EE

-EP

1 9

57 1

06 B

2

(51) Int. Cl.

C07K 16/26 (2006.01)

A61P 25/00 (2006.01)

EESTI VABARIIK (11) EE-EP 1 957 106 B2

PATENDIAMET

(12) EESTIS KEHTIVA EUROOPA PATENDIPATENDIKIRJELDUSE TÕLGE

(10) Registreeringu number: E008957

(11) Patendikirjelduse tõlke

number: EE-EP 1 957 106 B2

(30) Prioriteediandmed: 14.11.2005 US 736623 P

(96) Euroopa patenditaotluse

esitamise kuupäev: 02.11.2006

(96) Euroopa patendi-

taotluse number: 06809207.1

(97) Euroopa patendi väljaand-

misest teatamise kuupäev: 24.07.2019

(97) Euroopa patendi number: EP 1 957 106 B2

Patendikirjelduse tõlke

esitamise kuupäev: 11.09.2019

Patendikirjelduse tõlke

avalikustamise kuupäev: 15.10.2019

(73) Patendiomanik:

Teva Pharmaceuticals International GmbH Schlüsselstrasse 12,8645 Jona, CH

(72) Leiutise autorid:

ZELLER, Joerg Rinat Neuroscience Corp., 230 East Grand Avenue, South San Francisco, California 94080, US

POULSEN, Kristian Todd Rinat Neuroscience Corp., 230 East Grand Avenue, South San Francisco, California 94080, US

ABDICHE, Yasmina Noubia Rinat Neuroscience Corp., 230 East Grand Avenue, South San Francisco, California 94080, US

PONS, Jaume Rinat Neuroscience Corp., 230 East Grand Avenue, South San Francisco, California 94080, US

COLLIER, Sierra Jones Rinat Neuroscience Corp., 230 East Grand Avenue, South San Francisco, California 94080, US

ROSENTHAL, Arnon 150 Normandy Lane, Woodside, California 94062, US

(74) Patendivolinik:

Lembit Mitt AAA Patendibüroo OÜTartu mnt 16, 10117 Tallinn, EE

(54) Kaltsitoniini geeniga seotud peptiidi vastane antagonist-antikeha ja meetodid selle kasutamiseks

EE-EP 1 957 106 B2

*EE-EP1957106B1*

EE-EP 1 957 106 B2

Leiutise valdkond

[0001] Käesolev leiutis on seotud kaltsitoniini geeniga seotud peptiidi (CGRP) vastaste

antagonist-antikehade kasutamisega vasomotoorsete sümptomite, nagu näiteks CGRPga

seotud peavalude (näiteks migreeni) ja kuumahoogude ennetamiseks, leevendamiseks või 5

ravimiseks.

Leiutise taust

[0002] GGRP (calcitonin gene-related peptide – kaltsitoniini geeniga seotud peptiid) on 37 10

aminohappe pikkune neuropeptiid, mis kuulub peptiidide perekonda, kuhu kuuluvad

kaltsitoniin, adrenomedulliin ja amüliin. Inimestel esineb kahte CGRP vormi (α-CGRP ja

β-CGRP) ning neil on sarnased toimed. Nad erinevad kolme aminohappe poolest ja on

diferentsiaalselt jaotunud. Diferentsiaalseid toimeid võivad selgitada ka vähemalt kaks

CGRP retseptori alamtüüpi. CGRP on kesknärvisüsteemi neurotransmitter ning see on 15

näidatud olevat tugev perifeerne vasodilaator, kuna CGRPd sisaldavad neuronid on seal

veresoontega tihedalt seotud. CGRP-vahendatud vasodilatatsiooni seostatakse ka

neurogeense põletikuga osana sündmuste jadast, mille tagajärjeks on plasma

ekstravasatsioon (veresoonest väljumine) ja mikrovaskulatuuri vasodilatsioon (veresoonte

laienemine) ning seda esineb migreeni korral. 20

[0003] CGRPd on nimetatud seoses selle võimaliku seotusega vasomotoorsete

sümptomitega (Wyon et al., Scand. J. Urol. Nephrol. 35: 92–96 (2001); Wyon et al.,

Menopause 7(1):25–30 (2000)). Vasomotoorsed sümptomid (VMS), nagu näiteks

kuumahood või öine higistamine on kõige tavalisemad sümptomid, mida seostatakse 25

menopausiga ning mida esineb 60% kuni 80% kõikidest naistest pärast loomulikku või

kirurgiliselt esilekutsutud menopausi. Kuumahood on tõenäoliselt kesknärvisüsteemi

kohanemisreaktsioon suguhormoonide vähenemisele (Freedman, Am. J. Human Biol.

13:453–464 (2001)). Siiamaani on kõige tõhusam ravi kuumahoogude korral hormoonidel

baseeruvad ravimid, sealhulgas östrogeenid ja/või osad progestiinid. Hormonaalsed ravimid 30

võivad olla kuumahoogude leevendamisel tõhusad, kuid need ei sobi kõikidele naistele.

Arvatakse, et täheldatud psühholoogilisi ja emotsionaalseid sümptomeid, nagu näiteks

närvilisust, väsimust, ärrituvust, unetust, depressiooni, mälukaotust, peavalu, ärevust,

2 EE-EP 1 957 106 B2

närvilisust või keskendumisvõimetust põhjustab kuumahoogudele ja öistele higistamistele

järgnev magamatus (Kramer et al., allikas Murphy et al., 3.sup.rd Int'l Symposium on Recent

Advances in Urological Cancer Diagnosis and Treatment-Proceedings, Pariis,

Prantsusmaa: SCI: 3–7 (1992)).

5

[0004] Ka mehed kogevad steroidhormooni (androgeeni) taseme langedes kuumahoogusid.

See kehtib nii vanusega seotud androgeeni vähenemise korral (Katovich, et al., Proceedings

of the Society for Experimental Biology & Medicine, 1990, 193(2): 129–35) kui ka

hormoonide taseme ekstreemse languse juhtudel, mis on seotud eesnäärmevähi raviga

(Berendsen, et al., European Journal of Pharmacology, 2001, 419(1): 47–54). Tervelt 10

kolmandik nendest patsientidest kogeb pidevaid ja sagedasi sümptomeid, mis on piisavalt

tugevad, et põhjustada märkimisväärseid vaevusi ja ebamugavust.

[0005] CGRP on tugev vasodilaator, mille puhul on näidatud, et see on seotud muude

vasomotoorsete sümptomite patoloogiaga, nagu näiteks kõikide vaskulaarse peavalu 15

vormidega, sealhulgas migreenide (auraga või ilma) ja kobarpeavaluga. Durham, N. Engl.

J. Med. 350:1073–1075, 2004. CGRP seerumi tasemed on migreeni peavalu korral

patsientide välimises kägiveenis suurenenud. Goadsby et al., Ann. Neurol. 28:183–7, 1990.

Inimese α-CGRP intravenoosne manustamine aurata migreeni all kannatavatele

patsientidele kutsus esile peavalu ja migreeni, mis osutab asjaolule, et CGRP põhjustab 20

migreeni. Lassen et al., Cephalalgia 22:54–61, 2002.

[0006] CGRP võimalikku seost migreeniga on kasutatud alusena mitmete ühendite

arendamiseks ja katsetamiseks, mis inhibeerivad CGRP vabanemist (näiteks sumatriptaan),

antagoniseerivad CGRP retseptori asukohas (näiteks dipeptiidi derivaat BIBN4096BS 25

(Boerhringer Ingelheim); CGRP(8–37)) või toimivad vastastikku ühe või mitme

retseptoriga seotud valguga, nagu näiteks retseptori aktiivsusega seotud membraanivalgu

(receptor activity membrane protein, RAMP) või retseptori komponentvalguga (receptor

component protein, RCP), millest mõlemad mõjutavad CGRP seondumist selle

retseptoritega. Brain, S. et al., Trends in Pharmacological Sciences 23:51–53, 2002. Alfa-30

2 adrenoretseptori alamtüübid ja adenosiin A1 retseptorid kontrollivad (inhibeerivad)

samuti CGRP vabanemist ja trigeminaalset aktiveerimist (Goadsby et al., Brain 125:1392–

401, 2002). Adenosiini A1 retseptori agonistil GR79236 (metrafadiil), mis on näidatud

3 EE-EP 1 957 106 B2

inimestel inhibeerivat neurogeense vasodilatsiooni ja trigeminaalse notsitseptsiooni, võib

olla ka migreenivastane toime (Arulmani et al., Cephalalgia 25:1082–1090, 2005; Giffin

et al., Cephalalgia 23:287–292, 2003.)

[0007] Selle teooria puhul tekitab segadust tähelepanek, et ravi ühenditega, mis üksnes 5

inhibeerivad neurogeenset põletikku (näiteks tahhükiniini NK1 retseptori antagonistid) või

trigeminaalset aktiveerimist (näiteks 5HT1D retseptori agonistid), on migreeni korral

osutunud akuutse ravimina suhteliselt ebatõhusaks, mis tekitab osadel uurijatel kahtlusi

seoses sellega, kas CGRP vabanemise inhibeerimine on tõhusa migreenivastase ravi

peamine toimemehhanism. Arulmani et al., Eur. J. Pharmacol. 500:315–330, 2004. 10

[0008] Migreen on kompleksne ja sagedane neuroloogiline haigusseisund, mida

iseloomustavad tugevad, episoodilised peavaluhood ja nendega kaasnevad sümptomid,

mille hulka võivad kuuluda iiveldus, oksendamine, tundlikkus valguse, hääle või liikumise

suhtes. Osadel patsientidel esineb enne peavalu või kaasneb sellega aura. Peavalu võib olla 15

tugev ning see võib teatud patsientide puhul olla ühepoolne.

[0009] Migreenihood häirivad igapäevaelu. USAs ja Euroopa on migreeni all kannatavate

inimeste üldine osakaal üldisest elanikkonnast 11% (6% meestest ja 15-18% naistest).

Indiviididel esinevate hoogude keskmine sagedus on 1,5 hoogu kuus. Kuigi sümptomite 20

leevendamiseks või vähendamiseks on olemas terve hulk ravimeid, soovitatakse nendele

patsientidele, kellel on rohkem kui 3–4 migreenihoogu kuus, ennetava ravi kasutamist.

Goadsby et al., New Engl. J. Med. 346(4): 257–275, 2002.

[0010] Migreeni ravimiseks kasutatud farmakoloogiliste sekkumisvahendite mitmekesisus 25

ja patsientide erinevad reaktsioonid nendele vahenditele on selle häire mitmekülgse olemuse

tõestuseks. Sellest tulenevalt on migreeni ravimiseks juba üle kaheksakümne aasta

kasutatud selliseid suhteliselt mitteselektiivseid ravimeid nagu ergotalkaloide (näiteks

ergotamiin, dihüdroergotamiin, metüsergiid), millel on nii serotonergiline kui ka

adrenergiline, noradrenergiline ja dopaminergiline toime. Muude ravimite hulka kuuluvad 30

opiaadid (näiteks oksükodoon) ja β-adrenergilised antagonistid (näiteks propranolool).

Osad patsiendid, kellel on tavaliselt leebemad sümptomid, suudavad oma sümptomeid

kontrolli all hoida käsimüügiravimitega, nagu näiteks ühe või mitme mittesteroidse

4 EE-EP 1 957 106 B2

põletikuvastase toimeainega (NSAIDid), nagu näiteks aspiriini, atsetaminofeeni ja kofeiini

kombinatsiooniga (näiteks Excedrin® Migraine).

[0011] Hiljem raviti osasid migreeni all kannatavaid patsiente topiramaadiga –

antikonvulsandiga, mis blokeerib elektripingest sõltuvaid naatriumikanaleid ja teatavaid 5

glutamaadi retseptoreid (AMPA-kainaat), võimendab GABA-A retseptori toimet ja

blokeerib süsiniku anhüdraasi. Serotoniin 5HT-1B/1D ja/või 5HT-1a retseptori agonistide,

nagu näiteks sumatriptaani hiljutise suhtelise edukuse tagajärjel osade patsientide puhul on

teadlased välja pakkunud selle häire serotonergilise etioloogia. Kahjuks on aga nii, et kuigi

osad patsiendid reageerivad sellele ravile hästi, siis teised on selle suhtes jällegi suhteliselt 10

resistentsed.

[0012] Samuti on väidetud, et seda häiret põhjustab ioonkanali väärtalitlus amiinergilistes

ajutüve tuumades, kuid migreeni patofüsioloogiast ei saada veel päris hästi aru. Üks

migreeni vorm, perekondlik – hemipleegiline migreen – on näidanud seotust missenss--15

mutatsiooniga P/Q-tüübi pingest sõltuva kaltsiumikanali α1 alamüksuses ning seetõttu

peetakse tõenäoliseks, et teisi ioonkanali mutatsioone leidub ka teistes patsientide

populatsioonides. Samal ajal kui veresoonte dilatatsioon seotud migreeni valusümptomitega

ja halvendab neid, siis praegu arvatakse, et sellised neurovaskulaarsed juhud on pigem selle

haigusseisundi tagajärjed kui põhjustajad. Üldiselt peetakse meelte sisendit moduleerivate 20

ajutüve kanalite väärtalitlust migreeni ühendavaks omaduseks. Goadsby, P.J. et al., New

Engl. J. Med. 346(4): 257–275, 2002.

Leiutise lühikokkuvõte

25

[0013] Siin avalikustatud leiutis puudutab CGRP-vastaseid antagonistlikke antikehasid

kasutamiseks meetodis, millega ravitakse või hoitakse ära peavalu, nagu auraga või aurata

migreen, hemipleegiline migreen, kobarpeavalu, migreenne neuralgia, krooniline peavalu,

pingepeavalu ja muudest tervislikest seisunditest (nagu nakkused või kasvajast tingitud rõhu

suurenemine koljus) tingitud peavalu. 30

[0014] Vastavalt käesolevale leiutisele pakutakse CGRP-vastast antagonist-antikeha, mis

on inimese antikeha või humaniseeritud antikeha, mille seondumisafiinsus (KD) inimese

5 EE-EP 1 957 106 B2

α-CGRP suhtes on 50 nM või väiksem vastavalt pinna plasmonresonantsiga 37 °C juures

mõõdetule, kasutamiseks meetodis indiviidil peavalu (näiteks migreeni ja kobarpeavalu)

ravimiseks või ennetamiseks, mis hõlmab nimetatud indiviidile efektiivses koguses

leiutisekohase CGRP-vastase antagonist-antikeha manustamist.

5

[0015] Mõnes teostustes seob CGRP-vastane antagonistlik antikeha inimese α-CGRP-d ja

β-CGRP-d. Mõnes teostustes seob CGRP-vastane antagonistlik antikeha inimese ja roti

CGRP-d. Mõnes teostustes seob CGRP-vastane antagonistlik antikeha C-terminaalset

epitoopi CGRP aminohapete 25–37 ulatuses.

10

[0016] Osades teostustes on CGRP-vastane antagonist-antikeha monoklonaalne antikeha.

Osades teostustes on CGRP-vastane antagonist-antikeha humaniseeritud antikeha. Osades

teostustes on CGRP-vastane antagonist-antikeha inimese antikeha. Osades teostustes on

CGRP-vastane antagonist-antikeha antikeha G1 (vastavalt siin kirjeldatule). Osades

teostustes sisaldab CGRP-vastane antagonist-antikeha tabelis 6 välja toodud antikeha G1 15

või G1 variantide ühte või mitut CDRi (nagu näiteks ühte, kahte, kolme, nelja, viit või

osades teostustes kõiki kuut CDRi). Veel osades teistes teostustes sisaldab CGRP-vastane

antagonist-antikeha joonisel FIG 5 kujutatud raske ahela varieeruva piirkonna

aminohappejärjestust (SEQ ID NO: 1) ja joonisel FIG 5 kujutatud kerge ahela varieeruva

piirkonna aminohappejärjestust (SEQ ID NO: 2). 20

[0017] Osades teostustes sisaldab antikeha modifitseeritud konstantset piirkonda, nagu

näiteks konstantset piirkonda, mis on immunoloogiliselt inertne (sealhulgas osaliselt

immunoloogiliselt inertne), näiteks ei käivita see komplemendi vahendatud lüüsi, ei

stimuleeri antikehast sõltuvat rakulist tsütotoksilisust (antibody-dependent cell mediated 25

cytotoxity, ADCC), ei aktiveeri mikrogliiat või see vähendab ühte või mitut nendest

toimetest. Osades teostustes on konstantset piirkonda modifitseeritud viisil, mida on

kirjeldatud allikates Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613–2624; PCT patenditaotlus nr

PCT/GB99/01441; ja/või Ühendkuningriigi patenditaotluses nr 9809951.8. Teistes

teostustes sisaldab antikeha inimese raske ahela IgG2 konstantset piirkonda, mis sisaldab 30

alljärgnevaid mutatsioone: A330P331 on muudetud S330S331-ks (aminohapete loend

viitega looduslikule IgG2 järjestusele). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613–2624. Osades

teostustes on antikeha raske ahela pidev piirkond inimese raske ahel IgG1, mis sisaldab mis

6 EE-EP 1 957 106 B2

tahes alljärgnevaid mutatsioone: 1) A327A330P331 on muudetud G327S330S331-ks; 2)

E233L234L235G236 on muudetud P233V234A235-ks, kus G236 on deleteeritud; 3)

E233L234L235 on muudetud P233V234A235-ks; 4) E233L234L235G236A327A330P331

on muudetud P233V234A235G327S330S331-ks, kus G236 on deleteeritud; 5)

E233L234L235A327A330P331 on muudetud P233V234A235G327S330S331-ks; ja 6) 5

N297 on muudetud A297-ks või mis tahes muuks aminohappeks, v.a N. Osades teostustes

on antikeha raske ahela pidev piirkond inimese raske ahel IgG4, mis sisaldab mis tahes

alljärgnevaid mutatsioone: E233F234L235G236 on muudetud P233V234A235-ks, kus

G236 on deleteeritud; E233F234L235 on muudetud P233V234A235-ks; ja S228L235 on

muudetud P228E235-ks. 10

[0018] Veel mõnes teises teostuses aglükosüleeritakse pidev piirkond N-seotud

glükosüleerimise jaoks. Osades teostustes aglükosüleeritakse pidev piirkond N-seotud

glükosüleerimise jaoks oligosahhariidi kinnitumise jäägi (nagu näiteks Asn297) ja/või

flankeerivate jääkide muteerimise teel, mis on N-glükosüleerimist ära tundva järjestuse osa 15

konstantses piirkonnas. Osades teostustes aglükosüleeritakse pidev piirkond N-seotud

glükosüleerimise jaoks. Konstantset piirkonda võib aglükosüleerida N-seotud

glükosüleerimise jaoks ensümaatiliselt või ekspresseerimise kaudu glükosüleerimise

puudulikkusega peremeesrakus.

20

[0019] CGRP-vastase antagonistliku antikeha sidumisafiinsus (KD) inimese α-CGRP suhtes

mõõdetuna pinnaplasmonresonantsiga temperatuuril 37 °C on 50 nM või väiksem.

[0020] CGRP-vastast antagonist-antikeha võib manustada enne ja/või pärast peavalu ja/või

selle ajal. Osades teostustes manustatakse CGRP-vastast antagonist-antikeha enne 25

peavaluhoogu (näiteks enne migreeni või kobarpeavalu). CGRP-vastast antagonist-antikeha

või manustada mis tahes tehnika tasemes tuntud viisil, sealhulgas suukaudselt,

intravenoosselt, subkutaanselt, intraarteriaalselt, intramuskulaarselt, intrakardiaalselt,

intraspinaalselt, rindmikusiseselt, intraperitoneaalselt, intraventikulaarselt, sublinguaalselt,

transdermaalselt ja/või inhalatsiooni teel. Manustamine võib olla süsteemne, näiteks 30

intravenoosselt, või paikne.

7 EE-EP 1 957 106 B2

[0021] Osades teostustes võib CGRP-vastast antagonist-antikeha manustada koos mõne

muu toimeainega, nagu näiteks mõne muu peavalu ravimiseks mõeldud toimeainega.

[0022] Käesolevas leiutises võib kasutada antikehast G1 või selle variantidest tuletatud

CGRP-vastaseid antagonist-antikehasid ja polüpeptiide, mis on välja toodud tabelis 6. 5

Sellest tulenevalt on käesolev leiutis ühes aspektis antikeha G1 (samatähenduslik mõiste

„G1”), mis on toodetud ekspressioonivektoritest, mis kannavad ATCC

deponeerimisnumbrit PTA-6866 ja PTA-6867. Näiteks ühes teostuses on antikeha, mis

sisaldab rasket ahelat, toodetud ekspressioonivektoriga, mis kannab ATCC

deponeerimisnumbrit PTA-6867. Veel ühes edasises teostuses on antikeha, mis sisaldab 10

kerget ahelat, toodetud ekspressioonivektoriga, mis kannab ATCC deponeerimisnumbrit

PTA-6866. G1 raske ahela ja kerge ahela varieeruvate piirkondade aminohappejärjestused

on välja toodud joonisel FIG 5. Antikeha G1 komplementaarsust määrava piirkonna

(complementarity determining region, CDR) osad (sealhulgas Chothia ja Kabati CDRid) on

samuti välja toodud joonisel FIG 5. Siinkohal tuleb aru saada, et viide G1 mis tahes osale 15

või kogu piirkonnale hõlmab järjestusi, mis on toodetud ekspressioonivektoritega, mis

kannavad ATCC deponeerimisnumbreid PTA-6866 ja PTA-6867, ja/või joonisel FIG 5

kujutatud järjestusi. Käesolevas leiutises võib kasutada G1 antikeha variante

aminohappejärjestustega, mida on kujutatud tabelis 6.

20

[0023] Ühes aspektis kasutab käesolev leiutis antikeha, mis sisaldab VH domeeni, mis on

vähemalt 85%, vähemalt 86%, vähemalt 87%, vähemalt 88%, vähemalt 89%, vähemalt

90%, vähemalt 91 %, vähemalt 92%, vähemalt 93%, vähemalt 94%, vähemalt 95%,

vähemalt 96%, vähemalt 97% vähemalt 98%, vähemalt 99% või 100% ulatuses identne

aminohappejärjestusega SEQ ID NO: 1. 25

[0024] Veel ühes aspektis kasutab käesolev leiutis antikeha, mis sisaldab VL domeeni, mis

on vähemalt 85%, vähemalt 86%, vähemalt 87%, vähemalt 88%, vähemalt 89%, vähemalt

90%, vähemalt 91 %, vähemalt 92%, vähemalt 93%, vähemalt 94%, vähemalt 95%,

vähemalt 96%, vähemalt 97% vähemalt 98%, vähemalt 99% või 100% ulatuses identne 30

aminohappejärjestusega SEQ ID NO: 2.

8 EE-EP 1 957 106 B2

[0025] Veel ühes aspektis kasutab käesolev leiutis antikeha, mis sisaldab antikeha G1 või

selle tabelis 6 välja toodud variantide fragmenti või piirkonda. Ühes teostuses on selliseks

fragmendiks antikeha G1 kerge ahel. Veel ühes teostuses on selliseks fragmendiks antikeha

G1 raske ahel. Veel ühes teostuses sisaldab selline fragment ühte või mitut varieeruvat

piirkonda antikeha G1 kergest ahelast ja/või raskest ahelast. Veel ühes teostuses sisaldab 5

selline fragment ühte või mitut varieeruvat piirkonda joonisel FIG 5 välja toodud kergest

ahelast ja/või raskest ahelast. Veel ühes teostuses sisaldab selline fragment ühte või mitut

CDRi antikeha G1 kergest ahelast ja/või raskest ahelast.

[0026] Veel ühes aspektis pakub käesolev leiutiskirjeldus polüpeptiide (mis võivad olla 10

antikehad, kuid ei pruugi), mis sisaldavad VH CDR3, mis on esitatud järjestusega SEQ ID

NO: 5 või järjestusega, mis erineb järjestusest SEQ ID NO: 5 1, 2, 3, 4 või 5 aminohappe

asenduse poolest. Konkreetses teostuses on sellised aminohappe asendused konservatiivsed

asendused.

