-1, epidermaalne

kasvufaktor, epiteelist tuletatud neutrofiili atraktant, fibroblasti kasvufaktor 4,

fibroblasti kasvufaktor 5, fibroblasti kasvufaktor 6, fibroblasti kasvufaktor 7, 30

fibroblasti kasvufaktor 8, fibroblasti kasvufaktor 8b, fibroblasti kasvufaktor 8c,

fibroblasti kasvufaktor 9, fibroblasti kasvufaktor 10, happeline fibroblasti

kasvufaktor, aluseline fibroblasti kasvufaktor, gliia päritolu neurotroofne faktor-1,

EE - EP1615952 B1 70

gliia päritolu neurotroofne faktor-2, kasvuga seotud proteiin, kasvuga seotud

proteiin-1, kasvuga seotud proteiin-2, kasvuga seotud proteiin-3, hepariini siduv

epidermaalne kasvufaktor, hepatotsüüdi kasvufaktor, hepatotsüüdi kasvufaktori

retseptor, insuliinisarnane kasvufaktor I, insuliinisarnane kasvufaktori retseptor,

insuliinisarnane kasvufaktor II, insuliinisarnast kasvufaktorit siduv proteiin, 5

keratinotsüüdi kasvufaktor, leukeemiat inhibeeriv faktor, leukeemiat inhibeeriv

faktor-1, närvi kasvufaktor, närvi kasvufaktori retseptor, neurotrofiin-3, neurotrofiin-

4, platsenta kasvufaktor, platsenta kasvufaktor 2, vereliistakutest pärit

endoteelraku kasvufaktor, vereliistakutest pärit kasvufaktor, vereliistakutest pärit

kasvufaktori A ahel, vereliistakutest pärit kasvufaktor AA, vereliistakutest pärit 10

kasvufaktor AB, vereliistakutest pärit kasvufaktori B ahel, vereliistakutest pärit

kasvufaktor BB, vereliistakutest pärit kasvufaktori retseptor-1, vereliistakutest pärit

kasvufaktor retseptor-2, pre-B raku kasvu stimuleeriv faktor, tüveraku faktor,

tüveraku faktori, transformeeriv kasvufaktor-1, transformeeriv kasvufaktor-2,

transformeeriv kasvufaktor-1, transformeeriv kasvufaktor-1,2, transformeeriv 15

kasvufaktor-2, transformeeriv kasvufaktor-3, transformeeriv kasvufaktor-5, latentne

transformeeriv kasvufaktor-1, transformeeriva kasvufaktori-1 seostusvalk I,

transformeeriva kasvufaktori-1 seostusvalk II, transformeeriva kasvufaktori-1

seostusvalk III, kasvaja nekroosifaktori retseptori I tüüp (TNF-R1), kasvaja

nekroosifaktori retseptori II tüüp (TNF-R2), urokinaasi-tüüpi plasminogeeni 20

aktivaator-retseptor, vaskulaarne endoteeli kasvufaktor ning kimäärsed valgud ja

nende bioloogiliselt või immunoloogiliselt aktiivsed fragmendid.

On mõistetav, et leiutise spetsiifilisi sideaineid (nagu peptiidid või peptikehad) võib

manustada ühe või mitme põletikuvastase ainega. Siin kasutatud termin

„põletikuvastane“ tähendab üldiselt mis tahes ainet, mis alandab patsiendil 25

põletikku või tursumist. Siin on loetletud terve hulk põletikuvastaste ainete näiteid,

aga on mõistetav, et võib leiduda täiendavaid sobivaid põletikuvastaseid aineid,

mida ei ole siin loetletud, kuid mida antud leiutis hõlmab.

Põletikuvastane aine võib olla näiteks ühend, mis inhibeerib põletikuliste

tsütokiinide koostoimet nende retseptoritega. Leiutise spetsiifiliste sideainetega 30

kombineeritult kasulike tsütokiini inhibiitorite näidete seas on näiteks TGF-β

antagonistid (nagu antikehad) ning antagonistid (nagu antikehad), mis on

EE - EP1615952 B1 71

suunatud põletikus osalevate interleukiinide vastu. Taolisi interleukiine on siin

kirjeldatud ning eelistatult on nende seas muuhulgas IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-

6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17 ja IL-18. Vaata Feghali, et al, Frontiers in

Biosci., 2:12-26 (1997).

Leiutise spetsiifilisi sideaineid võib manustada ka koos I tüüpi proteiini kinaasi A 5

inhibiitoritega, et parandada T-raku proliferatsiooni HIV nakkusega patsientidel,

kes saavad anti-retroviirusravi.

Närvi kasvufaktoreid (NGF-d) saab kombineerida ka leiutise spetsiifiliste

sideainetega teatud seisundite ravimiseks. Taoliste seisundite seas on

neurodegeneratiivsed haigused, seljaaju vigastused ja hulgiskleroos. Antud 10

kombinatsiooniga ravitavad muud haigused on glaukoom ja diabeet.

Eelistatud kombinatsiooniravi käsitleb leiutise spetsiifilist sideainet, mida

manustatakse patsiendile koos ühe või mitme sobiva IL-1 inhibiitoriga. IL-1

inhibiitorite seas on muuhulgas IL-1 retseptorit siduvad peptiidi fragmendid, IL-1

või IL-1 beeta või IL-1 retseptori I tüübi vastu suunatud antikehad ning 15

rekombinantsed proteiinid, mis sisaldavad kõiki või osa retseptoreid IL-1 või selle

modifitseeritud variantidele, sealhulgas geneetiliselt modifitseeritud muteiinid,

multimeersed vormid ja pidevalt vabanevad formulatsioonid. Spetsiifiliste

antagonistide seas on IL-1ra polüpeptiidid, IL-1 beetat konverteeriva ensüümi

(ICE) inhibiitorid, antagonistlikud I tüüpi I IL-1 retseptori antikehad, I tüüpi IL-1 20

retseptori ja II tüüpi IL-1 retseptori IL-1 seostusvormid, IL-1 antikehad, sealhulgas

IL-1 alfa ja IL-1 beeta ning teised IL-1 perekonna liikmed ning ravim nimega IL-1

Trap (Regeneron). IL-1ra polüpeptiidide seas on IL-1ra vormid, mida on kirjeldatud

USA patendis nr 5,075,222, ning modifitseeritud vormid ja variandid, sealhulgas

need, mida on kirjeldatud patentides U.S. 5,922,573, WO 91/17184, WO 92 16221 25

ja WO 96 09323. IL-1 beetat konverteeriva ensüümi (ICE) inhibiitorite seas on

peptidüül ja väikse molekuli ICE inhibiitorid, sealhulgas need, mida on kirjeldatud

PCT patenditaotlustes WO 91/15577, WO 93/05071, WO 93/09135, WO 93/14777

ja WO 93/16710 ning Euroopa patenditaotluses 0 547 699. Mitte-peptidüüli

ühendite seas on need, mida on kirjeldatud PCT patenditaotluses WO 95/26958, 30

USA patendis nr 5,552,400, USA patendis nr 6,121,266, ja Dolle et al, J. Med

Chem., 39, lk 2438-2440 (1996). Täiendavaid ICE-sid on kirjeldatud USA

EE - EP1615952 B1 72

patentides nr 6,162,790, 6,204,261, 6,136,787, 6,103,711, 6,025,147, 6,008,217,

5,973,111, 5,874,424, 5,847,135, 5,843,904, 5,756,466, 5,656,627 ja 5,716,929.

Tüüp I IL-1 retseptori ja tüüp II IL-1 retseptori IL-1 seostusvorme on kirjeldatud

USA patentides nr 4,968,607, 4,968,607, 5,081,228, Re 35,450, 5,319,071 ja

5,350,683. Teiste sobivate IL-1 antagonistide seas on muuhulgas IL-1-st pärit 5

peptiidid, mis suudavad konkureerivalt seonduda IL-1 signaalivale retseptorile I

tüüpi IL-1R. Teatud IL-1 (ja teise tsütokiini) antagoniste puudutavaid täiendavaid

juhiseid võib leida USA patendis nr 6,472,179.

Lisaks on sobilikud TNF inhibiitorid ja nende seas on muuhulgas TNFα retseptorit

siduva peptiidi fragmendid, antisenssed oligonukleotiidid või ribosüümid, mis 10

inhibeerivad TNFα tootmist, TNFα vastu suunatud antikehad ning rekombinantsed

proteiinid, mis sisaldavad kõiki või osa retseptoreid TNFα või selle modifitseeritud

variantide jaoks, sealhulgas geneetiliselt muundatud muteiinid, multimeersed

vormid ja pidevalt vabanevad formulatsioonid. Samuti on sobivad TACE (kasvaja

nekroosifaktorit-α konverteeriv ensüüm) inhibiitorid, nagu TAPI (Immunex Corp.) ja 15

GW-3333X (Glaxo Wellcome Inc.). Samuti sobivad molekulid, mis inhibeerivad

IgA-α1AT kompleksi moodustumist, nagu patendis EP 0 614 464 B avaldatud

peptiidid, või selle kompleksi vastased antikehad. Lisaks on sobivate molekulide

seas muuhulgas TNFα-inhibeerivad disahhariidid, glükosamiini sulfaaditud

derivaadid või teised sarnased süsivesikud, mida on kirjeldatud USA patendis nr 20

6,020,323. Täiendavate sobivate molekulide seas on peptiidi TNFα inhibiitorid,

mida on kirjeldatud USA patentides nr 5,641,751 ja 5,519,000, ning D-aminohapet

sisaldavad peptiidid, mida on kirjeldatud USA patendis nr 5,753,628. Lisaks

sobivad ka TNFα konverteeriva ensüümi inhibiitorid. WO 01/03719 kirjeldab

täiendavaid aineid, mida saab vastavalt leiutisele koos kasutada. 25

Ent veel on sobivate ühendite seas muuhulgas väiksed molekulid nagu talidomiid

või talidomiidi analoogid, pentoksifülliin või maatriks metalloproteinaasi (MMP)

inhibiitorid või teised väiksed molekulid. Antud sihtotstarbeks sobivate MMP

inhibiitorite seas on näiteks need, mida on kirjeldatud USA patentides nr

5,883,131, 5,863,949 ja 5,861,510, ning merkapto-alküülpeptidüül ühendid, nagu 30

on kirjeldatud USA patendis nr 5,872,146. TNFα tootmist alandada suutvate teiste

väikeste molekulide seas on näiteks molekulid, mida on kirjeldatud USA

EE - EP1615952 B1 73

patentides nr 5,508,300, 5,596,013 ja 5,563,143. Täiendavate sobivate väikeste

molekulide seas on muuhulgas MMP inhibiitorid, nagu on kirjeldatud USA

patentides nr 5,747,514 ja 5,691,382, ning hüdroksaamhappe derivaadid, nagu on

kirjeldatud USA patendis nr 5,821,262. Sobivate lisa molekulide seas on näiteks

väiksed molekulid, mis inhibeerivad fosfodiesteraasi IV ja TNFα tootmist nagu 5

asendatud oksiimi derivaadid (WO 96/00215), kinoliin-sulfoonamiidid (USA patent

nr 5,834,485), arüülfuraani derivaadid (WO 99/18095) ja heterobitsüklilised

derivaadid (WO 96/01825; GB 2 291 422 A). Kasulikud on ka tiasoolid derivaadid,

mis pärsivad TNFα ja IFNα (WO99/15524), ning ksantiini derivaadid, mis pärsivad

TNFα ja teisi proinflammatoorseid tsütokiine (vaata näiteks USA patente 10

5,118,500, 5,096,906 ja 5,196,430). Siin kirjeldatud seisundite ravimiseks kasulike

täiendavate väikeste molekulide seas on need, mida on kirjeldatud USA patendis

nr 5,547,979.

Kombineeritud raviga manustatavate ravimite ja ravimitüüpide täiendavate näidete

seas on muuhulgas viirusevastased ained, antibiootikumid, analgeetikumid (nt 15

atseetaminofeen, kodeiin, propoksüfeen-napsülaat, oksükodoon vesinikkloriid,

hüdrokodoon bitartraat, tramadool), kortikosteroidid, põletikuliste tsütokiinide

antagonistid, haigust modifitseerivad antireumaatilised ravimid (DMARD-d),

mittesteroidsed põletikuvastased ravimid (NSAID-d) ja aeglase toimega

antireumaatilised ravimid (SAARD-d). 20

Haigust modifitseerivate antireumaatiliste ravimite (DMARD-d) näidete seas on

muuhulgas: Rheumatrex™ (metotreksaat), Enbrel® (etanertsept), Remicade®

(infliksimaab), Humira™ (adalimumaab), Segard® (afelimomaab), Arava™

(leflunomiid), Kinere™ (anakinra), Arava™ (leflunomiid), D-penitsillamiin,

Myochrysine, Plaquenil, Ridaura™ (auranofiin), Solganal, lenertsept (Hoffman-La 25

Roche), CDP870 (Celltech), CDP571 (Celltech), ning antikehad, mida on

kirjeldatud patendis EP0 516 785 B1, USA patendis nr 5,656,272, EP0 492 448

A1, onertsept (Serono; CAS reg-nr 199685-57-9), MRA (Chugai), Imuran™

(asatiopriin), NFKB inhibiitorid; Cytoxan™ (tsüklofosfamiid), tsüklosporiin,

hüdroksüklorokiin-sulfaat, minotsükliin, sulfasalasiin ning kullaühendid nagu 30

suukaudsed kullaravimid, kuld-naatriumtiomalaat ja aurotioglükoos.

EE - EP1615952 B1 74

Järgmiste sobivate molekulide seas on näiteks lahustuvad TNFR-d, mis

pärinevad p55 ja p75 TNFR-dest erineva TNFα retseptori molekulide rakuvälistest

piirkondadest nagu näiteks TNFR, mida on kirjeldatud patendis WO 99/04001,

sealhulgas sellest TNFR-st pärinevad TNFR-Ig-d. Järgmised asjakohased TNFα

inhibiitorid sobivad siin kirjeldatud kasutuseks. Nende seas on lisaks siin 5

kirjeldatud TNFα või TNFR vastase antikeha kasutamisele ka TNFα-st pärit

peptiid, mis võivad toimida TNFα konkureeriva inhibiitorina (nagu need, mida on

kirjeldatud USA patendis nr 5,795,859 või USA patendis nr 6,107,273), TNFR-IgG

sulandvalgud, nagu see, mis sisaldab, lahustuva TNFR ja IgG sulandvalgust

erineva p55 TNFα retseptori rakuvälist osa, või teised molekulid, mis alandavad 10

endogeense TNFα tasemeid nagu TNFα konverteeriva ensüümi inhibiitorid (vaata

nt U.S. 5,594,106), või väikesed molekulid või TNFα inhibiitorid, millest osa on siin

kirjeldatud.

Kuigi TNF antikehadega seoses määrab optimaalse annuse kogenud

tervisetöötaja vastavalt kõnealuse patsiendi konkreetsetele vajadustele, on üks 15

eelistatud annuse vahemiku näidis TNFα vastasele antikehale 0,1 kuni 20mg/kg ja

veel soovitatavamalt 1-10mg/kg. Teine eelistatud annuse vahemik anti-TNFα

antikeha jaoks on 0,75 kuni 7,5mg/kg kehamassist.

Käesolev leiutis võib ka rakendada spetsiifilist sideainet ja mis tahes ühte või mitut

mitte-steroidset põletikuvastast ravimit (NSAID-d). NSAID-de põletikuvastane 20

toime tuleneb vähemalt osaliselt prostaglandiini sünteesi inhibeerimisest.

Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, MacMillan 7.

väljaanne (1985). NSAID-d saab jaotada üheksaks rühmaks: (1) salitsüülhappe

derivaadid, (2) propioonhappe derivaadid, (3) äädikhappe derivaadid, (4)

fenaamhappe derivaadid, (5) karboksüülhappe derivaadid, (6) butüürhappe 25

derivaadid, (7) oksikaamid, (8) pürasoolid ja (9) pürasoloonid. NSAID-de näidete

seas on muuhulgas: Anaprox™, Anaprox DS™ (naprokseen-naatrium); Ansaid™

(flurbiprofeen), Arthrotec™ (diklofenaknaatrium + misoprostiil),

Cataflam™/Voltaren™ (diklofenak-kaalium); Clinoril™ (sulindak), Daypro™

(oksaprosiin), Disalcid™ (salsalaat), Dolobid™ (diflunisaal), EC Naprosyn™ 30

(naprokseen-naatrium), Feldene™ (piroksikaam), Indocin™, Indocin SR™

(indometatsiin), Lodine™, Lodine XL™ (etodolak), Motrin™ (ibuprofeen),

EE - EP1615952 B1 75

Naprelan™ (naprokseen), Naprosyn™ (naprokseen); Orudis™, (ketoprofeen),

Oruvail™ (ketoprofeen), Relafen™ (nabumetoon), Tolectin™, (tolmetiin-naatrium),

Trilisate™ (koliin-magneesium-trisalitsülaat), Cox-1 inhibiitorid, Cox-2 inhibiitorid

nagu Vioxx™ (rofekoksiib), Arcoxia™ (etorikoksiib), Celebrex™ (tselekoksiib),

Mobic™ (meloksikaam), Bextra™ (valdekoksiib), Dynastat™ (parakoksiib-5

naatrium), Prexige™ (lumirakoksiib) ja nambumetoon. Täiendavate sobivate

NSAID-de seas on muuhulgas järgnevad: ε-atseetamido-kaproonhape, S-

adenosüülmetioniin, 3-amino-4-hüdroksübutüürhape, amiksetriin, anitrasafeen,

antrafeniin, bendasak, bendasak-lüsinaat, bensüdamiin, beprosiin, broperamool,

bukoloom, bufesolak, kiprokvasoon (ciproquazone), kloksimaat (cloximate), 10

dasidamiin (dazidamine), deboksameet (deboxamet), detomidiin, difeenpiramiid

(difenpiramide), difeenpüramiid (difenpyramide), difisalamiin (difisalamine),

ditasool, emorfasoon, fanetisool mesülaat, fenflumisool, floktafeniin, flumisool,

fluniksiin, fluprokvasoon (fluproquazone), fopirtoliin (fopirtoline), fosfosaal,

guaimesaal (guaimesal), guaiasuleen, isoniksirn (isonixirn), lefetamiin HCl, 15

leflunomiid, lofemisool, lotifasool, lüsiin-kloniksinaat (lysin clonixinate),

meseklasoon, nabumetoon, niktindool, nimesuliid, orgoteiin, orpanoksiin,

oksakeprolm (oxaceprolm), oksapadool, paranüliin (paranyline), perisoksaal,

perisoksaaltsitraat, pifoksiim, piprokseen (piproxen), pirasolak, pirfenidoon,

prokvasoon (proquazone), proksasool, tielaviin B (thielavin B), tiflamisool, 20

timegadiin, tolektiin (tolectin), tolpadool, trüptamiid ja need, mis on märgitud firma

koodnumbriga nagu 480156S, AA861, AD1590, AFP802, AFP860, AI77B, AP504,

AU8001, BPPC, BW540C, CHINOIN 127, CN100, EB382, EL508, F1044, FK-506,

GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309,

ONO3144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, 25

SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TAI-901 (4-bensoüül-1-

indaankarboksüülhape), TVX2706, U60257, UR2301 ja WY41770. NSAID-dega

sarnaste analgeetiliste ja põletikuvastaste omadustega strukturaalselt seonduvad

NSAID-d kuuluvad samuti antud rühma.

Sobivate SAARD-ide või DMARD-ide seas on muuhulgas: allocupreide naatrium, 30

auranofiin, aurotioglükoos, aurotioglükaniid, asatiopriin, brekvinaar (brequinar)

naatrium, butsillamiin, kaltsium 3-aurotio-2-propanool-1-sulfonaat, klorambutsiil,

klorokiin, klobusariit, kuproksoliin, tsüklofosfamiid, tsüklosporiin, dapsoon, 15-

EE - EP1615952 B1 76

deoksüspergualiin, diatsereiin, glükoosamiin, kulla soolad (nt tsükloniini

(cycloquine) kulla sool, kuld naatrium-tiomalaat, kuld-naatrium-tiosulfaat),

hüdroksüklorokiin, hüdroksü-uurea, kebusoon, levamisool, lobensariit, melitiin, 6-

merkaptopuriin, metotreksaat, misoribiin, mükofenolaat mofetiil, myoral,

lämmastik-sinep, D-penitsillamiin, püridinool imidasoolid nagu SKNF86002 ja 5

SB203580, rapamütsiin, tioolid, tümopoietiin (thymopoietin) ja vinkristiin. Sarnaste

analgeetiliste ja põletikuvastaste omadustega strukturaalselt seotud SAARD-d või

DMARD-d kuuluvad samuti antud rühma.

Signaalkaskaadides olevate kinaaside inhibiitorid on samuti sobivad ained leiutise

spetsiifiliste sideainetega kombineerimiseks. Nende seas on muuhulgas ained, 10

mis suudavad inhibeerida P-38 (alias „RK“ või „SAPK-2“, Lee et al, Nature,

372:739 (1994). P-38 iseloomustatakse kui seriin/treoniini kinaasi (vaata Han et al,

Biochimica Biophysica Acta, 1265:224-227 (1995). On tõestatud, et P-38

inhibiitorid sekkuvad rakuvälisesse stiimulisse ja IL-1 eritumisse ning rakust pärit

TNFα hõlmab signaalitransduktsiooni blokeerimist signaali rajal oleva kinaasi 15

inhibeerimise kaudu.

Lisaks on sobivad MK2 inhibiitorid ja tpl-2 inhibiitorid. Täiendavalt on sobilikud T-

raku inhibiitorid, sealhulgas näiteks ctla-4, CsA, Fk-506, OX40, OX40R-Fc, OX40

antikeha, OX40 ligand, OX40 ligandi antikeha, lck ja ZAP70. Lisaks sobivad ka

retinoidid, sealhulgas suukaudsed retinoidid ning TGF-β antagonistid. 20

Leiutise spetsiifiliste sideainetega kombineerimiseks sobivate järgmiste ainete

seas on näiteks mis tahes üks või mitu salitsüülhappe derivaati, eelravimi estrit või

selle farmatseutiliselt sobivat soola. Taoliste salitsüülhappe derivaatide, eelravimi

estrite või selle farmatseutiliselt sobivate soolade seas on: atseetaminosalool,

aloksipriin (aloxiprin), aspiriin, benorülaat, bromosaligeniin, kaltsium-25

atsetüülsalitsülaat, koliin-magneesium trisalitsülaadi diflusinaal, etersalaat,

fendosaal, gentishape, glükool-salitsülaat, imidasool-salitsülaat, lüsiin

atsetüülsalitsülaat, mesalamiin, morfoliin-salitsülaat, 1-naftüül-salitsülaat,

olsalasiin, parsalmiid, fenüül atsetüülsalitsülaat, fenüülsalitsülaat, salatseetamiid,

salitsüülamiid O-äädikhape, salsalaat ja sulfasalasiin. Sarnaste analgeetiliste ja 30

põletikuvastaste omadustega strukturaalselt seotud salitsüülhappe derivaadid on

samuti siia rühma kaasatud. Täiendavate sobivate ainete seas on näiteks

EE - EP1615952 B1 77

propioonhappe derivaadid, eelravimi estrid või nende farmatseutiliselt sobivad

soolad. Propioonhappe derivaatide, eelravimi estrite või nende farmatseutiliselt

sobivate soolade seas on: alminoprofeen, benoksaprofeen, buklokshape,

karprofeen, deksindoprofeen, fenoprofeen, flunoksaprofeen, fluprofeen,

flurbiprofeen, furkloprofeen, ibuprofeen, ibuprofeen-alumiinium, ibuproksaam, 5

indoprofeen, isoprofeen, ketoprofeen, loksoprofeen, miroprofeen, naprokseen,

oksaprosiin, piketoprofeen, pimeprofeen (pimeprofen), pirprofeen, pranoprofeen,

protisiinhape (protizinic acid), püridoksiprofeen (pyridoxiprofen), suprofeen,

tiaprofeenhape ja tioksaprofeen. Sarnaste analgeetiliste ja põletikuvastaste

omadustega strukturaalselt seotud propioonhappe derivaadid on samuti siia 10

rühma kaasatud. Kasutuseks sobivad ka äädikhappe derivaadid, eelravimi estrid

või nende farmatseutiliselt sobivad soolad. Äädikhappe derivaatide, eelravimi

estrite või nende farmatseutiliselt sobivate soolade seas on: atsemetatsiin,

alklofenak, amfenak, bufeksamak, tsinmetatsiin, klopirak (clopirac), delmetatsiin,

diklofenak-naatrium, etodolak, felbinak, fenklofenak, fenklorak, fenklosiinhape 15

(fenclozic acid), fentiasak, furofenak, glükametatsiin (glucametacin), ibufenak,

indometatsiin, isofesolak, isoksepak (isoxepac), lonasolak, metiasiinhape,

oksametatsiin, okspinak, pimetatsiin, proglumetatsiin, sulindak, talmetatsiin,

tiaramiid, tiopinak, tolmetiin, sidometatsiin ja somepirak. Sarnaste analgeetiliste ja

põletikuvastaste omadustega strukturaalselt seotud äädikhappe derivaadid on 20

samuti siia rühma kaasatud. Järgmised siin kirjeldatud kasutamiseks sobivad on

fenaamhape derivaadid, eelravimi estrid või nende farmatseutiliselt sobivad

soolad. Fenaamhape derivaatide, eelravimi estrite või nende farmatseutiliselt

sobivate soolade seas on: enfenaamhape, etofenamaat, flufenaamhape,

isoniksiin, meklofenaamhape, meklofenamaat-naatrium, medofenaamhape, 25

mefanaamhape, nifluumhape, talniflumaat, terofenamaat, tolfenaamhape ja

ufenamaat. Sarnaste analgeetiliste ja põletikuvastaste omadustega strukturaalselt

seotud fenaamhape derivaadid on samuti siia rühma kaasatud.

Lisaks on sobivad kasutatavad karboksüülhappe derivaadid, eelravimi estrid või

nende farmatseutiliselt sobivad soolad: klidanak, diflunisaal, flufenisaal, inoridiin 30

(inoridine), ketorolak ja tinoridiin. Sarnaste analgeetiliste ja põletikuvastaste

omadustega strukturaalselt seotud karboksüülhappe derivaadid on samuti siia

rühma kaasatud. Lisaks on sobilikud butüürhappe derivaadid, eelravimi estrid või

EE - EP1615952 B1 78

nende farmatseutiliselt sobivad soolad. Kasutatavad butüürhappe derivaadid,

eelravimi estrid või nende farmatseutiliselt sobivad soolad on: bumadisoon,

butibufeen, fenbufeen ja ksenbutsiin. Sarnaste analgeetiliste ja põletikuvastaste

omadustega strukturaalselt seotud butüürhappe derivaadid on samuti siia rühma

kaasatud. Oksikaamid, eelravimi estrid või nende farmatseutiliselt sobivad soolad 5

on samuti sobilikud. Oksikaamide, eelravimi estrite või nende farmatseutiliselt

sobivate soolade seas on: droksikaam, enolikaam, isoksikaam, piroksikaam,

sudoksikaam, tenoksikaam ja 4-hüdroksüül-1,2-bensotiasiin 1,1-dioksiid 4-(N-

fenüül)-karboksamiid. Sarnaste analgeetiliste ja põletikuvastaste omadustega

strukturaalselt seotud oksikaamid on samuti siia rühma kaasatud. Pürasoolid, 10

eelravimi estrid või nende farmatseutiliselt sobivad soolad on samuti sobilikud.

Kasutatavate pürasoolide, eelravimi estrite või nende farmatseutiliselt sobivate

soolade seas on: difenamisool ja epirisool. Sarnaste analgeetiliste ja

põletikuvastaste omadustega strukturaalselt seotud pürasoolid on samuti siia

rühma kaasatud. Lisaks on sobilikud ka pürasoloonid, eelravimi estrid või nende 15

farmatseutiliselt sobivad soolad. Kasutatavad pürasaloonid, eelravimi estrid või

nende farmatseutiliselt sobivad soolad on: apasoon, asapropasoon,

benspiperüloon, feprasoon, mofebutasoon, morasoon, oksüfeenbutasoon,

fenüülbutasoon, pipebusoon, propüülfenasoon, ramifenasoon, suksibusoon ja

tiasolinobutasoon. Sarnaste analgeetiliste ja põletikuvastaste omadustega 20

strukturaalselt seotud pürasaloonid on samuti siia rühma kaasatud.

Lisaks sobivad eelravimi estrid või nende farmatseutiliselt sobivad soolad ka TNF-

põhjustatud haiguste ravimiseks. Kortikosteroidide, eelravimi estrite või nende

farmatseutiliselt sobivate soolade seas on hüdrokortisoon ja ühendid, mis on

tuletatud hüdrokortisoonist nagu 21-atsetoksü-pregnenoloon, alklomerasoon, 25

algestoon, amtsinoniid, beklometasoon, beetametasoon, beetametasoon-valeraat,

budesoniid, kloroprednisoon, klobetasool, klobetasool-propionaat, klobetasoon,

klobetasoon-butüraat, klokortoloon, kloprednool, kortikosteroon, kortivasool,

deflasakon (deflazacon), desoniid, desoksimerasoon (desoximerasone),

deksametasoon, diflorasoon (diflorasone), diflukortoloon, difluprednaat, 30

enoksoloon, fluasakort, flukloroniid, flumetasoon, flumetasoon-pivalaat, flunisoliid,

fluotsinoloonatsetoniid, fluotsinoniid, fluorotsinoloon-atsetoniid (fluorocinolone

acetonide), fluokortiin-butüül, fluokortoloon, fluokortoloon-heksanoaat,

EE - EP1615952 B1 79

diflukortoloon-valeraat, fluorometoloon, fluperoloon-atsetaat, fluprednideen-

atsetaat, fluprednisoloon, flurandenoliid, formokortaal, haltsinoniid, halometasoon,

halopredoon-atsetaat, hüdrokortamaat, hüdrokortisoon, hüdrokortisoon-atsetaat,

hüdrokortisoon-butüraat, hüdrokortisoon-fosfaat, hüdrokortisoon 21-

naatriumsuktsinaat, hüdrokortisoon-tebutaat, masipredoon, medrüsoon, 5

meprednisoon, metüülprednikoloon, mometasoon furoaat, parametasoon,

prednikarbaat, prednisoloon, prednisoloon 21-diedrüaminoatsetaat (prednisolone

21-diedryaminoacetate), prednisoloon naatriumfosfaat, prednisoloon

naatriumsuktsinaat, prednisoloon naatrium 21-m-sulfobensoaat, prednisoloon

naatrium 21-stearoglükolaat, prednisoloon-tebutaat, prednisoloon 21-10

trimetüülatsetaat, prednisoon, prednival, prednülideen, prednülideen 21-

dietüülaminoatsetaat, tiksokortool, triamtsinoloon, triamtsinoloon atsetoniid,

triamtsinoloon benetoniid ja triamtsinoloon heksatsetoniid. Sarnaste analgeetiliste

ja põletikuvastaste omadustega strukturaalselt seotud kortikosteroidid on samuti

siia rühma kaasatud. 15

Antimikroobikumid (ja eelravimi estrid või nende farmatseutiliselt sobivad soolad)

sobivad samuti kombineeritud kasutamiseks, nagu on siin kirjeldatud. Sobivate

antimikroobikumid seas on näiteks ampitsilliin, amoksütsilliin, aureomütsiin,

batsitratsiin, tseftasidiim, tseftriaksoon, tsefotaksiim, tsefakloor, tsefaleksiin,

tsefradiin, tsiprofloksatsiin, klavulaanhape, kloksatsilliin, dikloksatsillaan 20

(dicloxacillan), erütromütsiin, flukloksatsillaan, gentamitsiin, gramitsidiin,

metitsillaan (methicillan), neomütsiin, oksatsillaan (oxacillan), penitsilliin ja

vankomütsiin. Sarnaste analgeetiliste ja põletikuvastaste omadustega

strukturaalselt seotud antimikroobikumid on samuti siia rühma kaasatud.

Täiendavate sobivate ühendite seas on muuhulgas: BN 50730, tenidap, E 5531, 25

tiapafant PCA 4248, nimesuliid, panavir, rolipraam, RP 73401, peptiid T, MDL

201,449A, (1R,3S)-tsis-1-[9-(2,6-diaminopurinüül)]-3-hüdroksü-4-tsüklopenteen

vesinikkloriid, (1R,3R)-trans-1-[9-(2,6-diamino)puriin]-3-atsetoksütsüklopentaan,

(1R,3R)-trans-1-[9-adenüül)-3-asidotüklopentaan vesinikkloriid ja (1R,3R)-trans-1-

[6-hüdroksü-pusin-9-üül)-3-asidotsüklopentaan. 30

On avastatud, et IL-4 võib mõnel juhul nagu astmas esile kutsuda põletikulise

toime, kus IL-4 üle-ekspressioon kopsudes põhjustab epiteelraku hüpertoofiat ning

EE - EP1615952 B1 80

lümfotsüütide, eosinofiilide ja neutrofiilide kuhjumist. See reaktsioon on iseloomulik

teiste Th2 tsütokiinide tekitatud proinflammatoorse reaktsiooni põhiomadustele.

Nagu eespool märgiti, on IL-4 inhibiitorid järelikult kasulikud vastavalt leiutisele.

Lisaks on mõistetav, et teatud immunosupressiivseid ravimeid saab samuti

kasutada artriidi ravimisel, sealhulgas muuhulgas iNOS inhibiitorid ja 5-5

lipoksügenaasi inhibiitorid.

Ingveri puhul on tõestatud, et sellel on teatud põletikuvastased omadused ning

järelikult sobib see põletikuvastase ainena kasutamiseks vastavalt leiutisele, nagu

seda on kondroitiin.

Eespool toodud loetelud on esitatud ainult näidetena ning ei välista teiste ühendite 10

või ravi kasutamist, mida saab siin kirjeldatud ühenditega üheaegselt rakendada ja

antud valdkonnas pädevad isikud tunnevad või mis võivad jõuda antud valdkonnas

pädevate isikuteni, kasutades antud spetsifikatsioonis esitatud juhiseid.

Immuunravimid

Immuunravimid tuginevad üldiselt immuunsete efektorrakkude ja molekulide 15

kasutamisel, et vähirakke sihtida ja hävitada. Immuunefektoriks võib olla

käesoleva leiutise peptikeha, mis tunneb ära teatud markeri sihtraku pinnal.

Peptikeha võib üksinda toimida raviefektorina või kaasata teisi rakke, et rakkude

tapmist algatada. Peptikeha võib olla ka konjugeeritud ravimile või mürgile

(kemoterapeutiline ravim, radionukliid, ritsiini A-ahel, koolera mürk, läkaköha mürk 20

jne) ning seeläbi võib see toimida ainult märklaud-ravimina.

Vastavalt käesolevale leiutisele võivad Ang-2 mutantvormid olla immuunravi

sihtmärgiks kas leiutise peptikehade või peptikeha konjugaatidega. Eriti

võimalikuks peetakse, et peptikeha kompositsioone võib kasutada kombineeritud

teraapia võttes koos Ang-2 sihtmärgistatud raviga. 25

Tõestatult on passiivne immuunravi eriti tõhus mitmesuguste vähkide vastu. Vaata

näiteks patenti WO 98/39027.

Järgnevad näited on mõeldud ainult illustreerimiseks ning neid ei tohiks

tõlgendada leiutise ulatust mingil moel piiravana.

EE - EP1615952 B1 81

Näide 1

Ang-2 ekspressioon patoloogilises ja normaalses koes

Ang-2 ekspressiooni vaadeldi normaalses ja patoloogilises koes in situ

hübridisatsiooni kasutades. Inimese (GenBanki registreerimisnumber: AF004327,

nukleotiidid 1274-1726) ja hiirte (GenBanki registreerimisnumber: AF004326, 5

nukleotiidid 1135-1588) Ang-2 järjestuste fragmente võimendati

pöördtranskriptaas-PCR-ga inimese või hiire loote kopsu cDNA-st, klooniti pGEM-

T plasmiidi ja kinnitati sekventeerimisel. 33P-märgistusega antisense-RNA proove

transkribeeriti lineaarsetest plasmiidi mudelitest, kasutades 33P-UTP ja RNA

polümeraasi. Formaldehüüdiga fikseeritud parafiinis olevad kudede plokid jaotati 10

5µM kaupa lõikudesse ning koguti laetud slaididele. Enne in situ hübridisatsiooni

tehti koed läbilaskvaks 0,2MHCL-ga, millele järgnes proteinaasi K-ga lagundamine

ning atsetüülimine trietanoolamiini ja äädikhappe anhüdriidiga. Lõigud ristati

radiomärgistusega prooviga öö jooksul temperatuuril 55 ˚C ning edastati siis

RNaasi lagundamisse ning kõrgpiiratud pessu umbes 0,1xSSC temperatuuril 55 15

˚C. Slaidid pisteti Kodak NTB2 emulsiooni, hoiti 2-3 nädalat temperatuuril 4 ˚C,

neid arendati ning märgistati vastupidise värviga. Lõike uuriti pimevälja ja

standardvalgustamisega, et võimaldada koe morfoloogia ja hübridisatsiooni

signaali üheaegset hindamist.

Tulemused näitasid, et normaalses sünnijärgses inimeses on Ang-2 ekspressioon 20

piiratud väheste kudedeni, mis sisaldavad angiogeenilist vaskulatuuri nagu

munasarjad, platsenta ja emakas. Ang-2 ekspressiooni ei tuvastatud normaalses

inimese südames, ajus, neerus, maksas, kopsus, pankreases, põrnas, lihastes,

mandlites, tüümuses, pimesooles, lümfisõlmes, sapipõies, eesnäärmes ega

mundandites. Viie nädala vanusel hiirel (aga mitte täiskasvanud ahvil või inimesel) 25

ilmnes neerudes märkimisväärset Ang-2 ekspressiooni soolestikus. Et tuvastada,

kas see ekspressioon oli embrüonaalse arengu jäänus, korrati katset kuni ühe

aasta vanustelt hiirtelt pärit neerudel, kasutades hiirte Ang-2 proovi ning eespool

kirjeldatud tingimusi. Ang-2 ekspressiooni puhul täheldati alanemist vastsündinute

arengus, aga oli endiselt ilmne ühe aasta vanuste hiirte neerudes. 30

EE - EP1615952 B1 82

Ang-2 ekspressioon tuvastati praktiliselt kõikides testitud kasvajaliikides,

sealhulgas inimese primaarsetes kasvajates nagu käärsoole kartsinoom (5

juhtumit), rinnakartsinoom (10 juhtumit), kopsukartsinoom (8 juhtumit),

glioblastoom (1 juhtum), inimese metastaatilistes kasvajates nagu rinnakartsinoom

(2 juhtumit), kopsukartsinoom (2 juhtumit) ning munasarja kartsinoom (2 juhtumit), 5

mis olid läinud üle ajju, ning näriliste kasvajamudelites nagu C6 (roti glioom), HT29

(inimese käärsoole kartsinoom), Colo-205 (inimese käärsoole kartsinoom),

HCT116 (inimese käärsoole kartsinoom), A431 (inimese epidermoidne

kartsinoom), A673 (inimese rhabdomüosarkoom), HT1080 (inimese fibrosarkoom),

PC-3 (inimese eesnäärme kartsinoom), B16F10 (hiire melanoom), MethA (hiire 10

sarkoom) ning metastaasis Lewise kopsukartsinoom. Lisaks tuvastati Ang-2

ekspressiooni uutes veresoontes, mis kasvasid Matrigeli korgis pärast VEGF-ile

reageerimist ning enneaegse retionpaatia hiire hüpoksia mudelis.

Näide 2

Molekulaaranalüüsid Ang-2 peptikehade hindamiseks 15

Molekulaaranalüüsid (afiinsuse ELISA, neutralisatsiooni ELISA ja BIAcore meetod)

töötati välja peptikeha otsese sidumise Ang-2 ja asjakohase perekonnaliikmetele

seondumise ning peptikehade mõju Ang-2:Tie-2 koostoimele hindamiseks. Neid in

vitro analüüse on kirjeldatud järgnevalt.

Afiinsuse ELISA 20

Kandidaat anti-Ang-2 peptikehade esialgseks skriinimiseks kasutati inimese

puhastatud Ang-2 (R&D Systems, Inc; kataloogi number 623-AN; Ang-2 antakse 2

kärbitud versiooni seguna) või hiire Ang-2 polüpeptiidi (valmistati vastavalt eespool

kirjeldatule). Kinnitavate seostumistestideks saadi inimese Ang-2 inimese 293T

rakkude, mis olid transfekteeritud inimese täispika Ang-2 DNA-ga ja kasvatatud 25

ühe ml kohta 50 mikrogrammi veise seerumi albumiini (BSA) sisaldavas

seerumivabas DMEM-is (Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM),

konditsioneeritud söötmest.

Mikrotiitri plaate kasutades lisati igale süvendile ligikaudu 100 mikroliitrit Ang-2

ning seejärel inkubeeriti plaate umbes 2 tundi, mille järel pesti plaate neli korda 30

EE - EP1615952 B1 83

fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS), mis sisaldas umbes 0,1 protsenti

Tween-20. Seejärel süvendid blokeeriti, kasutades iga süvendi kohta umbes 250

mikroliitrit umbes 5 protsenti BSA-d PBS-s ning plaate inkubeeriti umbes 2 tundi

toatemperatuuril. Pärast inkubeerimist üleliigne blokeerimislahus eemaldati ning

100 mikroliitrit iga kandidaat anti-Ang-2 peptikeha lisati süvendile lahjendatud 5

seeriates, alustades kontsentratsiooniga umbes 40 nanomooli ja seejärel

lahjendati seeria kaupa 4-kordselt PBS-s, mis sisaldas umbes 1 protsenti BSA-d.

Neid plaate inkubeeriti seejärel öö jooksul toatemperatuuril. Pärast inkubeerimist

pesti plaate PBS-ga, mis sisaldas umbes 0,1 protsenti Tween-20. Pesemist korrati

täiendavalt neli korda ning seejärel lisati igasse süvendisse umbes 100 mikroliitrit 10

kitse inimesevastast IgG(Fc)-HRP (Pierce Chemical Co., kataloogi nr 31416),

mida oli eelnevalt lahjendatud 1:5000 PBS-sis, kus oli 1 protsent BSA-d. Plaate

inkubeeriti ligikaudu 1 tund toatemperatuuril. Plaate pesti seejärel viis korda PBS-

sis, mis sisaldas umbes 0,1 protsenti Tween-20, mille järel lisati igasse süvendisse

umbes 100 mikroliitrit TMB (3,3’,5,5’-tetrametüülbensidiini vedela substraadi 15

süsteem Liquid Substrate System; Sigma Chemical Company, St. Louis, MO,

kataloogi number T8665) substraati ning plaate inkubeeriti umbes 5-15 minutit

sinise värvuse tekkimiseni. Absorptsiooni loeti spektrofotomeetriga umbes 370nm

juures.

Neutralisatsiooni ELISA 20

Mikrotiitri plaadid, millele inimese Ang-2 polüpeptiid olid seotud, valmistati

afiinsuse ELISA analüüsis. Kandidaat anti-Ang-2 peptikehasid tiitriti 1000nM-st

0,2pM-ni 4-kordsetes lahjendustes PBS lahuses, mis sisaldas umbes 1% BSA-d ja

umbes 1nM Tie-2 (mis anti Tie-2-Fc molekulina, kus Tie-2 osa sisaldab ainult

molekuli lahustuvat rakuvälist osa; R&D Systems, kataloogi number 313-TI). 25

Pärast igale süvendile umbes 100 mikroliitri antikeha/Tie-2 lahuse lisamist

inkubeeriti plaate öö jooksul toatemperatuuril ning seejärel pesti viis korda PBS-is,

mis sisaldas umbes 0,1 protsenti Tween-20. Pärast pesemist lisati igasse

süvendisse umbes 100 mikroliitrit anti-Tie-2 antikeha (Pharmingen Inc., kataloogi

nr 557039) lõppkontsentratsioonil umbes 1 mikrogrammi ml kohta ning plaate 30

inkubeeriti umbes 1 tund toatemperatuuril. Järgmisena lisati igasse süvendisse

100 mikroliitrit kitse hiirevastast-IgG-HRP (Pierce Chemical CO., kataloogi nr

EE - EP1615952 B1 84

31432) lahjendusega 1:10,000 PBS-is, mis sisaldas umbes 1 protsent BSA-d.

Plaate inkubeeriti umbes 1 tund toatemperatuuril, mille järel neid pesti viis korda

PBS-ga, mis sisaldas umbes 0,1 protsenti Tween-20. Seejärel lisati süvendi kohta

100 mikroliitrit TMB substraati (kirjeldati eespool) ning värvil lasti tekkida.

Absorptsiooni loeti seejärel spektrofotomeetriga 370nM juures. 5

Afiinsuse BIAcore

Iga kandidaat Ang-2 peptikeha afiinsuse analüüs tehti seadmel BIAcore® 2000

(Biacore, Inc., Piscataway, NJ), kus PBS ja 0,005 protsendine P20 surfaktant

(Biacore, Inc.) oli töötlemispuhver. Rekombinantne proteiin G (Repligen,

Needham, MA) immobiliseeriti teadusliku astmega CM5 sensoriga kiibile (research 10

grade CM5 sensor chip) (Biacore, Inc.) primaarsete amiinirühmade kaudu,

kasutades komplekti Amine Coupling Kit (Biacore, Inc.) vastavalt tootja soovitatud

eeskirjadele.

Seostumistestid tehti esmalt umbes 100RÜ iga kandidaat anti-Ang-2 peptikeha

kinnitamisel immobiliseeritud proteiinile G, mille järel erinevates 15

kontsentratsioonides (0-100nM) huAng-2 või mAng-2 süstiti 3 minuti jooksul

antikeha pinnale voolukiirusel 50µl/min. Peptikeha seostumise kineetilised

parameetrid, sealhulgas ka (assotsiatsioonikonstant), kd (dissotsiatsioonikonstant)

ja KD (dissotsiatsiooni tasakaalukonstant) tuvastati BIA hindamise 3.1

arvutiprogrammi (Biacore, Inc.) abil. Madalamad dissotsiatsiooni 20

tasakaalukonstandid näitasid Ang-2 peptikeha kõrgemat afiinsust.

Näide 3

Ang-2 seostumispeptiidide tuvastamine

1. Ang-2-kattega magnetilise graanuli valmistamine

A. Ang-2 kinnistamine magnetilistele graanulitele 25

Mittespetsiifiliseks elueerimiseks kinnistati biotinüülitud Ang-2 proteiin (Biotinylated

Recombinant Human Angiopoietin-2, R&D Systems, Inc.; kataloogi number BT

623) graanulitele Streptavidin Dynabeads (Dynal, Lake Success, NY)

kontsentratsioonil umbes 4µg biotinüülitud Ang-2 proteiini 100µl graanuli varu

EE - EP1615952 B1 85

kohta tootjalt kõigiks kolmeks selektsiooniks. Antigeeni (Ang-2) ja retseptori (Tie-2)

elueerimiseks kinnistati 2µl biotinüülitud Ang-2 proteiini 50µl-le graanulitele

Streptavidin Dynabeads teiseks selektsiooniks. Katteaine kontsentratsioon

alandati umbes 1mg biotinüülitud Ang-2 proteiinile 50µl graanulite varu kohta

kolmandaks selektsiooniks. Tõmmates magneti abil graanulid tuubi ühele küljele ja 5

eemaldades vedeliku pipetiga, pesti graanuleid viis korda fosfaatpuhvri

soolalahusega (PBS) ja resuspendeeriti PBS-s. Biotinüülitud Ang-2 proteiini lisati

pestud graanulitele eespool toodud kontsentratsioonil ning inkubeeriti 1 tund

pöörlemisel toatemperatuuril, millele järgnes mõni tund öö jooksul pöörlemisel

inkubeerimist temperatuuril 4 ˚C. Seejärel Ang-2-kattega graanulid blokeeriti BSA 10

lisamisel umbes 1%-lise lõppkontsentratsioonini ning inkubeeriti pöörlemisel öö

jooksul temperatuuril 4 ˚C. Saadud Ang-2 kattega graanuleid pesti seejärel viis

korda PBS-ga enne selektsiooniprotseduuri edastamist.