15

[0027] Veel ühes aspektis pakub käesolev leiutiskirjeldus polüpeptiide (mis võivad olla

antikehad, kuid ei pruugi), mis sisaldavad VL CDR3, mis on esitatud järjestusega SEQ ID

NO: 8 või järjestusega, mis erineb järjestusest SEQ ID NO: 8 1, 2, 3, 4 või 5 aminohappe

asenduse poolest. Konkreetses teostuses on sellised aminohappe asendused konservatiivsed

asendused. 20

[0028] Veel ühes teostuses pakub käesolev leiutiskirjeldus polüpeptiide (mis võivad olla

antikehad, kuid ei pruugi), mis sisaldavad ühte või mitut alljärgnevatest: a) antikeha G1 või

selle tabelis 6 välja toodud variantide ühte või mitut CDRi; b) CDR H3 antikeha G1 või

selle tabelis 6 välja toodud variantide raskest ahelast; c) CDR L3 antikeha G1 või selle 25

tabelis 6 välja toodud variantide kergest ahelast; d) kolme CDRi antikeha G1 või selle

tabelis 6 välja toodud variantide kergest ahelast; e) kolme CDRi antikeha G1 või selle tabelis

6 välja toodud variantide raskest ahelast; f) kolme CDRi antikeha G1 või selle tabelis 6 välja

toodud variantide kergest ahelast ja kolme CDRi raskest ahelast. Käesolev leiutis pakub

lisaks polüpeptiide (mis võivad olla antikehad, kuid ei pruugi), mis sisaldavad ühte või mitut 30

alljärgnevatest: a) ühte või mitut (ühte, kahte, kolme, nelja, viit või kuut) CDRi, mis on

tuletatud antikehast G1 või selle tabelis 6 välja toodud variantidest; b) CDRi, mis on

tuletatud antikeha G1 raskest ahelast pärit CDR H3st; ja/või c) CDRi, mis on tuletatud

9 EE-EP 1 957 106 B2

antikeha G1 kergest ahelast pärit CDR L3st. Osades teostustes on CDR Joonisel FIG 5

kujutatud CDR. Osades teostustes on üks või mitu CDRi, mis on tuletatud antikehast G1

või selle tabelis 6 välja toodud variantidest, vähemalt ligikaudu 85%, vähemalt ligikaudu

86%, vähemalt ligikaudu 87%, vähemalt ligikaudu 88%, vähemalt ligikaudu 89%, vähemalt

ligikaudu 90%, vähemalt ligikaudu 91 %, vähemalt ligikaudu 92%, vähemalt ligikaudu 5

93%, vähemalt ligikaudu 94%, vähemalt ligikaudu 95%, vähemalt ligikaudu 96%, vähemalt

ligikaudu 97%, vähemalt ligikaudu 98% või vähemalt ligikaudu 99% ulatuses identsed

vähemalt ühe, vähemalt kahe, vähemalt kolme, vähemalt nelja, vähemalt viie või vähemalt

kuue G1 või selle variantide CDRiga.

10

[0029] Osades teostustes on CDR Kabati CDR. Teistes teostustes on CDR Chothia CDR.

Teistes teostustes on CDR Kabati ja Chothia CDRi kombinatsioon (tähistatakse ka

nimetusega „kombineeritud CDR” või „laiendatud CDR”). Teisisõnu võivad CDRid mis

tahes antud teostuse puhul, mis sisaldavad rohkem kui ühte CDRi, olla Kabati, Chothia

ja/või kombineeritud CDRid. 15

[0030] Osades teostustes sisaldab polüpeptiid (nagu näiteks antikeha) aminohappejärjestust

KASKXaaVXaaTYVS, kus Xaa positsioonil 5 on R, W, G, L või N; ning kus Xaa

positsioonil 7 on T, A, D, G, R, S, W või V. Osades teostustes on aminohappejärjestus

KASKXaaVXaaTYVS antikeha kerge ahela CDR1. 20

[0031] Osades teostustes sisaldab polüpeptiid (nagu näiteks antikeha) aminohappejärjestust

XaaXaaSNRYXaa, kus Xaa positsioonil 1 on G või A; kus Xaa positsioonil 2 on A või H;

ning kus Xaa positsioonil 7 on L, T, I või S. Osades teostustes on aminohappejärjestus

XaaXaaSNRYXaa antikeha kerge ahela CDR2. 25

[0032] Osades teostustes sisaldab polüpeptiid (nagu näiteks antikeha) aminohappejärjestust

EIRSXaaSDXaaXaaATXaaYAXaaAVKG, kus Xaa positsioonil 5 on E, R, K, Q või N; kus

Xaa positsioonil 8 on A, G, N, E, H, S, L, R, C, F, Y, V, D või P; kus Xaa positsioonil 9 on

S, G, T, Y, C, E, L, A, P, I, N, R, V, D või M; kus Xaa positsioonil 12 on H või F; kus Xaa 30

positsioonil 15 on E või D. Osades teostustes on aminohappejärjestus

EIRSXaaSDXaaXaaATXaaYAXaaAVKG antikeha raske ahela CDR2.

10 EE-EP 1 957 106 B2

[0033] Osades teostustes sisaldab polüpeptiid (nagu näiteks antikeha) aminohappejärjestust

SEQ ID NO:1, kus aminohappejääk järjestuse SEQ ID NO:1 positsioonil 99 on L või see

on asendatud A, N, S, T, V või R-ga; ning kus aminohappejäägid järjestuse SEQ ID NO:1

positsioonil 100 on A või need on asendatud L, R, S, V, Y, C, G, T, K või P-ga.

5

[0034] Osades teostustes on antikeha inimese antikeha. Osades teostustes on antikeha

humaniseeritud antikeha. Osades teostustes on leiutisekohane antikeha monoklonaalne

antikeha. Osades teostustes on antikeha (või polüpeptiid) isoleeritud. Osades teostustes on

antikeha (või polüpeptiid) sisuliselt puhas.

10

[0035] Antikehade raske ahela pidev piirkond võib olla pärit mis tahes tüüpi konstantsest

piirkonnast, nagu näiteks IgG, IgM, IgD, IgA ja IgE; ja mis tahes isotüübist, nagu näiteks

IgG1, IgG2, IgG3 ja IgG4.

[0036] Osades teostustes sisaldab antikeha siin kirjeldatud modifitseeritud konstantset 15

piirkonda.

Jooniste lühikirjeldus

20

[0037]

Joonis FIG 1 on tabel, milles on esitatud 12 närilise antikeha seondumisafiinsused erinevate

asendatud alaniiniga inimese α-CGRP fragmentide suhtes. Seondumisafiinsuseid mõõdeti

25 °C juures Biacore'i kasutades, lastes Fabidel voolata risti üle kiibil olevate CGRPde.

Kastidega ümbritsetud väärtused kujutavad lähtefragmendiga 25-37 seotud alaniini 25

mutantide afiinsuse kaotust (kaldkirjas), välja arvatud K35A, mis tuletati lähtefragmendist

19–37. "a" tähistab afiinsust 19–37 suhtes ning 25–37 fragmendid on keskmine ± kahe

erinevatel sensorkiipidel teostatud sõltumatu mõõtmise standardhälve. "b" tähistab neid

vastastiktoimeid, mis kalduvad lihtsast bimolekulaarse vastastiktoime mudelist kõrvale

kahefaasilise off-kiiruse tõttu, nii et nende afiinsuste kindlaks määramiseks kasutati 30

konformatsioonilise muutuse mudelit. Hallides toonides skaala selgitus: valge (1,0) tähistab

lähtefragmendi afiinsust; helehall (vähem kui 0,5) tähistab lähtefragmendist kõrgemat

11 EE-EP 1 957 106 B2

afiinsust; tumehall (rohkem kui 2) tähistab lähtefragmendist madalamat afiinsust; ning must

tähistab seda, et seondumist ei tuvastatud.

Joonistel FIG 2A ja FIG 2B on kujutatud CGRP 8–37 (400 nmol/kg), antikeha 4901

(25 mg/kg) ja antikeha 7D11 (25 mg/kg) manustamise mõju naha verevoolule, mida

mõõdeti vererakkude vooluna pärast elektriimpulsiga stimuleerimist 30 sekundi jooksul. 5

CGRP 8–37 manustati intravenoosselt (iv) 3–5 minutit enne elektriimpulsiga

stimuleerimist. Antikehasid manustati intraperitoneaalselt (IP) 72 tundi enne

elektriimpulsiga stimuleerimist. Iga joonistel kujutatud punkt tähistab ühe roti AUCd, keda

raviti määratletud tingimustes. Iga joonistel kujutatud joon tähistab rottide keskmist AUCd,

keda raviti määratletud tingimustes. AUC (kõvera alune pindala) võrdub Δvool × Δaeg. 10

„Δvool” tähistab vooluühikute muutust pärast elektriimpulsiga stimuleerimist; ning „Δaeg”

tähistab ajavahemikku, mis kulub vereraku voolu tasemel, et jõuda tagasi elektriimpulsiga

stimuleerimisele eelnenud tasemele.

Joonisel FIG 3 on kujutatud antikeha 4901 erinevates annustes (25 mg/kg, 5 mg/kg,

2,5 mg/kg või 1 mg/kg) manustamise mõju naha verevoolule, mida mõõdeti vererakkude 15

vooluna pärast elektriimpulsiga stimuleerimist 30 sekundi jooksul. Antikehasid manustati

intravenoosselt (IV) 24 tundi enne elektriimpulsiga stimuleerimist. Iga joonisel kujutatud

punkt tähistab ühe roti AUCd, keda raviti määratletud tingimustes. Joonisel kujutatud joon

tähistab rottide keskmist AUCd, keda raviti määratletud tingimustes.

Joonistel FIG 4A ja FIG 4B on kujutatud antikeha 4901 (1 mg/kg või 10 mg/kg 20

intravenoosselt), antikeha 7E9 (10 mg/kg intravenoosselt) ja antikeha 8B6 (10 mg/kg

intravenoosselt) manustamise mõju naha verevoolule, mida mõõdeti vererakkude vooluna

pärast elektriimpulsiga stimuleerimist 30 sekundi jooksul. Antikehasid manustati

intravenoosselt (IV), millele järgnes elektriimpulsiga stimuleerimine 30 minutit, 60 minutit,

90 minutit ja 120 minutit pärast antikeha manustamist. Y-telg tähistab AUC protsenti 25

võrreldes AUC tasemega, kui antikeha ei manustatud (aeg 0). X-telg tähistab antikehade

manustamise ja elektriimpulsiga stimuleerimise vahele jäävat ajavahemikku (minutites). *

tähistab P < 0,05 ja ** tähistab P < 0,01 võrreldes ajaga 0. Andmete analüüsimiseks kasutati

ühesuunalist ANOVA analüüsi Dunnetti mitmekordse võrdlustestiga.

Joonisel FIG 5 on kujutatud antikeha G1 raske ahela varieeruva piirkonna (SEQ ID NO:1) 30

ja kerge ahela varieeruva piirkonna aminohappejärjestust (SEQ ID NO:2). Kabati CDRid

on paksus kirjas ja Chothia CDRid on allajoonitud kirjas. Raske ahela ja kerge ahela

varieeruva piirkonna aminohappejäägid on järjestikku nummerdatud.

12 EE-EP 1 957 106 B2

Joonisel FIG 6 on kujutatud antikeha G1 kaardistamist peptiidi konkurentsiga Biacore'i

kasutades. N-biotinüülitud inimese α-CGRP püüti SA sensorkiibile. G1 Fabil (50 nM) lasti

voolata kiibile konkureeriva peptiidi puudumisel või seda oli eelnevalt inkubeeritud 1 tund

10 um konkureeriva peptiidiga. G1 Fab seondumist inimese α-CGRPga kiibil mõõdeti. Y

telg tähistab seondumise protsenti konkureeriva peptiidi juuresolekuga blokeerimise korral 5

võrreldes seondumisega konkureeriva peptiidi puudumise korral.

Joonisel FIG 7 on kujutatud antikeha G1 (1 mg/kg või 10 mg/kg intravenoosselt) või

vehiikuli (PBS, 0,01% Tween 20) manustamise mõju naha verevoolule, mida mõõdeti

vererakkude vooluna pärast elektriimpulsiga stimuleerimist 30 sekundi jooksul. Antikeha

G1 või vehiikulit manustati intravenoosselt (IV), millele järgnes närvi elektriimpulsiga 10

stimuleerimine 30 minutit, 60 minutit, 90 minutit ja 120 minutit pärast antikeha

manustamist. Y-telg tähistab AUC protsenti võrreldes AUC tasemega, kui antikeha või

vehiikulit (määratletud 100%-na) ei manustatud (aeg 0). X-telg tähistab antikehade

manustamise ja elektriimpulsiga stimuleerimise vahele jäävat ajavahemikku (minutites). *

tähistab P < 0,05 ja ** tähistab P < 0,01 võrreldes vehiikuliga. Andmete analüüsimiseks 15

kasutati kahesuunalist ANOVA analüüsi ja Bonferroni järelteste.

Joonisel FIG 8A on kujutatud antikeha G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg või 10 mg/kg intravenoosselt)

või vehiikuli (PBS, 0,01% Tween 20) manustamise mõju naha verevoolule, mida mõõdeti

vererakkude vooluna pärast elektriimpulsiga stimuleerimist 30 sekundi jooksul 24 tundi

pärast manustamist. Antikeha G1 ja vehiikulit manustati intravenoosselt (IV) 24 tundi enne 20

närvi elektriimpulsiga stimuleerimist. Y-telg tähistab kõvera alust kogupindala (muutus

vereraku voolus korda muutus ajas stimuleerimisest kuni voolu naasmiseni alustasemele,

AUC). X-telg tähistab antikeha G1 erinevaid annuseid. * tähistab P < 0,05 ja ** tähistab P

< 0,01 võrreldes vehiikuliga. Andmete analüüsimiseks kasutati ühesuunalist ANOVA

analüüsi ja Dunni mitmekordset võrdlustesti. 25

Joonisel FIG 8B on kujutatud antikeha G1 (0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg või 10 mg/kg

intravenoosselt) või vehiikuli (PBS, 0,01% Tween 20) manustamise mõju naha verevoolule,

mida mõõdeti vererakkude vooluna pärast elektriimpulsiga stimuleerimist 30 sekundi

jooksul 7 päeva pärast manustamist. Antikeha G1 ja vehiikulit manustati intravenoosselt

(IV) 7 päeva enne närvi elektriimpulsiga stimuleerimist. Y-telg tähistab kogu AUCd. X-telg 30

tähistab antikeha G1 erinevaid annuseid. ** tähistab P < 0,01 ja *** tähistab P < 0,001

võrreldes vehiikuliga. Andmete analüüsimiseks kasutati ühesuunalist ANOVA analüüsi ja

Dunni mitmekordset võrdlustesti.

13 EE-EP 1 957 106 B2

Joonis FIG 8C on joonistelt FIG 8A ja FIG 8B saadud andmete kõvera lähendamise analüüs.

Antikeha G1 või vehiikulit manustati intravenoosselt (IV) kas 24 tundi või 7 päeva enne

närvi elektriimpulsiga stimuleerimist. Y-telg tähistab kogu AUCd. X-telg tähistab antikeha

G1 erinevaid annuseid mõõtühikus „mg/kg” logaritmilisel skaalal, et määrata kindlaks EC50.

Joonisel FIG 9 on kujutatud antikeha mu7E9 (10 mg/kg), BIBN4096BS või vehiikuli (PBS, 5

0,01% Tween 20) mõju keskmise meningeaalse arteri diameetri muutumisele pärast

elektriväljaga stimuleerimist. Antikeha mu7E9, BIBN4096BS või vehiikulit manustati

intravenoosselt (IV) ajahetkel 0 minutit pärast baastaseme reaktsiooni saavutamist

elektrilise stimulatsiooni suhtes. Y-telg tähistab muutust keskmise meningeaalse arteri

diameetris pärast elektriväljaga stimuleerimist. Puhkeasendis diameeter vastab 0%-le. X-10

telg tähistab elektriimpulsiga stimuleerimise aega (minutites). * tähistab P < 0,05 ja **

tähistab P < 0,01 võrreldes vehiikuliga. Andmete analüüsimiseks kasutati ühesuunalist

ANOVA analüüsi ja Dunnetti mitmekordset võrdlustesti.

Joonisel FIG 10 on kujutatud antikeha G1 erinevate annuste (1 mg/kg, 3 mg/kg või

10 mg/kg intravenoosselt) või vehiikuli (PBS, 0,01% Tween 20) mõju keskmise 15

meningeaalse arteri diameetri muutumisele pärast elektriväljaga stimuleerimist. Antikeha

G1 ja vehiikulit manustati intravenoosselt (IV) 7 päeva enne elektriväljaga stimuleerimist.

Y-telg tähistab muutust keskmise meningeaalse arteri diameetris. Puhkeasendis diameeter

vastab 0%-le. X-telg tähistab stimuleerimise pinget. * tähistab P < 0,05, ** tähistab P < 0,01

ja *** tähistab P < 0,001 võrreldes vehiikuliga. Andmete analüüsimiseks kasutati 20

kahesuunalist ANOVA analüüsi ja Bonferroni järelteste.

Joonisel FIG 11A on kujutatud 24 tundi varem intravenoosselt (IV) manustatud antikeha

mu4901 (10mg/kg) või vehiikuli (PBS, 0,01% Tween 20) mõju sisetemperatuuri

vähenemisele, mis kutsuti esile naloksooni (1 mg/kg) subkutaanse süstimisega,

morfiinisõltuvusega rottides. Y-telg tähistab temperatuuri erinevust baastasemest. X-telg 25

tähistab naloksooni süstimise hetkest mõõdetud aega.

Joonisel FIG 11B on kujutatud 24 tundi varem intravenoosselt (IV) manustatud antikeha

mu4901 (10mg/kg) või vehiikuli (PBS, 0,01% Tween 20) mõju saba pinnatemperatuuri

suurenemisele, mis kutsuti esile naloksooni (1 mg/kg) subkutaanse süstimisega,

morfiinisõltuvusega rottides. Y-telg tähistab temperatuuri erinevust baastasemest. X-telg 30

tähistab naloksooni süstimise hetkest mõõdetud aega.

14 EE-EP 1 957 106 B2

Leiutise üksikasjalik kirjeldus

[0038] Käesolev leiutis pakub siin kirjeldatavat CGRP-vastast antikeha kasutamiseks

meetodites indiviidil vasomotoorsete sümptomite, nagu näiteks peavalu (näiteks migreeni,

kobarpeavalu, kroonilise peavalu ja pingepeavalu) või kuumahoogude ravimiseks ja/või 5

ennetamiseks, manustades nimetatud indiviidile terapeutiliselt efektiivses koguses

leiutisekohast CGRP-vastast antagonist-antikeha.

[0039] Käesolev leiutiskirjeldus pakub ka antikehast G1 või selle tabelis 6 välja toodud

variantidest tuletatud CGRP-vastaseid antagonist-antikehasid ja polüpeptiide. Käesolev 10

leiutiskirjeldus pakub ka nende antikehade ja polüpeptiidide valmistamise ja kasutamise

meetodeid.

Üldised tehnikad

15

[0040] Käesoleva leiutise praktiseerimiseks kasutatakse tavapäraseid molekulaarbioloogia

(sealhulgas rekombinantseid tehnikaid), mikrobioloogia, rakubioloogia, biokeemia ja

immunoloogia tehnikaid, mis kuuluvad tehnika tasemesse, välja arvatud juhul kui on

märgitud teisiti. Selliseid tehnikaid on põhjalikult selgitatud erialases kirjanduses, nagu

näiteks allikates Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. väljaanne (Sambrook et al., 20

1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait (toim.), 1984);

Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E.

Cellis (toim.), 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney (toim.), 1987);

Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather ja P.E. Roberts, 1998) Plenum Press;

Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths ja D.G. Newell 25

(toim.), 1993–1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.);

Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir ja C.C. Blackwell (toim.).); Gene

Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller ja M.P. Calos (toim.), 1987); Current

Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al. (toim.), 1987); PCR: The Polymerase

Chain Reaction, (Mullis et al. (toim.), 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. 30

Coligan et al. (toim.), 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999);

Immunobiology (C.A. Janeway ja P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997);

Antibodies: a practical approach (D. Catty (toim.) IRL Press, 1988–1989); Monoclonal

15 EE-EP 1 957 106 B2

antibodies: a practical approach (P. Shepherd ja C. Dean (toim.), Oxford University Press,

2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow ja D. Lane (Cold Spring Harbor

Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti ja J.D. Capra (toim.), Harwood

Academic Publishers, 1995).

5

Mõisted

[0041] „Antikeha” on immunoglobuliini molekul, mis suudab spetsiifiliselt seonduda

märklauaga, nagu näiteks süsivesikuga, polünukleotiidiga, rasvaga, polüpeptiidiga jne

vähemalt ühe antigeeni äratundmissaidi kaudu, mis paikneb immunoglobuliini molekuli 10

varieeruvas piirkonnas. Siin kasutatuna hõlmab see mõiste terviklikke polüklonaalseid ja

monoklonaalseid antikehi. Antikeha hõlmab mis tahes klassi – IgG, IgA või IgM (või nende

alamklassi) – kuuluvat antikeha, kuid antud antikeha ei pea kuuluma ühtegi konkreetsesse

klassi. Immunoglobuliine saab määrata erinevatesse klassidesse olenevalt aminohappe

raskete ahelate konstantse piirkonna aminohappejärjestusele. Peamisi immunoglobuliinide 15

klasse on viis: IgA, IgD, IgE, IgG ja IgM ning mitmed neist võivad olla omakorda jagatud

alamklassidesse (isotüüpidesse), näiteks IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 ja IgA2. Raske

ahela konstantseid domeene, mis vastavad immunoglobuliinide erinevatele klassidele,

nimetatakse vastavalt alfa-, delta-, üpsilon-, gamma- ja müü-domeenideks.

Immunoglobuliinide erinevate klasside alamüksuste struktuurid ja kolmemõõtmelised 20

konfiguratsioonid on hästi tuntud.

[0042] Käesolevas tähistab mõiste „monoklonaalne antikeha” sellist antikeha, mis on

saadud sisuliselt homogeensete antikehade populatsioonist, st populatsiooni moodustavad

individuaalsed antikehad on identsed, välja arvatud võimalike loomulikult tekkivate 25

mutatsioonide poolest, mida võib esineda väikestes kogustes. Monoklonaalsed antikehad on

ülimalt spetsiifilised, olles suunatud ühe antigeeni saidi vastu. Lisaks erinevalt

polüklonaalsete antikehade preparaatidest, mis tüüpiliselt hõlmavad erinevaid antikehasid,

mis on suunatud erinevate determinantide (epitoopide) vastu, on iga monoklonaalne

antikeha suunatud üheainsa antigeenil asuva determinandi vastu. Laiend „monoklonaalne” 30

osutab antikeha olemusele, st see on saadud sisuliselt homogeensest antikehade

populatsioonist, ning seda ei tuleks käsitleda nõudena valmistada antikeha mis tahes

konkreetset meetodit kasutades. Näiteks võib vastavalt käesolevale leiutisele kasutatavaid

16 EE-EP 1 957 106 B2

monoklonaalseid antikehasid valmistada hübridoomi meetodiga, mida esmakordselt

kirjeldati allikas Kohler et al., 1975, Nature 256:495, või neid võib valmistada

rekombinantse DNA meetoditega, mida on kirjeldatud näiteks USA patendis nr 4 816 567.