B. Negatiivse selekteerimisega graanuli valmistamine

Valmistati ka lisagraanuleid negatiivseks selektsiooniks. Igaks pesuseisundiks 15

edastati 500µl tootja graanulite varu eespool toodud protseduuri (lõik 1A), kuid

biotinüülitud Ang-2-ga etapp jäeti vahele. Viimases pesemisetapis jaotati graanulid

viieks 100µl-ks alikvoodiks.

2. Ang-2 seostumisfaagi selekteerimine

A. Üldine strateegia 20

Kolme kiulist faagi kogumit, mis olid märkega „TN8-IX“ (5x109 sõltumatud

transformandid), „TN12-I“ (1,4x109 sõltumatud transformandid) ja „lineaarne“

(2,3x109 sõltumatud transformandid) (kõik firmalt Dyax Corp.), kasutati Ang-2

seostumisfaagile selekteerimiseks. Iga kogum edastati seejärel kas

mittespetsiifilisse elueerimisse, Ang-2 elueerimisse või retseptori elueerimisse 25

(Tie-2). Üheksa erinevat pesuseisundit teostati Ang-2 (TN8-IX, kasutades

mittespetsiifilise elueerimise meetodit, TN8-IX, kasutades Ang-2 elueerimise

meetodit, TN8-IX, kasutades Tie-2 elueerimise meetodit, TN12-I, kasutades

mittespetsiifilist elueerimise meetodit, TN12-I, kasutades Ang-2 elueerimise

meetodit, ning TN12-I, kasutades Tie-2 elueerimise meetodit, lineaarne, kasutades 30

EE - EP1615952 B1 86

mittespetsfiilist elueerimise meetodit, lineaarne, kasutades Ang-2 elueerimise

meetodit, ning lineaarne, kasutades Tie-2 elueerimise meetodit). Kõigi kolme kogu

jaoks elueeriti esimesest selektsioonist saadud faage järgmiste

selektsioonikordade jaoks ainult mittespetsiifilisel moel. Ang-2 ja Tie-2 elueerimisi

kasutati teises ja kolmandas selektsioonikorras. Lineaarse kogu jaoks teostati 5

selektsioon ainult teisele ringile Ang-2 ja Tie-2 elueerimise jaoks.

B. Negatiivne selekteerimine

Iga pesemisseisundi jaoks tehti umbes 100 suvalise kogumi ekvivalenti TN8-IX ja

TN12-I kogu jaoks (umbes 5x1011pfu TN8-IX jaoks ning umbes 1,4x1011pfu TN12-I

jaoks) ning umbes 10 suvalise kogu ekvivalenti lineaarsele kogule (umbes 10

1x1011pfu) alikvootideks kogu varust ja lahjendati umbes 400µl-ni PBST-GA-ga

(PBS 0,05%-lise Tween-20-ga). Pärast viimast pesu eemaldati vedelik esimesest

graanulite 100µl alikvoodist, mis valmistati negatiivseks selekteerimiseks (lõik 1B),

ligikaudu 400µl-line lahjendatud kogu varu lisati graanulitele. Saadud segu

inkubeeriti umbes 10 minutit toatemperatuuril pöörlemisel. Faagi supernatant võeti 15

välja magneti abil ning lisati teisele 100µl-lisele alikvoodile järgmiseks negatiivse

selektsiooni etapiks. Sedasi sooritati viis negatiivse selekteerimise etappi.

C. Selekteerimine Ang-2 proteiiniga kaetud graanulite abil

Pärast viimast negatiivse selekteerimise etappi (lõik 1B) saadud faagi supernatant

lisati Ang-2 kattega graanulitele (lõik 1A). Seda mikstuuri inkubeeriti pöörlemisel 20

üks kuni kaks tundi toatemperatuuril, lastes faagil sihtmärk-proteiinile seonduda.

Pärast supernatandi eemaldamist pesti graanuleid umbes kümme korda PBST-

GA-ga, millele järgnes kaks pesu PBS-ga.

D. Mittespetsiifiline elueerimine

Pärast viimast pesu eemaldati vedelik (lõik 2C) ning graanulitele lisati umbes 1ml 25

Min A soolade lahust (60mM K2HPO4, 33mM KH2PO4, 7,6mM (NH4)SO4 ja 1,7mM

naatriumtsitraati). Antud graanulite segu lisati otse kontsentreeritud bakterite

proovile infektsiooniks (vaata allpool lõik 3A ja 3B).

E. Seostusfaagi antigeeni (Ang-2) elueerimine

EE - EP1615952 B1 87

Teiseks ringiks elueeriti seostusfaag pärast viimast pesemisetappi (lõik 2C)

magnetilistest graanulitest, lisades 100µl 1pM, 0,1nM ja 10nM rekombinantset

Ang-2 proteiini (Recombinant Human Angiopoietin-2, R&D Systems, Inc.,

Minneapolis, Minnesota) järgemööda 30-minutilise inkubeerimisega igaks

seisundiks. Allesjäänud faag elueeriti mittespetsiifiliselt (lõik 2D). Elueeritud faag 5

10nM-st ja mittespetsiifilised elueerimised kombineeriti ning need edastati

kolmandasse selekteerimisringi (vaata lõiku 4, allpool).

Kolmandaks ringiks elueeriti seostusfaag pärast viimast pesemisetappi (lõik 2C)

magnetilistest graanulitest, lisades umbes 1nM rekombinantset Ang-2 proteiini

ning 10nM rekombinantset Ang-2 proteiini järgemööda 30-minutilise 10

inkubeerimisega igaks seisundiks. Lisaks elueeriti faagi umbes 10 minutit rotaatoril

100mM trietüülamiini lahusega (Sigma, St. Louis, Missouri). Trietüülamini lahust

sisaldava faagi pH neutraliseeriti 0,5ml 1M Tris-HCl-ga (pH 7,5). Pärast viimast

elueerimist 100mM trietüülamiini lahusega elueeriti allesjäänud faagi graanulite

lisamisel bakteritele (lõik 2D). 15

F. Seostusfaagi retseptori (Tie-2) elueerimine

Teiseks ringiks elueeriti seostusfaag pärast viimast pesemisetappi (lõik 2C)

magnetilistest graanulitest, lisades 100µl 1pM, 0,1nM ja 10nM rekombinantset Tie-

2 proteiini (Recombinant Human Tie-2-Fc Chimera, R&D Systems, Inc.,

Minneapolis, Minnesota) järgemööda 30-minutilise inkubeerimisega igaks 20

seisundiks. Allesjäänud faag elueeriti mittespetsiifiliselt (lõik 2D). Elueeritud faag

10nM-st ja mittespetsiifilised elueerimised kombineeriti ning need edastati

kolmandasse selekteerimisringi (vaata lõiku 4, allpool).

Kolmandaks ringiks elueeriti seostusfaag pärast viimast pesemisetappi (lõik 2C)

magnetilistest graanulitest, lisades umbes 1nM rekombinantset Ang-2 proteiini 25

ning 10nM rekombinantset Ang-2 proteiini järgemööda 30-minutilise

inkubeerimisega igaks seisundiks. Lisaks elueeriti faagi umbes 10 minutit rotaatoril

100mM trietüülamiini lahusega (Sigma, St. Louis, Missouri). Trietüülamiini lahust

sisaldava faagi pH neutraliseeriti 0,5ml 1M Tris-HCl-ga (pH 7,5). Pärast viimast

elueerimist 100mM trietüülamiini lahusega elueeriti allesjäänud faagi graanulite 30

lisamisel bakteritele (lõik 2D).

EE - EP1615952 B1 88

3. Amplifikatsioon

A. Rakkude valmistamine plaadil

Värske E. Coli. (XL-1 Blue MRF’) kultuur kasvatati algtihedusel OD600 umbes 0,5

LB söötmes, mis sisaldas umbes 12,5µg/ml tetratsükliini. Igaks

pesemistingimuseks jahutati umbes 20ml seda kultuuri jääl ning tsentrifuugiti. 5

Bakterite graanul resuspendeeriti umbes 1ml-s Min A soolade lahuses.

B. Transduktsioon

Eespool esitatud (lõigud 2D, 2E ja 2F) igast erinevast elueerimismeetodist saadud

iga segu lisati kontsentreeritud bakteriproovile (lõik 3A) ja inkubeeriti umbes 15

minutit temperatuuril umbes 37 ˚C. Igale mikstuurile lisati ligikaudu 2ml NZCYM 10

söödet (2XNZCYM, 50µg/ml ampitsiliin) ning 15 minutit inkubeeriti temperatuuril

umbes 37 ˚C. Saadud 4ml lahus asetati suurele NZCYM agar-plaadile, mis

sisaldas umbes 50µg/ml ampitsiliini, ja seda inkubeeriti öö jooksul temperatuuril 37

˚C.

C. Faagi kogumine 15

Iga bakteri/faagi segu kasvatati öö jooksul suurel NZCYM agar-plaadil (lõik 3B),

mille järel need kraabiti umbes 35ml-lisse LB söötmesse. Agar-plaati puhastati

veel täiendava 35ml LB söötmega. Saadud bakteri/faagi mikstuuri LB söötmes

tsentrifuugiti, et baktereid välja granuleerida. Ligikaudu 50ml faagi supernatanti

edastati seejärel värskesse tuubi ja lisati umbes 12,5ml PEG lahust (20% 20

PEG8000, 3,5M ammooniumatsetaat) ning seda inkubeeriti 2 tundi jääl, et faagi

sadestada. Sadestunud faag tsentrifuugiti ja resuspendeeriti 6ml-s faagi

resuspensioonipuhvris (250mM NaCl, 100mM Tris pH8, 1mM EDTA). Seda faagi

lahust puhastati veel allesjäänud bakterite välja tsentrifuugimisel ning faagi

sadestamisel teist korda, lisades umbes 1,5ml PEG lahust. Pärast tsentrifuugimist 25

resuspendeeriti faagi graanulit umbes 400µl-s PBS-s. See lahus edastati lõplikku

tsentrifuugimisse, et mis tahes allesjäänud bakterite jääkide lahust eemaldada.

Saadud faagi preparaat tiitriti standardsete naastu moodustavate analüüsidega.

EE - EP1615952 B1 89

4. Täiendav selektsioon ja amplifikatsioon

Teises ringis kasutati esimesest ringist pärit (lõik 3C) amplifitseeritud faagi

preparaati (umbes 1010pfu) sisendfaagina, et selekteerimist ja

amplifikatsioonietappe teha (lõigud 2 ja 3). Ang-2 ja Tie-2 elueerimisteks

kombineeriti faagid 10nM-st ja mittespetsiifilised elueerimised ning amplifitseeriti 5

kolmanda selekteerimise jaoks. Amplifitseeritud faagi preparaati (umbes 109pfu)

teisest ringist kasutati omakorda sisendfaagina kolmanda selekteerimise ja

amplifikatsiooni teostamiseks (lõigud 2 ja 3). Pärast kolmanda ringi

elueerimisetappe (lõigud 2D, 2E ja 2F) seati plaadile elueeritud faagi väike

fraktsioon nagu naastu moodustumise analüüsis (lõik 3C). Valiti individuaalsed 10

naastud ning need asetati 96-süvendilistele mikrotiitri plaatidele, mis sisaldasid

100µl TE puhvrit igas süvendis. Neid põhiplaate inkubeeriti öö jooksul

temperatuuril 4 ˚C, et võimaldada faagil TE puhvrisse elueerida.

5. Kloonianalüüs

Faagi kloone analüüsiti faagi ELISA ja DNA sekventeerimise abil. Järjestusi 15

reastati nendest kahest analüüsist saadud tulemuste kombineerimise põhjal.

A. Faagi ELISA

XL-1 Blue MRF’ kultuuri kasvatati algtiheduse OD600 umbes 0,5 saavutamiseni.

Umbes kolmkümmend µl seda kultuuri tehti alikvootideks igasse 96-süvendilise

miktrotiitri plaadi süvendi vahel. Igasse süvendisse lisati umbes 10µl elueeritud 20

faagi (lõik 4) ja bakteritel lasti umbes 15 minuti jooksul toatemperatuuril nakatuda.

Igasse süvendisse lisati 100µl LB söödet, mis sisaldas ligikaudu 12,5µg/ml

tetratsükliini ja ligikaudu 50µg/ml ampitsilliini. Seejärel inkubeeriti miktrotiitri plaati

öö jooksul raputamisel temperatuuril umbes 37 ˚C. Rekombinantsel Ang-2

proteiinil (umbes 1µg/ml PBS-s) lasti öö jooksul temperatuuril umbes 4 ˚C 96-25

süvendilistele Maxisorp plaatidele seonduda (NUNC). Kontrolliks kaeti streptavidiin

eraldi Maxisorp plaadile umbes 2µg/ml juures PBS-s.

Järgmisel päeval eemaldati vedelik proteiiniga kaetud Maxisorpi plaatides ning iga

süvend blokeeriti öö jooksul umbes 300µl 5%-lise piimalahusega temperatuuril

umbes 4 ˚C (teisel juhul 1 tund toatemperatuuril). Seejärel eemaldati piimalahus 30

EE - EP1615952 B1 90

ning süvendeid pesti kolm korda PBST lahusega. Pärast viimast pesuetappi lisati

igasse proteiiniga kaetud Maxisorpi plaatide süvendisse umbes 50µl PBST 4%-list

piimalahust. Umbes 50µl öö jooksul saadud kultuure igast süvendist 96-

süvendilisel mikrotiitri plaadil edastati vastavatesse Ang-2-kaetud plaatide ning

kontrollina mõeldud streptavidiiniga kaetud plaatide süvenditesse. 100µl mikstuuri 5

igas plaadi tüübis inkubeeriti umbes 1 tund toatemperatuuril. Vedelik eemaldati

Maxisorpi plaatidelt ning süvendeid pesti umbes kolm korda PBST-ga. HRP-

konjugeeritud anti-M13 antikeha (Amersham Pharmacia Biotech) lahjendati umbes

1:7,500-le ning umbes 100ml lahjendatud lahust lisati Maxisorpi plaatide igale

süvendile ligikaudu 1 tunni inkubeerimisega toatemperatuuril. Vedelik eemaldati 10

uuesti ning süvendeid pesti umbes viis korda PBST-ga. Seejärel lisati igasse

süvendisse 100µl TMB substraati (Sigma) ning reaktsioon peatati umbes 50µl 5N

H2SO4 lahusega. Optiline tihendus OD450 loeti spektrofotomeetriga (Molecular

Devices).

B. Faagi kloonide järjestamine 15

Iga faagi klooni jaoks valmistati järjestusmaatriks PCR abil. Järgnevat

oligonukletiidi paari kasutati ligikaudu 500 nukleotiidi fragmendi

amplifitseerimiseks:

praimer 1: 5’-CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3’ (JÄRJESTUSE ID-

NR: 54) 20

praimer 2: 5’-CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3’ (JÄRJESTUSE ID-

NR:55)

Iga klooni jaoks valmistati järgnev mikstuur:

Reagendid Kogus (µL)/tuub

dH2O 26,25

50% glütserool 10

10X PCR puhver (w/o MgCl2) 5

25nM MgCl2 4

10mM dNTP segu 1

100µM praimer 1 0,25

100µM praimer 2 0,25

EE - EP1615952 B1 91

Reagendid Kogus (µL)/tuub

Taq polümeraas 0,25

Faag TE-s (lõik 4) 3

Lõplik reaktsiooni kogus 50

PCR jaoks kasutati termotsüklerit (GeneAmp PCR System 9700, Applied

Biosystems) järgmise programmi teostamiseks: 94 ˚C 5 minutit; (94 ˚C 30 sek, 55

˚C 30 sek, 72 ˚C 45 sek) x 30 tsüklit; 72 ˚C 7 minutit; jahutamine temperatuurile 4

˚C. Igast reaktsioonist saadud PCR produkti puhastati komplektiga QIAquick

Multiwell PCR Purification (Qiagen), järgides tootja juhiseid. Puhastatud PCR 5

produkti analüüsiti seejärel umbes 10µl iga PCR reaktsioonimikstuuri töötlemisel

umbes 1µl värviga (10xBBXS agaroosi geeli laadimisvärv) 1%-lisel agaroosigeelil.

Allesjäänud produkt järjestati seejärel sekvenaatoriga ABI 377 Sequencer (Perkin

Elmer), järgides tootja soovituslikke eeskirju.

6. Järjestuse hindamine ja konsensusjärjestuse tuvastamine 10

A. Järjestuse hindamine ja analüüs

Erinevatest nukleotiidi järjestustest (lõik 5B) transleeritud peptiidi järjestused pandi

ELISA andmetega korreleeruma. Kloonidele, millel oli kõrge OD450 Ang-2-kaetud

süvendites ning madal OD450 streptavidiiniga kaetud süvendites, anti kõrgema

prioriteediga hinnang. Järjestustele, mis esinesid mitu korda, anti samuti kõrgema 15

prioriteediga hinnang. Kandidaatjärjestused valiti nende kriteeriumide põhjal

edasiseks analüüsiks peptiidide või peptikehadena.

B. Konsensusjärjestuse tuvastamine

Kolm erinevat liiki konsensusmotiivi loodi TN8-IX kogumist järgnevalt:

KRPCEEXWGGCXYX (JÄRJESTUSE ID-NR:56) 20

KRPCEEXFGGCXYX (JÄRJESTUSE ID-NR:57)

XXXCXDXYWYCXXX (JÄRJESTUSE ID-NR:61)

XXXCXDXYTYCXXX (JÄRJESTUSE ID-NR:62)

EE - EP1615952 B1 92

XXXCXDXFWYCXXX (JÄRJESTUSE ID-NR:63)

XXXCXDXFTYCXXX (JÄRJESTUSE ID-NR:64)

XXXCXWDPWTCEXM (JÄRJESTUSE ID-NR:58)

Üks konsensus motiiv loodi TN12-I kogumist:

WSXCAWFXGXXXXXCRRX (JÄRJESTUSE ID-NR:59) 5

Kõikide konsensuse motiivi järjestuste jaoks saadi allajoonitud „aminohappe

tuumjärjestused“ igast konsensusjärjestusest, tuvastades kõige sagedamini

esineva aminohappe igas positsioonis. „X“ tähistab mis tahes looduslikult esinevat

aminohapet. Tuumjärjestuse kõrval olevad tsüsteiinid olid fikseeritud aminohapped

TN8-IX ja TN12-I kogus. 10

Ang-2-le seostuvatena tuvastatud peptiidid on esitatud tabelis 3 allpool.

Tabel 3: Ang-2 seostuspeptiid

Näide 4

DNA-d kodeerivate peptikehade loomine 15

Ang-2:Tie-2 seostamisele potentsiaalselt inhibeerivateks selekteeritud

modifitseeritud peptiide (vaata tabelit 3) kasutati sulandvalkude loomiseks, kus iga

peptiidi kumbki monomeer või iga peptiidi tandeemne dimeer (kus monomeersete

ühikute vahel on linker) ühendati seadmel DNA-d kodeerivale linkerile, millele

järgnes inimese IgG1 Fc piirkond. Iga modifitseeritud peptiid loodi 20

EE - EP1615952 B1 93

oligonukleotiidide („oligod“) paaridega karastamisel, et anda polünukleotiidi

dupleks, kodeerides peptiidi linkeriga, mis sõltuvalt peptiidist sisaldab kas viit

glütsiini jääki, kaheksat glütsiini jääki või ühte lüsiini jääki; need struktuurid olid

loodud kui NdeI kuni XhoI fragmendid. Need dupleksse polünukleotiidi molekulid

ligeeriti vektorisse (pAMG21-Fc N-ots, mida on allpool täpsemalt kirjeldatud), mis 5

sisaldas inimese Fc geeni, mida olin eelnevalt lagundatud NdeI ja XhoI-ga.

Standardprotseduure kasutades transformeeriti saadud ligeeritud segud

elektroporatsiooniga E. coli tüve 2596 rakkudesse (GM221, mida on allpool

täpsemalt kirjeldatud). Kloone uuriti võime osas toota rekombinantset proteiini

toodet ja omada geenifusiooni, millel on korrektne nukleotiidi järjestus. Taoline 10

üksik kloon selekteeriti igale modifitseeritud peptiidile (st Fc-peptiidi

sulandproduktid).

pAMG21-Fc N-terminaalse vektori loomine

pAMG21

Ekspressiooni plasmiid pAMG21 (ATCC nr 98113) saadakse 15

ekspressioonivektorist pCFM1656 (ATCC nr 69576) ja ekspressioonivektori

süsteemist, mida on kirjeldatud USA patendis nr 4,710,473, järgides avaldatud

rahvusvahelises patenditaotluses WO 00/24782 kirjeldatud protseduure (vaata

näite 2 osa, lehekülgede vahemik 100-103, ning joonised Fig 17A ja 17B).

Fc N- terminaalne vektor 20

Fc N-terminaalne vektor loodi E. coli tüve 3788, pAMG21 Tpo_Gly5_Fc

monomeeri maatriksina kasutades. Antud tüve kloonimist puudutava

informatsiooni leiab patendist WO 00/24782 (vaata seal näidet 2 ja joonist Fig 10).

5’ PCR praimer (allpool täpsemalt kirjeldatud) määratleti Tpo peptiidi järjestuse

eemaldamiseks pAMG Tpo Gly5 sees ja selle asendamiseks polülinkeriga, mis 25

sisaldas ApaLI ja XhoI kohti. Võttes tüve 3788 mudeliks, teostati PCR Expand

Long polümeraasiga, kasutades JÄRJESTUSE ID-NR: 8 oligonukleotiidi, allpool,

praimerina 5’ ja universaalse 3’ praimerina JÄRJESTUSE ID-NR: 9, allpool.

Saadud PCR produkt puhastati geeliga ning lagundati restriktsiooniensüümidega

NdeI ja BsrGI. Nii plasmiid kui ka huvialust peptiidi kodeeriv polünukleotiid koos 30

EE - EP1615952 B1 94

linkeriga puhastati firma Qiagen (Chatsworth, CA) geelpuhastuse tsentrifuugivate

kolonnidega. Plasmiid ja lisand ligeeriti seejärel ligeerimise

standardprotseduuridega ning saadud ligeerimise segu transformeeriti E. coli

rakkudeks (tüvi 2596). Selekteeriti üksikud kloonid ja teostati DNA järjestamine.

Tuvastati korrektne kloon ning seda kasutati vektori allikana siin kirjeldatud 5

modifitseeritud peptiidide jaoks.

5’ praimer:

ACAAACAAACATATGGGTGCACAGAAAGCGGCCGCAAAAAAA

CTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACA (JÄRJESTUSE ID-NR: 8)

3’ praimer: 10

GGTCATTACTGGACCGGATC (JÄRJESTUSE ID-NR: 9)

Lisaks nende modifitseeritud peptiidide valmistamisele N-terminaalsete

fusioonidena Fc-le (N-terminaalsed peptikehad), valmistati osa neis ka C-

terminaalsete sulandproduktidena (C-terminaalsed peptikehad). C-terminaalsete

fusioonidena valmistamiseks kasutatud vektorit on kirjeldatud allpool. 15

N-terminaalse vektori loomine

Fc C-terminaalne vektor loodi E. coli tüve 3728, pAMG21 Fc_Gly5_Tpo

monomeeri maatriksina kasutades. Antud tüve kloonimist puudutava

informatsiooni leiab patendist WO 00/24782 (vaata seal näidet 2 ja joonist Fig 7).

3’ PCR praimer (JÄRJESTUSE ID-NR: 10) määratleti Tpo peptiidi järjestuse 20

eemaldamiseks pAMG Tpo Gly5 sees ja selle asendamiseks polülinkeriga, mis

sisaldas ApaLI ja XhoI kohti. Võttes tüve 3728 mudeliks, teostati PCR Expand

Long polümeraasiga, kasutades universaalset 5’ praimerit (JÄRJESTUSE ID-NR:

11) ja eespool nimetatud 3’ praimerit. Saadud PCR produkt puhastati geeliga ning

lagundati restriktsiooniensüümidega BsrGI ja BamHI. Nii plasmiid kui ka huvialust 25

peptiidi kodeeriv polünukleotiid koos linkeriga puhastati firma Qiagen

geelpuhastuse tsentrifuugivate kolonnidega. Plasmiid ja lisand ligeeriti seejärel

ligeerimise standardprotseduuridega ning saadud ligeerimise segu transformeeriti

EE - EP1615952 B1 95

E. coli (tüve 2596) rakkudeks. Tuvastati korrektne kloon ning seda kasutati vektori

allikana siin kirjeldatud modifitseeritud peptiidide jaoks.

5’ praimer:

CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG (JÄRJESTUSE ID-NR: 10)

3’ praimer: 5

TTGTTGGATCCATTACTCGAGTTTTTTTGCGGCCGCTTTCTGTG

CACCACCACCTCCACCTTTAC (JÄRJESTUSE ID-NR: 11)

GM221 (nr 2596). Peremeestüvi nr 2596, mida kasutati Fc-peptiidi sulandvalkude

ekspresseerimiseks, on E. coli K-12 tüvi, mis on modifitseeritud sisaldama lux

promotorit ning mõlemat temperatuuritundlikku lambda repressorit cI857s7 10

varajases ebg piirkonnas ja lacIQ repressorit hilises ebg piirkonnas. Nende kahe

repressori olemasolu võimaldab selle peremeestüve kasutamist hulga

ekspressioonisüsteemidega. ATCC märge sellele tüvele on 202174.

Näide 5

Peptikehade tootmine 15

Ekspressioon E. colis. Iga pAMG21-Fc sulandstruktuuri kultuurid E. colis GM221

kasvatati temperatuuril 37 ˚C söötmes Terrific Brothmedium (vaata Tartof and

Hobbs, „Improved media for growing plasmid and cosmid clones“, Bethesda

Research Labs Focus, 9. köide, lk 12, 1987, tsiteeritud eespool mainitud

Sambrooki et al viites). Geeni produkti ekspressiooni esilekutsumine luxPR 20

promootorist saavutati sünteetilise autoinduktori N-(3-oksoheksanoüül)-DL-

homoseriin-laktooni lisamisel kultuurisöötmele lõppkontsentratsioonini 20

nanogrammi milliliitri kohta (ng/ml). Kultuure inkubeeriti veel kuus tundi

temperatuuril 37 ˚C. Bakteri kultuure uuriti seejärel mikroskoopiaga

sisestuskehakeste olemasolu jaoks ning koguti tsentrifuugimisel. 25

Murdumisvõimelisi sisestuskehasid vaadeldi indutseeritud kultuurides, mis viitas,

et Fc-fusioonid olid kõige tõenäolisemalt toodetud lahustumatus fraktsioonis E. coli

sees. Raku graanuleid lüüsiti otse resuspensiooniga Laemmli puhvriga, mis

sisaldas 10% β-merkaptoetanooli, ja seejärel analüüsiti SDS-PAGE-ga. Enamus

EE - EP1615952 B1 96

juhtudel täheldati vastava molekulmassi intensiivse Coomassie värviga riba SDS-

PAGE geelil.

Puhastamine. Rakud avati vees (1/10) kõrgsurvel homogeniseerimisega (kaks

läbimist 14 000PSI juures) ning sisestuskehakesed koguti tsentrifuugimisel

(4000RPM J-6B tsentrifuugis ühe tunni jooksul). Sisestuskehakesed tehti 6M 5

guanidiinis, 50mM Tris-is, 10mM DTT-s, pH 8,5, lahustuvaks ühe tunni jooksul

suhtega 1/10. Fc-le ühendatud lineaarsete peptiidide jaoks lahjendati lahustuvaks

tehtud segu kakskümmend viis korda 2M uureas, 50mM Tris-is, 160mM arginiinis

ja 2mM tsüsteiinis, pH 8,5. Oksüdeerumisel lasti kaks päeva temperatuuril 4 ˚C

jätkuda, võimaldades disulfiidiga seotud ühendi (st Fc-peptiidi homodimeer) 10

moodustumist. Fc-le ühendatud tsükliliste peptiidide jaoks järgiti samu eeskirju,

millele lisandus kolm voltimistingimust: (1) 2M uurea, 50mM Tris, 160mM arginiin,

4mM tsüsteiin, 1mM tsüstamiin, pH 8,5; (2) 4M uurea, 20% glütserool, 50mM Tris,

160mM arginiin, 2mM tsüsteiin, pH 8,5; ja (3) 4M uurea, 20% glütserool, 50mM

Tris, 160mM arginiin, 4mM tsüsteiin, 1mM tsüstamiin, pH 8,5. Taasvolditud 15

proteiini dialüüsiti 1,5M uurea, 50mM NaCl, 50mM Tris, pH 9,0 suhtes. Antud

mikstuuri pH alandati äädikhappega 5-le. Sete eemaldati tsentrifuugimisel ning

supernatant viidi pH-lt 5 pH-le 6,5, sõltuvalt iga sulandprodukti isoelektrilisest

punktist. Proteiin filtreeriti ja asetati temperatuuril 4 ˚C SP-Sepharose HP

kolonnile, mida oli tasakaalustatud 20mM-s NaAc-s, 50mM-s NaCl-s igale 20

struktuurile määratud pH juures. Proteiini elueeriti 20 kolonniga lineaarse

gradiendiga samas puhvris vahemikus 50mM NaCl kuni 500mM NaCl. Piik puuliti

ja filtreeriti.

Eespool toodud protseduuridega loodud peptikehad on esitatud tabelis 4 allpool.

Tabel 4 25

EE - EP1615952 B1 97

EE - EP1615952 B1 98

Tabelis 4 „Fc“ tähistab inimese Fc IgG1 järjestust. Teine tulp esitab peptikeha

aminohappe järjestuse. Sealne Fc osa on märkega „Fc“ ning on esitatud

JÄRJESTUSE ID-NR-s: 60 allpool. On mõistetav, et kui kasutatakse märget,

näiteks „Con4“ või „Con-4“, tähistab see Con-4 peptiidi, kusjuures nende sufiks 5

„C“, „(C)“ või „-C“ või „N“, „(N)“ või „-N“ viitab, et molekul on peptikeha, nagu on

siin kirjeldatud. Sufiksid „N“, „(N)“ või „-N“ peptikeha nimes viitavad, et Ang-2-

seostuspeptiid (või peptiidid) on N-terminaalsed Fc domeenil ning sufiksid „C“,

„(C)“ või „-C“ tähistavad, et Ang-2-seostuspeptiid (või peptiidid) on C-terminaalne

Fc domeenil. Lisaks võib 2xCon4 (C) 1K, nagu on määratletud JÄRJESTUSE ID-10

NR-s: 25, siin käsitleda ka ilma „1K“ sufiksita.

Iga peptikeha Fc osa aminohappe järjestus on järgnev (amino-otsast karboksüül-

otsani):

DNA järjestus (JÄRJESTUSE ID-NR-d: 33-53, mis kodeerivad vastavalt peptikeha 15

JÄRJESTUSE ID-NR-tele: 12-32 vastavaid peptikehasid tabelis 4) on esitatud

allpool:

EE - EP1615952 B1 99

EE - EP1615952 B1 100

EE - EP1615952 B1 101

EE - EP1615952 B1 102

EE - EP1615952 B1 103

EE - EP1615952 B1 104

EE - EP1615952 B1 105

EE - EP1615952 B1 106

EE - EP1615952 B1 107

EE - EP1615952 B1 108

EE - EP1615952 B1 109

Näide 6

Peptikeha analüüsid

Peptikehadest neljateistkümmet testiti neutralisatsiooni ELISA analüüsi kasutades

ning peptikehadest kolme testiti afiinsuse ELISA analüüsiga. Tulemused on 5

esitatud tabelis 5.

Tabel 5

hAng-2 mAng-2 hAng-1

Peptikeha IC 50 (nM) EC 50 (nM)

IC 50 (nM)

EC 50 (nM)

IC 50 (nM)

EC 50 (nM)

2xCon4 (C) 1K 0,04 0,02

Con4-L1 (C) 0,05 0,04

Con4 (C) 0,20 0,30

2xL1 (N) 0,65 0,80

Con4 (N) 0,85 0,03 0,72 0,07 Inhibeeri-

mine

puudus

Sidumine

puudus

2xL1 (C) 0,90 1,0

Con4 (N) 1K-

WT

1,9

EE - EP1615952 B1 110

Peptikeha IC 50 (nM) EC 50 (nM)

IC 50 (nM)

EC 50 (nM)

IC 50 (nM)

EC 50 (nM)

L1 (N) 6 11 Inhibeeri-

mine

puudus

C17 (N) 9 13 Inhibeeri-

mine

puudus

12-9 (N) 21 7,7 Inhibeeri-

mine

puudus

Con1 (N) 26 ~ 200 Inhibeeri-

mine

puudus

8-14 (N) 45 33 Inhibeeri-

mine

puudus

L1 (C) 65 37

8-8 (N) 80 ~ 700 Inhibeeri-

mine

puudus

Negatiivne

kontrolli

peptikeha 4883

Inhibeeri-

mine

puudus

Sidumi-

ne

puudus

Inhibee

-rimine

puudus

Sidu-

mine

puudu

s

Inhibeeri-

mine

puudus

Sidumine

puudus

Negatiivse kontrolli peptikeha 4883 aminohappe järjestus on järgnev (Fc osa on

allajoonitud, linker on „GGGGG“ ning peptiidi osa on paksus kirjas):

EE - EP1615952 B1 111

On mõistetav, et siinne termin „inhibeerimine puudus“ ei tähenda, et ühenditel

puuduvad inhibeerivad omadused. Pigem tähistab siin kasutatud „inhibeerimine

puudus“ ühendeid, millel testimisel neutralisatsiooni ELISA analüüsiga siin

kirjeldatud tingimustes oli IC50 väärtus suurem kui 1000nM, mis oli ka kõrgeim

kontsentratsioon, millega neid ühendeid skriiniti. Kuigi olulisi inhibeerivaid omadusi 5

ei täheldatud molekulidel märkega „inhibeerimine puudus“, on mõistetav, et nendel

molekulidel võib tegelikult inhibeerivaid omadusi olla erinevates analüüsi

tingimustes või erinevates analüüsides. Teatud eelistatud variandis on mõistetav,

et leiutis käsitleb peptikehasid, millel on inhibeerivad omadused siin kirjeldatud

analüüse kasutades. 10

Kahte peptikeha testiti afiinsuse BIAcore analüüsi kasutades (nagu kirjeldati näites

2). Tulemused on esitatud tabelis 6 allpool.

Tabel 6

Peptikeha (Pk) afiinsused hAng-2 ja mAng-2 jaoks

hAng-2 mAng-2

Peptikeha KD

(nM) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) ka (1/Ms) kd (1/s)

Pk L1 (N) 3,1 2,9x105 9,1x10-4 0,425 5,6x105 2,3x10-4

Con4 (N) 0,67 3,3x105 2,2x10-4 0,60 7,3x105 4,4x10-4

TN12-9 (N) 8,2 1,2x105 1,0x10-3 0,32 7,2x105 2,3x10-4

Näide 7

Terapeutilise tõhususe uuringud süsteemselt manustatud Ang-2 peptikehaga 15

Ang-2 peptikeha TN8-Con4-C manustati subkutaanselt A431 kasvajaga hiirtele

üks päevas režiimiga 72 tundi pärast kasvaja teket. Peptikeha kasutatud annused

olid 1000, 200, 40 ja 8ug/hiir/päevas. Kokku anti kõikidele loomadele 20 annust.

Kasvaja suurus ja kehamassi märgiti kolm korda nädalas. Uuringu lõpus loomad

surmati ning nende seerumid koguti kokku peptikeha tasemete mõõtmiseks ELISA 20

analüüsiga. Kasvajad ja normaalsete kudede hulk koguti kõikidest rühmadest.

Tulemused on esitatud joonisel Fig 1. Nagu näha, täheldati olulisi erinevusi

kasvaja arengus Ang-2 peptikehaga ravitud rühma ja kanduriga kontrolli vahel.

EE - EP1615952 B1 112

Kõik neli Ang-2 peptikeha annust inhibeerisid kasvaja arengut, võrreldes kanduri

kontrollidega (p <0,0001, võrreldes kanduri kontrolliga, kasutades

korduvmõõtmisega ANOVA analüüsi). Seevastu kontrollrühma kasvajad arenesid

edasi tunduvalt suurema kiirusega. Antud peptikehaga ravimisel ei olnud eespool

toodud annustel märkimisväärset toimet ravitud looma lõplikule kehamassile, 5

organite kaalule ega hematoloogia parameetritele.

Näide 8

1. Ang-2 sekundaarsete peptiidi kogumite loomine

A. Elektrokompetentse E. coli rakud

Epicurian Coli® XL1-Blue MRF’ elektroporatsiooni kompetentsed rakud 10

(Stratagene nr 200158) osteti firmalt Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La

Jolla, CA).

B. pCES1 vektori modifitseerimine

PCR teostati süsteemiga Extend Long Template PCR Systems (Roche

Diagnostics Corp., Indianapolis, IN), kus 1µg pCES1 vektor (TargetQuest Inc.) oli 15

mudeliks. PCR mikstuuri kogus oli 100µl, mis sisaldas 1x PCR puhvrit, 200nM

kumbagi kahte praimerit: 5’-CAAACGAATGGATCCTCATTAAAGCCAGA-3’

(JÄRJESTUSE ID-NR: 244) ja 5’-

GGTGGTGCGGCCGCACTCGAGACTGTTGAAAGTTGTTTAGCA-3’

(JÄRJESTUSE ID-NR: 245), 200nM dNTP ja 3 ühikut (Ü) Tag DNA polümeraasi. 20

TRIO-Thermoblock (Biometra) PCR süsteemil lasti järgnevalt töötada: 94 ˚C 5

minutit; 30 tsüklit temperatuuriga 94 ˚C 30 sekundit, 50 ˚C 30 sekundit, 72 ˚C 45

sekundit ning 72 ˚C 10 minutit; jahtumine temperatuurile 4 ˚C.

PCR produkte töödeldi 1%-lisel agaroosi geelil ja puhastati QIAGEN tsentrifuugiva

kolonniga (QIAGEN Inc., Valencia, CA) vastavalt tootja ettekirjutustele. Teine PCR 25

reaktsioon sooritati 5µl PCR produktide ja 200nM kummagi mõlema praimeriga 5’-

CAAACGAATGGATCCTCATTAAAGCCAGA-3’ (JÄRJESTUSE ID-NR: 246) ja 5’-

AACACAAAAGTGCACAGGGTGGAGGTGGTGGTGCGGCCGCACT-3’

(JÄRJESTUSE ID-NR: 247) samades PCR tingimustes, nagu kirjeldati eespool.

EE - EP1615952 B1 113

PCR produktid ja algne pCES1 vektor lagundati seejärel 1 tunni jooksul eraldi

100µl-lises reaktsioonis, mis sisaldas 1x NEB2 puhvrit, 60Ü ApaLI (New England

Biolabs, Beverly, MA), 60Ü BamHI (New England Biolabs) temperatuuril 37 ˚C.

Lagundatud DNA puhastati seejärel QIAGEN tsentrifuugiva kolonniga ning ligeeriti

öö jooksul toatemperatuuril kokku 40µl-lises reaktsioonis, mis sisaldas 1x 5

ligeerimise puhvrit ja 40Ü T4 DNA ligaasi (New England Biolabs).

Vektorid transfekteeriti E. colisse ja inkubeeriti öö jooksul temperatuuril 37 ˚C.

Selekteeriti isoleeritud üksikud kolooniad ja plasmiid puhastati seejärel QIAGEN

tsentrifuugiva kolonniga. Korrektne lisand kinnitati DNA sekventeerimisega.

C. Vektori DNA valmistamine 10

Üks mikrogramm modifitseeritud pCES1 vektori DNA-d (lõigust 1B eespool)

transformeeriti 40ml-ks elektrokompetentseks XL1-blue E.coliks (lõigust 1A

eespool), kasutades komplekti Gene Pulser II (BIO-RAD, Hercules, CA) pingel

2500V, 25µF ja 200 oomi. Transformeeritud bakteri proov edastati kohe tuubi,

milles oli 960µl SOC (2% trüptoon, 0,5% pärmi ekstrakt, 10mM NaCl, 2,5mM KCl, 15

20mM glükoos, 10mM MgSO4, 10mM MgCl2), ning kultuuril lasti 1 tund kasvada

temperatuuril 37 ˚C raputamisel.

Rakud jaotati 2xYTAGT (2xYT 100ug/ml ampitsilliiniga, 12,5ug/ml tetratsükliin ja

2% glükoos) agarplaadile ja inkubeeriti öö jooksul temperatuuril 37 ˚C. Üksik

koloonia kinnitati sekventeerimisega ning kasutati 2 liitri 2xYTAGT söötme 20

inokuleerimiseks temperatuuril 37 ˚C raputamisel öö jooksul. Plasmiidi vektori

DNA puhastati komplektiga QIAGEN Plasmid Maxi Kit vastavalt tootja

ettekirjutustele.

D. Vektor DNA lagundamine

Kokku umbes 2000 mikrogrammi vektori DNA (lõigust 1C eespool) lagundati 25

5000µl-lises reaktsioonis, mis sisaldas 1xNEB puhvrit 2, 300Ü ApaLI ja 300Ü

XhoI, temperatuuril 37 ˚C öö jooksul. Restriktsiooni lagundamisreaktsiooni

inkubeeriti öö jooksul temperatuuril 37 ˚C ja analüüsiti eelnevalt valmistatud 0,8%

agaroosi geelis (Embi Tec, San Diego, CA). Seejärel lineariseeritud vektori DNA

EE - EP1615952 B1 114

eemaldati geelist ja seda ekstraktiti komplektiga QIAquick Gel Extraction Kit

(QIAGEN Inc.) vastavalt tootja juhistele.

E. Kogumi oligonukleotiidide valmistamine

Kuus kogumi oligonukleotiidi (1 fikseeritud ja 5 töödeldud) loodi järjestuste põhjal,

mis tuletati eespool kirjeldatud tulemustest. Üks kogumi fikseeritud oligonukleotiid 5

oli: 5’-CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKS

ARTGGGATCCGTGGASCNNKNNKNNKNNKNNKNNK-NNKCATT

CTCTCGAGATCA-3’ (kogumi number 20) (JÄRJESTUSE ID-NR: 248);

ning 70% kogumi töödeldud oligonukleotiidist kaks olid järgnevad:

5’-CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKaaKcgKccKNNKga 10

KgaKatKttKggKggKNNKacKtaKcaKNNKNNKNNKCATTCTC

TCGAGATCA-3’ (kogumi number 27); (JÄRJESTUSE ID-NR: 249);

5’-CACAGTGCACAGGGTNNKaaKttKaaKccKctKgaKgaKctKgaKga

KacKctKtaKgaKcaKttKacKttKcaKcaKNNKCATTCTCTCGAGATCA-

3’ (kogumi number 99); (JÄRJESTUSE ID-NR: 250). 15

Väiketähed tähistavad segu 70% näidatud baasist ja 10% igast teisest kolmest

nukleotiidist. Ülejäänud 91% kogumi oligonukleotiididest kolm olid järgnevad:

5’-CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKcaKgaKgaKTGCgaKtg

KgaKccKtgKacKTGCgaKcaKatKNNKNNKNNKCATTCTCTCGAGA

TC A-3’ (kogumi number 94); (JÄRJESTUSE ID-NR: 251); 20

5’-CACAGTGCACAGGGTNNKttKgaKtaKNNKgaKggKgtKgaKgaKcc

KttKacKttKggKNNKgaKaaKcaKNNKCATTCTCT-

CGAGATCA-3’ (kogumi number 25); (JÄRJESTUSE ID-NR: 252);

ning

EE - EP1615952 B1 115

5’-CACAGTGCACAGGGTNNKaaKttKaaKccKctKgaKgaKctKgaKga

KacKctKtaKgaKcaKttKacKttKcaKcaKNNKCATTCTCTCGAGATCA-

3’ (kogumi number 26); (JÄRJESTUSE ID-NR: 253);

Eespool toodud oligode puhul antud valdkonnas pädevad isikud mõistavad, et „N“

tähendab, et neljast nukleotiidist (A, T, C ja G) igaüks on võrdselt esindatud oligo 5

sünteesi käigus, ning „K“ tähendab, et nukleotiidid G ja T olid võrdselt esindatud

oligo sünteesi käigus. Väiketähed tähistavad segu 91% näidatud baasist ja 3%

igast teisest kolmest nukleotiidist. Neist nukleotiididest igaühte kasutati mudelina

PCR-s.

PCR reaktsioonide jaoks kasutati süsteemi Expand High Fidelity PCR System kit 10

(Roche Diagnostics Corp.). Kogumi iga oligot amplifitseeriti 96-lises süvendis 50µl

PCR reaktsioonis, mis sisaldas 1nM kogumi oligonukleotiidi, 1X PCR puhvrit,

300nM kumbagi praimerit:

5’-CACAGTGCACAGGGT-3’ (JÄRJESTUSE ID-NR: 254);

ja 15

5’-TGATCTCGAGAGAATG-3’, (JÄRJESTUSE ID-NR: 255);

200µM dNTP, 1,5mM MgCl2 ja 350Ü Expand polümeraasi. Termotsüklerit

(GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems) kasutati järgneva programmi

teostamiseks: 94 ˚C 5 minutit; 25 tsüklit temperatuuril 94 ˚C 30 sekundit, 52,5 ˚C

60 sekundit, 72 ˚C 30 sekundit; 72 ˚C 10 minutit; jahutamine temperatuurile 4 ˚C. 20

Seejärel eemaldati vabad nukleotiidid komplektiga QIAquick PCR Purification Kit

(QIAGEN Inc. kat-nr 28104) vastavalt tootja juhistele.

F. Kogumi oligonukleotiidide lagundamine

Iga kogumi jaoks lagundati PCR produktid (lõik 1E) 1200µl-lises reaktsioonis, mis

sisaldas 1x NEB puhvrit 2, 750Ü ApaLI ja 750Ü XhoI, öö jooksul temperatuuril 37 25

˚C. Lagundatud DNA eraldati eelnevalt valmistatud 3% agaroosi geelil (Embi Tec).

Vaatlusalune DNA riba igast reaktsioonist lõigati geelist ning seda ekstraktiti

EE - EP1615952 B1 116

COSTAR Spin-X tsentrifuugi torufiltriga, 0,22mM tselluloosatsetaadiga (Corning

Inc., kat-nr 8160).

G. Vektori ligeerimine kogumi oligonukleotiididega

450µl ligeerimise reaktsioon sisaldas lineariseeritud vektorit (lõik 1D) ja kogumi iga

lagundatud PCR produkti (lõik IF) moolisuhtes 1:5, 1xNEB ligeerimispuhvrit ja 5

20 000Ü T4 DNA ligaasi temperatuuril 16 ˚C öö jooksul. Ligeeritud produkte

inkubeeriti 20 minutit temperatuuril 65 ˚C, et T4 DNA ligaasi inaktiveerida, ja

inkubeeriti veel 2 tundi 100Ü NotI-ga temperatuuril 37 ˚C, et vekotri iseeneslikku

ligeerimist miinimumini viia. Ligeeritud produktid puhastati seejärel

fenool/kloroformi standardse ekstraktimisega (Molecular Cloning: A Laboratory 10

Manual, Maniatis et al, 3. väljaanne, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000)

ja resuspendeeriti 120µl-s H2O-s.

H. Elektroporatsiooni transformatsioon

Iga kogumi jaoks teostati kaksteist elektroporatsiooni reaktsiooni. Igaks

transformatsiooniks segati 10µl ligeeritud vektorit DNA (lõik 1G) ja 300µl XL1-15

BLUE MRF’ rakke (lõik 1A) 0,2cm-lises küvetis (BIO-RAD). Saadud segu

elektroporeeriti seadmega Gene Pulser II pingel 2500V, 25uF ja 200 oomi.