Monoklonaalsed antikehad võivad samuti olla isoleeritud faagipankadest, kasutades

tehnikaid, mida on kirjeldatud näiteks allikas McCafferty et al., 1990, Nature 348:552–554. 5

[0043] Käesolevas osutab mõiste „humaniseeritud” antikeha mitte-inimese (näiteks

närilise) antikehade vormidele, mis on spetsiifilised kimäärsed immunoglobuliinid,

immunoglobuliinide ahelad või nende fragmendid (nagu näiteks Fv, Fab, Fab', F(ab')2 või

muud antikeha antigeeni siduvad alamjärjestused), mis sisaldavad mitte-inimese 10

immunoglobuliinist tuletatud minimaalset järjestust. Humaniseeritud antikehad on enamasti

inimese immunoglobuliinid (vastuvõtja antikeha), milles vastuvõtja komplementaarsust

määravast piirkonnast (CDR) saadud jäägid asendatakse mitte-inimese liigi, nagu näiteks

hiire, roti või küüliku CDRist saadud jääkidega (doonori antikeha), millel on soovitud

spetsiifilisus, afiinsus ja bioloogiline aktiivsus. Teatavatel juhtudel asendatakse inimese 15

immunoglobuliini Fv raampiirkonna (framework region, FR) jäägid vastavate mitte-inimese

jääkidega. Lisaks võib humaniseeritud antikeha sisaldada jääke, mida ei leidu vastuvõtja

antikehas ega imporditud CDRis või raamjärjestustes, kuid mis on lisatud antikeha

suutlikkuse edasiseks viimistlemiseks ja optimeerimiseks. Üldiselt sisaldab humaniseeritud

antikeha sisuliselt kõiki vähemalt ühest ja tüüpiliselt kahest varieeruvast piirkonnast, milles 20

kõik või sisuliselt kõik CDR-piirkonnad vastavad mitte-inimese immunoglobuliini omadele

ja kõik või sisuliselt kõik FR-piirkonnad on inimese immunoglobuliini kokkulepitud

järjestuse omad. Humaniseeritud antikeha sisaldab optimaalselt ka vähemalt osa

immunoglobuliini konstantsest piirkonnast või domeenist (Fc), tüüpiliselt inimese

immunoglobuliini omast. Antikehadel võivad olla Fc-piirkonnad, mida on modifitseeritud 25

viisil, mida on kirjeldatud publikatsioonis WO 99/58572. Humaniseeritud antikehade teistel

vormidel on üks või mitu CDRi (üks, kaks, kolm, neli, viis, kuus), mida on muudetud algse

antikeha suhtes ning mida nimetatakse ka üheks või mitmeks CDRiks, mis „on tuletatud”

ühest või mitmest algsest antikehast pärit CDRist.

30

[0044] Käesolevas tähendab „inimese antikeha” sellist antikeha, millel on

aminohappejärjestus, mis vastab antikeha aminohappejärjestusele, mis on toodetud inimese

poolt ja/või mille valmistamiseks on kasutatud mis tahes tehnika tasemes tuntud või siin

17 EE-EP 1 957 106 B2

kirjeldatud tehnikat inimese antikehade valmistamiseks. Inimese antikeha mõiste hõlmab

antikehasid, mis sisaldavad vähemalt ühte inimese raske ahela polüpeptiidi või vähemalt

ühte inimese kerge ahela polüpeptiidi. Üheks selliseks näiteks on antikeha, mis sisaldab

närilise kerge ahela ja raske ahela polüpeptiide. Inimese antikehade valmistamiseks võib

kasutada erinevaid tehnika tasemes tuntud tehnikaid. Ühes teostuses on inimese antikeha 5

valitud faagipangast, kus nimetatud faagipank ekspresseerib inimese antikehasid (Vaughan

et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309–314; Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:6157–

6162; Hoogenboom ja Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol.

Biol., 222:581). Inimese antikehasid võib valmistada ka selliselt, et inimese

immunoglobuliini lookused sisestatakse transgeensetesse loomadesse, näiteks hiirtesse, 10

kelle endogeensed immunoglobuliini geenid on osaliselt või täielikult inaktiveeritud. Seda

lähenemisviisi on kirjeldatud USA patentides nr 5 545 807; 5 545 806; 5 569 825;

5 625 126; 5 633 425; ja 5 661 016. Alternatiivselt võib inimese antikeha valmistada

inimese B-lümfotsüütide surematuks muutmise teel, mis toodavad märklaud-antigeeni vastu

suunatud antikeha (selliseid B-lümfotsüüte võib taastada indiviidilt või need võivad olla 15

immuniseeritud in vitro). Vt näiteks Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer

Therapy, Alan R. Liss, lk 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86–95; ja

USA patent nr 5 750 373.

[0045] Käesolevas tähistab mõiste „kaltsitoniini geeniga seotud peptiid” ja „CGRP” mis 20

tahes kaltsitoniini geeniga seotud peptiidi vormi ja selle variante, mis säilitavad vähemalt

osa CGRP aktiivsusest. Näiteks võib CGRP olla α-CGRP või β-CGRP. Käesolevas hõlmab

CGRP kõiki imetajate liike, kellel on loomuliku järjestusega CGRP, näiteks inimest, koera,

kassi, hobust ja veist.

25

[0046] Käesolevas tähistab mõiste „CGRP-vastane antagonist-antikeha” (mida nimetatakse

ka „CGRP-vastaseks antikehaks”) antikeha, mis on suuteline seonduma CGRPga ja

inhibeerima CGRP bioloogilist aktiivsust ja/või CGRP signaliseerimisega vahendatud

pärisuunalist rada (pärisuunalisi radasid). CGRP-vastane antagonist-antikeha hõlmab

antikehasid, mis blokeerivad, antagoniseerivad, pärsivad või vähendavad (sealhulgas 30

märkimisväärselt) CGRP bioloogilist aktiivsust, sealhulgas CGRP signaliseerimisega

vahendatud pärisuunalisi radasid, nagu näiteks retseptori seondumist ja/või rakulise

reaktsiooni esile kutsumist CGRP suhtes. Käesoleva leiutise mõistes tuleb selgelt aru saada,

18 EE-EP 1 957 106 B2

et mõiste „CGRP-vastane antagonist-antikeha” hõlmab kõiki varasemalt määratletud

mõisteid, pealkirju ja funktsionaalseid olekuid ja omadusi, kusjuures CGRP ise, CGRP

bioloogiline aktiivsus (sealhulgas mittepiiravalt selle suutlikkus vahendada mis tahes

peavalu aspekti) või sellise bioloogilise aktiivsuse tagajärjed on sisuliselt nullitud,

vähendatud või neutraliseeritud märkimisväärsel määral. Osades teostustes seob CGRP-5

vastane antagonist-antikeha CGRPd ja ennetab CGRP seondumist CGRP retseptoriga.

Teistes teostustes seob CGRP-vastane antikeha CGRPd ja ennetab CGRP retseptori

aktiveerimist. CGRP-vastaste antagonist-antikehade näited on siin esitatud.

[0047] Käesolevas osutavad „G1” ja „antikeha G1” samatähenduslikult antikehale, mida 10

toodetakse ekspressioonivektoritega, mille deponeerimisnumbrid on ATCC PTA-6867 ja

ATCC PTA-6866. Raske ahela ja kerge ahela varieeruvate piirkondade

aminohappejärjestused on välja toodud joonisel FIG 5. Antikeha G1 CDRi osi (sealhulgas

Chothia ja Kabati CDRe) on skemaatiliselt kujutatud joonisel FIG 5. Raske ja kerge ahela

varieeruvaid piirkondi kodeerivad polünukleotiidid on näidatud järjestustes SEQ ID NO:9 15

ja SEQ ID NO:10. G1 iseloomustamist on kirjeldatud näidetes.

[0048] Mõisteid „polüpeptiid”, „oligopeptiid”, „peptiid” ja „valk” on siin kasutatud

samatähenduslikena ning need osutavad mis tahes pikkusega aminohapete polümeeridele.

Nimetatud polümeer võib olla hargnemata või hargnenud ahelaga, see võib sisaldada 20

modifitseeritud aminohappeid ning see võib olla aminohapete poolt katkestatud. Need

mõisted hõlmavad ka aminohappe polümeeri, mida on modifitseeritud loomulikul teel või

sekkumisega; näiteks disulfiidsideme moodustamise, glükosüleerimise, lipideerimise,

atsetüülimise, fosforüülimise või mis tahes muu manipuleerimise või modifitseerimise teel,

nagu näiteks märgistava komponendiga ühendamise teel. See määratlus hõlmab ka näiteks 25

polüpeptiide, mis sisaldavad ühte või mitut aminohappe analoogi (sealhulgas näiteks

mittelooduslikud aminohapped jne) ning ka teisi tehnika tasemes tuntud modifikatsioone.

Siinkohal on selge, et kuna polüpeptiidid põhinevad antikehal, siis võivad polüpeptiidid

esineda üheahelalistena või seotud ahelatena.

30

[0049] Mõisted „polünukleotiid” ja „nukleiinhape”, mida kasutatakse samatähenduslikult,

osutavad mis tahes pikkusega nukleotiidide polümeeridele ning hõlmavad DNAd ja RNAd.

Nukleotiidid võivad olla desoksüribonukleotiidid, ribonukleotiidid, modifitseeritud

19 EE-EP 1 957 106 B2

nukleotiidid või alused ja/või nende analoogid või mis tahes substraat, mis võib olla

polümeeri sisestatud DNA või RNA polümeraasiga. Polünukleotiid võib sisaldada

modifitseeritud nukleotiide, nagu näiteks metüülitud nukleotiide ja nende analooge. Kui

seda kasutatakse, siis võib nukleotiidi struktuuri modifikatsiooni edastada enne või pärast

polümeeri koostamist. Nukleotiidijärjestus võib olla katkestatud komponentidega, mis ei 5

ole nukleotiidid. Polünukleotiidi võib lisaks modifitseerida pärast polümeriseerimist, nagu

näiteks märgistava komponendiga ühendamise teel. Muude modifikatsioonide tüüpide

hulka kuuluvad näiteks „korgid”, ühe või mitme looduslikult esineva nukleotiidi

asendamine analoogiga, nukleotiidisisesed modifikatsioonid, nagu näiteks need, mis

teostatakse laenguta aheldustega (näiteks metüülfosfonaadi, fosfotriestrid, fosfoamidaadid, 10

karbamaadid jne) ja laenguga aheldustega (näiteks fosforotioaadid, fosforoditioaadid jne),

need, mis sisaldavad külgrühma fragmente, nagu näiteks valke (näiteks nukleaasid,

toksiinid, antikehad, signaalpeptiidid, plü-L-lüsiin jne), need, mis teostatakse

interkalaatoritega (näiteks akridiin, psoraleen jne), need, mis sisaldavad kelaatoreid (näiteks

metallid, radioaktiivsed metallid, boor, oksüdeerivad metallid jne), need, mis sisaldavad 15

alküülivaid aineid, need, mida teostatakse modifitseeritud aheldustega (näiteks alfa

anomeersed nukleiinhapped jne) ning polünukleotiidi(de) modifitseerimata vormid. Lisaks

võivad mis tahes hüdroksüülrühmad, mis tavaliselt sisalduvad suhkrutes, olla asendatud,

näiteks fosfonaatrühmade või fosfaatrühmadega, kaitstud standardsete kaitserühmadega või

aktiveeritud, et valmistada täiendavaid aheldusi täiendavate nukleotiididega, või olla 20

ühendatud tahketele tugiainetele. 5' või 3' otsa OH võib olla fosforüülitud või asendatud

amiinide või orgaanilise korkimisrühma fragmentidega 1 kuni 20 süsinikuaatomi ulatuses.

Teised hüdroksüülrühmad võivad samuti olla deriveeritud standardseteks kaitserühmadeks.

Polünukleotiidid võivad sisaldada ka tehnika tasemes üldiselt tuntud riboos- või

desoksüriboossuhkrute analoogseid vorme, mille hulka kuuluvad näiteks 2'-O-metüül-, 2'-25

O-allüül-, 2'-fluoro- või 2'-asido-riboos, karboksüülsuhkru analooge, α-anomeerseid

suhkruid, epimeerseid suhkruid, nagu näiteks arabinoosi, ksüloose või lüksoose, püranoosi

suhkruid, furanoosi suhkruid, sedoheptuloose, atsüklilisi analooge ja mittealuselise

nukleosiidi analooge, nagu näiteks metüülribosiidi. Üks või mitu fosfodiestri aheldustest

võivad olla asendatud alternatiivsete aheldusrühmadega. Nende alternatiivsete 30

aheldusrühmade hulka kuuluvad mittepiiravalt teostused, kus fosfaat on asendatud P(O)S

(„tioaat”), P(S)S („ditioaat”), (O)NR2 („amidaat”), P(O)R, P(O)OR', CO või CH2-ga

(„formatsetaal”), kus iga R või R' on üksteisest sõltumatult H või asendatud või asendamata

20 EE-EP 1 957 106 B2

alküülrühm (1–20 C), mis sisaldab valikuliselt eetri (-O-) aheldust, arüül-, alkenüül-,

tsükloalküül-, tsükloalkenüül- või araldüülrühma. Kõik polünukleotiidis sisalduvad

aheldused ei pea olema identsed. Kogu eelnev kirjeldus kehtib kõikide siin osutatud

polünukleotiidide, sealhulgas RNA ja DNA puhul.

5

[0050] Antikeha „varieeruv piirkond” osutab antikeha kerge ahela varieeruvale piirkonnale

või antikeha raske ahela varieeruvale piirkonnale, kas üksi või kombineeritult. Iga raske ja

kerge ahela varieeruv piirkond koosneb neljast raampiirkonnast (FR), mis on ühendatud

kolme komplementaarsust määrava piirkonnaga (CDRid), mida tuntakse ka

hüpervarieeruvate piirkondadena. Igas ahelas sisalduvaid CDRe hoiavad üksteise lähedal 10

tihedalt koos FRid ning need aitavad koos teisest ahelast pärit CDRidega kaasa antikehade

antigeeni sidumissaidi moodustamisele. CDRide kindlaks määramiseks on olemas vähemalt

kaks tehnikat: (1) osakestevahelisel järjestuse varieeruvusel põhinev lähenemisviis (st

Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5. väljaanne, 1991, National

Institutes of Health, Bethesda MD)); ja (2) antigeeni-antikeha komplekside 15

kristallograafilistel uuringutel põhinev lähenemisviis (Al-lazikani et al. (1997), J. Molec.

Biol. 273:927–948)). Käesolevas võib CDR osutada ükskõik kumma lähenemisviisi või

mõlema lähenemisviisi kombinatsiooniga määratletud CDRile.

[0051] Antikeha „pidev piirkond” osutab antikeha kerge ahela konstantsele piirkonnale või 20

antikeha raske ahela konstantsele piirkonnale, kas üksi või kombineeritult.

[0052] Epitoop, mis „eelistatult seondub” või „spetsiifiliselt seondub” (kasutatakse siin

samatähenduslikult) antikehaga või polüpeptiidiga, on tehnika tasemes hästi tuntud mõiste,

ning meetodid sellise spetsiifilise või eelistatud seondumise kindlaks määramiseks on 25

tehnika tasemes samuti hästi tuntud. Molekul „seondub spetsiifiliselt” või „seondub

eelistatult”, kui see reageerib või seostub konkreetse raku või ainega sagedamini, kiiremini,

pikema aja jooksul ja/või suurema afiinsusega, kui see seondub alternatiivsete rakkude või

ainetega. Antikeha „spetsiifiliselt seondub” või „eelistatult seondub” märklauaga, kui see

seondub sellega suurema afiinsusega, lihtsamalt ja/või pikema aja jooksul, kui see seondub 30

teiste ainetega. Näiteks on antikeha, mis spetsiifiliselt või eelistatult seondub CGRP

epitoobiga, selline antikeha, mis seondub selle epitoobiga suurema afiinsusega, innukamalt,

lihtsamalt ja/või pikema aja jooksul, kui see seondub teiste CGRP epitoopide või mitte-

21 EE-EP 1 957 106 B2

CGRP epitoopidega. Samuti tuleb käesolevat määratlust lugedes aru saada näiteks seda, et

antikeha (või fragment või epitoop), mis spetsiifiliselt või eelistatult seondub esimese

märklauaga, võib spetsiifiliselt või eelistatult seonduda teise märklauaga, kuid ei pruugi

seda teha. Sellisena ei nõua „spetsiifiline seondumine” või „eelistatud seondumine”

tingimata eksklusiivset seondumist (kuigi see võib seda hõlmata). Üldiselt, kuid mitte 5

ilmtingimata, tähendab viide seondumisele eelistatud seondumist.

[0053] Käesolevas osutab mõiste „sisuliselt puhas” materjalile, mis on vähemalt 50% puhas

(st saasteainetest vaba), enam eelistatult vähemalt 90% puhas, enam eelistatult vähemalt

95% puhas, enam eelistatult vähemalt 98% puhas, enam eelistatult vähemalt 99% puhas. 10

[0054] Mõiste „peremeesrakk” hõlmab individuaalset rakku või rakukultuuri, mis võib olla

või on olnud vektori(te) vastuvõtja polünukleotiidi insertsiooni sisestamiseks.

Peremeesrakkude hulka kuuluvad ühe peremeesraku järglased ning need järglased ei pea

loomuliku, juhusliku või tahtliku mutatsiooni tagajärjel tingimata olema täiesti identsed 15

(morfoloogias või genoomses DNA komplemendis) algse peremeesrakuga. Peremeesraku

hulka kuuluvad rakud, mida on in vivo transfekteeritud käesoleva leiutise

polünukleotiidi(de)ga.

[0055] Mõistet „Fc-piirkond” kasutatakse immunoglobuliini raske ahela C-otsa piirkonna 20

määratlemiseks. „Fc-piirkond” võib olla loomuliku järjestuse Fc-piirkond või variandi Fc-

piirkond. Kuigi immunoglobuliini raske ahela Fc-piirkonna piirid võivad varieeruda, on

inimese IgG raske ahela Fc-piirkond määratletud tavaliselt selliselt, et see ulatub

positsioonil Cys226 või Pro230 asuvast aminohappejäägist selle karboksüülotsa lõpuni.

Jääkide nummerdamiseks Fc-piirkonnas kasutatakse ELi indeksit, mis põhineb Kabati 25

süsteemil. Kabat et al., Sequences of Proteins of Imunological Interest, 5. väljaanne, Public

Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. Immunoglobuliini Fc-

piirkond sisaldab tavaliselt kahte konstantset domeeni –CH2 ja CH3.

[0056] Käesolevas kirjeldab „Fc-retseptor” või „FcR” retseptorit, mis seondub antikeha Fc-30

piirkonnaga. Eelistatud FcR on loomuliku järjestusega inimese FcR. Lisaks on eelistatud

FcR selline, mis seondub IgG antikehaga (gamma-retseptor) ning see hõlmab FcγRI, FcγRII

ja FcγRII alamklasside retseptoreid, sealhulgas nende retseptorite alleelseid variante ja

22 EE-EP 1 957 106 B2

alternatiivselt splaissitud vorme. FcγRII retseptorite hulka kuuluvad FcγRIIA („aktiveeriv

retseptor”) ja FcγRIIB („inhibeeriv retseptor”), millel on sarnased aminohappejärjestused,

mis erinevad peamiselt nende tsütoplasmaatiliste domeenide poolest. FcRe on põhjalikult

käsitletud allikates Ravetch ja Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457–92; Capel et al.,

1994, Immunomethods, 4:25–34; ja de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330–41. 5

Mõiste „FcR” hõlmab ka neonatalset retseptorit (FcRn), mis vastutab ema IgGde lootele

ülekandmise eest (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; ja Kim et al., 1994, J. Immunol.,

24:249).

[0057] Mõisted „komplemendist sõltuv tsütotoksilisus” ja „CDC” osutavad märklaua 10

lüüsimisele komplemendi juuresolekul. Komplemendi aktiveerimisrada käivitatakse

esimese komplemendi süsteemi komponendi (C1q) seondumisega molekuliga (näiteks

antikehaga), mida täiendatakse samatüvelise antigeeniga. Komplemendi aktiveerimise

hindamiseks võib teostada CDC-analüüsi, näiteks sellise, mida on kirjeldatud allikas

Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996). 15

[0058] „Funktsionaalne Fc-piirkond” omab vähemalt ühte loomuliku järjestuse Fc-

piirkonna efektorfunktsiooni „Efektorfunktsioonide” näidete hulka kuuluvad: C1q

sidumine; komplemendist sõltuv tsütotoksilisus (CDC); Fc-retseptori sidumine; antikehast

sõltuv rakuline tsütotoksilisus (ADCC); fagotsütoos; raku pinnaretseptorite (näiteks B-raku 20

retseptori; BCRi) allareguleerimine. Sellised efektorfunktsioonid nõuavad üldiselt seda, et

Fc-piirkond oleks kombineeritud siduva domeeniga (näiteks antikeha varieeruva

domeeniga) ning selle hindamiseks võib kasutada erinevaid tehnika tasemes tuntud

analüüsimeetodeid, näiteks antikeha efektorfunktsioonide hindamiseks kasutatavaid

analüüsimeetodeid. 25

[0059] „Loomuliku järjestuse Fc-piirkond” sisaldab aminohappejärjestust, mis on identne

looduses leiduva Fc-piirkonna aminohappejärjestusega. „Fc-piirkonna variant” sisaldab

aminohappejärjestust, mis erineb loomuliku järjestuse Fc-piirkonna aminohappejärjestusest

vähemalt ühe aminohappe modifikatsiooni võrra, kuid see säilitab vähemalt ühe loomuliku 30

järjestuse Fc-piirkonna efektorfunktsiooni. Eelistatult on Fc-piirkonna variandil vähemalt

üks aminohappe asendus võrreldes loomuliku järjestuse Fc-piirkonna või lähtepolüpeptiidi

Fc-piirkonnaga, näiteks ligikaudu üks kuni ligikaudu kümme aminohappe asendust, ning

23 EE-EP 1 957 106 B2

eelistatult ligikaudu üks kuni ligikaudu viis aminohappe asendust loomuliku järjestuse Fc-

piirkonnas või lähtepolüpeptiidi Fc-piirkonnas. Siin kirjeldatud variandi Fc-piirkonnal on

järjestus, mis on vähemalt ligikaudu 80% ulatuses identne loomuliku järjestuse Fc-

piirkonna ja/või lähtepolüpeptiidid Fc-piirkonnaga, ning enim eelistatult vähemalt ligikaudu

90% ulatuses identne järjestus, enam eelistatult vähemalt ligikaudu 95%, vähemalt 5

ligikaudu 96%, vähemalt ligikaudu 97%, vähemalt ligikaudu 98%, vähemalt ligikaudu 99%

ulatuses identne järjestus.

[0060] Käesolevas osutavad mõisted „antikehast sõltuv rakuline tsütotoksilisus” ja

„ADCC” rakulisele reaktsioonile, kus mittespetsiifilised rakud, mis ekspresseerivad Fc-10

retseptoreid (FcR) (näiteks loomulikke tapjarakke (NK-rakke), neutrofiile ja makrofaage),

tunnevad ära seotud antikeha märklaud-rakul ning seejärel kutsuvad esile märklaud-raku

lüüsi. Huvipakkuva molekuli ADCC aktiivsuse hindamiseks võib kasutada in vitro ADCC

analüüsi, mida on kirjeldatud näiteks USA patentides nr 5 500 362 või 5 821 337. Selliste

analüüside jaoks kasulike efektorrakkude hulka kuuluvad perifeerse vere mononukleaarsed 15

rakud (PBMC) ja NK-rakud. Alternatiivselt või täiendavalt võib huvipakkuva molekuli

ADCC aktiivsust hinnata in vivo, näiteks loommudelis, mida on kirjeldatud näiteks allikas

Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652–656.

[0061] Käesolevas on „ravimine” lähenemisviis, mida kasutatakse kasulike või soovitud 20

kliiniliste tulemuste saavutamiseks. Käesoleva leiutise mõistes kuuluvad kasulike või

soovitud kliiniliste tulemuste hulka mittepiiravalt üks või mitu alljärgnevatest: mis tahes

peavalu aspekti leevendamine, sealhulgas tugevuse vähendamine, valu intensiivsuse

leevendamine, ja muude kaasnevate sümptomite leevendamine, nende esinemise

vähendamine, peavalu all kannatavate inimeste elukvaliteedi parandamine ja muude 25

peavalu ravimiseks kasutatavate ravimite annuse vähendamine. Migreeni puhul kuuluvad

muude kaasnevate sümptomite hulka mittepiiravalt iiveldus, oksendamine ning tundlikkus

valguse, hääle ja/või liikumise suhtes. Kobarpeavalu puhul kuuluvad muude kaasnevate

sümptomite hulka mittepiiravalt silmaaluste või silmaümbruse paistetus, liigsed pisarad,

punased silmad, ninavoolus või ninakinnisus ja punetav nägu. 30

[0062] Peavalu „esinemise vähendamine” tähendab selle tugevuse (mis võib hõlmata

vajaduse vähendamist teiste ravimite ja/või toimeainete järele, mida sellise seisundi puhul

24 EE-EP 1 957 106 B2

üldiselt kasutatakse, sealhulgas näiteks migreeni puhul ergotamiini, dihüdroergotamiini või

triptaani järele ja/või nende teiste ravimite ja/või toimeainete koguse (näiteks nendega

kokkupuute) vähendamist), kestuse ja/või sageduse vähendamist (sealhulgas näiteks

indiviidil episoodilise hoo edasilükkamist või järgmise hooni kuluva aja suurendamist).