Transformeeritud bakterid kaheteistkümnest elektroporatsiooni reaktsioonist

kombineeriti ja edastati 1 tunniks temperatuuril 37 ˚C inkubeerimiseks kolvi, milles

oli 26ml SOC. Rakud lisati 450ml 2xYTAG-le ja kasvatati temperatuuril 37 ˚C 20

raputamisel 5 tundi. Rakke tsentrifuugiti 15 minutit temperatuuril 4 ˚C kiirusel

4000rpm. Seejärel rakugraanulid resuspendeeriti 12ml-s 15%-lises

glütseroolis/2xYT-s ja neid hoiti temperatuuril -80 ˚C. See oli kogumike primaarne

varu. Tiitrid näitasid kogumite suurusteks 5,0x109 (kogumi number 20), 3,3x1010

(kogumi number 94), 4,7x109 (kogumi number 25), 5,0x109 (kogumi number 26), 25

3,0x109 (kogumi number 27) ja 4,2x109 (kogumi number 99) sõltumatut

transformanti.

2. Kogumite amplifitseerimine

A. Kogumite teise varu valmistamine

EE - EP1615952 B1 117

Esmasest kogumi rakuvarust (lõigust 1H eespool) kasutati piisavalt rakke, et katta

10x liiasust igast kogumi suurusest ja inokuleerida 2xYTAGT (2YT 100ug/ml

ampitsilliini, 12,5ug/ml tetratsükliini ja 2% glükoosiga) söödet, nii et esialgne OD600

oli 0,1. Kultuuridel lasti kasvada mitu tundi temperatuuril 37 ˚C raputades, kuni

OD600 = 0,5. Igast kogumist võeti välja ühe kümnendiku suurune alikvoot ja 5

kasvatati üles eraldi kolbides veel kahe tunni jooksul temperatuuril 37 ˚C. Neid

alamkultuure tsentrifuugiti seejärel 10 minutit temperatuuril 4 ˚C rootoriga

Beckman JA-14 kiirusel 4000rpm ning bakterite graanuleid resuspendeeriti

säilitamiseks 7,0ml-s (iga kogumi jaoks) 15%-lises gltüseroolis/2xYT-s

temperatuuril -80 ˚C. 10

B. Faagi induktsioon

M13KO7 faagi abistaja alikvoote (Amersham Pharmacia Biotech) lisati allesjäänud

bakteri kultuuridele optilisel tihedusel OD600=0,5 (lõigust 2A eespool)

lõppkontsentratsioonile 3x109pfu/ml. Abistaja faagil lasti baktereid 30 minutit

raputamata nakatada temperatuuril 37 ˚C ning 30 minutit aeglase raputamisega. 15

Nakatatud rakke tsentrifuugiti 15 minutit temperatuuril 4 ˚C kiirusel 5000rpm. Raku

graanuleid resuspendeeriti samas koguses (lõigust 2A eespool) 2xYTAK

söötmega (2YT 100ug/ml ampitsiliini ja 40ug/ml kanamütsiiniga). Fagemiidi

tootmisel lasti öö jooksul loksutamisel toimuda temperatuuril 30 ˚C.

C. Faagi kogumine 20

Bakteri kultuure lõigust 2B eespool tsentrifuugiti 15 minutit temperatuuril 4 ˚C

kiirusel 5000rpm. Supernatandid edastati seejärel uutesse pudelitesse ning lisati

0,2-line kogus 20%-list PEG/2,5M NaCl ja seda inkubeeriti jääl 1 tund, et

fagemiide sadestada. Sadestatud fagemiide tsentrifuugiti 30 minutit temperatuuril

4 ˚C kiirusel 10 000rpm ja resuspendeeriti ettevaatlikult 100ml külma PBS-ga. 25

Fagemiidi lahust puhastati veel allesjäänud rakkude välja tsentrifuugimisel 10

minutit temperatuuril 4 ˚C kiirusel 4000rpm ning fagemiidide setitamisel, lisades

0,2-lise koguse 20%-list PEG/2,5M NaCl. Fagemiide tsentrifuugiti 30 minutit

temperatuuril 4 ˚C kiirusel 10 000rpm ning fagemiidi graanuleid resuspendeeriti

18ml külma PBS-ga. Fagemiidi lahusele lisati säilitamiseks kuus ml 60% 30

EE - EP1615952 B1 118

glütserooli lahust temperatuuril -80 ˚C. Fagemiidi tiitrid tuvastati

standardprotseduuriga (Molecular Cloning, Maniatis et al, 3. väljaanne).

3. Ang-2 seostusfaagi selekteerimine

A. Ang-2 kinnistamine magnetilistele graanulitele

Biotinüülitud Ang-2 (lõigust 3A eespool) kinnistati osakestele Dynabead M-280 5

Streptavidin (DYNAL, Lake Success, NY) kontsentratsioonil 2000ng Ang-2

proteiini 100µl graanulite varu kohta tootjalt. Pärast graanulite tõmbamist toru

ühele küljele magneti abil ja vedeliku pipetiga eemaldamist pesti graanuleid kaks

korda fosfaatpuhvri soolahusega (PBS) ja resuspendeeriti PBS-s. Biotinüülitud

Ang-2 proteiini lisati pestud graanulitele ülaltoodud kontsentratsioonil ning 10

inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril pöörlemisel. Ang-2 kattega graanulid blokeeriti

seejärel BSA lisamisel 2%-lise lõppkontsentratsioonile ning inkubeeriti öö jooksul

temperatuuril 4 ˚C pöörlemisel. Saadud Ang-2 kattega graanuleid pesti seejärel

kaks korda PBST-ga (PBS 0,05%-lise Tween-20-ga) enne selektsiooni

protseduuridesse edastamist. 15

B. Ang-2 kattega graanulitega selekteerimine

Umbes 1000-kordse kogumiga ekvivalentseid fagemiide (lõigust 2C eespool)

blokeeriti üks tund 2%-list BSA-d sisaldava 1ml PBS-ga. Blokeeritud fagemiidi

proov edastati kolme negatiivse selektsiooni etappi, lisades selle puhastele

graanulitele (samad graanulid nagu lõigus 3A, aga Ang-2 proteiini katteta) ning 20

seda mikstuuri inkubeeriti 15 minutit toatemperatuuril pöörlemisel. Fagemiidi

sisaldav supernatant tõmmati magneti abil välja ja edastati teise torusse, mis

sisaldas puhtaid graanuleid (samad graanulid nagu lõigus 3A, aga Ang-2 proteiini

katteta) ning seda mikstuuri inkubeeriti 15 minutit toatemperatuuril pöörlemisel.

Sama protseduuri korrati. Fagemiidi sisaldav supernatant tõmmati magneti abil 25

välja ja edastati teise torusse, mis sisaldas Ang-2 proteiini kattega graanuleid

(lõigust 3A) ning seda mikstuuri inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril pöörlemisel.

Pärast supernatandi eemaldamist pesti fagemiidiga seotud graanuleid 10 korda

2%-lise piima-PBS-ga, 10 korda 2%-lise BSA-PBS-ga, 10 korda PBST-ga ja kaks

korda PBS-ga. Seejärel lasti fagemiididel 10 minutit rotaatoril elueerida 1ml-s 30

EE - EP1615952 B1 119

100mM-s trietüülamiini lahuses (Sigma, St. Louis, MO). Fagemiidi sisaldava

lahuse pH neutraliseeriti 0,5ml 1MTris-HCl (pH 7,5) lisamisega. Saadud fagemiide

kasutati 10ml värskelt kasvatatud XL1-Blue MRF’ bakterite nakatamiseks (OD600

umbes 0,5) temperatuuril 37 ˚C 30 minutit loksutamisega ning 30 minutit aeglase

loksutamisega. Kõik nakatatud XL1-BLUE MRF’ rakud seati 15x15cm 2xYTAG 5

plaadile ja inkubeeriti öö jooksul temperatuuril 30 ˚C.

C. Faagi induktsioon ja kogumine

10ml-line alikvoot 2xYTAGT söödet lisati plaadile (lõigust 3B) XL1-BLUE MRF’

rakkude resuspendeerimiseks. Kõik XL1-BLUE MRF’ rakud koguti torusse ning

250ml-line alikvoot neid rakke lisati 25ml-le 2xYTAGT-le ja kasvatati temperatuuril 10

37 ˚C, kuni OD600 = 0,5. M13KO7 abistaja faagi lisati lõppkontsentratsioonile

3x109cfu/ml ning inkubeeriti 30 minutit loksutamiseta temperatuuril 37 ˚C ja 30

minutit aeglasel loksutamisel. Rakke tsentrifuugiti 10 minutit kiirusel 5000rpm

temperatuuril 4 ˚C ja resuspendeeriti 25ml 2xYTAK-ga. Nendel bakteritel lasti öö

jooksul temperatuuril 30 ˚C loksutamisel kasvada. Indutseeritud fagemiidid koguti 15

kokku ning puhastati nagu lõigus 2C.

D. Teine selekteerimine

Teine selekteermine tehti nagu lõikudes 3B kuni 3C, välja arvatud järgnev. Umbes

1000-kordse kogumiga ekvivalentseid lõigust 3C saadud fagemiide kasutati

lähtefagemiidina. Biotinüülitud Ang-2 proteiini (lõik 3A) katte kogust osakestele 20

Dynabead M-280 Streptavidin vähendati 20ng-ni. Faagiga seotud graanuleid pesti

seejärel 10 korda 2%-lise piima-PBS-ga, 10 korda 2%-lise BSA-PBS-ga, 10 korda

PBST-ga, kus viimane pesu hõlmas 60-minutilist inkubeerimist toatemperatuuril

PBST-s. Graanuleid pesti kaks korda PBS-ga. Elueerimise tingimused olid samad

nagu esimeses selekteerimises (lõik 3B). 25

E. Kolmas selekteerimine

Kolmanda ringi selekteerimine sooritati nagu lõikudes 3B kuni 3C eespool, välja

arvatud järgnev. Umbes 10-kordse kogumi ekvivalendi fagemiide 3D kasutati

lähtefagemiididena. Umbes 2ng biotinüülitud Ang-2 proteiini (lõigust 3A) kasutati

osakeste Dynabead M-280 Streptavidin katmiseks. Faagiga seotud graanuleid 30

EE - EP1615952 B1 120

pesti 10 korda 2%-lise piima-PBS-ga, 10 korda 2%-lise BSA-PBS-ga, 10 korda

PBST-ga, kus viimane pesu hõlmas 60-minutilist inkubeerimist toatemperatuuril

PBST-s. Graanuleid pesti kaks korda PBS-ga. Elueerimise tingimused olid samad

nagu esimeses selekteerimises (lõik 3B).

F. Neljas selekteerimine 5

Neljanda ringi selekteerimine sooritati nagu lõikudes 3B kuni 3C eespool, välja

arvatud järgnev. Kogumi ekvivalendi fagemiide lõigust 3E kasutati

lähtefagemiididena. Biotinüülitud Ang-2 proteiini (lõik 3A) katte kogust osakestele

Dynabead M-280 Streptavidin vähendati kogumite 25, 26 ja 27 puhul 0,4ng-le.

Kogumitele 20 ja 94 hoiti katte kogust nagu kolmandas ringis 2ng juures. Kogumit 10

99 neljanda selektsiooni etapile ei tehtud. Elueerimise tingimused olid samad nagu

esimeses selekteerimises (lõik 3B).

4. KLOONI ANALÜÜS

A. Peaplaadi (Master Plate) valmistamine

Üksikud kolooniad teisest selekteerimisest valiti välja ja inokuleeriti 96-15

süvendilistele plaatidele, mis sisaldasid igas süvendis 120µl 2xYTAGT. 96-

süvendilisi plaate inkubeeriti öö jooksul loksutis temperatuuril 30 ˚C. Igale

süvendile lisati säilitamiseks nelikümmend mikroliitrit 60%-list glütserooli

temperatuuril -80 ˚C.

B. Fagemiidi ELISA 20

Umbes 2µl alikvoote rakke peaplaadist (lõigust 4A eespool) inokuleeriti värskele

Costar® 96-süvendilisele plaadile (Corning Incorporated, Coming, NY, kat-nr

9794), mis sisaldas igas süvendis 100µl 2xYTAGT, ning seda uut rakkude plaati

kasvatati temperatuuril 37 ˚C, kuni OD600 oli ligikaudu 0,5.

Igale süvendile lisati nelikümmend µl 2xYTAGT, mis sisaldas M13KO7 abistaja 25

faagi (1,5x1013cfu/ml), ning 96-süvendilist plaati inkubeeriti 30 minutit

loksutamiseta ning veel 30 minutit aeglase loksutamisega temperatuuril 37 ˚C.

Plaati tsentrifuugiti 10 minutit temperatuuril 4 ˚C kiirusel 2000rpm (Beckman CS-

6R lauatsentrifuug). Supernatandid eemaldati rakkudest ning iga rakugraanulit

EE - EP1615952 B1 121

resuspendeeriti igas süvendis 150µl 2xYTAK kasutamisel. Plaati inkubeeriti öö

jooksul temperatuuril 30 ˚C fagemiidi ekspressiooniks.

Inimese Ang-2 proteiin kaeti temperatuuril 4 ˚C öö jooksul 96-süvendilisele

Maxisorpi plaadile (NUNC) koguses 1µg/ml 1xPBS-s. Kontrolliks kaeti 2% BSA

(Sigma) eraldi Maxisorpi plaadile. Järgmisel päeval tsentrifuugiti öö jooksul saadud 5

rakke 10 minutit temperatuuril 4 ˚C kiirusel 2000rpm. Kümme µl supernatanti igast

süvendist edastati uuele 96-süvendilisele plaadile, mis sisaldas BSA/PBS lahust,

et lahjendada supernatanti suhtes 1:10. Saadud segusid inkubeeriti 1 tund

toatemperatuuril loksutamisel, et fagemiide blokeerida. Samal ajal blokeeriti Ang-2

proteiiniga kaetud plaat 400µl 2% BSA/PBS lahusega igas süvendis 1 tunni 10

jooksul toatemperatuuril loksutamisel. BSA lahus eemaldati ning iga süvendit pesti

kolm korda PBS lahusega. Pärast viimast pesuetappi lisati igale Ang-2 proteiiniga

kaetud plaadi süvendile ja kontrollplaadile 100µl blokeeritud fagemiidi lahuseid

ning neid inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril loksutamisel. Vedelik eemaldati ja iga

süvendit pesti kolm korda PBST lahusega. Igale Ang-2 proteiiniga kaetud ja 15

kontrollplaadi süvendile lisati sada µl HRP-konjugeeritud anti-M13 mAb

(Amersham Pharmacia Biotech) 15 000-lisel lahjendusel ning neid plaate

inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril loksutamisel. Vedelik eemaldati uuesti ja iga

süvendit pesti kolm korda PBST lahusega. Süvenditele lisati sada µl LumiGLO

kemoluminestsents-substraate (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, 20

MD) ja iga süvendit loeti seadmega Luminoskan Ascent DLRearly (Labsystems,

Franklin, MA).

C. Faagi kloonide sekventeerimine

PCR reaktsioon sooritati 1µl bakteritega peaplaadi igast süvendist (lõik 4A), mis

olid mudeliks. Iga PCR segu kogus oli 50µl, mis sisaldas 1xPCR puhvrit, 300nM 25

kumbagi praimerit:

5’-GTTAGCTCACTCATTAGGCAC-3’ (JÄRJESTUSE ID-NR: 256) ja

5’-GTACCGTAACACTGAGTTTCG-3’, (JÄRJESTUSE ID-NR: 257);

200mM dNTP, 2mM MgCl2 ja 2,5Ü taq DNA polümeraasi (Roche Molecular

Biochemicals). Järgneva programmi teostamiseks kasutati masinat GeneAmp 30

EE - EP1615952 B1 122

PCR System 9700 (Applied Biosystems): 94 ˚C 5 minutit; 40 tsüklit (94 ˚C 45

sekundit, 55 ˚C 45 sekundit, 72 ˚C 90 sekundit); 72 ˚C 10 minutit; jahutamine

temperatuurile 4 ˚C. PCR produkte puhastati seadmega QIAquick 96 PCR

Purification Kit (QIAGEN Inc.) vastavalt tootja juhistele. Kõik PCR produktid

järjestati praimeriga 5’-TTACACTTTATGCITCCG-3’ (JÄRJESTUSE ID-NR: 258), 5

kasutades sekventserit ABI 3770 (Perkin Elmer) vastavalt tootja juhistele.

5. Järjestuse hindamine

Nukleotiidi järjestustest (lõigust 4C eespool) transleeritud peptiidi järjestused pandi

ELISA andmetega korreleeruma. Kloonid näitasid, et kõrget OD näitu Ang-2

kaetud süvendites ja madalat OD näitu BSA kaetud süvendites peeti palju 10

olulisemaks. Mitu korda esinenud järjestusi peeti samuti oluliseks. Kakskümmend

neli peptiidi järjestust kogumist 20, 26 peptiidi järjestust kogumist 94, 7 peptiidi

järjestust kogumist 25, 18 peptiidi järjestust kogumist 26, 6 peptiidi järjestust

kogumist 27 ning 4 peptiidi järjestust kogumist 99 valiti edasiseks analüüsiks ja

peptikeha loomiseks. Lisaks tuletati üksteist konsensusjärjestust kogumitest 20 ja 15

94, kolm konsensusjärjestust kogumitest 26 ja 99 ning kaks konsensusjärjestust

kogumitest 25 ning neid kasutati peptikehade loomiseks. Peptikehasid tabelis 7

hinnati neutralisatsiooni ELISA analüüsi eeskirjadega, mida on kirjeldatud siin

näites 10. Tulemused on esitatud tabelis 7.

Tabel 7 20

EE - EP1615952 B1 123

EE - EP1615952 B1 124

EE - EP1615952 B1 125

EE - EP1615952 B1 126

EE - EP1615952 B1 127

EE - EP1615952 B1 128

EE - EP1615952 B1 129

EE - EP1615952 B1 130

EE - EP1615952 B1 131

Näide 9

Anti-Ang2 peptikehade 6 proovi testiti nende seostumistoime osas huAng2-le

(R&D Systems, BNO12103A firmalt BIAcore). Proteiin G kinnistati CM5 kiibile

vastavalt amiini sidumise standardeeskirjadele (BIAcore Inc.) ning peptikehad 5

sisestati proteiini G pinnale haaramiseks (RL ~100RÜ). Seostumise testimiseks

hAng2 ja haaratud peptikeha vahel süstiti 0,3nM kuni 40nM huAng2 haaratud

peptikeha pinnale ja seostuvaid sensorgramme analüüsiti seadmega

EE - EP1615952 B1 132

BIAevaluation 3,0 (BIAcore Inc.). Tabelis 8 on antud katse tulemused kokku

võetud.

Tabel 8

Peptikeha Partii nr KD (M) ka (1/Ms) kd (1/s)

Con4-44 (C) 011702 2,1E-10 2,9E+05 5,9E-05

L1-7 (N) 022102 2,4E-10 3,7E+05 8,7E-05

L1-10 (N) 021302 7,7E-10 1,5E+05 1,1E-04

L1-21 (N) 021802 2,4E-10 5,6E+05 1,4E-04

Con4 (C) 33456-77 3,8E-10 5,3E+05 2,0E-04

2xCon4 (C) 1K 092501 3,4E-10 4,8E+05 1,6E-04

Näide 10

Neutralisatsiooni ELISA 5

Inimese, hiire, koera ja roti Ang-2 ning inimese ja hiire Ang-1 töödeldud söödet

lahjendati DMEM/50mg/ml-s BSA-s järgnevalt: hAng-2 - 1:64 lahjendus; mAng-2 -

1:64 lahjendus; roti Ang-2 - lahjendamata; koera Ang-2 - 1:32 lahjendus; hAng-1 -

1:4 lahjendus; ning mAng-1 - 1:4 lahjendus.

Ulatus, milleni iga konditsioneeritud söödet lahjendati, määrati nende võime põhjal 10

siduda 1nM hTie2-Fc (võimaldati Tie-2-Fc molekulina, kus Tie-2 osa sisaldab

ainult molekuli lahustuvat rakuvälist osa; R&D Systems, kataloogi number 313-TI)

50% maksimaalselt saavutatava sidumisega (st platoo). Mikrotiitri plaadid kaeti

100µl lahjendatud konditsioneeritud söötmega. Ang-2 neutralisatsiooni ELISA

analüüside jaoks tiitriti kandidaat anti-Ang-2 peptikehasid 62,5nM-st 0,015pM-ni 4-15

kordsetes lahjendustes PBS lahuses, mis sisaldas umbes 1% BSA-d ja umbes

1nM Tie-2 (võimaldati Tie-2-Fc molekulina, kus Tie-2 osa sisaldab ainult molekuli

lahustuvat rakuvälist osa; R&D Systems, kataloogi number 313-TI). Ang-1

neutralisatsiooni ELISA analüüside jaoks tiitriti kandidaat anti-Ang-2 peptikehasid

1000nM-st 0,2pM-ni 4-kordsetes lahjendustes PBS lahuses, mis sisaldas umbes 20

1% BSA-d ja umbes 1nM Tie-2 (võimaldati Tie-2-Fc molekulina, kus Tie-2 osa

sisaldab ainult molekuli lahustuvat rakuvälist; R&D Systems, kataloogi number

313-TI).

EE - EP1615952 B1 133

Pärast umbes 100 mikroliitri peptikeha/Tie-2 lahuse lisamist igasse süvendisse

inkubeeriti plaate öö jooksul toatemperatuuril ning seejärel pesti viis korda PBS-s,

mis sisaldas umbes 0,1 protsenti Tween-20. Pärast pesu lisati süvendi kohta 100

mikroliitrit anti-Tie-2 antikeha (Pharmingen Inc., kataloogi nr557039)

lõppkontsentratsioonil umbes 1 mikrogrammi ml kohta ning plaate inkubeeriti 5

umbes 1 tund toatemperatuuril. Järgmisena lisati süvendi kohta 100 mikroliitrit

kitse anti-hiire-IgG-HRP (Pierce Chemical Co., kataloogi nr 31432) lahjendusel

umbes 1:10 000 PBS-s, mis sisaldas umbes 1% BSA-d.

Plaate inkubeeriti toatemperatuuril umbes 1 tund, mille järel neid pesti viis korda

PBS-ga, mis sisaldas umbes 0,1 protsenti Tween-20. Seejärel lisati umbes 100 10

mikroliitrit TMB substraati süvendi kohta (SIGMA, kataloogi nr T8665) ning sinisel

värvil lasti tekkida. Seejärel loeti spektrofotomeetriga absorptsioon 370nM juures.

Tulemused on esitatud tabelis 9 allpool.

Tabel 9

Angiopoietiin:Tie2 koostoime peptikeha vahendatud neutralisatsioon

hAng-2 mAng-2 rAng-2 cAng-2 hAng-1 mAng-1

Peptikeha IC50 (nM) IC50 (nM) IC50 (nM) IC50 (nM) IC50 (nM) IC50 (nM)

2xCon4 (C) 0,026 0,035 0,024 0,047 3,0 3,2

Con4 (C) 0,197 0,289 0,236 0,540 200 300

Con4-44 (C) 0,08 0,16 0,22 ---- 43 ----

Con4-40 (C) 0,20 0,27 0,35 ---- > 1000 ----

L1-7 (N) 0,046 0,063 0,035 0,108 > 1000 > 1000

L1-21 (N) 0,179 0,249 0,204 0,608 > 1000 > 1000

L1-10 (N) 0,06 0,06 0,06 ---- > 1000 ----

Näide 11 15

FK uuring

Uuringu struktuur

Isased CD-1 hiired kehamassiga 20-30g jaotati suvaliselt iga peptikeha ravirühma

(2xCon4-C, L1-7-N ja L1-21-N). Loomad said üksiku IV booluse (n=38/rühm) või

EE - EP1615952 B1 134

üksiku subkutaanse (SK) manustamisena 50µg peptikeha (n=34/rühm). Süste tehti

sabaveeni kaudu ja õlgadel oleva naha alla vastavalt N ja SK manustamiseks.