Valdkonna asjatundja mõistab, et indiviidide vastuvõtlikkus ravi suhtes võib erineda ning 5

sellisel juhul tähendab näiteks „indiviidil peavalu esinemise vähendamise meetod” CGRP-

vastase antagonist-antikeha manustamist põhjendatud ootuse alusel, et selline manustamine

võib tõenäoliselt põhjustada sellist esinemise vähendamist sellel konkreetsel indiviidil.

[0063] Peavalu või peavalu ühe või mitme sümptomi „leevendamine” tähendab ühe või 10

mitme peavalu sümptomi vähendamist või leevendamist võrreldes sellega, kui CGRP-

vastast antagonist-antikeha ei manustata. „Leevendamine” tähendab ka sümptomi kestuse

lühendamist või vähendamist.

[0064] Käesolevas osutab „peavalu kontrolli all hoidmine” indiviidil ühe või mitme 15

peavalu sümptomi tugevuse või kestuse või peavaluhoogude sageduse säilitamisele või

vähendamisele (võrreldes ravile eelnenud tasemega). Näiteks väheneb indiviidil peavalu

valu kestus või tugevus või hoogude sagedus vähemalt ligikaudu 10%, 20%, 30%, 40%,

50%, 60% või 70% võrreldes ravile eelnenud tasemega.

20

[0065] Käesolevas tähendab peavalu tekkimise „edasilükkamine” haiguse süvenemise

edasilükkamist, pidurdamist, aeglustamist, viivitamist ja/või stabiliseerimist. Selline

edasilükkamine võib olla erineva ajalise pikkusega, olenevalt senisest haigusloost ja/või

ravitavatest indiviididest. Antud valdkonna asjatundjale on ilmselge, et piisav või

märkimisväärne edasilükkamine võib tegelikult hõlmata ka ennetamist, st et uuringualusel 25

ei tekigi peavalu (näiteks migreeni). Meetod, mis „lükkab edasi” sümptomi arengut, on

selline meetod, mis vähendab sümptomi arengu tõenäosust antud ajalises raamistikus ja/või

vähendab sümptomite ulatust antud ajalises raamistikus võrreldes sellega, kui antud

meetodit ei kasutata. Sellised võrdlused põhinevad tüüpiliselt kliinilistel uuringutel, kus

kasutatakse statistiliselt olulist hulka uuringualuseid. 30

[0066] Peavalu „tekkimine” või „süvenemine” tähendab häire esialgseid ilminguid ja/või

selle edasist süvenemist. Peavalu tekke tuvastamiseks ja hindamiseks võib kasutada tehnika

25 EE-EP 1 957 106 B2

tasemes hästi tuntud standardseid kliinilisi tehnikaid. Kuid teke viitab ka süvenemisele, mis

võib jääda märkamatuks. Käesoleva leiutise mõistes osutab teke või süvenemine

sümptomite bioloogilisele kulgemisele. „Teke” hõlmab esinemist, kordumist ja puhkemist.

Käesolevas hõlmab peavalu „puhkemine” või „esinemine” esialgset puhkemist ja/või

kordumist. 5

[0067] Käesolevas on ravimi, ühendi või farmatseutilise koostise „efektiivne annus” või

„efektiivne kogus” selline kogus, mis on piisav kasulike või soovitud tulemuste

saavutamiseks. Profülaktilise kasutamise korral hõlmavad kasulikud või soovitud

tulemused selliseid tulemusi, nagu näiteks haiguse, sealhulgas haiguse bioloogiliste, 10

histoloogiliste ja/või käitumuslike sümptomite ning haiguse tekke ajal esinevate

komplikatsioonide ja vahepealsete patoloogiliste fenotüüpide riski kõrvaldamist või

vähendamist, tõsiduse vähendamist või puhkemise edasilükkamist. Terapeutilise

kasutamise korral kuuluvad kasulike või soovitud tulemuste hulka sellised kliinilised

tulemused, nagu näiteks peavaluhoo valu intensiivsuse, kestuse või sageduse vähendamine 15

ning ühe või mitme peavalu tagajärjel tekkiva sümptomi (biokeemilise, histoloogilise ja/või

käitumusliku sümptomi), sealhulgas haiguse tekkimisel esinevate komplikatsioonide ja

vahepealsete patoloogiliste fenotüüpide vähendamine, haiguse all kannatavate inimeste

elukvaliteedi parandamine, muude haiguse ravimiseks vajalike ravimite annuse

vähendamine, mõne muu ravimi toime parandamine ja/või patsientide haiguse süvenemise 20

edasilükkamine. Efektiivset annust võib manustada ühe korra või mitu korda. Käesoleva

leiutise mõistes on ravimi, ühendi või farmatseutilise koostise efektiivne annus selline

kogus, mis on piisav profülaktilise või terapeutilise ravi otseseks või kaudseks

saavutamiseks. Nagu sellest kliinilises kontekstis aru saadakse, võib ravimi, ühendi või

farmatseutilise koostise efektiivse annuse saavutada koos mõne muu ravimi, ühendi või 25

farmatseutilise koostisega, kuid ei pruugi. Seega võib „efektiivset annust” käsitleda ühe või

mitme terapeutilise toimeaine manustamise kontekstis ning ühte toimeainet võib pidada

efektiivses koguses manustatuks, kui see võimaldab saavutada või saavutab soovitud

tulemuse ühe või mitme teise toimeainega kombineeritult.

30

[0068] „Indiviid” või „uuringualune” on imetaja, enam eelistatult inimene. Imetajate hulka

kuuluvad ka mittepiiravalt kariloomad, spordiloomad, lemmikloomad, primaadid, hobused,

koerad, kassid, hiired ja rotid.

26 EE-EP 1 957 106 B2

[0069] Käesolevas tähendab „vektor” konstrukti, mis suudab edastada ja eelistatult

ekspresseerida ühte või mitut huvipakkuvat geeni või järjestust peremeesrakus. Vektorite

hulka kuuluvad mittepiiravalt viirusvektorid, paljad DNA või RNA ekspressioonivektorid,

plasmiid-, kosmiid- või faagivektorid, katiooniliste kondenseerivate agensitega seotud

DNA või RNA ekspressioonivektorid, liposoomidesse kapseldatud DNA või RNA 5

ekspressioonivektorid ning teatavad eukarüootsed rakud, nagu näiteks tootjarakud.

[0070] Käesolevas tähendab „ekspressiooni kontrolljärjestus” nukleiinhappe järjestust, mis

suunab nukleiinhappe transkriptsiooni. Ekspressiooni kontrolljärjestus võib olla promootor,

nagu näiteks konstitutiivne või esilekutsuv promootor või võimendusjärjestus. 10

Ekspressiooni kontrolljärjestus on toimivalt seotud transkribeeritava

nukleiinhappejärjestusega.

[0071] Käesolevas hõlmab „farmatseutiliselt aktsepteeritav tugiaine” või „farmatseutiliselt

aktsepteeritav abiaine” mis tahes materjali, mis aktiivse toimeainega kombineeritult 15

võimaldab antud koostisosal säilitada bioloogilise aktiivsuse ning ei reageeri uuringualuse

immuunsüsteemiga. Nende näidete hulka kuuluvad mittepiiravalt mis tahes standardsed

farmatseutilised tugiained, nagu näiteks fosfaatpuhverdatud soolalahus, vesi, emulsioonid,

nagu näiteks õli-vees emulsioon, ning erinevat tüüpi märgavad ained. Eelistatud lahjendid

aerosooli või parenteraalse manustamise korral on fosfaatpuhverdatud soolalahus või 20

tavaline (0,9%-line) soolalahus. Selliseid tugiaineid sisaldavaid koostisi formuleeritakse

hästi tuntud tavapäraste meetoditega (vt näiteks Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.

väljaanne, A. Gennaro (toim.), Mack Publishing Co.; Easton, PA, 1990; ja Remington, The

Science and Practice of Pharmacy, 20. väljaanne, Mack Publishing, 2000).

25

[0072] Käesolevas osutab mõiste „kon” antikeha antigeeniga ühinemise kiiruse konstandile.

[0073] Käesolevas osutab mõiste „koff” antikeha antikeha/antigeeni kompleksist eraldumise

kiiruse konstandile.

30

[0074] Käesolevas osutab mõiste „KD” antikeha ja antigeeni vastastiktoime dissotsiatsiooni

tasakaalukonstandile.

27 EE-EP 1 957 106 B2

[0075] Käesolevas osutab mõiste „vasomotoorne sümptom” vasodilatatsiooniga seotud

haigusseisunditele ning see hõlmab mittepiiravalt peavalu (nagu näiteks migreeni jt),

kuumapahvakuid (kuumahoogusid), külmahoogusid, unetust, unehäireid, meeleoluhäireid,

ärrituvust, liigset higistamist, öist higistamist, päevast higistamist, väsimust jms, mida

põhjustab muu hulgas termoregulatoorne väärtalitlus. 5

[0076] Käesolevas on mõisted „punastamine”, „kuumapahvak” ja „kuumahoog” tehnika

tasemes tunnustatud mõisted, mis osutavad kehatemperatuuri episoodilisele häirele, mis

tüüpiliselt seisneb ootamatus naha punetuses, millega kaasneb tavaliselt uuringualuse

higistamine. 10

A. Meetodid vasomotoorsete sümptomite ennetamiseks või ravimiseks

[0077] Ühe aspektina esitatakse leiutisega antikeha, mis on ette nähtud kasutamiseks

patsiendil peavalu (nt migreen) ravimise või ärahoidmise meetodis, mis hõlmab siin 15

määratletud CGRP-vastase antagonistliku antikeha tõhusa koguse manustamist patsiendile.

[0078] Antud valdkonna asjatundjad suudavad määrata konkreetsete CGRP antikehaga

kombinatsioonis kasutatavate toimeainete sobivad annused. Näiteks võib sumatriptaani

manustada annuses ligikaudu 0,01 kuni ligikaudu 300 mg. Mitteparenteraalse manustamise 20

korral on sumatriptaani tüüpiline annus ligikaudu 25 kuni ligikaudu 100 mg, kus üldiselt

eelistatakse annust ligikaudu 50 mg; parenteraalse manustamise korral on eelistatud annus

ligikaudu 6 mg. Kuid neid annuseid võib varieerida vastavalt tehnika tasemes standardsetele

meetoditele, nii et need oleksid optimeeritud konkreetse patsiendi jaoks või konkreetse

kombineeritud teraapia jaoks. Lisaks võib näiteks tselekoksiibi manustada koguses, mis on 25

vahemikus 50 kuni 500 mg.

[0079] Kõikide siin kirjeldatud meetodite puhul hõlmab viide CGRP-vastastele antagonist-

antikehadele ka koostisi, mis sisaldavad ühte või mitut nendest toimeainetest. Need

koostised võivad lisaks sisaldada sobivaid abiaineid, nagu näiteks farmatseutiliselt 30

aktsepteeritavaid abiaineid, sealhulgas puhvreid, mis on tehnika tasemes hästi tuntud.

Käesolevat leiutist võib kasutada üksi või teiste tavapäraste ravimeetoditega kombineeritult.

28 EE-EP 1 957 106 B2

[0080] CGRP-vastast antagonist-antikeha võib manustada indiviidile mis tahes sobival

viisil. Antud valdkonna asjatundjale peaks olema ilmselge, et siin kirjeldatud näidete

eesmärgiks ei ole käesoleva leiutise piiramine, vaid olemasolevate tehnikate illustreerimine.

Sellest tulenevalt manustatakse osades teostustes CGRP-vastast antagonist-antikeha

indiviidile vastavalt tuntud meetoditele, nagu näiteks manustatakse seda intravenoosselt, 5

näiteks boolusena või pideva infusiooni teel pikema aja jooksul, intramuskulaarselt,

intraperitoneaalselt, intratserebrospinaalselt, subkutaanselt, intraartikulaarselt,

sublinguaalselt, intrasünoviaalselt, insuflatsiooni teel, intratekaalselt, suukaudselt,

inhalatsiooni teel või topikaalselt. Manustamine võib olla süsteemne, näiteks intravenoosne

manustamine, või paikne. Manustamiseks on kasulikud kaubanduslikult kättesaadavad 10

nebulisaatorid vedelate formulatsioonide jaoks, sealhulgas pihustiga nebulisaatorid ja

ultrahelinebulisaatorid. Vedelaid formulatsioone võib vahetult nebuliseerida ja

lüofiliseeritud pulbrit võib nebuliseerida pärast taastamist. Alternatiivselt võib CGRP-

vastase antikeha muuta aerosooliks, kasutades fluorosüsiniku formulatsiooni ja

dosaatorinhalaatorit, või seda võib sisse hingata lüofiliseeritud ja jahvatatud pulbrina. 15

[0081] Ühes teostuses manustatakse CGRP-vastast antagonist-antikeha

asukohaspetsiifilise või sihtmärgistatud lokaalse manustamise tehnikatega.

Asukohaspetsiifiliste või sihtmärgistatud lokaalse manustamise tehnikate näidete hulka

kuuluvad erinevad siirdatavad CGRP-vastase antagonist-antikeha depooallikad või paikse 20

manustamise kateetrid, nagu näiteks infusioonikateetrid, sisemine kateeter või nõel-

kateeter, sünteetilised siirikud, ümbritsevad mähised, šundid või stendid või muud

siirdatavad vahendid, asukohaspetsiifilised tugiained, vahetu süstimine või vahetu

pealekandmine. Vt näiteks PCT publikatsioon nr WO 00/53211 ja USA patent nr 5 981 568.

25

[0082] Manustamiseks võib kasutada erinevaid CGRP-vastase antagonist-antikeha

formulatsioone. Osades teostustes võib CGRP-vastast antagonist-antikeha manustada

puhtalt. Osades teostustes võivad CGRP-vastane antagonist-antikeha ja farmatseutiliselt

aktsepteeritav abiaine olla erinevates formulatsioonides. Farmatseutiliselt aktsepteeritavad

abiained on tehnika tasemes tuntud ning need on suhteliselt inertsed ained, mis lihtsustavad 30

farmakoloogiliselt efektiivse aine manustamist. Näiteks võib abiaine anda vormi või

konsistentsi või toimida lahjendina. Sobivate abiainete hulka kuuluvad mittepiiravalt

stabilisaatorid, märgavad ained ja emulgaatorid, osmolaarsust varieerivad soolad,

29 EE-EP 1 957 106 B2

kapseldavad ained, puhvrid ja nahka imendumist parandavad ained. Abiained ning

formulatsioonid ravimi parenteraalseks ja mitteparenteraalseks manustamiseks on välja

toodud allikas Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20. väljaanne, Mack

Publishing (2000).

5

[0083] Osades teostustes on need toimeained formuleeritud süstimise teel manustamiseks

(näiteks intraperitoneaalseks, intravenoosseks, subkutaanseks, intramuskulaarseks jne

süstimiseks). Sellest tulenevalt võivad need toimeained olla kombineeritud farmatseutiliselt

aktsepteeritavate vehiikulitega, nagu näiteks soolalahusega, Ringeri lahusega, dekstroosi

lahusega jms. Konkreetne annustamisrežiim (st annus, ajastus ja kordus) sõltub konkreetsest 10

indiviidist ja selle indiviidi varasemast haigusloost.

[0084] CGRP-vastase antikeha manustamiseks võib kasutada mis tahes sobivat meetodit,

sealhulgas süstimist (näiteks intraperitoneaalselt, intravenoosselt, subkutaanselt,

intramuskulaarselt jne). CGRP-vastaseid antikehi võib manustada ka inhalatsiooni teel 15

vastavalt siin kirjeldatule. Üldiselt võib algne kandidaatannus CGRP-vastaste antikehade

manustamiseks olla ligikaudu 2 mg/kg. Käesoleva leiutise mõistes võib tüüpiline päevane

annus olla vahemikus ligikaudu 3 µg/kg kuni 30 µg/kg kuni 300 µg/kg kuni 3 mg/kg kuni

30 mg/kg kuni 100 mg/kg või suurem, olenevalt eespool nimetatud teguritest. Näiteks võib

kasutada annust, mis on ligikaudu 1 mg/kg, ligikaudu 2,5 mg/kg, ligikaudu 5 mg/kg, 20

ligikaudu 10 mg/kg ja ligikaudu 25 mg/kg. Korduvate manustamiste korral mitme päeva

jooksul või kauem jätkatakse ravi haigusseisundist olenevalt kuni sümptomite soovitud

pärssimiseni või kuni piisava terapeutilise toime saavutamiseni, näiteks valu

vähendamiseni. Annustamisrežiimi näide hõlmab algse annuse manustamist, mis on

ligikaudu 2 mg/kg, millele järgneb iganädalane säilitamisannus, mis on ligikaudu 1 mg/kg 25

CGRP-vastast antikeha, või millele järgneb säilitamisannus, mis on ligikaudu 1 mg/kg ja

mida manustatakse üle nädala. Kuid kasulikud võivad olla ka teised annustamisrežiimid,

olenevalt farmakokineetilise lagunemise mustrist, mida raviarst soovib saavutada. Näiteks

osades teostustes kaalutakse üks kuni neli korda nädalas annustamist. Selle ravimeetodi

edusamme on lihtne jälgida tavapäraste tehnikate ja analüüsimeetoditega. 30

Annustamisrežiim (sealhulgas kasutatud CGRP antagonist(id)) võib aja jooksul varieeruda.

30 EE-EP 1 957 106 B2

[0085] Käesoleva leiutise mõistes sõltub CGRP-vastase antagonist-antikeha sobiv annus

kasutatud CGRP-vastasest antagonist-antikehast (või selle koostistest), ravitava peavalu

tüübist ja tõsidusest (nt migreen), sellest, kas toimeainet manustatakse ennetavatel või

ravieesmärkidel, varasemast ravist, patsiendi kliinilisest ajaloost ja reaktsioonist antud

toimeainele ning raviarsti valikuvabadusest. Raviarst manustab tüüpiliselt CGRP-vastast 5

antagonist-antikeha seni, kuni saavutatakse annus, mis saavutab soovitud tulemusi. Annus

ja/või sagedus võib ravi jooksul varieeruda.

[0086] Empiirilised kaalutlused, nagu näiteks pooleluiga, aitavad annuse kindlaks

määramisele üldiselt kaasa. Näiteks antikehasid, mis ühilduvad inimese 10

immuunsüsteemiga, nagu näiteks humaniseeritud antikehasid või täielikult inimese

antikehasid võib kasutada antikeha pooleluea pikendamiseks ja selleks, et vältida antikeha

ründamist peremehe immuunsüsteemi poolt. Manustamise sagedust võib kindlaks määrata

ja kohandada ravi jooksul ning selle aluseks on üldiselt, kuid mitte ilmtingimata, peavalu

(näiteks migreeni) ravimine ja/või pärssimine ja/või leevendamine ja/või edasilükkamine. 15

Alternatiivselt võivad olla asjakohased CGRP-vastaste antagonist-antikehade pikaajalise

pideva vabanemisega formulatsioonid. Erinevad formulatsioonid ja vahendid pikaajalise

vabanemise saavutamiseks on tehnika tasemes tuntud.

[0087] Ühes teostuses võib CGRP-vastase antagonist-antikeha annused kindlaks määrata 20

empiiriliselt indiviidides, kellele on CGRP-vastast antagonist-antikeha üks või mitu korda

manustatud. Indiviididele manustatakse CGRP-vastase antagonist-antikeha lisanduvaid

annuseid. CGRP-vastase antagonist-antikeha tõhususe hindamiseks võib jälgida haiguse

näitajaid.

25

[0088] CGRP-vastase antagonist-antikeha manustamine vastavalt käesolevas leiutises

esitatud meetodile võib olla katkematu või vahelduv, olenevalt näiteks vastuvõtja

füsioloogilisest seisundist, kas manustamise eesmärk on terapeutiline või profülaktiline,

ning muudest kogenud meditsiinitöötajale tuntud teguritest. CGRP-vastase antagonist-

antikeha manustamine võib olla sisuliselt katkematu eelnevalt kindlaks määratud 30

ajavahemiku jooksul või see võib olla vahedega annuste seeria, näiteks enne peavalu (nt

migreeni) arenemist, selle ajal ja pärast seda; enne peavalu arenemist; peavalu ajal; enne ja

pärast peavalu arenemist; peavalu ajal ja pärast seda; enne peavalu arengut ja selle ajal; või

31 EE-EP 1 957 106 B2

enne peavalu arenemist, selle ajal ja pärast seda. Manustamine võib toimuda enne mis tahes

sündmust, mis võib tõenäoliselt peavalu põhjustada, selle ajal ja/või pärast seda.

[0089] Osades teostustes võib esindatud olla rohkem kui üks CGRP-vastane antagonist-

antikeha. Esindatud võib olla vähemalt üks, vähemalt kaks, vähemalt kolm, vähemalt neli, 5

vähemalt viis või rohkem CGRP-vastast antagonist-antikeha. Üldiselt võivad nendel CGRP-

vastastel antagonist-antikehadel olla täiendavad toimed, mis ei avalda üksteisele kahjulikku

mõju. CGRP-vastast antikeha võib kasutada ka koos mõne muu CGRP antagonisti või

CGRP retseptori antagonistiga. Näiteks võib kasutada ühte või mitut alljärgnevatest CGRP

antagonistidest: CGRP vastu suunatud antisenss-molekul (sealhulgas CGRPd kodeeriva 10

nukleiinhappe vastu suunatud antisenss-molekul), CGRPd inhibeeriv ühend, CGRP

struktuuriline analoog, CGRP retseptori dominant-negatiivne mutatsioon, mis seondub

CGRPga ning CGRP retseptori vastane antikeha. CGRP-vastast antagonist-antikeha võib

kasutada ka koos muude toimeainetega, mille eesmärgiks on parandada ja/või täiendada

nende toimeainete tõhusust. 15

[0090] Käesoleva leiutise kohaselt kasutatava CGRP-vastase antagonist-antikeha

terapeutilisi formulatsioone valmistatakse säilitamiseks selliselt, et soovitud puhtusastmega

antikeha segatakse valikuliste farmatseutiliste tugiainete, abiainete või stabilisaatoritega

(Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20. väljaanne, Mack Publishing 20

(2000)) lüofiliseeritud formulatsioonide või vesilahuste kujul. Aktsepteeritavad tugiained,

abiained või stabilisaatorid on vastuvõtjatele kasutatud annustes ja kontsentratsioonides

mittetoksilised ning nende hulka võivad kuuluda puhvrid, nagu näiteks fosfaat, titraat ja

teised orgaanilised happed; soolad, nagu näiteks naatriumkloriid; antioksüdandid, nagu

näiteks askorbiinhape ja metioniin; säilitusained (nagu näiteks oktadetsüüldimetüülbensüül-25

ammooniumkloriid; heksametooniumkloriid; bensalkooniumkloriid, bensetooniumkloriid;

fenool-, butüül- või bensüülalkohol; alküülparabeenid, nagu näiteks metüül- või

propüülparabeen; katekool; resortsinool; tsükloheksanool; 3-pentanool; ja m-kresool);

madala molekulmassiga (vähem kui ligikaudu 10 jääki) polüpeptiidid; valgud, nagu näiteks

seerumi albumiin, želatiin või immunoglobuliinid; hüdrofiilsed polümeerid, nagu näiteks 30

polüvinüülpürrolidoon; aminohapped, nagu näiteks glütsiin, glutamiin, asparagiin, histidiin,

arginiin või lüsiin; monosahhariidid, disahhariidid ja muud süsivesikud, sealhulgas glükoos,

mannoos või dekstriinid; kelaativad ained, nagu näiteks EDTA; suhkrud, nagu näiteks

32 EE-EP 1 957 106 B2

sahharoos, mannitool, trehaloos või sorbitool; sooli moodustavad vastasioonid, nagu näiteks

naatrium; metallikompleksid (näiteks Zn-valgu kompleksid); ja/või mitteioonsed

pindaktiivsed ained, nagu näiteks TWEEN™, PLURONICS™ või polüetüleenglükool

(PEG).

5

[0091] CGRP-vastast antagonist-antikeha sisaldavaid liposoome valmistatakse tehnika

tasemes tuntud meetoditega, mida on kirjeldatud näiteks allikates Epstein, et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980);

ja USA patentides nr 4 485 045 ja 4 544 545. Parandatud tsirkulatsiooniajaga liposoome on

kirjeldatud USA patendis nr 5 013 556. Eriti kasulikke liposoome saab genereerida 10

pöördfaasilise aurustamismeetodi abil lipiidi koostisega, mis sisaldab fosfatidüülkoliini,

kolesterooli ja PEG-derivatiseeritud fosfatidüületanoolamiini (PEG-PE). Liposoomid

surutakse läbi kindlaksmääratud poori suurusega filtrite, et saada soovitud diameetriga

liposoomid.

15

[0092] Toimeained võivad olla ka sisestatud mikrokapslitesse, mis on valmistatud näiteks

koatservatsioonitehnikate või faasidevahelise polümerisatsiooni teel, näiteks vastavalt

hüdroksümetüültselluloosi või želatiini mikrokapslitesse ning polü-(metüülmetatsülaat)-

mikrokapslitesse kolloidsetes ravimi manustamise süsteemides (näiteks liposoomid,

albumiini mikrosfäärid, mikroemulsioonid, nanoosakesed ja nanokapslid) või 20

makroemulsioonides. Selliseid tehnikaid on kirjeldatud allikas Remington, The Science and

Practice of Pharmacy, 20. väljaanne, Mack Publishing (2000).

[0093] Valmistada võib ka pikaajalise vabanemisega preparaate. Pikaajalise vabanemisega

preparaatide sobivate näidete hulka kuuluvad poolläbilaskvad tahkete hüdrofoobsete 25

polümeeride maatriksid, mis sisaldavad antikeha; nimetatud maatriksid on vormitud

toodete, näiteks kilede või mikrokapslite kujul. Pikaajalise vabanemisega maatriksite

näidete hulka kuuluvad polüestrid, hüdrogeelid (näiteks polü-2-hüdroksüetüül-metakrülaat

või polüvinüülalkohol), polülaktiidid (USA patent nr 3 773 919), L-glutamiinhappe

kopolümeerid ja 7-etüül-L-glutamaat, lagunematu etüleenvinüülatsetaat, lagunevad 30

piimhappe-glükoolhappe kopolümeerid, nagu näiteks LUPRON DEPOT™ (süstitavad

mikrosfäärid, mis koosnevad piimhappe-glükoolhappe kopolümeerist ja

leuproliidatsetaadist), sahharoosatsetaatisobutüraat ja polü-D-(-)-3-hüdroksübutüürhape.

33 EE-EP 1 957 106 B2

[0094] In vivo manustamiseks kasutatavad formulatsioonid peavad olema steriilsed. Seda

on lihtne saavutada näiteks filtreerimisega läbi steriilsete filtreerimismembraanide.

Terapeutilised CGRP-vastase antagonist-antikeha koostised paigutatakse üldiselt

mahutisse, millel on steriilne juurdepääsuava, näiteks intravenoosse lahuse kotti või viaali,

millel on hüpodermilise nõelaga läbistatav kork. 5

[0095] Käesoleva leiutise kohased koostised võivad olla ühikannuste kujul, nagu näiteks

tabletid, pillid, kapslid, pulbrid, graanulid, lahused või suspensioonid või suposiidid

suukaudseks, parenteraalseks või rektaalseks manustamiseks või inhalatsiooni või

insulfatsiooni teel manustamiseks. 10

[0096] Tahkete koostiste, nagu näiteks tablettide valmistamiseks segatakse peamine

toimeaine farmatseutilise tugiainega, näiteks tavapäraste tablettide valmistamiseks

kasutatavate koostisosadega, nagu näiteks maisitärklise, laktoosi, sahharoosi, sorbitooli,

talgi, steaarhappe, magneesiumstearaadi, dikaltsiumfosfaadi või kummidega, ja teiste 15

farmatseutiliste lahjenditega, näiteks veega, et valmistada tahke preformulatsiooni koostis,

mis sisaldab käesoleva leiutise ühendi või selle farmatseutiliselt aktsepteeritava

mittetoksilise soola homogeenset segu. Kui selliseid preformulatsiooni koostisi

kirjeldatakse homogeensetena, siis mõeldakse selle all seda, et toimeaine on ühtlaselt

hajutatud kogu koostise ulatuses selliselt, et koostise võib lihtsalt jagada omakorda võrdselt 20

tõhusateks ühikannuste vormideks, nagu näiteks tablettideks, pillideks ja kapsliteks.

Seejärel jagatakse tahke preformulatsiooni koostis eespool kirjeldatud ühikannuste

vormideks, mis sisaldavad 0,1 kuni ligikaudu 500 mg käesoleva leiutise kohast toimeainet.

Selle uudse koostise tabletid või pillid võib katta või muul tervikuks muuta, et pakkuda

ravimvormi, mis annab pikaajalise toime eelise. Näiteks võib tablett või pill sisaldada 25

sisemise annuse ja välimise annuse komponenti, kusjuures viimane võib esimest

ümbritseda. Need kaks komponenti võivad olla eraldatud enteerse kihiga, mille eesmärgiks

on vältida selle lagunemist maos ning see võimaldab sisemisel komponendil liikuda

terviklikult edasi kaksteistsõrmiksoolde või selle vabanemist edasi lükata. Selliste

enteersete kihtide või kattekihtide valmistamiseks võib kasutada erinevaid materjale, 30

sealhulgas mitmeid polümeerseid happeid ja polümeersete hapete segusid selliste

materjalidega nagu šellak, tsetüülalkohol ja tselluloosatsetaat.

34 EE-EP 1 957 106 B2

[0097] Sobivate pindaktiivsete ainete hulka kuuluvad eelkõige mitteioonsed ained, nagu

näiteks polüoksüetüleensorbitaanid (näiteks Tween™ 20, 40, 60, 80 või 85) ja teised

sorbitaanid (näiteks Span™ 20, 40, 60, 80 või 85). Pindaktiivset ainet sisaldavad koostised

sisaldavad sobivalt 0,05 kuni 5% pindaktiivset ainet ning võib sisaldada seda 0,1 kuni 2,5%.

Siinkohal on selge, et vajaduse korral võib lisada ka teisi koostisosi, näiteks mannitooli või 5

teisi farmatseutiliselt aktsepteeritavaid vehiikuleid.

[0098] Sobivate emulsioonide valmistamiseks võib kasutada kaubanduslikult

kättesaadavaid rasvemulsioone, nagu näiteks Intralipid™, Liposyn™, Infonutrol™,

Lipofundin™ ja Lipiphysan™. Toimeaine võib olla lahustatud eelnevalt kokku segatud 10

emulsiooni koostises või alternatiivselt võib selle lahustada õlis (näiteks sojaoaõlis,

safloorõlis, puuvillaseemneõlis, seesamiõlis, maisiõlis või mandliõlis) ning emulsioon

moodustatakse fosfolipiidiga (näiteks muna fosfolipiidid, sojaoa fosfolipiidid või sojaoa

letsitiin) segamisel. Siinkohal on selge, et emulsiooni tonaalsuse reguleerimiseks võib lisada

ka teisi koostisosi, näiteks glütserooli või glükoosi. Sobivad emulsioonid sisaldavad 15

tüüpiliselt kuni 20% õli, näiteks vahemikus 5 kuni 20% õli. Rasvemulsioon võib koosneda

rasvatilkadest, mille läbimõõt on vahemikus 0,1 kuni 1,0 lm, eelkõige vahemikus 0,1 kuni

0,5 lm, ning selle pH on vahemikus 5,5 kuni 8,0.

[0099] Emulsiooni koostised võivad olla sellised, mis on valmistatud CGRP-vastase 20

antagonist-antikeha segamise teel Intralipid™.või selle komponentidega (sojaoaõli, muna

fosfolipiidid, glütserool ja vesi).

[0100] Inhalatsiooniks või insuflatsiooniks kasutatavate koostiste hulka kuuluvad lahused

ja suspensioonid farmatseutiliselt aktsepteeritavates veepõhistes või orgaanilistes lahustites, 25

või nende segud, või pulbrid. Vedelad või tahked koostised võivad sisaldada sobivaid

farmatseutiliselt aktsepteeritavaid abiaineid vastavalt eespool väljatoodule. Osades

teostustes manustatakse koostisi lokaalse või süsteemse toime saavutamiseks suukaudselt

või nina hingamisteede kaudu. Eelistatult steriilsetes farmatseutiliselt aktsepteeritavates

lahustites olevad koostised võivad olla nebuliseeritud gaaside kasutamise teel. 30

Nebuliseeritud lahuseid võib sisse hingata vahetult nebuliseerimisseadmest või see

nebuliseerimisseade võib olla kinnitatud näomaski, tendi või hootise positiivse rõhuga

hingamisseadme külge. Lahuse, suspensiooni või pulbri koostisi võib manustada (eelistatult

35 EE-EP 1 957 106 B2

suukaudselt või nasaalselt) seadmetest, mis sisestavad formulatsiooni organismi sobival

viisil.

[0101] Peavalu diagnoosimist või hindamist on tehnika tasemes põhjalikult kirjeldatud.

Hindamist võib teostada subjektiivsete mõõtmiste alusel, nagu näiteks selle alusel, kuidas 5

patsient sümptomeid iseloomustab. Näiteks migreeni võib diagnoosida järgmiste

kriteeriumide alusel: 1) episoodilised peavaluhood, mis kestavad 4 kuni 72 tundi; 2) esineb

kaks alljärgnevatest sümptomitest: ühepoolne valu, tuikav valu, süvenev valu liikumise

korral ning keskmise või tugeva intensiivsusega valu; ja 3) esineb üks alljärgnevatest

sümptomitest: iiveldus või oksendamine ning fotofoobia või fonofoobia. Goadsby et al., N. 10

Engl. J. Med. 346:257–270, 2002.

[0102] Ravi tõhusust saab hinnata tehnika tasemes hästi tuntud meetoditega. Näiteks võib

hinnata valu leevendamist. Sellest tulenevalt jälgitakse osades teostustes valu leevendamist

subjektiivselt 1, 2 või mõni tund pärast CGRP-vastase antikeha manustamist. Osades 15

teostustes jälgitakse peavaluhoogude sagedust subjektiivselt pärast CGRP-vastase antikeha

manustamist.

B. CGRP-vastased antagonist-antikehad

20

[0103] Käesolev leiutis on seotud CGRP-vastase antagonist-antikeha kasutamisega, mis

osutab mis tahes antikeha molekulile, mis blokeerib, pärsib või vähendab (sealhulgas

märkimisväärselt) CGRP bioloogilist aktiivsust, sealhulgas CGRP signaliseerimisega

vahendatud pärisuunalisi radasid, nagu näiteks retseptori seondumist ja/või rakulise

reaktsiooni esile kutsumist CGRP suhtes. 25

[0104] CGRP-vastasel antagonist-antikehal peaks olema üks või mitu alljärgnevat

omadust: (a) seondub CGRPga; (b) blokeerib CGRP seondumist selle retseptori(te)ga; (c)

blokeerib või vähendab CGRP retseptori aktiveerimist (sealhulgas cAMP aktiveerimist); (d)

inhibeerib CGRP bioloogilist aktiivsust või CGRP signaliseerimisega vahendatud 30

pärisuunalisi radasid; (e) ennetab, leevendab või ravib mis tahes peavalu aspekti (näiteks

migreeni); (f) suurendab CGRP kõrvaldamist; ja (g) inhibeerib (vähendab) CGRP

sünteesimist, tootmist või vabanemist. CGRP-vastased antagonist-antikehad on tehnika

36 EE-EP 1 957 106 B2

tasemes tuntud. Vt näiteks Tan et al., Clin. Sci. (Lond). 89:565–73, 1995; Sigma (Missouri,

US), toode nr C7113 (kloon nr 4901); Plourde et al., Peptides 14:1225–1229,1993.

[0105] Käesoleva leiutise mõistes reageerib antikeha CGRPga sellisel viisil, et see

inhibeerib CGRPd ja/või CGRP signaliseerimisega vahendatud pärisuunalisi radasid. 5

Osades teostustes seondub CGRP-vastane antagonist-antikeha nii inimese α-CGRP kui ka

β-CGRPga. Osades teostustes seondub CGRP-vastane antagonist-antikeha inimese ja roti

CGRPga. Osades teostustes seondub CGRP-vastane antagonist-antikeha C-otsa epitoobiga

CGRP aminohapetes 25–37.

10

[0106] Käesolevas leiutises kasulike antikehade hulka võivad kuuluda monoklonaalsed

antikehad, bispetsiifilised antikehad, heterokonjugaat-antikehad, humaniseeritud antikehad

ja mis tahes muu immunoglobuliini molekuli modifitseeritud konfiguratsioon, mis sisaldab

nõutud spetsiifilisusega antigeeni äratundmissaiti, sealhulgas antikehade glükosüleerimise

variandid, antikehade aminohappejärjestuse variandid ja kovalentselt modifitseeritud 15

antikehad.

[0107] Osades teostustes on CGRP-vastane antagonist-antikeha monoklonaalne antikeha.

Osades teostustes on CGRP-vastane antagonist-antikeha humaniseeritud antikeha. Osades

teostustes on CGRP-vastane antagonist-antikeha inimese antikeha. Osades teostustes on 20

CGRP-vastane antagonist-antikeha antikeha G1 (vastavalt siin kirjeldatule). Osades

teostustes sisaldab CGRP-vastane antagonist-antikeha tabelis 6 välja toodud antikeha G1

või G1 variantide ühte või mitut CDRi (nagu näiteks ühte, kahte, kolme, nelja, viit või

osades teostustes kõiki kuut CDRi). Veel teistes teostustes sisaldab CGRP-vastane

antagonist-antikeha Joonisel FIG 5 välja toodud raske ahela varieeruva piirkonna 25

aminohappejärjestust (SEQ ID NO:1) ja Joonisel FIG 5 välja toodud kerge ahela varieeruva

piirkonna aminohappejärjestust (SEQ ID NO:2).

[0108] Osades teostustes sisaldab antikeha modifitseeritud konstantset piirkonda, nagu

näiteks käesolevas kirjeldatud immunoloogiliselt inertset konstantset piirkonda. Osades 30

teostustes on konstantset piirkonda modifitseeritud viisil, mida on kirjeldatud allikates Eur.

J. Immunol. (1999) 29:2613–2624; ja WO99/58572. Teistes teostustes sisaldab antikeha

inimese raske ahela IgG2 konstantset piirkonda, mis sisaldab alljärgnevaid mutatsioone:

37 EE-EP 1 957 106 B2

A330P331 on muudetud S330S331ks (aminohapete loend viitega looduslikule IgG2

järjestusele). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613–2624. Osades teostustes sisaldab antikeha

IgG4 konstantset piirkonda, mis sisaldab alljärgnevaid mutatsioone: E233F234L235 on

muudetud P233V234A235ks. Veel osades teistes teostustes aglükosüleeritakse pidev

piirkond N-seotud glükosüleerimise jaoks. Osades teostustes aglükosüleeritakse pidev 5

piirkond N-seotud glükosüleerimise jaoks oligosahhariidi kinnitumise jäägi (nagu näiteks

Asn297) ja/või flankeerivate jääkide muteerimise teel, mis on N-glükosüleerimist ära

tundva järjestuse osa konstantses piirkonnas. Osades teostustes on pidev piirkond N-seotud

glükosüleerimise jaoks aglükosüleeritud. Konstantset piirkonda võib aglükosüleerida N-

seotud glükosüleerimise jaoks ensümaatiliselt või ekspresseerimise kaudu glükosüleerimise 10

puudulikkusega peremeesrakus.

[0109] Üks viis, kuidas kindlaks määrata antikehade seondumisafiinsust CGRP suhtes, on

mõõta antikeha monofunktsionaalsete Fab fragmentide seondumisafiinsust.

Monofunktsionaalsete Fab fragmentide saamiseks võib antikeha (näiteks IgG) lõhustada 15

papaiiniga või ekspresseerida rekombinantselt. Antikeha CGRP-vastase Fab fragmendi

afiinsust saab kindlaks määrata pinna plasmonresonantsiga (Biacore3000™ pinna

plasmonresonantsi (surface plasmon resonance, SPR) süsteem, Biacore, INC, Piscataway

NJ), mis on varustatud eelnevalt immobiliseeritud streptavidiini sensorkiipidega (SA),

kasutades HBS-EP voolavat puhvrit (0,01 M HEPES, pH 7,4, 0,15 NaCl, 3 mM EDTA, 20

0,005% v/v pindaktiivset ainet P20). Biotinüülitud inimese CGRP (või mis tahes muu

CGRP) võib lahjendada HBS-EP puhvrisse kontsentratsioonini, mis on väiksem kui 0,5

μg/ml ning pritsida üle individuaalsete kiipide kanalite, kasutades varieeruvaid

kokkupuuteaegu, et saavutada kaks antigeeni tiheduse vahemikku, milleks on 50–200

vastusühikut (response unit, RU) üksikasjalikeks kineetilisteks uuringuteks või 800–1000 25

RU skriininganalüüsideks. Regeneratsiooni uuringud on näidanud, et 25 mM NaOH 25%

v/v etanoolis eemaldab efektiivselt seotud Fabi, säilitades samal ajal CGRP aktiivsust kiibil

rohkem kui 200 süstimise jooksul. Tüüpiliselt süstitakse puhastatud Fabi proovide

seerialahjendusi (kontsentratsioonide ulatus on 0,1–10 × hinnanguline KD) 1 minuti jooksul

kiirusega 100 µl/minutis ning lubatakse kuni 2-tunniseid dissotsiatsiooniaegu. Fab valkude 30

kontsentratsioonid määratakse kindlaks ELISA analüüsiga ja/või SDS-PAGE

elektroforeesiga, kasutades standardina Fabi teadaolevaid kontsentratsioone (vastavalt

aminohappe analüüsiga kindlaks määratule). Kineetilised assotsiatsioonikiirused (kon) ja

38 EE-EP 1 957 106 B2

dissotsiatsioonikiirused (koff) saadakse samaaegselt, kui andmed sobitatakse üldiselt 1:1

Langmuiri seondumismudelisse (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994).

Methods Enzymology 6. 99–110), kasutades programmi BIA Evaluation. Dissotsiatsiooni

tasakaalukonstandi (KD) väärtused arvutatakse võrrandist koff/kon. See protokoll sobib

kasutamiseks antikeha seondumisafiinsuse kindlaks määramiseks mis tahes CGRP suhtes, 5

sealhulgas inimese CGRP, mõne teise imetaja CGRP (nagu näiteks hiire CGRP, roti CGRP,

primaadi CGRP) ning samuti CGRP erinevate vormide (nagu näiteks α- ja β-vormi) suhtes.

Antikeha seondumisafiinsust mõõdetakse üldiselt 25 °C juures, kuid seda võib mõõta ka

37 °C juures.

10

[0110] CGRP-vastaste antagonist-antikehade valmistamiseks võib kasutada mis tahes

tehnika tasemes tuntud meetodit. Peremeesraku immuniseerimise viisi ja ajakava puhul

järgitakse üldiselt väljakujunenud ja tavapäraseid tehnikaid, mida kasutatakse antikeha

stimuleerimiseks ja tootmiseks vastavalt siin edaspidi kirjeldatule. Üldised tehnikad inimese

ja hiire antikehade tootmiseks on tehnika tasemes tuntud ning neid on siin kirjeldatud. 15

[0111] Siinkohal peetakse võimalikuks, et mis tahes imetajast uuringualust, sealhulgas

inimesi või nendelt saadud antikeha tootvaid rakke saab manipuleerida, et kasutada neid

alusena imetaja, sealhulgas inimese hübridoomi rakuliinide tootmiseks. Tüüpiliselt

inokuleeritakse peremeeslooma intraperitoneaalselt, intramuskulaarselt, suukaudselt, 20

subkutaanselt, intraplantaarselt ja/või intradermaalselt immunogeeni, sealhulgas käesolevas

kirjeldatud immunogeeni annusega.

[0112] Hübridoome võib valmistada lümfotsüütidest ja surematuks muudetud

müeloomirakkudest, kasutades üldist somaatilise raku hübridiseerimise tehnikat, mida on 25

kirjeldanud Kohler, B. ja Milstein, C. (1975) Nature 256:495–497 või mida on

modifitseerinud Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377–381 (1982). Hübridiseerimiseks võib

kasutada kättesaadavaid müeloomi rakuliine, sealhulgas mittepiiravalt X63-Ag8.653 ja

neid, mis on pärit Salki instituudist, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA.

Üldiselt hõlmab selline tehnika müeloomirakkude ja lümfoidrakkude ühildamist, kasutades 30

selleks fusogeeni, nagu näiteks polüetüleenglükooli, või elektriseadmeid, mis on antud

valdkonna asjatundjatele hästi tuntud. Pärast ühildamist eraldatakse rakud

ühildamissöötmest ja neid kasvatatakse selektiivses kasvusöötmes, nagu näiteks

39 EE-EP 1 957 106 B2

hüpoksantiin-aminopteriin-tümidiini (HAT) söötmes, et kõrvaldada hübridiseerimata

lähterakud. Mis tahes siin kirjeldatud söötmeid, mida on või ei ole seerumiga täiendatud,

võib kasutada hübridoomide kultiveerimiseks, mis eritavad monoklonaalseid antikehasid.

Rakkude ühildamise tehnika alternatiivina võib kasutada EBVga surematuks muudetud B-

rakke, et toota käesoleva leiutise teemaks olevaid CGRP-vastaseid monoklonaalseid 5

antikehi. Hübridoome võib soovi korral laiendada ja edasi kloonida ning supernatante

analüüsitakse nende immunogeenivastase toime suhtes tavapäraste immunoanalüüsi

protseduuridega (näiteks radioimmuunanalüüs, ensüümimmuunanalüüs või fluorestsents-

immuunanalüüs).

10

[0113] Hübridoomid, mida võib kasutada antikehade allikana, hõlmavad kõiki derivaate,

lähtehübridoomide järglasrakke, mis toodavad CGRP suhtes spetsiifilisi monoklonaalseid

antikehi või nende osasid.

[0114] Hübridoome, mis toodavad selliseid antikehi, võib kasvatada in vitro või in vivo, 15

kasutades selleks tuntud protseduure. Monoklonaalseid antikehi võib soovi korral isoleerida

kultuurisöötmest või kehavedelikest tavapäraste immunoglobuliini puhastamise

protseduuridega, nagu näiteks ammooniumsulfaadiga sadestamise, geelelektroforeesi,

dialüüsi, kromatograafia ja ultrafiltratsiooni teel. Soovimatu toime (kui see on olemas) saab

eemaldada näiteks selliselt, et preparaadil lastakse voolata üle adsorbentide, mis on 20

valmistatud tahke faasi külge kinnitunud immunogeenist ning seejärel elueeritakse või

vabastatakse immunogeenist soovitud antikehad. Peremeeslooma immuniseerimine inimese

CGRPga või fragmendiga, mis sisaldab immuniseeritavates osakestes immunogeense

valguga konjugeeritud märklaud-aminohappejärjestust, näiteks meriteo hemotsüaniini,

seerumi albumiini, veise türeoglobuliini või sojaoa trüpsiini inhibiitoriga, kasutades 25

bifunktsionaalset või derivatiseerivat ainet, näiteks maleimidobensoüül-sulfosuktsinimiidi

estrit (konjugatsioon tsüsteiini jääkide kaudu), N-hüdroksüsuktsinimiidi (lüsiini jääkide

kaudu), glutaaraldehüüdi, suktsiinanhüdriidi, SOCl2 või R1N=C=NR (kus R ja R1 on

erinevad alküülrühmad), võib anda tulemuseks antikehade populatsiooni (näiteks

monoklonaalsed antikehad). 30

[0115] Soovi korral võib huvipakkuva CGRP-vastase antagonist-antikeha (monoklonaalse

või polüklonaalse) järjestada ning seejärel võib polünukleotiidijärjestuse kloonide

40 EE-EP 1 957 106 B2

vektorisse ekspresseerimiseks või levitamiseks. Huvipakkuvat antikeha kodeerivat

järjestust võib säilitada peremeesrakus sisalduvas vektoris ning seda peremeesrakku võib

seejärel laiendada ja külmutada tulevaseks kasutamiseks. Alternatiivina võib

polünukleotiidijärjestust kasutada geneetilistes manipulatsioonides, et „humaniseerida”

antikeha või parandada antikeha afiinsust või teisi omadusi. Näiteks võib konstantset 5

piirkonda töödelda selliselt, et see sarnaneks rohkem inimese konstantsetele piirkondadele,

et vältida immuunvastust, kui seda antikeha kasutatakse kliinilistes uuringutes ja inimeste

ravimiseks. Antikeha järjestuse geneetiline manipuleerimine võib olla CGRP suhtes

suurema afiinsuse ja CGRP inhibeerimisel suurema tõhususe saavutamiseks. Antud

valdkonna asjatundjale on selge, et CGRP-vastasele antagonist-antikehal võib muuta ühte 10

või mitut polünukleotiidi ning see säilitab endiselt oma seondumisafiinsuse CGRP suhtes.