Vereproovid ja analüütilised meetodid

Vereproovid võeti iga anti-Ang2 peptikeha kontsentratsiooni mõõtmise esialgse

annuse jaoks ning 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 216, 264, 312 ja 5

336 tundi pärast doosi manustamist SK ja N rühmadele. Lisaproovid võeti 5 ja 30

minutit doosijärgselt IV rühmade jaoks. Kahel loomal võeti verd teatud ajapunktil

ning loomad surmati pärast proovi võtmist. Veri (ligikaudu 0,50ml) koguti südamest

vere võtmisega Microtainer® polüproüleeni seerumi eraldustorudesse. Proove

hoiti jääl ligikaudu 20 minutit või klompide moodustumiseni. Seerum eemaldati 10

vereproovist ligikaudu 10 minuti jooksul temperatuuril 2-8 ˚C tsentrifuugimisel ning

seda hoiti analüüsimiseni ligikaudu temperatuuril -70 ˚C. Proove mõõdeti

kontrollitud TRF analüüsiga alumise määramispiiriga (LLOQ) 100ng/mL. NUNC

Maxisorpi fluoriga miktrotiitri plaadid kaeti rekombinantse hiire Ang-2 proteiiniga.

Seejärel blokeeriti plaadid proteiini lahusega, et alandada mittespetsiifilist sidumist. 15

Standardid, kvaliteedikontroll ja tundmatud proovid valmistati 10%-lises hiire

seerumi analüüsi puhvris ning lasti pipetiga mikrotiitri plaatide süvenditesse.

Peptikehad seoti spetsiifiliselt kinnistatud Ang-2-le. Pärast kõikide seondumata

ainete välja pesemist (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.) lisati süvenditesse

biotinüülitud kitse anti-inimese IgG (H+L) monoklonaalne antikeha (Jackson 20

ImmunoResearch Laboratories Inc.). Pärast mis tahes seondumata biotinüülitud

monoklonaalsete antikehade eemaldamise etappi lisati süvenditesse

euroopiumiga märgistatud streptavidiini. Pärast seondumata streptavidiin-

euroopiumi välja pesemist eemaldati seotud euroopium streptavidiinist igasse

süvendisse pipeteeritud happelise lahusega. Loodi fluorestsentssignaal ja seda 25

loeti Wallaci fluorimeetriga. Testi vahemik anti-Ang-2 peptikeha analüüsiks hiire

seerumis on 0,078-5µg/mL.

Farmakokineetiline analüüs

Komposiidi keskmine kontsentratsiooni-aja andmed iga rühma jaoks sisestati

jaotusega analüüsi, kasutades tarkvara WinNonlin Professional (versioon 3.3, 30

Pharsight Corp., Mountain View, CA). Nominaalseid proovi aegu kasutati

EE - EP1615952 B1 135

farmakokineetiliseks analüüsiks, kui proovid koguti nominaalsest ajast 10%

jooksul. Kõik alla LLOQ kontsentratsiooni väärtused seati enne FK analüüsi nullile.

Mõõdeti järgnevad FK parameetrid:

• terminaalne poolestusaeg (t½ arvutati valemiga , kus kel oli

esimest järku terminaalne kiiruskonstant, mis määrati kindlaks terminaalse 5

log-lineaarse lagunemisfaasi lineaarse regressiooniga;

• seerumi kontsentratsiooni-aja kõvera all olev ala (AUC(0-viimane)) määrati

kindlaks lineaarse/log trapetsiaalse meetodiga ajast 0 kuni viimane, viimase

mõõdetava kontsentratsiooni aeg (Cviimane).

• ala kõvera all ajast 0 kuni lõpmatuseni (AUC(0-∞)) määrati kindlaks vastava 10

AUC(0-viimane) ja prognoositud Cviimane/kel väärtuste summana:

AUC(0-∞)=AUC(0-viimane)+prognoositud Cviimane/kel

• absoluutne biokättesaadavus (F) pärast SK manustamist arvutati

valemiga:

F=(AUC(0-∞)SK/AUC(0-∞)IV)x100 15

Tulemused on esitatud joonisel Fig 2.

Näide 12

Uuringu päeval 0 süstiti emastele karvututele hiirtele subkutaanselt 1x107 A431

rakke. 3. päeval manustati Ang-2 peptikeha 2xCon4-C subkutaanselt annuses

200µg/hiir/päevas. Kasvaja suurust ja kehamassi märgiti üles regulaarsete 20

intervallidega, nagu on joonisel näidatud. Olulisi erinevusi kasvaja arengus

täheldati Ang-2 peptikehaga ravitud rühma ning kandur-kontrolli ja kontroll-

peptikeha (p <0,0001 iga kontrolli suhtes, kasutades korduvmõõtmisega ANOVA

analüüsi, Scheffe’i post hoc testiga) vahel. Selle peptikehaga ravimisel ei olnud

olulist toimet kehamassile. Tulemused on esitatud joonisel Fig 3. 25

EE - EP1615952 B1 136

Näide 13

A431 in vitro kasvukõver

A431 rakud külvati 96-süvendilistele koekultuuri plaatidele tihedusel 2000 rakku

süvendisse 200µl-s DMEM-s, millele oli lisatud 10%-list veise looteseerumit (FBS).

Sööde imeti välja 16 tundi pärast külvamist. Seejärel lisati süvenditesse järgnev 5

ning seati sisse triplikaadina: 100µl DMEM-i igasse süvendisse, 10% FBS, 1mg/ml

negatiivne kontroll-peptikeha 4883 või peptikeha TN8-Con4. Sama seadistust

korrati 5 plaadil. Ühelt plaadilt saadud sööde imeti välja 24, 48, 72, 96 ja 120 tundi

pärast ravi. Seejärel lisati igasse süvendisse sada µl 10% trikloroäädikhapet (TCA)

ning plaate hoiti temperatuuril 4 ˚C. Kõik plaadid koguti, kui viimane plaat oli 10

minimaalselt 4 tundi 10%-lises TCA-s. 10%-line TCA loksutati välja ning süvendeid

loputati 5 korda kraaniveega. Rakud märgistati seejärel 10 minuti jooksul

toatemperatuuril 100µl 0,4% sulforodamiiniga B (Sigma S-9012) 1%-lises

äädikhappes (Sigma A-6283) ning neid pesti siis 5 korda 1%-lise äädikhappega.

Hiljem kuivatati plaadid õhkkuivaks. Värvi tehti 2 tundi pöördloksutil lahustuvaks 15

300µl 20mM puhverdamata Tris-ga (pH>10). Seejärel mõõdeti optiline tihedus

(OD) 540nm juures mikrotiitri plaadi loenduriga. Tulemused on esitatud joonisel

Fig 4.

Näide 14

Uuringu päeval 0 süstiti emastele karvututele hiirtele subkutaanselt 2x106 Colo-20

205 rakke ja Matrigeli (2:1). 3. päeval manustati Ang-2 peptikehasid L1-7-N, L1-

21-N, Con4-C ja 2xCon4-C subkutaanselt annusel 14µg/hiir kaks korda nädalas.

Positiivse kontrollina manustati Anti-Ang-2 antikeha Ab536 annuses 47µg/hiir kolm

korda nädalas. Kasvaja suurus ja kehamassid märgiti üles regulaarsetel

intervallidel. 25

Olulisi erinevusi kasvaja arengus täheldati iga Ang-2 peptikehaga ravitud rühma ja

kandur-kontrolli ning kontroll-peptikeha vahel (p <0,0001 iga kontrolli suhtes,

kasutades korduvmõõtmisega ANOVA analüüsi Scheffe’i post hoc testiga). Nende

peptikehadega ravimisel ei olnud märkimisväärset toimet kehamassile (tulemusi ei

ole näidatud). Tulemused on esitatud joonisel Fig 5. 30

EE - EP1615952 B1 137

Näide 15

Uuringu päeval 0 süstiti emastele karvututele hiirtele subkutaanselt 2x106 Colo-

205 rakke ja Matrigeli (2:1). 3. päeval manustati Ang-2 peptikeha 2xCon4-C

subkutaanselt annustes 14, 2,8 ja 0,56µg/hiir kaks korda nädalas. Kasvaja suurust

ja kehamassi märgiti üles regulaarsetel intervallidel, nagu on näidatud. Olulisi 5

erinevusi kasvaja arengus täheldati kahe kõrgemas annuses Ang-2 peptikehaga

ravitud rühma ning kandur-kontrolli ja kontroll-peptikeha suhtes (p=0,003

vaheannuse puhul ja p<0,0001 kõrgema annuse puhul, kasutades

korduvmõõtmisega ANOVA analüüsi Scheffe’i post hoc testiga). Nende

peptikehadega ravimisel ei olnud olulist toimet kehamassile. Katkendlik joon 10

tähistab rühma kogu n vähenemist 10-st 9 hiireni ühe hiire surma tõttu teadmata

põhjustel. Tulemused on esitatud joonisel Fig 6.

Näide 16

Anti-Ang-2 peptikehad Colo-205 ksenografti kasvajatega võrreldes

Uuringu päeval 0 süstiti emastele karvututele hiirtele subkutaanselt 2x106 Colo-15

205 rakke ja Matrigeli (2:1). 3. päeval manustati Ang-2 peptikeha 2xCon4-C või

kontroll-peptikeha subkutaanselt annuses 350µg/päevas. Kontroll-peptikehaga

ravitud rühmadest (nagu on kirjeldatud tabelis 5) saadud kasvajad koguti kas 14.

päeval (suurusega ühitatud kontroll) või 18. päeval (ajaga ühitatud kontroll).

Kasvajad 2xCon4(C) ravitud rühmadest koguti seejärel 18. päeval. Kasvaja 20

suurust märgiti üles regulaarsetel intervallidel, nagu on näidatud. Olulisi erinevusi

kasvaja arengus täheldati ajaga ühitatud kontrollrühma ja 2xCon4-C ravitud rühma

(p=0,0154 korduvmõõtmisega ANOVA analüüsil Scheffe’i post hoc testiga) vahel.

Nende peptikehadega ravimisel ei olnud olulist toimet kehamassile.

Kujutise analüüsiks valmistatud kasvajad lõigati pooleks ning üks pool kiirkülmutati 25

OCT-s (Sakura Finetek USA Inc., Torrance, CA). Külmutatud lõigud märgistati

immunohistokeemiliselt anti-hiire CD31-ga (kataloogi nr 553370, BD PharMingen,

San Diego, CA) 2µg/ml juures, kus DAB oli kromogeen. Kasvaja lõike fotografeeriti

digitaalselt 20-kordse objektiiviga suurendamisel. Tabati neli „kompass-punkti“

välja kasvaja kohta, kus ravirühma kohta oli kümme kasvajat. Kujundi analüüsi 30

EE - EP1615952 B1 138

süsteemiga MetaMorph (Universal Imaging Corporation, Downington, PA) seati

lävi kujundites olevate CD31 märgistusega veresoonte jaoks. CD31 positiivse

märgistusega alasid ekspresseeriti kasvaja kogu koe suhtena igas väljas.

Tulemused on esitatud joonisel Fig 7.

Näide 17 5

Uuringu päeval 0 süstiti emastele karvututele hiirtele subkutaanselt 2x106 Colo-

205 rakke ja Matrigeli (2:1). Ravimine annuses 350µg/hiirele kaks korda nädalas

Ang-2 peptikeha 2xCon4-C või ekvivalentse kontroll-peptikehaga algas 3., 10. või

15. uuringu päeval. Kasvaja suurust ja kehamassi märgiti üles regulaarsetel

intervallidel. Olulisi erinevusi kasvaja arengus täheldati kõikide Ang-2 peptikehaga 10

ravitud rühmade vahel ning kandur-kontrolli suhtes (p=0,089 15. päeva rühma ning

p<0,0001 3. ja 10. päeva rühmade jaoks, kasutades korduvmõõtmisega ANOVA

analüüsi Scheffei post hoc testiga). Nende peptikehadega ravimisel ei olnud olulist

toimet kehamassile. Tulemused on esitatud joonisel Fig 8 (kehamasse ei ole

näidatud). 15

Näide 18

Kokkuvõte täieliku vastuse (CR) määradest saadi antikehaga Ab536 annusel

47µg/emasele karvutule hiirele, kellele seda manustati intraperitoneaalselt kolm

korda nädalas, või peptikehaga 2xCon4(C), mida anti subkutaanselt mitmekordse

annustamise režiimidega erinevates pikaajalistes uuringutes (≥10 nädalat 20

doseerimist) mõlemas A431 ja Colo-205 ksenografti mudelis. Siin kasutatud CR

tähistab tulemust, millesse mõõdetavat kasvajat pärast ravi ei jäänud. Tulemused

on esitatud joonisel Fig 9.

Näide 19

a) Pk kombinatsioon taksoteeriga Colo-205 kasvaja mudelis 25

Uuringu päeval 0 süstiti emastele karvututele hiirtele subkutaanselt 2x106 Colo-

205 rakke ja Matrigeli (2:1). 14. uuringupäeval algatati ravimist a) annuses

350µg/hiir kaks korda nädalas Ang-2 peptikeha 2xCon4-C, b) 20mg/kg qwx3

intraperitoneaalselt taksoteeriga või c) kombinatsiooniga mõlemast. Kasvaja

EE - EP1615952 B1 139

suurust ja kehamassi märgiti üles regulaarsetel intervallidel. Olulisi erinevusi

kasvaja arengus täheldati kõikides ravirühmades kandur-kontrolliga võrreldes

(p<0,0001, kasutades korduvmõõtmisega ANOVA analüüsi Scheffe’i post hoc

testiga). Lisaks oli kombineeritud ravi tunduvalt erinevam kui kumbki monoteraapia

aine (p<0,0001 2xCon-4-C ja p=0,0122 taksoteeriga võrreldes). Katkendlik joon 5

tähistab rühma kogu n vähenemist 10-st 9 hiirele ühe hiire surma tõttu teadmata

põhjustel. Nende peptikehadega ravimisel ei olnud olulist toimet kehamassile.

Tulemused on esitatud joonisel Fig 10a.

b) Pk kombinatsioon 5-FU-ga Colo-205 kasvaja mudelis

Uuringu päeval 0 süstiti emastele karvututele hiirtele subkutaanselt 2x106 Colo-10

205 rakke ja Matrigeli (2:1). 14. uuringupäeval algatati ravimist a) annuses

350µg/hiirele kaks korda nädalas Ang-2 peptikehaga 2xCon4-C, b) 50mg/kg qdx5

intraperitoneaalselt 5-FU-ga või c) a kombinatsiooniga mõlemast. Kasvaja suurust

ja kehamassi märgiti üles regulaarsetel intervallidel, nagu on näidatud.

Olulisi erinevusi kasvaja arengus täheldati kõikides ravirühmades kandur-15

kontrolliga võrreldes (p<0,0001, kasutades korduvmõõtmisega ANOVA analüüsi

Scheffe’i post hoc testiga). Lisaks oli kombineeritud ravi tunduvalt erinevam kui

kumbki monoteraapia aine (p=0,0375 2xCon-4-C-ga võrreldes ja p=0,0453 5-FU-

ga võrreldes). Mööduvat alanemist kehamassis täheldati 5-FU ravirühmas (18%

20. uuringu päeval) ning kombineeritud ravi rühmas (16% 20. uuringu päeval), 20

millele järgnes kehamassi täielik taastumine. Tulemused on esitatud joonisel Fig

10b.

Näide 20

Adjuvandi artriidi mudel

Isased Lewise rotid (120-130g, Charles River, Wilmington MA) paigutati 25

kahekaupa filtriga kaetud puuri kontrollitud keskkonnaga ruumis (temperatuur

23±2 ˚C, suhteline niiskus 50±20%) 12-tunnise valge/pime tsükliga. Loomadele

söödeti kommertsiaalset näriliste toitu (formulatsioon 8640; Tek Lab, Madison, WI)

ning nad said filtriga puhastatud kraanivett ad libitum. Normipõhine kaltsiumi ja

fosfori sisaldus oli vastavalt 1,2% ja 1,0%. 30

EE - EP1615952 B1 140

Adjuvandi artriit kutsuti esile 0,05mL-s petrooleumis (Crescent Chemical Co.,

Hauppauge, NY) suspendeeritud kuumusega surmatud Mycobacterium

tuberculosise H37Ra üksiku 0,5mg-lise süstiga (Difco Laboratories, Detroit, MI)

intradermaaselt saba alaotsa. Artriidi kliiniline algus oli 9. päeval, nagu näitasid

tagakäpa tursumine ja ambulatoorsed raskused. Välja arvatud 2xCon4(c) 5

ravirühmas (mida raviti 1. päevast pärast immuniseerimist), tehti ravi igapäevaste

subkutaansete süstidena alates 9. päevast pärast immunisatsiooni (enne artriidi

algust) ning jätkati 18. päevani.

Adjuvandi artriidi kliiniline jälgimine

Põletiku progressiooni hinnati kliiniliselt tagakäpa suuruse perioodilise 10

mõõtmisega, kasutades vee pletüsmograafi vastavalt meetoditele, mida on

kirjeldanud Feige et al, Cellular Molec. Life Sci., 57:1457-1470 (2000). Käpa

põletiku inhibeerimine arvutati kõvera all oleva ala põhjal (AUC), kasutades

trapetsiaalset reeglit vastavalt valemile:

[1-{(ravitud AdA)-normaalne)/(ravimata AdA-normaalne)}x100 15

Lisaks tuvastati kogu kehamass igapäevaselt 9-päevase ravirežiimi jooksul

täiendava lõpp-punktina, kuna kehamass on olnud paralleelne liigese põletiku

progressiooniga antud artriidi mudelis. Loomad surmati CO2 keskkonnas 18.

päeval.

Luutihedust (BMD) vaadeldi lahangul (18. päev pärast immuniseerimist). 20

Tagakäpad eemaldati karvajoonelt (täpselt pahkluu juures (hüppeliiges)), kasteti

70%-lisse etanooli ning seejärel skaneeriti horisontaalsuunas, kasutades

röntgenkiirte (fan-beam x-ray) densitomeetrit (Model QDR-4500A; Hologic,

Waltham, MA). Vaata Feige et al, supra. Pärast skaneerimist paigutati kontsluu

keskele nelinurkne karp (29x25mm), et analüüsitavat kohta piiritleda, ning 25

patenditud algoritmidega (Hologic software) arvutati luu piirkond, luu mineraali

sisaldus ja luutihedus.

Kõik tulemused väljendati keskmise ± standardhälbega. p väärtusega 0,05

kasutati oluliste erinevuste piiritlemiseks rühmade vahel. Kliinilistel andmetel

EE - EP1615952 B1 141

(pidevad muutujad) tehti Kruskal-Wallis ANOVA ja Mann-Whitney U. test

kommertsiaalse statistika tarkvaraga (Statsoft v 3.0; Statsoft, Tulsa, OK).

Tulemused on esitatud vastavalt joonistel Fig 11a, 11b ja 11c.

Näide 21

Sarvkesta angiogeneesi mudel 5

CON4(C) toime VEGF tekitatud angiogeneesile rottidel

Ang-2 peptikeha CON4(C) hinnati sarvkesta angiogeneesi mudelil rottidel.

Angiogenees kutsuti esile VEGF-ga (või BSA kontrolli) immutatud nailondiski

siirdamisel sarvkesta põhikoesse (n=8/rühmas). Peptikeha TN8CON4-C manustati

subkutaanse süstiga annuses 1,0 või 0,1mg/rott/päevas mitme päeva jooksul. 10

Loomade teist kahte rühma töödeldi samas annuses negatiivse kontroll-

peptikehaga 4883. Kõiki rühmi eeltöödeldi üksiku esialgse suurema annusega

(loading dose) kas 3,0 või 0,3mg, mis oli kolmekordne pidev annus (maintenance

dose) 1,0 või 0,1mg (vaata joonist). Seitse päeva pärast ravi määratleti kaks

vaskulaarset lõpp-punkti roti igast sarvkesta digitaalkujutisest: diski ja ääre ning 15

veresoone pinna vahelises keskpunktis lõikuvate veresoonte arv. TN8CON4-C-ga

ravimine inhibeeris tunduvalt VEGF indutseeritud angiogeneesi annusest sõltuval

moel (p<0,04), samas kui kontroll-peptikehaga ravimisel ei olnud olulist toimet

kummalegi lõpp-punktile. Puudusid tõendid ilmsest mürgisusest ravitud loomade

kehamassi põhjal. Tulemused on esitatud joonisel Fig 12. 20

Näide 22

Epitoopide kaardistamine

Täispikad (aminohapped 1-495), N-terminaalsed (aminohapped 1-254) ja C-

terminaalsed (aminohapped 255-495) inimese Ang-2 (hAng-2) proteiinid klooniti

CMV-tekitatud imetaja ekspressiooni vektorisse C-terminaalsete 6xHis 25

märgistega. Kolm saadud struktuuri ja vektori-kontroll ekspresseeriti kiirelt 293T

rakkudesse. Seejärel koguti transfekteeritud rakkudest konditsioneeritud sööde

ning Ang-2ekspressiooni tase söötmes määrati anti-6xhis ELISA ja western blot-

analüüsiga.

EE - EP1615952 B1 142

Anti-Ang-2 antikehade ja peptikehade siduv epitoop tuvastati ELISA analüüsiga

nende võime põhjal seonduda kolmele inimese hAng-2 versioonile vastavalt

järgnevatele eeskirjadele: kõrge seondumisega 96-süvendiline analüüsi plaat kaeti

100µl konditsioneeritud söötmega süvendis ning seda inkubeeriti 1 tund

temperatuuril 37 ˚C. Konditsioneeritud sööde imeti välja ning plaati blokeeriti 1 5

tund 200µl süvendis 5%-lise BSA-ga PBS-s toatemperatuuril. Seejärel imeti

blokeerimise lahus välja. Igasse süvendisse lisati 100µl antikeha, peptikeha või

Tie2-Fc 1µg/ml juures 1%-lises BSA-s PBS-s ning neid inkubeeriti 1 tund

toatemperatuuril. Süvendeid pesti 4 korda 200µl 0,1% Tween-ga PBS-is. Igasse

süvendisse lisati 100µl HRP-konjugeeritud kitse anti-inimese IgG või kitse anti-10

hiire IgG ning seda inkubeeriti 45 minutit toatemperatuuril. Seejärel pesti

süvendeid 4 korda 200µl 0,1%-lise Tween-ga PBS-is. Seejärel lisati igasse

süvendisse 100µl TMB substraati. O.D. määrati 370nm juures.

Tulemused on esitatud joonistel Fig 13a, Fig 13b ja Fig 13c.

Näide 23 15

BiaCore analüüsile omaste teatud tundlikkuspiirangute tõttu hinnati sidumise

afiinsust ka Sepidyne KinExA analüüsiga.

2xCON4-C (Pb5714) seondumist huAng-2-le testiti KinExA analüüsiga (Sapidyne,

Boise, ID). Reacti-Gel 6x graanulid (Pierce, Rockford, IL) kaeti eelnevalt huAng-2-

ga ja blokeeriti BSA-ga. 10pM ja 30pM 2xCON4-C proove inkubeeriti 8 tundi 20

erinevatel kontsentratsioonidel (0,3pM-3nM) huAng-2-ga toatemperatuuril enne

huAng-2-kattega graanulite läbitöötamist. Graanulitega kaetud peptikeha kogus

määrati fluorestsentsmärkega (Cy5) kitse anti-inimse-Fc antikehaga (Jackson

ImmunoResearch, West Grove, PA). Sidumise signaal oli proportsionaalne

tasakaalus vaba peptikeha kontsentratsiooniga. 25

Dissotsiatsiooni tasakaalu konstant (KD) saadi konkureerivate kõverate

mittelineaarsest regressioonist, kasutades topelt kõvera ühe kohaga homogeenset

sidumismudelit (KinEx™ tarkvara). Seejärel tuvastati, et KD oli huAng-2-ga

seonduva 2xCON4-C jaoks ligikaudu 2pM.

EE - EP1615952 B1 143

Nagu on joonisel Fig 14 näidatud, analüüsi KinExA kasutades oli peptikehal

2xCon4 afiinsus -2pM hAng-2-le.

Näide 24

Pegüülitud peptiidid

L1-7 peptiidi sünteesiti 431 ABI sünteesijaga, kasutades sidumise 5

standardeeskirja ning topelt sidumist jäägist 14 (met) kuni N-terminaalse jäägini 1

(Cys) N-otsast C-otsani nummerdades.