[0116] Monoklonaalse antikeha humaniseerimine hõlmab nelja üldist etappi. Need on: (1)

lähteantikeha kerge ja raske ahela varieeruvate piirkondade nukleotiidi ja prognoositava

aminohappejärjestuse kindlaks määramine; (2) humaniseeritud antikeha kavandamine, st 15

otsustamine, millist antikeha raampiirkonda kasutatakse humaniseerimisprotsessi ajal; (3)

tegelikud humaniseerimise metodoloogiad/tehnikad; ja (4) humaniseeritud antikeha

transfekteerimine ja ekspresseerimine. Vt näiteks USA patendid nr 4 816 567; 5 807 715;

5 866 692; 6 331 415; 5 530 101; 5 693 761; 5 693 762; 5 585 089; ja 6 180 370.

20

[0117] Kirjeldatud on mitmeid „humaniseeritud” antikeha molekule, mis sisaldavad mitte-

inimese immunoglobuliinist tuletatud antigeeni sidumissaiti, sealhulgas kimäärseid

antikehasid, millel on närilise või modifitseeritud närilise V piirkonnad ja nendega

kaasnevad komplementaarsust määravad piirkonnad (CDRid), mis on ühendatud inimese

konstantsete domeenidega. Vt näiteks Winter et al., Nature 349:293–299 (1991), Lobuglio 25

et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220–4224 (1989), Shaw et al., J Immunol. 138:4534–

4538 (1987), ja Brown et al., Cancer Res. 47:3577–3583 (1987). Teistes viiteallikates on

kirjeldatud närilise CDRe, mis on siirdatud inimese toetavasse raampiirkonda (FR) enne

ühendamist sobiva inimese antikeha konstantse domeeniga. Vt näiteks Riechmann et al.,

Nature 332:323–327 (1988), Verhoeyen et al., Science 239:1534–1536 (1988), ja Jones 30

et al., Nature 321:522–525 (1986). Teistes viiteallikates on kirjeldatud närilise CDRe, mida

toetavad rekombinantselt töödeldud närilise raampiirkonnad. Vt näiteks Euroopa

patendipublikatsiooni nr 0519596. Need „humaniseeritud” molekulid on kujundatud

41 EE-EP 1 957 106 B2

selliselt, et viia miinimumini soovimatu immunoloogiline reaktsioon närilise inimese

vastase antikeha molekulide suhtes, mis piirab neid fragmente kasutavate rakenduste kestust

ja tõhusust inimestest vastuvõtjates. Näiteks võib antikeha konstantset piirkonda töödelda

selliselt, et see on immunoloogiliselt inertne (näiteks ei käivita komplemendi lüüsi). Vt

näiteks WO99/58572. Humaniseeritud antikehade teisi meetodeid, mida võib samuti 5

kasutada, on kirjeldatud allikas Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19:2471–2476 (1991) ja

USA patentides nr 6 180 377; 6 054 297; 5 997 867; 5 866 692; 6 210 671; ja 6 350 861;

ning PCT publikatsioonis nr WO 01/27160.

[0118] Veel ühe võimalusena võib täielikult inimese antikehasid saada kaubanduslikult 10

kättesaadavaid hiiri kasutades, mida on töödeldud selliselt, et need ekspresseerivad

spetsiifilisi inimese immunoglobuliini valke. Humaniseeritud või inimese antikehade

genereerimiseks võib kasutada ka transgeenseid loomi, keda on disainitud selliselt, et need

toodavad soovitavamaid antikehasid (näiteks täielikult inimese antikehasid) või jõulisemat

immuunvastust. Sellise tehnoloogia näited on Xenomouse ™ ettevõttelt Abgenix, Inc. 15

(Fremont, CA) ning HuMAb-Mouse® ja TC Mouse™ ettevõttelt Medarex, Inc. (Princeton,

NJ).

[0119] Alternatiivselt võib antikehasid valmistada rekombinantselt ja ekspresseerida mis

tahes tehnika tasemes tuntud meetodit kasutades. Teise võimalusena võib antikehasid 20

valmistada rekombinantselt faagidisplei tehnoloogiat kasutades. Vt näiteks USA patente nr

5 565 332; 5 580 717; 5 733 743; ja 6 265 150; ja Winter et al., Annu. Rev. Immunol.

12:433–455 (1994). Alternatiivselt võib faagidisplei tehnoloogiat (McCafferty et al., Nature

348:552–553 (1990)) kasutada inimese antikehade ja antikeha fragmentide valmistamiseks

in vitro immuniseerimata doonoritelt pärit immunoglobuliini varieeruva (V) domeeni 25

geenivalikust. Selle tehnika kohaselt kloonitakse antikeha V-domeeni geenid raamistikku

kas filamentoosse bakteriofaagi, nagu näiteks M13 või fd suurema või väiksema kattevalgu

geeni ning demonstreeritakse funktsionaalse antikeha fragmentidena faagiosakese pinnal.

Kuna filamentoosne osake sisaldab faagi genoomi ühetüvelist DNA koopiat, annab antikeha

funktsionaalsetel omadustel põhinev selekteerimine tulemuseks ka selliste omadustega 30

antikeha kodeeriva geeni selekteerimise. Seega matkib faag osasid B-raku omadusi.

Faagidispleid võib teostada erinevates formaatides; ülevaate saamiseks vt näiteks allika

Johnson, Kevin S. ja Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564–571

42 EE-EP 1 957 106 B2

(1993). Faagidisplei jaoks võib kasutada mitmeid V-geeni segmentide allikaid. Clackson

et al., Nature 352:624–628 (1991) isoleerisid mitmekesise oksasolooni vastaste antikehade

maatriksi immuniseeritud hiirte põrnadest saadud V-geenide väikesest juhuslikult

kombineeritud pangast. Immuniseerimata inimdoonoritelt saadud V-geenide repertuaari

võib konstrueerida ning antikehasid mitmekesise antigeenide (sealhulgas iseeneslike 5

antigeenide) maatriksi suhtes võib isoleerida, järgides peamiselt tehnikaid, mida on

kirjeldatud allikates Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581–597 (1991), või Griffith et al., EMBO

J. 12:725–734 (1993). Loomuliku immuunvastuse puhul akumuleerivad antikeha geenid

mutatsioone kõrgel kiirusel (somaatiline hüpermutatsioon). Osad sisestatud muudatustest

annavad kõrgema afiinsuse ning B-rakud, millel on kõrge afiinsus pinna immunoglobuliini 10

suhtes, eelistatult replitseeritakse ja diferentseeritakse järgneva antigeeni väljakutse ajal.

Seda loomulikku protsessi saab matkida, kasutades tehnikat, mis on tuntud nimetusega

„ahela ümberpaigutamine”. Marks, et al., Bio/Technol. 10:779–783 (1992)). Selles

meetodis saab faagidispleist saadud „primaarsete” inimese antikehade afiinsust parandada,

asendades üksteise järel raske ja kerge ahela V-piirkonna geenid immuniseerimata 15

doonoritelt saadud V-domeeni geenide looduslikult esinevate variantide repertuaaridega.

See tehnika võimaldab toota antikehasid ja antikeha fragmente, mille afiinsused jäävad pM–

nM suurusjärku. Strateegiat väga suurte faagi antikeha repertuaaride valmistamiseks (tuntud

ka kui emapangad ehk nn the mother-of-all libraries) on kirjeldatud allikas Waterhouse

et al., Nucl. Acids Res. 21:2265–2266 (1993). Geenide ümberpaigutamist võib kasutada ka 20

närilise antikehadest inimese antikehade tuletamiseks, kus inimese antikehal on närilise

lähteantikehale sarnanevad afiinsused ja spetsiifilisused. Vastavalt sellele meetodile, mida

nimetatakse ka „epitoobi jäljendamiseks”, asendatakse faagidisplei tehnikaga saadud

närilise antikeha raske või kerge ahela V-domeeni geen inimese V-domeeni geeni

repertuaariga, luues seeläbi närilise-inimese kimäärid. Antigeenil selekteerimine annab 25

tulemuseks inimese varieeruvate piirkondade isoleerimise, mis suudavad taastada

funktsionaalse antigeeni sidumissaidi, st epitoop juhib (jäljendab) partneri valikut. Kui seda

protsessi korratakse ülejäänud närilise V-domeeni asendamiseks, siis saadakse selle

tagajärjel inimese antikeha (vt PCT publikatsiooni nr WO 93/06213, avaldatud 1. aprillil

1993). Erinevalt närilise antikehade traditsioonilisest humaniseerimisest CDRide siirdamise 30

teel pakub käesolev tehnika täielikult inimese antikehasid, millel ei ole ühtegi närilise

päritolu raamistikku ega CDR-jääke.

43 EE-EP 1 957 106 B2

[0120] Kuigi eelnev kirjeldus on seotud humaniseeritud antikehadega, on siiski ilmselge,

et käsitletud üldpõhimõtteid võib rakendada ka antikehade kohandamiseks, et kasutada neid

näiteks koertel, kassidel, primaatidel, hobustel ja veistel. Lisaks on ilmselge, et ühte või

mitut siin kirjeldatud antikeha humaniseerimise aspekti võib omavahel kombineerida,

näiteks CDRi siirdamist, raamistiku mutatsiooni ja CDRi mutatsiooni. 5

[0121] Antikehasid võib valmistada rekombinantselt, isoleerides kõigepealt antikehad ja

antikeha tootvad rakud peremeesloomadest, eraldades geenijärjestuse, ning kasutades seda

geenijärjestust antikeha rekombinantseks ekspresseerimiseks peremeesrakkudes (näiteks

CHO-rakkudes). Teine meetod, mida võib kasutada, on seotud antikeha järjestuse 10

ekspresseerimisega taimedes (näiteks tubakas) või transgeenses piimas. Meetodid

antikehade rekombinantseks ekspresseerimiseks taimedes või piimas on avaldatud. Vt

näiteks Peeters, et al., Vaccine 19:2756 (2001); Lonberg, N. ja D. Huszar, Int. Rev. Immunol

13:65 (1995); ja Pollock, et al., J Immunol Methods 231:147(1999). Meetodid antikehade

derivaatide, näiteks humaniseeritud, üheahelaliste jne antikehade valmistamiseks on tehnika 15

tasemes tuntud.

[0122] CGRP suhtes spetsiifiliste antikehade isoleerimiseks võib kasutada ka

immunoanalüüse ja voolutsütomeetrilisi sorteerimistehnikaid, nagu näiteks fluorestsents-

aktiveeritud rakusorteerimist (FACS). 20

[0123] Antikehad võivad olla seotud paljude erinevate tugiainetega. Tugiained võivad olla

aktiivsed ja/või inertsed. Hästi tuntud tugiainete näidete hulka kuuluvad polüpropüleen,

polüstüreen, polüetüleen, dekstraan, nailon, amülaasid, klaas, looduslikud ja modifitseeritud

tselluloosid, polüakrüülamiidid, agaroosid ja magnetiit. Käesoleva leiutise mõistes võib 25

selline tugiaine olla oma olemuselt lahustuv või lahustumatu. Antud valdkonna asjatundjad

teavad teisi antikehade sidumiseks sobivaid tugiaineid või nad on suutelised neid kindlaks

määrama rutiinseid katsetamismeetodeid kasutades. Osades teostustes sisaldab tugiaine

fragmenti, mille märklauaks on müokard (südamelihas).

30

[0124] Monoklonaalseid antikehi kodeerivat DNAd on lihtne isoleerida ja järjestada

tavapäraseid protseduure kasutades (kasutades näiteks oligonukleotiidi proove, mis

suudavad spetsiifiliselt seonduda geenidega, mis kodeerivad monoklonaalsete antikehad

44 EE-EP 1 957 106 B2

raskeid ja kergeid ahelaid). Sellise DNA eelistatud allikas on hübridoomi rakud. Kui DNA

on isoleeritud, võib selle paigutada ekspressioonivektoritesse (näiteks

ekspressioonivektoritesse, mida on kirjeldatud PCT publikatsiooni nr WO 87/04462), mis

seejärel transfekteeritakse peremeesrakkudesse, nagu näiteks E. coli rakkudesse, ahvilise

COS rakkudesse, hiina hamstri munasarja (CHO) rakkudesse või müeloomi rakkudesse, mis 5

muidu ei tooda immunoglobuliini valku, et saavutada monoklonaalsete antikehade

sünteesimine rekombinantsetes peremeesrakkudes. Vt näiteks PCT publikatsiooni nr WO

87/04462. Antikeha DNAd saab modifitseerida ka näiteks inimese raske ja kerge ahela

konstantsete domeenide kodeerimisjärjestuse asendamise teel homoloogsete närilise

järjestuste vastu, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851 (1984) või mitte-10

immunoglobuliini polüpeptiidi kogu või osa kodeerimisjärjestuse kovalentse sidumise teel

immunoglobuliini kodeerimisjärjestuse külge. Sellisel viisil valmistatakse „kimäärseid” või

„hübriidseid” antikehasid, millel on siin kirjeldatud CGRP-vastase monoklonaalse antikeha

seondumisspetsiifilisus.

15

[0125] Antikehadest tuletatud CGRP-vastaseid antagonist-antikehasid ja polüpeptiide saab

tuvastada või iseloomustada tehnika tasemes tuntud meetodeid kasutades, kus tuvastatakse

ja/või mõõdetakse CGRP bioloogilise aktiivsuse vähendamist, parandamist või

neutraliseerimist. Näiteks võib CGRP-vastast antagonist-antikeha tuvastada ka

kandidaataine CGRPga inkubeerimise teel ning ühe või mitme alljärgneva omaduse 20

jälgimise teel: (a) seondub CGRPga; (b) blokeerib CGRP seondumist selle retseptori(te)ga;

(c) blokeerib või vähendab CGRP retseptori aktiveerimist (sealhulgas cAMP aktiveerimist);

(d) inhibeerib CGRP bioloogilist aktiivsust või CGRP signaliseerimisega vahendatud

pärisuunalisi radasid; (e) ennetab, leevendab või ravib mis tahes peavalu aspekti (näiteks

migreeni); (f) suurendab CGRP kõrvaldamist; ja (g) inhibeerib (vähendab) CGRP 25

sünteesimist, tootmist või vabanemist. Osades teostustes tuvastatakse CGRP-vastane

antagonist-antikeha või polüpeptiid kandidaataine CGRPga inkubeerimise teel ning

seondumist ja/või sellega kaasneva CGRP bioloogilise aktiivsuse vähendamise või

neutraliseerimise jälgimise teel. Seondumisanalüüsi võib teostada puhastatud CGRP

polüpeptiidi(de) või rakkudega, mis loomulikult ekspresseerivad CGRP polüpeptiidi 30

(polüpeptiide) või mida on transfekteeritud, et nad ekspresseeriksid CGRP polüpeptiidi

(polüpeptiide). Ühes teostuses on seondumisanalüüs konkureeriv seondumisanalüüs, kus

hinnatakse kandidaat-antikeha suutlikkust konkureerida tuntud CGRP-vastase agonistiga

45 EE-EP 1 957 106 B2

CGRP sidumise osas. Seda analüüsi võib teostada erinevates formaatides, sealhulgas ELISA

formaadis. Teistes teostustes tuvastatakse CGRP-vastane antagonist-antikeha kandidaataine

CGRPga inkubeerimise teel ja seondumise ja sellega kaasneva raku pinnal ekspresseeritud

CGRP retseptori aktiveerimise inhibeerimise jälgimise teel.

5

[0126] Esialgse tuvastamise järel võib CGRP-vastase antagonist-antikeha kandidaadi

aktiivsust edasi kinnitada ja viimistleda bioanalüüsidega, mida kasutatakse suunatud

bioloogiliste aktiivsuste testimiseks. Alternatiivselt võib bioanalüüse kasutada kandidaatide

vahetuks skriinimiseks. Näiteks soodustab CGRP mitmeid mõõdetavaid muudatusi

reageerivates rakkudes. Nende hulka kuulub mittepiiravalt cAMP stimuleerimine rakus 10

(näiteks SK-N-MC rakkudes). Antagonisti aktiivsuse mõõtmiseks võib samuti kasutada

loommudeleid, nagu näiteks roti jäsemenärvi stimuleerimisega esile kutsutud naha

vasodilatatsiooni mõõtmist. Escott et al., Br. J. Pharmacol. 110: 772–776, 1993. Peavalude

(nagu näiteks migreeni) loommudeleid võib lisaks kasutada antagonist-antikehade või

polüpeptiidide efektiivsuse testimiseks. Reuter, et al., Functional Neurology (15) Suppl. 3, 15

2000. Osasid meetodeid CGRP-vastase antagonist-antikeha või polüpeptiidi tuvastamiseks

ja iseloomustamiseks on üksikasjalikult kirjeldatud lisatud näidetes.

[0127] CGRP-vastaste antagonist-antikehade iseloomustamiseks võib kasutada tehnika

tasemes hästi tuntud meetodeid. Üks meetod seisneb näiteks epitoobi tuvastamises, millega 20

see seondub, ehk „epitoobi kaardistamises”. Tehnika tasemes tuntakse paljusid meetodeid,

mida kasutatakse valkudel epitoopide asukoha kaardistamiseks ja iseloomustamiseks,

sealhulgas antikeha-antigeeni kompleksi kristallstruktuuri lahendamine,

konkurentsianalüüsid, geenifragmendi ekspressiooni analüüsid ja sünteetilised

peptiidipõhised analüüsid, mida on kirjeldatud näiteks allika Harlow ja Lane, Using 25

Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring

Harbor, New York, 1999, 11. peatükis. Täiendavas näites võib epitoobi kaardistamist

kasutada järjestuse kindlaks määramiseks, millega CGRP-vastane antagonist-antikeha

seondub. Epitoobi kaardistamine on kaubanduslikult kättesaadav erinevatest allikatest,

näiteks ettevõttest Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, Madalmaad). 30

Nimetatud epitoop võib olla lineaarne epitoop, st sisalduda aminohapete ühel sirgel, või

konformatsiooniline epitoop, mis on moodustatud aminohapete kolmemõõtmelise

vastastiktoimega, mis ei pruugi tingimata sisalduda ühel sirgel. Varieeruva pikkusega

46 EE-EP 1 957 106 B2

(näiteks vähemalt 4 kuni 6 aminohappe pikkuseid) peptiide võib isoleerida või sünteesida

(näiteks rekombinantselt) ning kasutada CGRP-vastase antagonist-antikehaga teostatavate

seondumisanalüüside jaoks. Teises näites võib epitoobi, millega CGRP-vastane antagonist-

antikeha seondub, kindlaks määrata süstemaatilise skriinimise teel, kasutades CGRP

järjestusest saadud kattuvaid peptiide ja määrates seondumise CGRP-vastase antagonist-5

antikeha poolt. Vastavalt geenifragmendi ekspresseerimise analüüsile fragmenteeritakse

CGRPd kodeeriv avatud lugemisraam kas juhuslikult või spetsiifiliste geneetiliste

konstruktsioonidega ning määratakse kindlaks CGRP ekspresseeritud fragmentide

reaktiivsus testitava antikehaga. Need geenifragmendid võivad näiteks olla toodetud

PCRiga ning seejärel transkribeeritud ja transleeritud valguks in vitro radioaktiivsete 10

aminohapete juuresolekul. Seejärel määratakse antikeha seondumine radioaktiivselt

märgistatud CGRP fragmentidega kindlaks immunosadestamise ja geelelektroforeesi teel.

Teatavate epitoopide kindaks määramiseks võib kasutada ka faagiosakeste pinnal

kuvatavate juhuslike suuri peptiidijärjestuste panku (faagipanku). Alternatiivselt võib

kattuvate peptiidifragmentide määratletud panka testida testitava antikehaga seondumise 15

osas lihtsa seondumisanalüüsiga. Täiendavas näites võib teostada antigeeni siduva domeeni

mutageneesi, domeenide vahetamise katseid ja alaniini skaneerimise mutageneesi, et

tuvastada jäägid, mis on epitoobi sidumiseks nõutavad, piisavad ja/või vajalikud. Näiteks

võib domeenide vahetamise katsete teostamiseks kasutada mutant-CGRPd, kus CGRP

polüpeptiidi erinevad fragmendid on asendatud (vahetatud) lähedases suguluses, kuid 20

antigeeniliselt erinevast valgust (nagu näiteks neurotrofiini valguperekonna teiselt liikmelt)

pärit järjestustega. Antikeha mutant-CGRPga seondumise hindamisel võib hinnata

konkreetse CGRP fragmendi olulisust antikeha seondumise jaoks.

[0128] Veel üks meetod, mida võib kasutada CGRP-vastase antagonist-antikeha 25

iseloomustamiseks, seisneb konkurentsianalüüside kasutamises teiste antikehadega, mis

teadaolevalt seonduvad sama antigeeniga, st erinevad fragmendid CGRPl, et määrata

kindlaks, kas CGRP-vastane antagonist-antikeha seondub sama epitoobiga kui teised

antikehad. Konkurentsianalüüsid on antud valdkonna asjatundjatele hästi tuntud.

30

[0129] Ekspressioonivektorit võib kasutada CGRP-vastase antagonist-antikeha vahetuks

ekspresseerimiseks. Antud valdkonna asjatundjale on ekspressioonivektorite manustamine

tuttav, et saavutada eksogeense valgu ekspresseerimine in vivo. Vt näiteks USA patendid nr

47 EE-EP 1 957 106 B2

6 436 908; 6 413 942; ja 6 376 471. Ekspressioonivektorite manustamine hõlmab paikset

või süsteemset manustamist, sealhulgas süstimist, suukaudset manustamist, osakeste

püstolit või kateetri abil manustamine, ning topikaalne manustamine. Veel ühes teostuses

manustatakse ekspressioonivektorit vahetult sümpateetilisse tüvesse või närvikeskusesse

või pärgarterisse, kojasse, vatsakesse või perikardi (südamepauna). 5

[0130] Samuti võib kasutada ekspressioonivektorit sisaldavate terapeutiliste koostiste või

subgenoomsete polünukleotiidide suunatud sisestamist. Retseptori vahendatud DNA

sisestamise tehnikaid on kirjeldatud näiteks allikates Findeis et al., Trends Biotechnol.

(1993) 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene 10

Transfer (J.A. Wolff, toim.) (1994); Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu et al., J.

Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655; Wu

et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338. Polünukleotiidi sisaldavaid terapeutilisi koostisi

manustatakse koguses, mis jääb geeniteraapia protokollis lokaalsel manustamisel 100 ng

kuni ligikaudu 200 mg DNA vahele. Geeniteraapia protokolli ajal võib kasutada ka DNA 15

kontsentratsioone, mis on ligikaudu 500 ng kuni ligikaudu 50 mg, ligikaudu 1 µg kuni

ligikaudu 2 mg, ligikaudu 5 µg kuni ligikaudu 500 µg ja ligikaudu 20 µg kuni ligikaudu 100

µg. Terapeutiliste polünukleotiidide ja polüpeptiidide sisestamiseks võib kasutada geeni

sisestamise vehiikuleid. Geeni sisestamise vehiikul võib olla viiruse või mitteviiruse

päritolu (vt üldiselt publikatsioone Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51; Kimura, 20

Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185; ja

Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148). Selliste kodeerimisjärjestuste ekspresseerimise

esile kutsumiseks võib kasutada endogeenseid imetaja või heteroloogilisi promootoreid.

Kodeerimisjärjestuse ekspresseerimine võib olla konstitutiivne või reguleeritud.

25

[0131] Viirusel põhinevad vektorid soovitud polünukleotiidi sisestamiseks ja

ekspresseerimiseks soovitud rakus on tehnika tasemes hästi tuntud. Viirustel põhinevate

vehiikulite näidete hulka kuuluvad rekombinantsed retroviirused (vt näiteks PCT

publikatsioone nr WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO

93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; USA patente nr 5 219 740 ja 4 777 127; GB 30

patenti nr 2 200 651; ja EP patenti nr 0 345 242), alfaviirusel põhinevaid vektoreid (näiteks

Sindbis viiruse vektorid, Semiliki Forest viiruse (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), Ross

River viiruse (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) ja Venezuela Hobuste Entsefaliidi viiruse

48 EE-EP 1 957 106 B2

(ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)) ja adeno-seotud

viiruse (AAV) vektorid (vt näiteks PCT publikatsioone nr WO 94/12649, WO 93/03769;

WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 ja WO 95/00655). Samuti võib kasutada

surmatud adenoviirusega seotud DNA manustamist, mida on kirjeldatud allikas Curiel,

Hum. Gene Ther. (1992) 3:147. 5

[0132] Samuti võib kasutada viirusega mitteseotud sisestamisvehiikuleid ja meetodeid,

sealhulgas mittepiiravalt polükatioonilist kondenseeritud DNA-d, mis on seotud või ei ole

seotud surmatud adenoviirusega (vt näiteks Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147);

ligandiga seotud DNAd (vt näiteks Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985); eukarüootseid 10

sisestamisvehiikuleid-rakke (vt näiteks USA patenditaotlust nr 5 814 482; PCT

publikatsioone nr WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; ja WO 97/42338) ja

nukleiinse laengu neutraliseerimist või ühendamist rakumembraanidega. Samuti võib

kasutada nn paljast DNAd. Palja DNA sisestamismeetodeid on kirjeldatud PCT

publikatsioonis nr WO 90/11092 ja USA patendis nr 5 580 859. Liposoome, mis võivad 15

toimida geeni sisestamise vehiikulitena, on kirjeldatud USA patendis nr 5 422 120; PCT

publikatsioonides nr WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; ja EP 0524968.

Täiendavaid lähenemisviise on kirjeldatud allikates Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411

ja Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581.

20

C. Antikeha G1 ning seotud antikehad, polüpeptiidid, polünukleotiidid, vektorid ja

peremeesrakud

[0133] Leiutis võib kasutada kompositsioone, sealhulgas farmatseutilisi koostisi, mis

sisaldavad antikeha G1 ja selle tabelis 6 välja toodud variante või antikehast G1 või selle 25

tabelis 6 välja toodud variantidest tuletatud polüpeptiidi; ning G1 või selle variante või

polüpeptiidi kodeerivaid järjestusi sisaldavaid polünukleotiide. Käesolevas sisaldavad

koostised ühte või mitut antikeha või polüpeptiidi (mis võib olla antikeha, kuid ei pruugi),

mis seonduvad CGRPga ja/või ühte või mitut polünukleotiidi, mis sisaldavad ühte või mitut

antikeha või polüpeptiidi, mis seonduvad CGRPga, kodeerivaid järjestusi. Need koostised 30

võivad lisaks sisaldada sobivaid abiaineid, nagu näiteks farmatseutiliselt aktsepteeritavaid

abiaineid, sealhulgas puhvreid, mis on tehnika tasemes hästi tuntud.

49 EE-EP 1 957 106 B2

[0134] Leiutisekohastel CGRP-vastastel antagonistlikel antikehadel võib olla üks või enam

järgmistest tunnustest: (a) seondub CGRPga; (b) blokeerib CGRP seondumist selle

retseptori(te)ga; (c) blokeerib või vähendab CGRP retseptori aktiveerimist (sealhulgas

cAMP aktiveerimist); (d) inhibeerib CGRP bioloogilist aktiivsust või CGRP

signaliseerimisega vahendatud pärisuunalisi radasid; (e) ennetab, leevendab või ravib mis 5

tahes peavalu aspekti (näiteks migreeni); (f) suurendab CGRP kõrvaldamist; ja (g)

inhibeerib (vähendab) CGRP sünteesimist, tootmist või vabanemist.

[0135] Sellest tulenevalt pakub käesolev leiutiskirjeldus mis tahes alljärgnevatest või

koostisi (sealhulgas farmatseutilisi koostisi), mis sisaldavad mis tahes alljärgnevatest: (a) 10

antikeha G1 või selle tabelis 6 välja toodud variandid; (b) antikeha G1 või selle tabelis 6

välja toodud variantide fragment või piirkond; (c) antikeha G1 või selle tabelis 6 välja

toodud variantide kerge ahel; (d) antikeha G1 või selle tabelis 6 välja toodud variantide

raske ahel; (e) üks või mitu varieeruvat piirkonda antikeha G1 või selle tabelis 6 välja toodud

variantide kergest ahelast ja/või raskest ahelast; (f) antikeha G1 või selle tabelis 6 välja 15

toodud variantide üks või mitu CDRi (üks, kaks, kolm, neli, viis või kuus CDRi); (g) CDR

H3 antikeha G1 raskest ahelast; (h) CDR L3 antikeha G1 või selle tabelis 6 välja toodud

variantide kergest ahelast; (i) kolm CDRi antikeha G1 või selle tabelis 6 välja toodud

variantide kergest ahelast; (j) kolm CDRi antikeha G1 või selle tabelis 6 välja toodud

variantide raskest ahelast; (k) kolm CDRi antikeha G1 või selle tabelis 6 välja toodud 20

variantide kergest ahelast ja kolm CDRi raskest ahelast; ning (l) antikeha, mis sisaldab mis

tahes ühte punktidest (b) kuni (k). Käesolev leiutis pakub ka polüpeptiide, mis sisaldavad

mis tahes ühte või mitut eespool nimetatutest.

[0136] Antikeha G1 CDRi osi (sealhulgas Chothia ja Kabati CDRid) on skemaatiliselt 25

kujutatud joonisel FIG 5. CDR-piirkondade kindlaks määramine kuulub tehnika tasemesse.

Siinkohal on selge, et osades teostustes võivad CDRid olla Kabati ja Chothia CDRide

kombinatsioon (tähistatakse ka nimetusega „kombineeritud CDRid” või „laiendatud

CDRid”). Osades teostustes on CDRid Kabati CDRid. Osades teostustes on CDRid Chothia

CDRid. Teisisõnu võivad CDRid teostuse puhul, mis sisaldavad rohkem kui ühte CDRi, 30

olla mis tahes Kabati, Chothia, kombineeritud CDRid või nende kombinatsioonid.

50 EE-EP 1 957 106 B2

[0137] Osades teostustes pakub käesolev leiutiskirjeldus polüpeptiidi (mis võib olla

antikeha, kuid ei pruugi), mis sisaldab vähemalt ühte CDRi, vähemalt kahte, vähemalt

kolme, või vähemalt nelja, vähemalt viit või kõiki kuut CDRi, mis on sisuliselt identsed

vähemalt ühe G1 või selle tabelis 6 välja toodud variantide CDRiga, vähemalt kahe,

vähemalt kolme, vähemalt nelja, vähemalt viie või kõigi kuue CDRiga. Teised teostused 5

hõlmavad antikehasid, millel on vähemalt kaks, kolm, neli, viis või kuus CDRi, mis on

sisuliselt identsed vähemalt kahe, kolme, nelja, viie või kuue G1 või G1st tuletatud CDRiga.

Osades teostustes on vähemalt üks, kaks, kolm, neli, viis või kuus CDRi vähemalt ligikaudu

85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% või 99% ulatuses identsed

vähemalt ühe, kahe, kolme, nelja, viie või kuue G1 või selle tabelis 6 välja toodud variantide 10

CDRiga. Siinkohal tuleb mõista, et käesoleva leiutise mõistes säilitatakse üldiselt

seondumisspetsiifilisust ja/või üldist aktiivsust, kuigi aktiivsuse ulatus võib varieeruda

võrreldes G1 ja selle tabelis 6 välja toodud variantidega (võib olla suurem või väiksem).

[0138] Käesolevas leiutises pakutakse ka polüpeptiidi (mis võib olla antikeha, aga ei 15

pruugi), mis sisaldab G1 või selle tabelis 6 välja toodud variantide aminohappejärjestust,

millel on mis tahes alljärgnevatest: vähemalt 5 järjestikust aminohapet, vähemalt 8

järjestikust aminohapet, vähemalt ligikaudu 10 järjestikust aminohapet, vähemalt ligikaudu

15 järjestikust aminohapet, vähemalt ligikaudu 20 järjestikust aminohapet, vähemalt

ligikaudu 25 järjestikust aminohapet, vähemalt ligikaudu 30 järjestikust aminohapet G1 või 20

selle tabelis 6 välja toodud variantide järjestusest, kus vähemalt 3 aminohapet on G1 (joonis

FIG 5) või selle tabelis 6 välja toodud variantide varieeruvast piirkonnast. Ühes teostuses

on varieeruv piirkond pärit G1 kergest ahelast. Veel ühes teostuses on varieeruv piirkond

pärit G1 raskest ahelast. Näitlikul polüpeptiidil on järjestikune aminohape (eespool

kirjeldatud pikkused) G1 raske ja kerge ahela varieeruvatest piirkondadest. Teises teostuses 25

on 5 (või rohkem) järjestikust aminohapet joonisel FIG 5 kujutatud G1 komplementaarsust

määravast piirkonnast (CDRist). Osades teostustes on järjestikused aminohapped G1

varieeruvast piirkonnast.

[0139] Käesolev leiutiskirjeldus pakub ka mis tahes selliste antikehade või polüpeptiidide 30

valmistamise meetodeid. Käesoleva leiutise kohaseid antikehasid võib valmistada tehnika

tasemes tuntud protseduuridega. Polüpeptiide võib valmistada antikehade proteolüütilise

või muu degradatsiooniga, rekombinantsete meetoditega (st üksikud või liitpolüpeptiidid)

51 EE-EP 1 957 106 B2

vastavalt eespool kirjeldatule või keemilise sünteesiga. Antikehade polüpeptiide, eelkõige

lühemaid, kuni 50 aminohapet sisaldavaid polüpeptiide saab sobivalt valmistada keemilise

sünteesi teel. Keemilise sünteesi meetodid on tehnika tasemes tuntud ning need on

kaubanduslikult kättesaadavad. Näiteks võib antikeha toota automatiseeritud polüpeptiidi

sünteesijaga, mis kasutab tahke faasi meetodit. Vt ka USA patente nr 5 807 715; 4 816 567; 5

ja 6 331 415.

[0140] Alternatiivis võib antikehasid valmistada rekombinantselt tehnika tasemes tuntud

protseduure kasutades. Ühes teostuses sisaldab polünukleotiid antikeha G1 raske ahela

ja/või kerge ahela varieeruvaid piirkondi kodeerivat järjestust, mis on esitatud järjestustega 10

SEQ ID NO:9 ja SEQ ID NO:10. Veel ühes teostuses sisaldab polünukleotiid järjestust, mis

on esitatud järjestustega SEQ ID NO:9 ja SEQ ID NO:10, mis on kloonitud ühte või

mitmesse vektorisse ekspresseerimiseks või levitamiseks. Huvipakkuvat antikeha

kodeerivat järjestust võib säilitada peremeesrakus sisalduvas vektoris ning seda

peremeesrakku võib seejärel laiendada ja külmutada tulevaseks kasutamiseks. Vektoreid 15

(sealhulgas ekspressioonivektoreid) ja peremeesrakke on siin edaspidi kirjeldatud.

[0141] Näiteks võib bispetsiifiliste antikehade (monoklonaalsed antikehad, millel on

seondumisspetsiifilisused vähemalt kahe erineva antigeeni suhtes) valmistamiseks kasutada

siin kirjeldatud antikehi. Meetodid bispetsiifiliste antikehade valmistamiseks on tehnika 20

tasemes tuntud (vt näiteks Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210).

Traditsiooniliselt põhines bispetsiifiliste antikehade rekombinantne tootmine kahe

immunoglobuliini raske ahela-kerge ahela paari samaaegsel ekspresseerimisel, kus

nimetatud kahel raskel ahelal olid erinevad spetsiifilisused (Millstein ja Cuello, 1983,

Nature 305, 537–539). 25

[0142] Vastavalt ühele bispetsiifiliste antikehade valmistamise lähenemisviisile

ühendatakse antikeha soovitud seondumisspetsiifilisustega varieeruvad domeenid

(antikeha-antigeeni sidumissaidid) immunoglobuliini konstantse domeeni järjestustega.

Ühendamine teostatakse eelistatult immunoglobuliini raske ahela konstantse piirkonnaga, 30

mis sisaldab vähemalt osa liigend-, CH2- ja CH3-piirkonnast. Eelistatud on raske ahela

konstantse piirkonna (CH1), mis sisaldab kerge ahela sidumiseks vajalikku saiti, olemasolu

vähemalt ühes ühendamises. Immunoglobuliini raske ahela ühendamisi ja soovi korral

52 EE-EP 1 957 106 B2

immunoglobuliini kerge ahela ühendamisi kodeerivad DNAd sisestatakse eraldi

ekspressioonivektoritesse ning neid transfekteeritakse samaaegselt sobivasse

peremeesorganismi. See annab suurepärase paindlikkuse kolme polüpeptiidi fragmendi

vastastikuste proportsioonide kohandamisel teostustes, kui kolme konstruktsioonis

kasutatud polüpeptiidahela ebavõrdsed suhtarvud annavad optimaalse saagise. Kuid on 5

võimalik sisestada kahe või kõigi kolme polüpeptiidahela kodeerivad järjestused ühte

ekspressioonivektorisse, kui vähemalt kahe võrdsetes suhtarvudes polüpeptiidahela

ekspresseerimine annab tulemuseks kõrge saagise või kui need suhtarvud ei oma erilist

tähtsust.

10

[0143] Ühes lähenemisviisis koosnevad bispetsiifilised antikehad ühelt poolt esimese

seondumisspetsiifilisusega hübriidse immunoglobuliini raskest ahelast ja teiselt poolt

hübriidse immunoglobuliini raske ahela-kerge ahela paarist (mis pakub teist

seondumisspetsiifilisust). Selline asümmeetriline struktuur, kus immunoglobuliini kerge

ahel on ainult bispetsiifilise molekuli ühes pooles, lihtsustab soovitud bispetsiifilise ühendi 15

eraldamist soovimatutest immunoglobuliini ahela kombinatsioonidest. Seda lähenemisviisi

on kirjeldatud PCT publikatsioonis nr WO 94/04690, mis avaldati 3. märtsil 1994.

[0144] Käesoleva leiutise ulatusse kuuluvad ka heterokonjugaat-antikehad, mis sisaldavad

kahte kovalentselt ühendatud antikeha. Selliseid antikehasid on kasutatud immuunsüsteemi 20

rakkude suunamiseks soovimatute rakkude vastu (USA patent nr 4 676 980), ja HIV-

infektsiooni ravimiseks (PCT patenditaotluse publikatsioonid nr WO 91/00360 ja WO

92/200373; EP 03089). Heterokonjugaat-antikehade valmistamiseks võib kasutada mis

tahes tavapäraseid ristsidumise meetodeid. Sobivad ristsidumisagendid ja -tehnikad on

tehnika tasemes hästi tuntud ning neid on kirjeldatud USA patendis nr 4 676 980. 25

[0145] Kimäärseid või hübriidseid antikehi saab samuti valmistada in vitro, kasutades

selleks tuntud sünteetilise valgukeemia meetodeid, sealhulgas selliseid, mis hõlmavad

ristsidumise agente. Näiteks võib immunotoksiinide konstrueerimiseks kasutada

disulfiidsideme vahetamise reaktsiooni või tioeetersideme moodustamist. Selleks 30

eesmärgiks sobivate reagentide näidete hulka kuuluvad iminotiolaat ja metüül-4-

merkaptobutüürimidaat.

53 EE-EP 1 957 106 B2

[0146] Humaniseeritud antikeha valmistamiseks, mis sisaldab ühte või mitut antikeha G1

või selle tabelis 6 välja toodud variandi CDRi või ühte või mitut CDRi, mis on tuletatud

antikehast G1 või selle tabelis 6 välja toodud variantidest, võib kasutada mis tahes tehnika

tasemes tuntud meetodit. Näiteks võib monoklonaalse antikeha humaniseerimiseks

kasutada nelja üldist etappi. 5

[0147] Käesolev leiutis hõlmab antikeha G1 või selle tabelis 6 välja toodud variantide

modifikatsioone, sealhulgas funktsionaalselt ekvivalentseid antikehi, mis ei mõjuta

märkimisväärselt nende omadusi, ning variante, millel on parandatud või vähendatud

aktiivsus ja/või afiinsus. Näiteks võib antikeha G1 või selle tabelis 6 välja toodud variantide 10

aminohappejärjestust muteerida, et saada antikeha, millel on soovitud seondumisafiinsus

CGRP suhtes. Polüpeptiidide modifitseerimine on tehnika tasemes rutiinne praktika ning

seda ei ole vaja siin üksikasjalikult kirjeldada. Polüpeptiidide modifitseerimise näited on

esitatud lisatud näidetes. Modifitseeritud polüpeptiidide näidete hulka kuuluvad

polüpeptiidid, mis hõlmavad aminohappejääkide konservatiivseid asendusi, aminohapete 15

ühte või mitut deletsiooni või lisandust, mis ei muuda märkimisväärselt kahjulikult

funktsionaalset aktiivsust, või keemiliste analoogide kasutamist.

[0148] Aminohappejärjestuse insertsioonide hulka kuuluvad amino- ja/või karboksüülotsa

ühendamised, mis ulatuvad pikkuse poolest ühest jäägist kuni sadat või enamat jääki 20

sisaldavate polüpeptiidideni, ning samuti ühe või mitme aminohappejäägi järjestusesisesed

insertsioonid. Otste insertsioonide näidete hulka kuuluvad N-otsa metionüüli jäägiga

antikeha või epitoobi märgisega ühendatud antikeha. Antikeha molekuli teiste insertsiooni

variantide hulka kuuluvad ensüümi ühendamine antikeha N- või C-otsaga või polüpeptiid,

mis suurendab antikeha seerumi pooleluiga. 25

[0149] Asendatud variantides on antikeha molekulist eemaldatud vähemalt üks

aminohappejääk ja selle asemele on sisestatud teistsugune jääk. Asendusliku mutageneesi

osas suurimat huvi pakkuvate saitide hulka kuuluvad hüpervarieeruvad piirkonnad, kuid

samuti kaalutakse FR muutmisi. Konservatiivsed asendused on välja toodud tabelis 1 tulbas 30

„Konservatiivsed asendused”. Kui selliste asenduste tulemuseks on muutus bioloogilises

aktiivsuses, siis võib teha veelgi olulisemaid muudatusi, mis on esitatud tabelis 1 tulbas

54 EE-EP 1 957 106 B2

„Näitlikud asendused”, või vastavalt edaspidi allpool kirjeldatule viitega aminohapete

klassidele, ning neid produkte võib skriinida.

Tabel 1. Aminohappe asendused

Algne jääk Konservatiivsed asendused Näitlikud asendused

Ala (A) Val Val; Leu; Ile

Arg (R) Lys Lys; Gin; Asn

Asn (N) Gln Gln; His; Asp, Lys; Arg

Asp (D) Glu Glu; Asn

Cys (C) Ser Ser; Ala

Gln (Q) Asn Asn; Glu

Glu (E) Asp Asp; Gin

Gly (G) Ala Ala

His (H) Arg Asn; Gln; Lys; Arg

Ile (I) Leu Leu; Val; Met; Ala; Phe; norleutsiin

Leu (L) Ile Norleutsiin; Ile; Val; Met; Ala; Phe

Lys (K) Arg Arg; Gln; Asn

Met (M) Leu Leu; Phe; Ile

Phe (F) Tyr Leu; Val; Ile; Ala; Tyr

Pro (P) Ala Ala

Ser (S) Thr Thr

Thr (T) Ser Ser

Trp (W) Tyr Tyr; Phe

Tyr (Y) Phe Trp; Phe; Thr; Ser

Val (V) Leu Ile; Leu; Met; Phe; Ala; norleutsiin

5

55 EE-EP 1 957 106 B2

[0150] Antikeha bioloogiliste omaduste oluliseks modifitseerimiseks selekteeritakse

asendused, mis erinevad märkimisväärselt oma toime poolest (a) polüpeptiidi karkassi

struktuuri säilitamisele asenduse piirkonnas, näiteks lehe- või vedrukujulise

konformatsioonina, (b) molekuli laengu või hüdrofoobsuse säilitamisele märklaud-saidi

juures, või (c) külgahela mahu säilitamisele. Looduslikult esinevad jäägid jagatakse 5

rühmadesse külgahelate tavaliste omaduste alusel:

(1) mittepolaarsed jäägid: norleutsiin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) laenguta polaarsed jäägid: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) happelised (negatiivselt laetud) jäägid: Asp, Glu;

(4) aluselised (positiivselt laetud) jäägid: Lys, Arg; 10

(5) ahela suundumust mõjutavad jäägid: Gly, Pro; ja

(6) aromaatsed jäägid: Trp, Tyr, Phe, His.

[0151] Mittekonservatiivsete asenduste tegemiseks vahetatakse ühe nimetatud klassi liige

teise klassi liikme vastu. 15

[0152] Samuti võib asendada mis tahes tsüsteiinijäägi, mis ei osale antikeha nõuetekohase

konformatsiooni säilitamises, üldiselt seriiniga, et parandada molekuli

oksüdatsioonistabiilsust ja vältida ebatüüpilist ristsidumist. Teisest küljest võib antikehale

lisada tsüsteiini sideme(id), et parandada selle stabiilsust, eelkõige sellisel juhul, kui 20

antikeha on antikeha fragment, nagu näiteks Fv fragment.

[0153] Aminohappe modifikatsioonid võivad ulatuda ühe või enama aminohappe

muutmisest või modifitseerimisest kuni piirkonna, nagu näiteks varieeruva piirkonna

täieliku ümberkujundamiseni. Varieeruvas piirkonnas tehtavad muudatused võivad muuta 25

seondumisafiinsust ja/või spetsiifilisust. Osades teostustes tehakse CDR domeenis mitte

rohkem kui üks kuni viis konservatiivset aminohappe asendust. Teistes teostustes tehakse

CDR domeenis mitte rohkem kui üks kuni kolm konservatiivset aminohappe asendust. Veel

osades teistes teostustes on CDR domeen CDR H3 ja/või CDR L3.

30

[0154] Modifikatsioonide hulka kuuluvad ka glükosüleeritud ja mitteglükosüleeritud

polüpeptiidid, samuti muude translatsioonijärgsete modifikatsioonidega polüpeptiidid, nagu

näiteks erinevate suhkrutega glükosüleerimine, atsetüülimine ja fosforüülimine.

56 EE-EP 1 957 106 B2

Antikehasid glükosüleeritakse konserveerunud positsioonidel nende konstantsetes

piirkondades (Jefferis ja Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111–128; Wright ja Morrison,

1997, TibTECH 15:26–32). Immunoglobuliinide oligosahhariidi külgahelad mõjutavad

valgu funktsiooni (Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311–1318; Wittwe ja Howard,

1990, Biochem. 29:4175–4180) ning glükovalgu osade molekulisisest vastastiktoimet, mis 5

võib avaldada mõju konformatsiooni ja olla esitatud glükovalgu kolmemõõtmelisel pinnal

(Hefferis ja Lund, supra; Wyss ja Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409–416).

Oligosahhariidide ülesandeks võib olla ka suunata antud glükovalku konkreetsete

äratundmise struktuuride alusel teatavate molekulide vastu. Antikehade glükosüleerimine

mõjutab teadaolevalt ka antikehast sõltuvat rakulist tsütotoksilisust (ADCC). Eelkõige on 10

teatatud, et β(1,4)-N-atsetüülglükosaminüültransferaas III (GnTIII) (GlcNAc poolitamist

katalüseeriv glükosüültransferaas) tetratsükliini-reguleeritud ekspressiooniga CHO

rakkudel on paranenud ADCC toime (Umana et al., 1999, Mature Biotech. 17:176–180).

[0155] Antikehade glükosüleerimine on tüüpiliselt ka N-seotud või O-seotud. N-seotud 15

glükosüleerimine osutab süsivesikufragmendi kinnitamisele aspargiinijäägi külgahela

külge. Äratundmisjärjestused süsivesikufragmendi ensümaatiliseks kinnitamiseks

aspargiini külgahela külge on tripeptiidijärjestused aspargiin-X-seriin, aspargiin-X-treoniin

ja aspargiin-X-tsüsteiin, kus X on mis tahes aminohape (v.a proliin). Seega loob ükskõik

millise nimetatud tripeptiidijärjestuse olemasolu polüpeptiidis potentsiaalse 20

glükosüleerimissaidi. O-seotud glükosüleerimine osutab ühe N-atsetüülgalaktoosamiini

suhkru (galaktoosi või ksüloosi) kinnitamisele hüdroksüaminohappe külge, milleks on

kõige tavalisemalt seriin või treoniin, kuigi kasutada võib ka 5-hüdroksüproliini või 5-

hüdroksülüsiini.