L1-7 peptiidi konjugeerimine metoksü-polü(etüleenglükool)-maleimiidiga; MW: 5

KDa: nimega „mPEG5K-(L1-7 peptiid)“

0,8mg L1-7 peptiidi lahust 400mL-s puhvris 1 (20mM fosfaat, 5mM EDTA, pH 6,5) 10

töödeldi 13,5mg metoksü-polü(etüleenglükool)-maleimiidiga (MW=5KDa;

Shearwater Corp.), 0,27ml 50,0mg/mL lahusega puhvris 1. Reaktsioonimikstuuri

inkubeeriti öö jooksul temperatuuril 4 ˚C, lahjendati seejärel 1,6ml puhvriga A

(20mM Tris vesinikkloriid, pH 7,2) ning dialüüsiti Slide-A-Lyzer kassetis (3500

MWCO, Pierce) sama puhvri suhtes. Dialüüsitud reaktsioonimikstuuri puhastati 15

ioonvahetus kromatograafiaga 1,0ml HiTrap Q Sepharose HP kolonnil (Amersham

Biosciences Corp.). Saaduse piiki elueeriti kahes 1,0ml-lises fraktsioonis

gradiendiga 100%-lisest puhvrist A 100%-lisele puhvrile B (puhver A + 0,5M NaCl)

40 kolonni kogusel. Kombineeritud saaduse fraktsioonid kontsentreeriti

tsentrifugaalseadmega Microsep 1K Centrifugal Device (Pall Life Sciences) 20

koguseni 250µl, mis sisaldas 0,23mg proteiini/mL.

L1-7 peptiidi konjugeerimine 1,11-bis-maleimidotetraetüleenglükooliga; nimega

„PEO4(L1-7 peptiid)2“

1,0mg L1-7 peptiidi lahust 500µl puhvris 1 (20mM fosfaat, 5mM EDTA, pH 6,5)

töödeldi 0,0375mg 1,11-bis-maleimidotetraetüleenglükooliga (Pierce) (0,375ml 25

0,1mg/mL lahust puhvris 1). Reaktsioonimikstuuri inkubeeriti 3,33 tundi

temperatuuril 4 ˚C, seejärel dialüüsiti Slide-A-Lyzer kassetis (3500 MWCO, Pierce)

puhvri A suhtes (20mM Tris vesinikkloriid, pH 7,2). Dialüüsitud

reaktsioonimikstuuri puhastati ioonvahetus kromatograafiaga 1,0ml HiTrap Q

EE - EP1615952 B1 144

Sepharose HP kolonnil (Amersham Biosciences Corp.). Dimeerse produkti piiki

elueeriti kolmes 1,0ml-lises fraktsioonis gradiendiga 100%-lisest puhvrist A 100%-

lisele puhvrile B (puhver A + 0,5M NaCl) 40 kolonni kogusel. Saaduse

kombineeritud fraktsioonid kontsentreeriti tsentrifugaalseadmega Microsep 1K

Centrifugal Device (Pall Life Sciences) koguseni 550µl, mis sisaldas 0,12mg 5

proteiini/mL.

L1-7 peptiidi konjugeerimine polü(etüleenglükool)-bis-maleimiidiga: MW3,4 KDa:

nimega „PEG3,4K(L1-7 peptiid)2“

3,0mg L1-7 peptiidi lahust 1,5ml puhvris 1 (20mM fosfaat, 5mM EDTA, pH 6,5)

töödeldi 1,125mg polü(etüleenglükool)-bis-maleimiidiga (MW=3,4 KDa, 10

Shearwater Corp.); 0,563ml 2,0mg/mL lahust puhvris 1. Reaktsioonimikstuuri

inkubeeriti öö jooksul temperatuuril 4 ˚C, seejärel dialüüsiti Slide-A-Lyzer kassetis

(3500 MWCO, Pierce) puhvri A suhtes (20mM Tris vesinikkloriid, pH 7,2).

Dialüüsitud reaktsioonimikstuuri puhastati ioonvahetus kromatograafiaga 5,0ml

HiTrap Q Sepharose HP kolonnil (Amersham Biosciences Corp.). Produkti piiki 15

elueeriti kolmes 3,0ml-lises fraktsioonis gradiendiga 100%-lisest puhvrist A 100%-

lisele puhvrile B (puhver A + 0,5M NaCl) 40 kolonni kogusel. Kombineeritud

fraktsioonid kontsentreeriti tsentrifugaalseadmega Microsep 1K Centrifugal Device

(Pall Life Sciences) koguseni 850µl, mis sisaldas 0,24mg proteiini/mL.

MALDI-TOF massisepktromeetria tulemused olid järgnevad: 20

Proovi nr Identiteet Eksp. MS Vaatluse MS

1 L1-7 (PEGüülimata

peptiid)

3,545 3,538,7

2 mPEG5K-(L1-7 peptiid) 8,500 8,851

3 PE04(L1-7 peptiid)2 7,443 7,446,29

4 PEG3,4K(L1-7 peptiid)2 10,550 10,552

6,882,61

3,550,13

On mõistetav, et alaindeks „2“ PEG3,4K(L1-7 peptiid) ja PE04(L1-7 peptiid) jaoks

tähendab, et polümeeri ahela kohta on kaks peptiidi, kus üks asub iga polümeeri

kummaski otsas.

EE - EP1615952 B1 145

IC50 määramine

IC50 hAng2:hTie2-Fc koostoime inhibeerimise jaoks L1-7 vabale ja PEGüülitud

peptiididele tuvastati neutralisatsiooni ELISA analüüsiga, nagu kirjeldati näites 2.

Neutralisatsiooni ELISA analüüsi jaoks valmistati mikrotiitri plaadid, millele inimese

Ang-2 polüpeptiid seoti, nagu kirjeldati näites 2 afiinsuse ELISA analüüsiks. 5

Kandidaadi anti-Ang-2 L1-7 PEGüülitud ja vabasid peptiidid tiitriti 1000nM-st

0,2pM-le 4-kordsetes lahjendustes PBS-s, mis sisaldas umbes 1% BSA ja umbes

1nM Tie-2 (olemas Tie-2-Fc molekulina, kus Tie-2 osa sisaldab ainult molekuli

lahustuvat rakuvälist osa; R&D Systems, kataloogi number 313-TI). Pärast umbes

100 mikroliitri antikeha/Tie-2 lisamist igale süvendile inkubeeriti plaate öö jooksul 10

toatemperatuuril ning pesti viis korda PBS-s, mis sisaldas umbes 0,1 protsenti

Tween-20. Pärast pesemist lisati igasse süvendisse 100 mikroliitrit anti-Tie-2

antikeha (Pharmingen Inc., kataloogi nr 557039) lõppkontsentratsioonile umbes 1

mikrogrammi ml kohta ja plaate inkubeeriti umbes 1 tund toatemperatuuril.

Järgmisena lisati igasse süvendisse umbes 100 mikroliitrit kitse anti-hiire-IgGHRP 15

(Pierce Chemical CO., kataloogi nr 31432) lahjendusel 1:10,000 PBS-s, mis

sisaldas umbes 1 protsenti BSA-d. Plaate inkubeeriti umbes 1 tund

toatemperatuuril, mille järel neid pesti viis korda PBS-ga, mis sisaldas umbes 0,1

protsenti Tween-20. Seejärel lisati igasse süvendisse umbes 100 mikroliitrit TMB

substraati (kirjeldati eespool) ning seejärel lasti värvil tekkida. Absorptsioon loeti 20

hiljem spektrofotomeetriga 370nM juures.

L1-7 peptiidid (C-GGGGG-AQ-TNFMPMDDLEQRLYEQFILQQG-LE)

(JÄRJESTUSE ID-NR: 359) hõlmasid: N-terminaalset tsüsteiini PEG-le

seondumiseks ning 5Gly linkerit. AQ ja LE flankeeriv järjestus olid olemas nii

esialgses faagi kloonis kui ka peptikehas. hAng-2:Tie2 inhibeerimise IC50 25

tulemused olid järgnevad:

Peptiid IC50 (nM)

L1-7 peptiid 0,49

mPEG5K-(L1-7 peptiid) 11,7

PE04(L1-7 peptiid)2 0,064

PEG3,4K(L1-7 peptiid)2 0,058

EE - EP1615952 B1 146

Näide 25

Ang-2 peptikeha 2xCon4(C) toime roti adjuvandi artriidile oli uurimise all,

manustamine algas kas immunisatsiooni päeval (päev 0) või kohe enne artriidi

kliiniliste sümptomite algust (8. päev). Ang-2 peptikeha 2xCon4(C) uuriti samuti

koos PEGüülitud TNF inhibiitoriga pegsunertsept (PEG sTNF-R1). 5

Isased Lewise rotid (200-250g) saadi firmalt Charles River (Wilmington, MA). Artriit

kutsuti esile 0 päeval saba alaossa tehtud üksiku intradermaalse 0,5mg süstiga

kuumusega surmatud Mycobacterium tuberculosise H37Ra ehk „MTb“-ga (Difco

Laboratories, Detroit, MI), mida oli suspendeeritud 0,05ml-s petrooleumis

(Crescent Chemical Co., Hauppauge, NY). PEG sTNF-R1 (30mg/ml, anti annuses 10

1mg/kg), peptikeha 2xCon4(C) (30,8mg/ml, anti annuses 1mg/rott) või kanduri

(PBS) ravi manustati subkutaanselt, nagu on allpool tabelis välja toodud.

Rühma nr MTb Rühm PEG s TNF-R1 või PBS

2xCon4(C) või PBS

N

1 - Normaalne kontroll - - 6

2 + Artriidi kontroll - - 6

3 + PBS kontroll PBS päevadel 0-17

PBS päevadel 0-17

6

4 + PEG sTNF-R1 PEGsTNF-R1 päevadel 0-17

PBS päevadel 0-17

6

5 + 2xCon4(C) PBS päevadel 0-17

2xCon4(C) päevadel 0-17

6

6 + PEG sTNF-R1 + 2xCon4(C)

PEGsTNF-R1 päevadel 0-17

6

7 + PBS kontroll PBS päevadel 8-17

PBS päevadel 8-17

6

8 + PEG sTNF-R1 PEGsTNF-R1 päevadel 8-17

PBS päevadel 8-17

6

9 + 2xCon4(C) PBS päevadel 8-17

2xCon4(C) päevadel 8-17

6

10 + PEG sTNF-R1 + 2xCon4(C)

PEG sTNF-R1 päevadel 8-17

2xCon4(C) päevadel 8-17

6

11 + PEG sTNF-R1 + 2xCon4(C)

PEG sTNF-R1 päevadel 8-17

2xCon4(C) päevadel 0-17

6

Väiksem kui maksimaalselt tõhus annus 1mg/kg PEG sTNF-R1 valiti selleks, et

võimaldada peptikehaga 2xCon4(C) ravimise potentsiaalsete lisatoimete

hindamist. Tagakäpa suurust hinnati kliiniliselt iga päevase tagakäpa suuruse 15

mõõtmisega, kasutades vee pletüsmograafiat (Feige et al, Cell Mol Life Sci,

EE - EP1615952 B1 147

57:1457-1470 (2000)). Käpa põletiku inhibeerimine arvutati kõvera aluse piirkonna

(AUC) põhjal vastavalt valemile:

[(AUC artriidi AdA-AUC ravitud Ada)/ AUC artriidi AdA]x100

Kogu kehamass määratleti alates 9. päevast kuni 18. päevani täiendava lõpp-

punktina, kuna kehamassi langemine oli paralleelne liigese põletiku 5

progressiooniga antud artriidi mudelis.

Joonisel Fig 16 on tulemused esitatud keskmise ± standardhälbena. p väärtust

0,05 kasutati rühmade vahel märkimisväärsete erinevuste piiritlemiseks. Kruskal-

Wallise ANOVA analüüs ja Mann-Whitney U test ilma kohandustega

mitmekordseks testimiseks tehti kliiniliste andmete põhjal (pidevad muutujad). 10

Kehamass: rühmad, kellele anti kas peptikeha 2xCon4(C) või PEG sTNF-R1

üksinda mis tahes perioodi jooksul, kas kaotasid kaalu või ei võtnud katse käigus

kaalus juurde. Loomadele, kellele anti kombineeritud ravi peptikehaga 2xCon4(C)

ja PEG sTNF-R1 päevadel 8-17, säilitasid kaalu, aga ei võtnud juurde. Ent

artriidiga loomad, kes said peptikeha 2xCon4 (C) päevadel 0-17 koos PEG sTNF-15

R1-ga kummagi perioodi jooksul (päevadel 0-17 või päevadel 8-17), võtsid katse

jooksul kaalus juurde.

Tulemused on esitatud joonisel Fig 15, 16 ja 17.

EE - EP1615952 B1 148

Patendinõudlus

1. Peptikeha, mis suudab siduda Ang-2, kusjuures peptikeha hõlmab

JÄRJESTUSE ID-NR:25-s esitatud järjestust, koos põletikuvastase ainega

kasutamiseks põletikulise haiguse ravimeetodis.

2. Peptikeha kasutamiseks vastavalt punktile 1, mis erineb selle poolest, et 5

põletikuvastane aine hõlmab vähemalt ühte DMARD-i (haigust modifitseerivad

antireumaatilised ravimid), SAARD-i (aeglase toimega antireumaatilised ravimid)

ja NSAID-i (mittesteroidsed põletikuvastased ravimid).

3. Peptikeha kasutamiseks vastavalt punktile 1, mis erineb selle poolest, et

põletikuvastane aine hõlmab vähemalt ühte TNF inhibiitorit, IL-1 inhibiitorit, TACE 10

inhibiitorit, COX-2 inhibiitorit ja P-38 inhibiitorit.

4. Peptikeha kasutamiseks vastavalt punktile 2, mis erineb selle poolest, et TNF

inhibiitor hõlmab vähemalt ühte etanertsepti, adalimumaabi, pegsunertsepti

(PEGsTNF-R1), onertsepti ja infliksimaabi.

5. Peptikeha kasutamiseks vastavalt punktile 2, mis erineb selle poolest, et 15

nimetatud IL-1 inhibiitor on vähemalt üks anakinra, IL-1, TRAP, IL-1 antikeha ja

lahustuva IL-1 retseptori seast.

EP 1 615 952 B1

210

EP 1 615 952 B1

211

EP 1 615 952 B1

212

EP 1 615 952 B1

213

EP 1 615 952 B1

214

EP 1 615 952 B1

215

EP 1 615 952 B1

216

EP 1 615 952 B1

217

EP 1 615 952 B1

218

EP 1 615 952 B1

219

EP 1 615 952 B1

220

EP 1 615 952 B1

221

EP 1 615 952 B1

222

EP 1 615 952 B1

223

EP 1 615 952 B1

224

EP 1 615 952 B1

225

EP 1 615 952 B1

226

EP 1 615 952 B1

227

EP 1 615 952 B1

228

EP 1 615 952 B1

229

EP 1 615 952 B1

230

EP 1 615 952 B1

231

EP 1 615 952 B1

78

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

[0382] The results are set forth in Figures 15, 16, and 17.

SEQUENCE LISTING

[0383]

<110> AMGEN INC.

<120> SPECIFIC BINDING AGENTS OF HUMAN ANGIOPOIETIN-2

<130> A-801C

<140> NOT YET ASSIGNED<141> 2004-04-08

<150> US 10/410,998<151> 2003-04-09

<160> 359

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1<211> 14<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Ang-2 Binding Peptides

<400> 1

<210> 2<211> 14<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Ang-2 Binding Peptides

<400> 2

<210> 3<211> 14<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Ang-2 binding Polypeptide

EP 1 615 952 B1

79

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<400> 3

<210> 4<211> 14<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Ang-2 binding Polypeptide

<400> 4

<210> 5<211> 18<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Ang-2 binding Polypeptide

<400> 5

Asn His

<210> 6<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Ang-2 binding Polypeptide

<400> 6

<210> 7<211> 14<212> PRT<213> Artificial Sequence

EP 1 615 952 B1

80

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><223> Ang-2 Binding Peptides

<400> 7

<210> 8<211> 67<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> Oligonucleotide

<400> 8

<210> 9<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> oligonucleotide

<400> 9ggtcattact ggaccggatc 20

<210> 10<211> 25<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> oligonucleotide

<400> 10cgtacaggtt tacgcaagaa aatgg 25

<210> 11<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> oligonucleotide

<400> 11

EP 1 615 952 B1

81

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 12<211> 32<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (32)..(32)<223> Xaa = Fc

<400> 12

<210> 13<211> 29<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (29)..(29)<223> Xaa = Fc

<400> 13

<210> 14<211> 51<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2

EP 1 615 952 B1

82

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><221> misc_feature<222> (51)..(51)<223> Xaa = Fc

<400> 14

<210> 15<211> 60<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (60)..(60)<223> xaa = Fc

<400> 15

<210> 16<211> 56<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2

EP 1 615 952 B1

83

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><221> misc_feature<222> (56)..(56)<223> xaa = Fc

<400> 16

<210> 17<211> 26<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (26)..(26)<223> xaa = Fc

<400> 17

<210> 18<211> 45<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (45)..(45)<223> xaa = Fc

<400> 18

EP 1 615 952 B1

84

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 19<211> 62<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (62)..(62)<223> Xaa = Fc

<400> 19

<210> 20<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_features<222> (2)..(2)<223> xaa = Fc

<400> 20

EP 1 615 952 B1

85

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 21<211> 53<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 21

<210> 22<211> 59<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 22

EP 1 615 952 B1

86

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 23<211> 25<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 23

<210> 24<211> 47<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 24

EP 1 615 952 B1

87

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 25<211> 61<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 25

<210> 26<211> 75<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (75)..(75)<223> Xaa = Fc

<400> 26

EP 1 615 952 B1

88

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 27<211> 72<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 27

<210> 28<211> 30<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2

<220>

EP 1 615 952 B1

89

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<221> misc_feature<222> (30)..(30)<223> Xaa = Fc

<400> 28

<210> 29<211> 26<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (26)..(26)<223> Xaa = Fc

<400> 29

<210> 30<211> 26<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (26)..(26)<223> Xaa = Fc

<400> 30

<210> 31

EP 1 615 952 B1

90

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<211> 26<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (26)..(26)<223> Xaa = Fc

<400> 31

<210> 32<211> 26<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Peptibody capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (26)..(26)<223> Xaa = Fc

<400> 32

<210> 33<211> 784<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2

<400> 33

EP 1 615 952 B1

91

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 34<211> 768<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2

<400> 34

EP 1 615 952 B1

92

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 35<211> 834<212> DNA<213> Artificial sequence

<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2

<400> 35

<210> 36

EP 1 615 952 B1

93

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<211> 861<212> DNA<213> Artificial sequence

<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2

<400> 36

<210> 37<211> 849<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2

<400> 37

EP 1 615 952 B1

94

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 38<211> 759<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2

<400> 38

EP 1 615 952 B1

95

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 39<211> 816<212> DNA<213> Artificial sequence

<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2

<400> 39

EP 1 615 952 B1

96

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 40<211> 867<212> DNA<213> Artificial sequence

<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2

<400> 40

<210> 41<211> 774<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2

<400> 41

EP 1 615 952 B1

97

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 42<211> 840<212> DNA<213> Artificial sequence

<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2

<400> 42

EP 1 615 952 B1

98

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 43<211> 858<212> DNA<213> Artificial sequence

<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2

<400> 43

EP 1 615 952 B1

99

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 44<211> 756<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2

<400> 44

EP 1 615 952 B1

100

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 45<211> 822<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2

<400> 45

EP 1 615 952 B1

101

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 46<211> 864<212> DNA<213> Artificial sequence

<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2

<400> 46

<210> 47<211> 906<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2

<400> 47

EP 1 615 952 B1

102

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 48<211> 897<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2

<400> 48

EP 1 615 952 B1

103

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 49<211> 771<212> DNA<213> Artificial sequence

<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2

<400> 49

<210> 50<211> 759<212> DNA<213> Artificial Sequence

EP 1 615 952 B1

104

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2

<400> 50

<210> 51<211> 759<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2

<400> 51

EP 1 615 952 B1

105

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 52<211> 759<212> DNA<213> Artificial sequence

<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2

<400> 52

<210> 53<211> 759

EP 1 615 952 B1

106

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptibodies capable of binding to Ang-2

<400> 53

<210> 54<211> 25<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> oligonucleotide

<400> 54cggcgcaact atcggtatca agctg 25

<210> 55<211> 26<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> oligonucleotide

<400> 55catgtaccgt aacactgagt ttcgtc 26

<210> 56 <211> 14<212> PRT<213> Artificial sequence

EP 1 615 952 B1

107

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><223> consensus motifs generated from TN8-IX library

<220><221> misc_feature<222> (7, 12 and)..(14)<223> Xaa refers to any naturally occurring amino acid.

<400> 56

<210> 57<211> 14<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> consensus motifs generated from TN8-Ix library

<220><221> misc_feature<222> (7, 12 and)..(14)<223> Xaa refers to any naturally occurring amino acid.

<400> 57

<210> 58<211> 14<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Consensus motifs generated from TN8-IX library

<220><221> misc_feature<222> (1, 2, 3, 5 and)..(13)<223> Xaa refers to any naturally occurring amino acid.

<400> 58

<210> 59<211> 18<212> PRT<213> Artificial sequence

<220>

EP 1 615 952 B1

108

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<223> consensus motif generated from TN12-I library

<220><221> misc_feature<222> (3, 8, 10-14 and)..(18)<223> Xaa refers to any naturally occurring amino acid.

<400> 59

<210> 60<211> 227<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Human Fc IgG1

<400> 60

EP 1 615 952 B1

109

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 61<211> 14<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Consensus motifs generated from TN8-IX library

<220><221> misc_feature<222> (1-3, 5, 7, 12, 13 and)..(14)<223> Xaa refers to any naturally occurring amino acid.

<400> 61

<210> 62<211> 14<212> PRT<213> Artificial sequence

EP 1 615 952 B1

110

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><223> Consensus motifs generated from TN8-IX library

<220><221> misc_feature<222> (1-3, 5, 7, 12, 13 and)..(14)<223> Xaa refers to any naturally occurring amino acid.

<400> 62

<210> 63<211> 14<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> consensus motifs generated from TN8-IX library

<220><221> misc_feature<222> (1-3, 5, 7, 12, 13 and)..(14)<223> Xaa refers to any naturally occurring amino acid.

<400> 63

<210> 64<211> 14<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Consensus motifs generated from TN8-IX library

<220><221> misc_feature<222> (1-3, 5, 7, 12, 13 and)..(14)<223> Xaa refers to any naturally occurring amino acid.

<400> 64

<210> 65<211> 5<212> PRT<213> Artificial sequence

<220>

EP 1 615 952 B1

111

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 65

<210> 66<211> 6<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 66

<210> 67<211> 7<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa is an acidic or neutral polar amino acid residue

<400> 67

<210> 68<211> 8<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa is an acidic or neutral polar amino acid residue

<400> 68

EP 1 615 952 B1

112

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 69<211> 14<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (1, 2 and)..(3)<223> Xaa are each independent amino acid residues.

<220><221> misc_feature<222> (5)..(5)<223> Xaa is an amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (12)..(12)<223> Xaa is absent or an amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (13)..(13)<223> Xaa is absent or a neutral hydrophobic, neutral polar, or a basic amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (14)..(14)<223> Xaa is a neutral hydrophobic or neutral polar amino acid residue.

<400> 69

<210> 70<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (1 and)..(15)<223> Xaa is absent or an amino acid residue.

<220>

EP 1 615 952 B1

113

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<221> misc_feature<222> (2 and)..(16)<223> Xaa is absent or a neutral hydrophobic, neutral polar, or a basic amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (3-6, 18, 19 and)..(20)<223> Xaa are each independently absent or amino acid residues.

<220><221> misc_feature<222> (8)..(8)<223> Xaa is an amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (17)..(17)<223> Xaa is absent or a neutral hydrophobic or neutral polar amino acid residue.

<400> 70

<210> 71<211> 10<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa is a neutral hydrophobic amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (4)..(4)<223> Xaa is a A, D, or E.

<220><221> misc_feature<222> (6)..(6)<223> Xaa is an acidic amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (7)..(7)<223> Xaa is an amino acid residue.

<220>

EP 1 615 952 B1

114

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<221> misc_feature<222> (8)..(8)<223> Xaa is a neutral hydrophobic, neutral polar, or basic amino acid residue.

<400> 71

<210> 72<211> 22<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (1, 4 and )..(20)<223> Xaa is absent, or an amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (2, 15, 16 and)..(21)<223> Xaa is absent, or a neutral polar, acidic, or a basic amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (3, 17 and)..(18)<223> xaa is absent, or a neutral hydrophobic, or neutral polar amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (6)..(6)<223> Xaa is a neutral hydrophobic amino acid residue.

<220><221> mist-feature<222> (8)..(8)<223> Xaa is a A, D, or E.

<220><221> misc_feature<222> (10)..(10)<223> Xaa is an acidic amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (11)..(11)<223> Xaa is an amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (12)..(12)<223> Xaa is a neutral hydrophobic, neutral polar, or basic amino acid residue.

EP 1 615 952 B1

115

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><221> misc_feature<222> (19 and)..(22)<223> Xaa is absent, or a neutral hydrophobic, neutral polar, or basic amino acid residue.

<400> 72

<210> 73<211> 8<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (3)..(3)<223> Xaa is a neutral polar amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (4)..(4)<223> Xaa is an acidic amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (5)..(5)<223> Xaa is a neutral polar or an acidic amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (6 and)..(7)<223> Xaa is a neutral hydrophobic amino acid residue.

<400> 73

<210> 74<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature

EP 1 615 952 B1

116

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<222> (1, 2, 4, 13, 14, 19 and)..(20)<223> Xaa is a neutral hydrophobic or neutral polar amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (3, 9 and)..(17)<223> Xaa is a neutral polar or acidic amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (7, 15 and)..(16)<223> Xaa is a neutral polar amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (8)..(8)<223> Xaa is an acidic amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (10 and)..(11)<223> Xaa is a neutral hydrophobic amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (18)..(18)<223> Xaa is a neutral hydrophobic or basic amino acid residue.

<400> 74

<210> 75<211> 13<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa is an acidic amino acid residue;

<220><221> misc_feature<222> (4)..(4)<223> Xaa is a neutral hydrophobic amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (5)..(5)

EP 1 615 952 B1

117

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<223> Xaa is E, D, or Q.

<220><221> misc_feature<222> (10)..(10)<223> Xaa is a neutral hydrophobic or neutral polar amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (13)..(13)<223> Xaa is an acidic residue.

<400> 75

<210> 76<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 76

<210> 77<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 77

<210> 78<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence

<220>

EP 1 615 952 B1

118

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 78

<210> 79<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 79

<210> 80<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 80

<210> 81<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 81

EP 1 615 952 B1

119

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 82<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 82

<210> 83<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 83

<210> 84<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 84

<210> 85<211> 20<212> PRT

EP 1 615 952 B1

120

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<213> Artificial sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 85

<210> 86<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 86

<210> 87<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 87

<210> 88<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 88

EP 1 615 952 B1

121

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 89<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 89

<210> 90<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 90

<210> 91<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 91

EP 1 615 952 B1

122

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 92<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 92

<210> 93<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 93

<210> 94<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 94

<210> 95<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

EP 1 615 952 B1

123

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<400> 95

<210> 96<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 96

<210> 97<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 97

<210> 98<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 98

EP 1 615 952 B1

124

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 99<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 99

<210> 100<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 100

<210> 101<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 101

EP 1 615 952 B1

125

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 102<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 102

<210> 103<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 103

<210> 104<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 104

<210> 105<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

EP 1 615 952 B1

126

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<400> 105

<210> 106<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 106

<210> 107<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 107

<210> 108<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 108

EP 1 615 952 B1

127

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 109<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 109

<210> 110<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 110

<210> 111<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 111

EP 1 615 952 B1

128

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 112<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 112

<210> 113<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 113

<210> 114<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 114

<210> 115<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

EP 1 615 952 B1

129

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<400> 115

<210> 116<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 116

<210> 117<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 117

<210> 118<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 118

EP 1 615 952 B1

130

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 119<211> 22<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 119

<210> 120<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 120

<210> 121<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 121

EP 1 615 952 B1

131

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 122<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 122

<210> 123<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 123

<210> 124<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 124

<210> 125<211> 22<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

EP 1 615 952 B1

132

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<400> 125

<210> 126<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 126

<210> 127<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 127

<210> 128<211> 22<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 128

EP 1 615 952 B1

133

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 129<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 129

<210> 130<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 130

<210> 131<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 131

EP 1 615 952 B1

134

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 132<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 132

<210> 133<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 133

<210> 134<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 134

EP 1 615 952 B1

135

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 135<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 135

<210> 136<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 136

<210> 137<211> 22<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 137

<210> 138<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

EP 1 615 952 B1

136

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<400> 138

<210> 139<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 139

<210> 140<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 140

<210> 141<211> 22<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 141

EP 1 615 952 B1

137

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 142<211> 22<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 142

<210> 143<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 143

<210> 144<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 144

EP 1 615 952 B1

138

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 145<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 145

<210> 146<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 146

<210> 147<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 147

<210> 148<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

EP 1 615 952 B1

139

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<400> 148

<210> 149<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 149

<210> 150<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 150

<210> 151<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 151

EP 1 615 952 B1

140

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 152<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 152

<210> 153<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 153

<210> 154<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 154

EP 1 615 952 B1

141

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 155<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 155

<210> 156<211> 20<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 156

<210> 157<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 157

<210> 158<211> 20<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

EP 1 615 952 B1

142

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><221> misc_feature<222> (1) .. (1)<223> Xaa is absent or a neutral hydrophobic, neutral polar, or a basic amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (2, 4, 14)..(19)<223> Xaa is a neutral hydrophobic or neutral polar amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (3, 6)..(17)<223> Xaa is an acidic amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (8)..(8)<223> Xaa is a neutral hydrophobic amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (9)..(9)<223> Xaa is E, D, or Q.

<220><221> misc_feature<222> (18)..(18)<223> Xaa is a neutral hydrophobic, neutral polar, or a basic amino acid residue.

<220><221> misc_feature<222> (20)..(20)<223> Xaa is absent or an amino acid residue.

<400> 158

<210> 159<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 159ccgatccgtc aggaagaatg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat gtgggaagtt 60

<210> 160<211> 60<212> DNA

EP 1 615 952 B1

143

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 160accaacatcc aggaagaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaccacat gccgggtaaa 60

<210> 161<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 161tggtacgaac aggacgcttg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat ggctgaagtt 60

<210> 162<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 162aaccgtctgc aggaagtttg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat ggaaaacgtt 60

<210> 163<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 163gctgctaccc aggaagaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgcgttcc 60

<210> 164<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 164ctgcgtcacc aggaaggttg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gttcgactgg 60

<210> 165<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220>

EP 1 615 952 B1

144

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 165gttccgcgtc agaaagactg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gtacgttggt 60

<210> 166<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 166tgggctgctc aggaagaatg cgaatgggat ccgtggactt gcgaacacat gggtcgtatg 60

<210> 167<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 167acttggccgc aggacaaatg cgaatgggat ccgtggactt gcgaacacat gggttctact 60

<210> 168<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 168ggtcactccc aggaagaatg cggttgggac ccgtggacct gcgaacacat gggtacgtcc 60

<210> 169<211> 60<212> DNA<213> Artificial sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 169cagcactggc aggaagaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaccacat gccgtccaaa 60

<210> 170<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 170

EP 1 615 952 B1

145

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

aacgttcgtc aggaaaaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gccggttcgt 60

<210> 171<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 171aaatccggtc aggttgaatg caactgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgcgtaac 60

<210> 172<211> 60<212> DNA<213> Artificial sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 172gttaaaaccc aggaacactg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat gcgtgaatgg 60

<210> 173<211> 60<212> DNA<213> Artificial sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 173gcttggggtc aggaaggttg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat gctgccgatg 60

<210> 174<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 174ccggttaacc aggaagactg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgccgatg 60

<210> 175<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 175cgtgctccgc aggaagactg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacat ggacatcaaa 60

<210> 176

EP 1 615 952 B1

146

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 176cacggtcaga acatggaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gttccgttac 60

<210> 177<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 177ccgcgtctgc aggaagaatg cgtttgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgctgcgt 60

<210> 178<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 178cgtaccaccc aggaaaaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat ggaatcccag 60

<210> 179<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 179cagacctccc aggaagactg cgtttgggac ccgtggacct gcgaccacat ggtttcctcc 60

<210> 180<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 180caggttatcg gtcgtccgtg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacct ggaaggtctg 60

<210> 181<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

EP 1 615 952 B1

147

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 181tgggctcagc aggaagaatg cgcttgggac ccgtggacct gcgaccacat ggttggtctg 60<210> 182<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 182ctgccgggtc aggaagactg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat ggttcgttcc 60

<210> 183<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 183ccgatgaacc aggttgaatg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgcgttcc 60

<210> 184<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 184ttcggttggt ctcacggttg cgaatgggat ccgtggactt gcgaacacat gggttctacc 60

<210> 185<211> 60<212> DNA<213> Artificial sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 185aaatccaccc aggacgactg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat ggttggtccg 60

<210> 186<211> 60<212> DNA<213> Artificial sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 186

EP 1 615 952 B1

148

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

ggtccgcgta tctccacctg ccagtgggac ccgtggacct gcgaacacat ggaccagctg 60

<210> 187<211> 60<212> DNA<213> Artificial sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 187tccaccatcg gtgacatgtg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacat gcaggttgac 60

<210> 188<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 188gttctgggtg gtcagggttg cgaatgggac ccgtggacct gccgtctgct gcagggttgg 60

<210> 189<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 189gttctgggtg gtcagggttg ccagtgggac ccgtggacct gctcccacct ggaagacggt 60

<210> 190<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 190accaccatcg gttccatgtg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacat gcagggtggt 60

<210> 191<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 191accaaaggta aatccgtttg ccagtgggac ccgtggacct gctcccacat gcagtccggt 60

<210> 192

EP 1 615 952 B1

149

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<211> 60<212> DNA<213> Artificial sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 192accaccatcg gttccatgtg ccagtgggac ccgtggacct gcgctcacat gcagggtggt 60

<210> 193<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 193tgggttaacg aagttgtttg cgaatgggac ccgtggacct gcaaccactg ggacaccccg 60

<210> 194<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 194gttgttcagg ttggtatgtg ccagtgggac ccgtggacct gcaaacacat gcgtctgcag 60

<210> 195<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 195gctgttggtt cccagacctg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacct ggttgaagtt 60

<210> 196<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 196cagggtatga aaatgttctg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacat cgtttaccgt 60

<210> 197<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

EP 1 615 952 B1

150

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 197accaccatcg gttccatgtg ccagtgggac ccgtggacct gcgaacacat gcagggtggt 60

<210> 198<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 198acctcccagc gtgttggttg cgaatgggac ccgtggacct gccagcacct gacctacacc 60

<210> 199<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 199cagtggtcct ggccgccgtg cgaatgggac ccgtggacct gccagaccgt ttggccgtcc 60

<210> 200<211> 60<212> DNA<213> Artificial sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 200ggtacctccc cgtccttctg ccagtgggac ccgtggacct gctcccacat ggttcagggt 60

<210> 201<211> 42<212> DNA<213> Artificial sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 201caggaagaat gcgaatggga cccatggact tgcgaacaca tg 42

<210> 202<211> 66<212> DNA<213> Artificial sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

EP 1 615 952 B1

151

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<400> 202

<210> 203<211> 66<212> DNA<213> Artificial sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 203

<210> 204<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 204

<210> 205<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 205

<210> 206<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

EP 1 615 952 B1

152

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<400> 206

<210> 207<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 207

<210> 208<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 208

<210> 209<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 209

<210> 210<211> 66<212> DNA<213> Artificial sequence

<220>

EP 1 615 952 B1

153

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<223> RNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 210

<210> 211<211> 66<212> DNA<213> Artificial sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 211

<210> 212<211> 65<212> DNA<213> Artificial sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 212

<210> 213<211> 66<212> DNA<213> Artificial sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 213

<210> 214<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence

EP 1 615 952 B1

154

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 214

<210> 215<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 215

<210> 216<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 216

<210> 217<211> 67<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 217

<210> 218

EP 1 615 952 B1

155

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 218

<210> 219<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 219

<210> 220<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 220

<210> 221<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 221

EP 1 615 952 B1

156

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 222<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 222

<210> 223<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 223

<210> 224<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 224

<210> 225<211> 66<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 225

EP 1 615 952 B1

157

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 226<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 226aaattcaacc cgctggacga gctggaagag actctgtacg aacagtttac ttttcaacag 60

<210> 227<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 227gctggtggta tgcgtccgta cgacggtatg ctgggttggc cgaactacga cgttcaggct 60

<210> 228<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 228cagacttggg acgatccgtg catgcacatt ctgggtccgg ttacttggcg tcgttgcatc 60

<210> 229<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 229gctccgggtc agcgtccgta cgacggtatg ctgggttggc cgacctacca gcgtatcgtt 60

<210> 230<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 230

EP 1 615 952 B1

158

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

tccggtcagc tgcgtccgtg cgaagaaatc ttcggttgcg gtacccagaa cctggctctg 60

<210> 231<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 231ttcggtgaca aacgtccgct ggaatgcatg ttcggtggtc cgatccagct gtgcccgcgt 60

<210> 232<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 232ggtcaggacc tgcgtccgtg cgaagacatg ttcggttgcg gtaccaaaga ctggtacggt 60

<210> 233<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 233ggtttcgaat actgcgacgg tatggaagac ccgttcacct tcggttgcga caaacagacc 60

<210> 234<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 234aaactggaat actgcgacgg tatggaagac ccgttcaccc agggttgcga caaccagtcc 60

<210> 235<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 235ctgcaggaat ggtgcgaagg tgttgaagac ccgttcacct tcggttgcga aaaacagcgt 60

<210> 236

EP 1 615 952 B1

159

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 236gctcaggact actgcgaagg tatggaagac ccgttcacct tcggttgcga aatgcagaaa 60

<210> 237<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 237ctgctggact actgcgaagg tgttcaggac ccgttcacct tcggttgcga aaacctggac 60

<210> 238<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 238caccaggaat actgcgaagg tatggaagac ccgttcacct tcggttgcga ataccagggt 60

<210> 239<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 239atgctggact actgcgaagg tatggacgac ccgttcacct tcggttgcga caaacagatg 60

<210> 240<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 240ctgcaggact actgcgaagg tgttgaagac ccgttcacct tcggttgcga aaaccagcgt 60

<210> 241<211> 60<212> DNA<213> Artificial Sequence

EP 1 615 952 B1

160

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 241ctgcaggact actgcgaagg tgttgaagac ccgttcacct tcggttgcga aaaacagcgt 60

<210> 242<211> 54<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 242ttcgactact gcgaaggtgt tgaagacccg ttcactttcg gctgtgataa ccac 54

<210> 243<211> 250<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> DNA encoding peptide capable of binding to Ang-2

<400> 243

EP 1 615 952 B1

161

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 244

EP 1 615 952 B1

162

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<211> 29<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> oligonucleotide

<400> 244caaacgaatg gatcctcatt aaagccaga 29

<210> 245<211> 42<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> oligonucleotide

<400> 245ggtggtgcgg ccgcactcga gactgttgaa agttgtttag ca 42

<210> 246<211> 29<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> oligonucleotide

<400> 246caaacgaatg gatcctcatt aaagccaga 29

<210> 247<211> 43<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> oligonucleotide

<400> 247aacacaaaag tgcacagggt ggaggtggtg gtgcggccgc act 43

<210> 248<211> 91<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> oligonucleotide

<400> 248

EP 1 615 952 B1

163

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 249<211> 91<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> oligonucleotide

<400> 249

<210> 250<211> 95<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220>

EP 1 615 952 B1

164

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<223> oligonucleotide

<400> 250

<210> 251<211> 91<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> oligonucleotide

<400> 251

<210> 252 <211> 89

EP 1 615 952 B1

165

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> oligonucleotide

<400> 252

<210> 253<211> 95<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> oligonucleotide

<400> 253

EP 1 615 952 B1

166

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 254<211> 15<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> oligonucleotide

<400> 254cacagtgcac agggt 15

<210> 255<211> 16<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> oligonucleotide

<400> 255tgatctcgag agaatg 16

<210> 256<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> oligonucleotide

<400> 256gttagctcac tcattaggca c 21

<210> 257<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence

EP 1 615 952 B1

167

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><223> oligonucleotide

<400> 257gtaccgtaac actgagtttc g 21

<210> 258<211> 18<212> DNA<213> Artificial Sequence

<220><223> oligonucleotide

<400> 258ttacacttta tgcttccg 18

<210> 259<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 259

<210> 260<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 260

EP 1 615 952 B1

168

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 261<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2) .. (2)<223> Xaa = Fc

<400> 261

<210> 262<211> 31<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 262

<210> 263<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

EP 1 615 952 B1

169

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 263

<210> 264<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 264

<210> 265<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 265

EP 1 615 952 B1

170

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 266<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 266

<210> 267<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 267

<210> 268<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 268

EP 1 615 952 B1

171

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 269<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 269

<210> 270<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 270

<210> 271<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

EP 1 615 952 B1

172

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 271

<210> 272<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 272

<210> 273<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 273

EP 1 615 952 B1

173

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 274<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 274

<210> 275<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 275

<210> 276<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

EP 1 615 952 B1

174

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 276

<210> 277<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 277

<210> 278<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 278

EP 1 615 952 B1

175

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 279<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 279

<210> 280<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 280

<210> 281<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

EP 1 615 952 B1

176

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 281

<210> 282<211> 31<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 282

<210> 283<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 283

EP 1 615 952 B1

177

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 284<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 284

<210> 285<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 285

<210> 286<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 286

EP 1 615 952 B1

178

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 287<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 287

<210> 288<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 288

<210> 289<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

EP 1 615 952 B1

179

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 289

<210> 290<211> 31<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 290

<210> 291<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 291

EP 1 615 952 B1

180

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 292<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 292

<210> 293<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 293

<210> 294<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 294

EP 1 615 952 B1

181

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 295<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 295

<210> 296<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 296

<210> 297<211> 31

EP 1 615 952 B1

182

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 297

<210> 298<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 298

<210> 299<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 299

EP 1 615 952 B1

183

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 300<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 300

<210> 301<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 301

<210> 302<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220>

EP 1 615 952 B1

184

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 302

<210> 303<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 303

<210> 304<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 304

EP 1 615 952 B1

185

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 305<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 305

<210> 306<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 306

<210> 307<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

EP 1 615 952 B1

186

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 307

<210> 308<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 308

<210> 309<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 309

EP 1 615 952 B1

187

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 310<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 310

<210> 311<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 311

<210> 312<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 312

EP 1 615 952 B1

188

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 313<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 313

<210> 314<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 314

<210> 315<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

EP 1 615 952 B1

189

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 315

<210> 316<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 316

<210> 317<211> 31<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 317

EP 1 615 952 B1

190

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 318<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

<400> 318

<210> 319<211> 34<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

<400> 319

<210> 320<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence

EP 1 615 952 B1

191

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

<400> 320

<210> 321<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

<400> 321

<210> 322<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

EP 1 615 952 B1

192

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<400> 322

<210> 323<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

<400> 323

<210> 324<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

<400> 324

EP 1 615 952 B1

193

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 325<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

<400> 325

<210> 326<211> 34<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

<400> 326

EP 1 615 952 B1

194

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 327<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

<220><221> ’misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

<400> 327

<210> 328<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc-feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

<400> 328

EP 1 615 952 B1

195

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 329<211> 34<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

<400> 329

<210> 330<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

<400> 330

EP 1 615 952 B1

196

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 331<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

<400> 331

<210> 332<211> 34<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

<400> 332

EP 1 615 952 B1

197

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 333<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

<400> 333

<210> 334<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

<400> 334

EP 1 615 952 B1

198

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 335<211> 34<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

<400> 335

<210> 336<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

<400> 336

EP 1 615 952 B1

199

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 337<211> 34<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

<400> 337

<210> 338<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

<400> 338

<210> 339

EP 1 615 952 B1

200

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (34) .. (34)<223> Xaa = Fc

<400> 339

<210> 340<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

<400> 340

<210> 341<211> 34<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220>

EP 1 615 952 B1

201

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<221> misc_feature<222> (34)..(34)<223> Xaa = Fc

<400> 341

<210> 342<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 342

<210> 343<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 343

EP 1 615 952 B1

202

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 344<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 344

<210> 345<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 345

<210> 346<211> 31<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

EP 1 615 952 B1

203

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 346

<210> 347<211> 31<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 347

<210> 348<211> 25<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 348

EP 1 615 952 B1

204

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 349<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 349

<210> 350<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 350

<210> 351<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 351

EP 1 615 952 B1

205

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 352<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 352

<211> 31<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 353

<210> 354<211> 31<212> PRT<213> Artificial sequence

EP 1 615 952 B1

206

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 354

<210> 355<211> 31<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 355

<210> 356<211> 31<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2)..(2)<223> Xaa = Fc

<400> 356

EP 1 615 952 B1

207

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 357<211> 31<212> PRT<213> Artificial sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2) .. (2)<223> Xaa = Fc

<400> 357

<210> 358<211> 29<212> PRT<213> Artificial Sequence

<220><223> Peptibodies capable of binding to Ang-2

<220><221> misc_feature<222> (2) .. (2)<223> Xaa = Fc

<400> 358

<210> 359

<211> 32

<212> PRT<213> Artificial Sequence

EP 1 615 952 B1

208

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220><223> Polypeptide capable of binding to Ang-2

<400> 359

Claims

1. A peptibody capable of binding Ang-2 wherein the peptibody comprises the sequence set forth in SEQ ID NO:25,in combination with an anti-inflammatory agent, for use in a method for treating an inflammatory disease.

2. The peptibody for use according to claim 1 wherein the anti-inflammatory agent comprises at least one of a DMARD(Disease-Modifying Anti-Rheumatic Drug), SAARD (Slow-Acting Anti-Rheumatic Drug), and NSAID (Non-SteroidalAnti-Inflammatory Drug).

3. The peptibody for use according to claim 1 wherein the anti-inflammatory agent comprises at least one of a TNFinhibitor, a IL-1 inhibitor, a TACE inhibitor, a COX-2 inhibitor, and a P-38 inhibitor.

4. The peptibody for use according to claim 2 wherein the TNF inhibitor comprises at least one of etanercept, adali-mumab, pegsunercept (PEGsTNF-R1), onercept, and infliximab.

5. The peptibody for use according to claim 2 wherein said IL-1 inhibitor is at least one of anakinra, IL-1, TRAP, IL-1antibody, and soluble IL-1 receptor.

Patentansprüche

1. Peptikörper ("Peptibody"), der zur Bindung von Ang-2 in der Lage ist, wobei der Peptikörper die in SEQ ID NR: 25dargestellte Sequenz umfasst, in Kombination mit einem entzündungshemmenden Wirkstoff, zur Verwendung ineinem Verfahren zur Behandlung einer entzündlichen Erkrankung.

2. Peptikörper zur Verwendung nach Anspruch 1, wobei der entzündungshemmende Wirkstoff mindestens ein Elementder Gruppe bestehend aus einem krankheitsmodifizierenden Antirheumatikum (DMARD), einem langsam wirkendenAntirheumatikum (SAARD) und einem nicht-steroiden entzündungshemmenden Wirkstoff (NSAID) umfasst.

3. Peptikörper zur Verwendung nach Anspruch 1, wobei der entzündungshemmende Wirkstoff mindestens ein Elementder Gruppe bestehend aus einem TNF-Inhibitor, einem IL-1-Inhibitor, einem TA-CE-Inhibitor, einem COX-2-Inhibitorund einem P-38-Inhibitor umfasst.

4. Peptikörper zur Verwendung nach Anspruch 2, wobei der TN-F-Inhibitor mindestens ein Element der Gruppe be-stehend aus Etanercept, Adalimumab, Pegsunercept (PEGs TNF-R1), Onercept und Infliximab umfasst.

5. Peptikörper zur Verwendung nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem IL-1-Inhibitor um mindestens ein Elementder Gruppe bestehend aus Anakinra, IL-1, TRAP, IL-1-Antikörper und löslichem IL-1-Rezeptor handelt.

Revendications

1. Peptibody capable de se lier à Ang-2, ledit peptibody comprenant la séquence définie dans SEQ ID N˚ : 25, encombinaison avec un agent anti-inflammatoire, à utiliser dans un procédé de traitement d’une maladie inflammatoire.