25

[0156] Antikehale glükosüleerimissaitide lisamine saavutatakse sobivalt

aminohappejärjestuse muutmise teel selliselt, et see sisaldab ühte või mitut eespool

kirjeldatud tripeptiidijärjestust (N-seotud glükosüleerimissaitide jaoks). Muudatusi on

võimalik teha ka ühe või mitme seriini- või treoniinijäägi lisamisega algsele antikeha

järjestusele või nendega asendamise teel (O-seotud glükosüleerimissaitide jaoks). 30

[0157] Antikehade glükosüleerimismustrit võib muuta ka selliselt, et seeläbi ei muudeta

nende aluseks olevat nukleotiidijärjestust. Glükosüleerimine sõltub üsna suurel määral

57 EE-EP 1 957 106 B2

antikeha ekspresseerimiseks kasutatud peremeesrakust. Kuna rakutüüp, mida kasutatakse

rekombinantsete glükovalkude, näiteks antikehade ekspresseerimiseks potentsiaalsete

ravimitena, on harva looduslik rakk, siis võib eeldada variatsioone antikehade

glükosüleerimismustris (vt näiteks Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062–9070).

5

[0158] Lisaks peremeesrakkude valikule kuuluvad antikehade rekombinantse tootmise ajal

toimuvat glükosüleerimist mõjutavate tegurite hulka kasvurežiim, söötme formulatsioon,

kultuuri tihedus, oksügenisatsioon, pH, puhastamisskeemid jms. Konkreetses

peremeesorganismis saavutatud glükosüleerimismustri muutmiseks on välja pakutud

erinevaid meetodeid, sealhulgas teatavate oligosahhariidide tootmises osalevate ensüümide 10

sisestamist või üleekspresseerimist (USA patendid nr 5 047 335; 5 510 261 ja 5 278 299).

Glükosüleerimist või teatavaid glükosüleerimise tüüpe saab glükovalgust ensümaatiliselt

eemaldada, kasutades selleks näiteks endoglükosidaasi H (Endo H), N-glükosidaasi F,

endoglükosidaasi F1, endoglükosidaasi F2, endoglükosidaasi F3. Lisaks saab rekombinatset

peremeesrakku geneetiliselt töödelda, et see oleks teatavat tüüpi polüsahhariidide töötlemise 15

suhtes puudulik. Need ja sarnased tehnikad on tehnika tasemes hästi tuntud.

[0159] Muude modifitseerimismeetodite hulka kuuluvad tehnika tasemes tuntud

ühendamistehnikad, sealhulgas mittepiiravalt ensümaatilised vahendid, oksüdatiivne

asendamine ja kelaatimine. Modifikatsioone võib kasutada näiteks immunoanalüüsi jaoks 20

märgiste kinnitamiseks. Modifitseeritud G1 polüpeptiidide valmistamiseks kasutatakse

tehnika tasemes väljakujunenud protseduure ning nende skriinimiseks võib kasutada

tehnika tasemes tuntud standardseid analüüsimeetodeid, millest osasid on kirjeldatud

allpool ja lisatud näidetes.

25

[0160] Osades teostustes sisaldab antikeha modifitseeritud konstantset piirkonda, nagu

näiteks konstantset piirkonda, mis on immunoloogiliselt inertne või osaliselt inertne, näiteks

ei käivita komplemendi vahendatud lüüsi, ei stimuleeri antikehast sõltuvat rakulist

tsütotoksilisust (ADCC) või ei aktiveeri mikrogliiat; või sellel on vähenenud toimed

(võrreldes modifitseerimata antikehaga) ühes või mitmes alljärgnevas valdkonnas: 30

komplemendi vahendatud lüüsi käivitamine, antikehast sõltuva rakulise tsütotoksilisuse

(ADCC) stimuleerimine või mikrogliia aktiveerimine. Konstantse piirkonna erinevaid

modifikatsioone võib kasutada efektorfunktsioonide optimaalse taseme saavutamiseks

58 EE-EP 1 957 106 B2

ja/või kombineerimiseks. Vt näiteks Morgan et al., Immunology 86:319–324 (1995); Lund

et al., J. Immunology 157:4963–9 157:4963–4969 (1996); Idusogie et al., J. Immunology

164:4178–4184 (2000); Tao et al., J. Immunology 143: 2595–2601 (1989); ja Jefferis et al.,

Immunological Reviews 163:59–76 (1998). Osades teostustes on konstantset piirkonda

modifitseeritud viisil, mida on kirjeldatud allikates Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613–2624; 5

PCT patenditaotlus nr PCT/GB99/01441; ja/või Ühendkuningriigi patenditaotluses nr

9809951.8. Teistes teostustes sisaldab antikeha inimese raske ahela IgG2 konstantset

piirkonda, mis sisaldab alljärgnevaid mutatsioone: A330P331 on muudetud S330S331-ks

(aminohapete loend viitega looduslikule IgG2 järjestusele). Eur. J. Immunol. (1999)

29:2613–2624. Veel osades teistes teostustes aglükosüleeritakse pidev piirkond N-seotud 10

glükosüleerimise jaoks. Osades teostustes aglükosüleeritakse pidev piirkond N-seotud

glükosüleerimise jaoks glükosüülitud aminohappejäägi või flankeerivate jääkide

muteerimise teel, mis on N-glükosüleerimist ära tundva järjestuse osa konstantses

piirkonnas. Näiteks võib N-glükosüleerimissaidi N297 muteerida A-ks, Q-ks, K-ks või H-

ks. Vt Tao et al., J. Immunology 143: 2595–2601 (1989); ja Jefferis et al., Immunological 15

Reviews 163:59–76 (1998). Osades teostustes aglükosüleeritakse pidev piirkond N-seotud

glükosüleerimise jaoks. Konstantset piirkonda võib aglükosüleerida N-seotud

glükosüleerimise jaoks ensümaatiliselt (nagu näiteks eemaldades süsivesiku ensüümi

PNGaasiga) või ekspresseerimise kaudu glükosüleerimise puudulikkusega peremeesrakus.

20

[0161] Teiste antikeha modifikatsioonide hulka kuuluvad antikehad, mida on

modifitseeritud vastavalt sellele, mida on kirjeldatud PCT publikatsioonis nr WO 99/58572,

avaldatud 18. novembril 1999. Need antikehad sisaldavad lisaks märklaud-molekulile

suunatud sidumisdomeenile efektordomeeni, mille aminohappejärjestus on sisuliselt

homoloogne kogu või osa inimese immunoglobuliini raske ahela konstantse piirkonna 25

suhtes. Need antikehad suudavad siduda märklaud-molekuli, käivitamata seejuures

märkimisväärset komplemendist sõltuvat lüüsi või märklaua rakulist hävitamist. Osades

teostustes suudab efektordomeen spetsiifiliselt siduda FcRn-i ja/või FcγRIIb-d. Need

põhinevad tüüpiliselt kimäärsetel domeenidel, mis on tuletatud kahest või enamast inimese

immunoglobuliini CH2 domeenist. Sellisel viisil modifitseeritud antikehad on eriti sobivad 30

kroonilise antikeha ravis kasutamiseks, et vältida põletiku teket või teisi kahjulikke

reaktsioone tavapärase antikehateraapia suhtes.

59 EE-EP 1 957 106 B2

[0162] Käesolev leiutis hõlmab küpse afiinsusega teostusi. Näiteks võib küpse afiinsusega

antikehasid toota tehnika tasemes tuntud protseduuridega (Marks et al., 1992,

Bio/Technology, 10:779–783; Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809–3813;

Schier et al., 1995, Gene, 169:147–155; Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155:1994–2004;

Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154(7):3310–9; Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol., 5

226:889–896; ja W02004/058184).

[0163] Alljärgnevaid meetodeid võib kasutada antikeha afiinsuse kohandamiseks või CDRi

iseloomustamiseks. Ühte viis antikeha CDRi iseloomustamiseks ja/või polüpeptiidi, nagu

näiteks antikeha seondumisafiinsuse muutmiseks (näiteks parandamiseks), nimetatakse 10

„skaneeritava panga mutageneesiks” („library scanning mutagenesis”). Üldiselt toimib

skaneeritava panga mutagenees alljärgneval viisil. Üks või mitu aminohappe positsiooni

CDRis asendatakse kahe või enama (nagu näiteks 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,

16, 17, 18, 19 või 20) aminohappega, kasutades selleks tehnika tasemes tunnustatud

meetodeid. Selle tulemusel genereeritakse väike kloonide pank (osades teostustes 15

moodustatakse üks selline pank iga analüüsitud aminohappe positsiooni kohta), millest

igaüks on kahe või enama liikme keerukusega (kui igas positsioonis asendatakse kaks või

enam aminohapet). Üldiselt sisaldab selline pank ka klooni, mis sisaldab looduslikku

(asendamata) aminohapet. Väikest hulka kloone, näiteks ligikaudu 20–80 klooni (olenevalt

panga keerukusest) igast pangast skriinitakse seondumisafiinsuse osas märklaud-20

polüpeptiidi (või mõne muu sidumismärklaua) suhtes ning tehakse kindlaks suurenenud,

samasuguse või vähenenud seondumisafiinsusega või seondumisafiinsuseta kandidaadid.

Meetodid seondumisafiinsuse kindlaks määramiseks on tehnika tasemes hästi tuntud.

Seondumisafiinsuse kindlaks määramiseks võib kasutada Biacore'i pinna

plasmonresonantsi analüüsi, mis tuvastab erinevused seondumisafiinsuses, mis on ligikaudu 25

2 korda või rohkem kordi suuremad. Biacore on eriti kasulik siis, kui lähteantikeha seondub

juba suhteliselt kõrge afiinsusega, näiteks on selle KD ligikaudu 10 nM või madalam.

Skriinimist, mille puhul kasutatakse Biacore'i pinna plasmonresonantsi, on kirjeldatud siin

näidetes.

30

[0164] Seondumisafiinsuse kindlaks määramiseks võib kasutada Kinexa Biocensor'it,

stsintsillatsiooni lähedusanalüüse, ELISAt, ORIGEN immunoanalüüsi (IGEN),

60 EE-EP 1 957 106 B2

fluorestsentsi kustutamist, fluorestsentsi ülekannet ja/või pärmidisplei meetodit.

Seondumisafiinsuse skriinimiseks võib kasutada ka sobivat bioanalüüsi.

[0165] Osades teostustes on iga aminohappe positsioon CDRis asendatud (osades

teostustes ühekaupa) kõigi 20 loodusliku aminohappega, kasutades selleks tehnika tasemes 5

tunnustatud mutageneesi meetodeid (millest osasid on siin kirjeldatud). Selle tulemusel

genereeritakse väike kloonide pank (osades teostustes moodustatakse üks selline pank iga

analüüsitud aminohappe positsiooni kohta), millest igaüks on 20 liikme keerukusega (kui

igas positsioonis asendatakse kõik 20 aminohapet).

10

[0166] Osades teostustes sisaldab skriinitav pank asendusi kahes või enamas positsioonis,

mis võivad olla samas CDRis või kahes või enamas CDRis. Seega võib pank sisaldada

asendusi kahes või enamas positsioonis ühes CDRis. Pank võib sisaldada asendust kahes

või enamas positsioonis kahes või enamas CDRis. Pank võib sisaldada asendust 3, 4, 5 või

enamas positsioonis, kus nimetatud positsioonid asuvad kahes, kolmes, neljas, viies või 15

kuues CDRis. Asenduste valmistamiseks võib kasutada madala liiasusega koodoneid. Vt

näiteks tabelit 2 publikatsioonis Balint et al., (1993) Gene 137(1):109–18).

[0167] CDR võib olla CDRH3 ja/või CDRL3. CDR võib olla üks või mitu CDRL1,

CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 ja/või CDRH3. CDR võib olla Kabati CDR, Chothia 20

CDR või laiendatud CDR.

[0168] Parandatud seondumisega kandidaadid võib järjestada, tuvastades seeläbi asendatud

CDRiga mutandi, mille tulemuseks on paranenud afiinsus (nimetatakse ka „parandatud”

asendamiseks). Kandidaadid, mis seonduvad, võib samuti järjestada, tuvastades seeläbi 25

CDRi asenduse, mis säilitab seondumise.

[0169] Skriinimist võib läbi viia mitu korda. Näiteks on parandatud seondumisega

kandidaadid (millest igaüks sisaldab aminohappe asendust ühe või mitme CDRi ühes või

mitmes positsioonis) samuti kasulikud teise panga disainimiseks, mis sisaldab igas 30

parandatud CDRi positsioonis vähemalt algset ja asendatud aminohapet (st aminohappe

positsioonis CDRis, kus asendatud mutandi seondumine oli paranenud). Sellise panga

valmistamist ning skriinimist või selekteerimist on allpool üksikasjalikumalt kirjeldatud.

61 EE-EP 1 957 106 B2

[0170] Skaneeritava panga mutagenees pakub ka vahendit CDRi iseloomustamiseks

sellises ulatuses, et parandatud seondumise, samasuguse seondumise, vähenenud

seondumise või seondumiseta kloonide sagedus annab samuti teavet iga aminohappe

positsiooni tähtsuse kohta antikeha-antigeeni kompleksi stabiilsuse jaoks. Näiteks kui CDRi

positsioon säilitab seondumise ka pärast kõigi 20 aminohappe muutmist, siis tuvastatakse 5

see positsioon positsioonina, mida tõenäoliselt ei ole antigeeni sidumiseks vaja. Kui aga

CDRi positsioon säilitab seondumise üksnes asenduste väga väikese osakaalu korral, siis

tuvastatakse see positsioon positsioonina, mis on CDRi funktsiooni jaoks oluline. Seega

annavad skaneeritava panga mutageneesi meetodid teavet CDRis asuvate positsioonide

kohta, mida võib vahetada paljude erinevate aminohapete vastu (sealhulgas kõigi 20 10

aminohappe vastu) ning CDRi positsioonide kohta, mida ei saa vahetada või mida saab

vahetada üksnes väga väheste aminohapete vastu.

[0171] Parandatud afiinsusega kandidaate võib kombineerida teiseks pangaks, mis hõlmab

parandatud aminohapet, algset aminohapet selles positsioonis, ning võib lisaks selles 15

positsioonis hõlmata täiendavaid asendusi, olenevalt panga keerukusest, mis on soovitud

või mida on võimaldanud soovitud skriinimis- või selekteerimismeetodi kasutamine. Lisaks

võib soovi korral randomiseerida külgnevaid aminohappe positsioone vähemalt kahe või

enama aminohappe suhtes. Külgnevate aminohapete randomiseerimine võib anda täiendava

konformatsioonilise pandlikkuse mutant-CDRis, mis omakorda võib võimaldada või 20

lihtsustada suurema hulga täiustavate mutatsioonide sisestamist. Pank võib sisaldada ka

asendust positsioonides, mis ei näidanud täiustatud afiinsus esimese skriinimise ajal.

[0172] Teist panka skriinitakse või selekteeritakse täiustatud ja/või muudetud

seondumisafiinsusega panga liikmete leidmiseks, kasutades selleks mis tahes tehnika 25

tasemes tuntud meetodit, sealhulgas skriinimist Biacore'i pinna plasmonresonantsi

analüüsiga ning selekteerimist, mille puhul kasutatakse mis tahes tehnika tasemes tuntud

selekteerimiseks kasutatavat meetodit, sealhulgas faagidispleid, pärmidispleid ja

ribosoomidispleid.

30

[0173] Käesoleva antikeha võib siduda märgistava ainega (mida alternatiivselt nimetatakse

„märgiseks”), nagu näiteks fluorestseeruva molekuli, radioaktiivse molekuli või mis tahes

62 EE-EP 1 957 106 B2

muude tehnika tasemes tuntud märgistega. Tehnika tasemes on tuntud märgised, mis

üldiselt annavad (otsese või kaudse signaali).

[0174] Kahte polünukleotiidi- või polüpeptiidijärjestust nimetatakse „identseteks”, kui

nukleotiidide või aminohapete järjestus nendes kahes järjestuses on ühesugune, kui need 5

joondatakse maksimaalse vastavuse määramiseks vastavalt allpool kirjeldatule. Võrdlusi

kahe järjestuse vahel teostatakse tüüpiliselt järjestuste võrdlemise teel võrdlusakna kohal,

et tuvastada ja võrrelda järjestuste lokaalsete piirkondade sarnasust. „Võrdlusaken”

tähendab siin segmenti, mis koosneb vähemalt ligikaudu 20 järjestikusest positsioonist,

tavaliselt 30 kuni ligikaudu 75, 40 kuni ligikaudu 50 järjestikusest positsioonist, mille 10

järjestust saab võrrelda sama arvu järjestikuste positsioonidega viitejärjestusega pärast

nende kahe järjestuse optimaalset joondamist.

[0175] Võrdluse läbiviimiseks järjestuste optimaalseks joondamiseks võib kasutada

Lasergene bioinformaatika tarkvara komplekti kuuluvat programmi Megalign 15

(DNASTAR, Inc., Madison, WI), kasutades vaikeparameetreid. See programm hõlmab

mitmeid joondamisskeeme, mida on kirjeldatud alljärgnevates viiteallikates: Dayhoff, M.O.

(1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant

relationships. Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National

Biomedical Research Foundation, Washington DC, 5. väljaanne Suppl. 3, lk 345–358; Hein 20

J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes, lk 626–645, Methods in

Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. ja Sharp, P.M.,

1989, CABIOS 5:151–153; Myers, E.W. ja Muller W., 1988, CABIOS 4:11–17; Robinson,

E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406–425;

Sneath, P.H.A. ja Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of 25

Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. ja Lipman, D.J.,

1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726–730.

[0176] Eelistatult määratakse „järjestuse identsuse määr” kindlaks kahe optimaalselt

joondatud järjestuse võrdlemise teel vähemalt 20 positsioonist koosneva võrdlusakna kohal, 30

kus polünukleotiidi- või polüpeptiidijärjestuse osa võrdlusaknas võib sisaldada lisandusi või

deletsioone (st tühimikke) 20 protsendi ulatuses või vähem, tavaliselt 5 kuni 15 protsendi

ulatuses või 10 kuni 12 protsendi ulatuses võrreldes viitejärjestustega (mis ei sisalda

63 EE-EP 1 957 106 B2

lisandusi või deletsioone) nende kahe järjestuse optimaalseks joondamiseks. Osakaalu

arvutamiseks määratakse kindlaks positsioonide arv, mille juures asuvad identsed

nukleiinhappe alused või aminohappejäägid mõlemas järjestuses, et saada kattuvate

positsioonide arv; seejärel jagatakse kattuvate positsioonide arv viitejärjestuses olevate

positsioonide koguarvuga (st akna suurusega) ning tulemused korrutatakse 100ga, et saada 5

järjestuse identsuse osakaal.

[0177] Variandid võivad olla või alternatiivselt olla sisuliselt homoloogsed loodusliku

geeniga või selle osa või komplemendiga. Sellised polünukleotiidi variandid on suutelised

hübridiseeruma mõõdukalt rangetes tingimustes looduslikult esinevaks DNA-järjestuseks, 10

mis kodeerib looduslikku antikeha (või komplementaarset järjestust).

[0178] Sobivalt hõlmavad „mõõdukalt ranged tingimused” eelpesu lahuses, mis hõlmab

5 × SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hübridiseerimist 50 °C–65 °C juures, 5 ×

SSC, öö läbi; millele järgneb kaks korda pesemist 65 °C juures 20 minutit igaühega 2×, 0,5× 15

ja 0,2× SSC, mis sisaldavad 0, 1% SDS-i.

[0179] Käesolevas on „ülimalt ranged tingimused” või „ülima rangusega tingimused”

alljärgnevad: (1) pesemiseks kasutatakse madalat ioonset tugevust ja kõrget temperatuuri,

näiteks 0,015 M naatriumkloriid/0,0015 M naatriumtsitraat/0,1% naatriumdodetsüülatsetaat 20

50 °C juures; (2) hübridiseerimise ajal kasutatakse denatureerivat ainet, nagu näiteks

formamiidi, näiteks 50% (v/v) formamiidi 0,1% veise seerumi albumiini/0,1% Ficolli/0,1%

polüvinüülpürrolidiini/50mM naatriumfosfaadi puhvriga pH väärtuse 6,5 juures 750 mM

naatriumkloriidi, 75 mM naatriumtsitraadiga 42 °C juures; või (3) kasutada 50%

formamiidi, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M naatriumtsitraat), 50 mM naatriumfosfaati (pH 25

6,8), 0,1% naatriumpürofosfaati, 5 × Denhardt'i lahust, sonikeeritud lõhe sperma DNAd (50

µg/ml), 0,1% SDS-i ja 10% dekstraansulfaati 42 °C juures koos pesemisega 42 °C juures

0,2 × SSC-is (naatriumkloriid/naatriumtsitraat) ja 50% formamiidis 55 °C juures, millele

järgneb pesu ülimalt rangetes tingimustes, mis hõlmab 0,1 × SSCd, mis sisaldab EDTAd,

55 °C juures. Antud valdkonna asjatundja teab, kuidas kohandada temperatuuri, ioonset 30

tugevust jne, mis on vajalik erinevatele teguritele, nagu näiteks proovi pikkusele jms

kohandumiseks.

64 EE-EP 1 957 106 B2

[0180] Antud valdkonna asjatundjad mõistavad, et geneetilise koodi degeneratiivsuse

tagajärjel on terve hulk nukleotiidijärjestusi, mis kodeerivad siin kirjeldatud polüpeptiidi.

Osad nendest polünukleotiididest kannavad mis tahes loodusliku geeni nukleotiidijärjestuse

suhtes minimaalset homoloogiat. Sellest hoolimata peetakse käesolevas leiutises

spetsiifiliselt võimalikuks polünukleotiide, mis varieeruvad erinevuste tõttu koodoni 5

kasutamises. Lisaks on siin välja pakutud polünukleotiidi järjestusi sisaldavad geenide

alleelid käesoleva leiutise ulatuses. Alleelid on endogeensed geenid, mida on muudetud ühe

või mitme mutatsiooni, nagu näiteks nukleotiidide deletsioonide, lisanduste ja/või asenduste

tulemusel. Tulemuseks saadud mRNAl ja valgul võib, kuid ei pruugi olla muutunud

struktuur või funktsioon. Alleelide tuvastamiseks võib kasutada standardseid tehnikaid 10

(nagu näiteks hübridiseerimist, laiendamist ja/või andmebaasi järjestuse võrdlust).

[0181] Polünukleotiidide saamiseks võib kasutada keemilist sünteesi, rekombinantseid

meetodeid või PCRi. Polünukleotiidi keemilise sünteesi meetodid on tehnika tasemes hästi

tuntud ning neid ei ole vaja siin üksikasjalikult kirjeldada. Antud valdkonna asjatundja võib 15

soovitud DNA järjestuse tootmiseks kasutada siin välja pakutud järjestusi ja

kaubanduslikult kättesaadavat DNA sünteesijat.

[0182] Polünukleotiidide valmistamiseks rekombinantseid meetodeid kasutades võib

soovitud järjestust sisaldava polünukleotiidi sisestada sobivasse vektorisse ning selle 20

vektori võib omakorda sisestada sobivasse peremeesrakku replitseerimiseks ja

laiendamiseks vastavalt siin edaspidi kirjeldatule. Polünukleotiide võib

peremeesrakkudesse sisestada mis tahes tehnika tasemes tuntud meetodeid kasutades.

Rakud kujundatakse ümber eksogeense polünukleotiidi sisestamisega otsese omastamise,

endotsütoosi, transfektsiooni, F-paaritamise või elektroporatsiooni teel. Kui eksogeenne 25

polünukleotiid on rakku sisestatud, siis võib seda seal säilitada integreerimata vektorina

(nagu näiteks plasmiidina) või selle võib integreerida peremeesraku genoomi. Sellisel viisil

laiendatud polünukleotiidi saab peremeesrakust isoleerida tehnika tasemes hästi tuntud

meetoditega. Vt näiteks Sambrook et al. (1989).

30

[0183] Alternatiivselt võimaldab PCR DN- järjestusi reprodutseerida. PCR-tehnoloogia on

tehnika tasemes hästi tuntud ning seda on kirjeldatud USA patentides nr 4 683 195,

65 EE-EP 1 957 106 B2

4 800 159, 4 754 065 ja 4 683 202 ning samuti allikas PCR: The Polymerase Chain

Reaction, Mullis et al. (toim.), Birkauswer Press, Boston (1994).

[0184] RNA saamiseks võib kasutada asjakohases vektoris isoleeritud DNAd, mis

sisestatakse sobivasse peremeesrakku. Kui rakk paljuneb ning DNA transkribeeritakse 5

RNAks, võib RNA seejärel isoleerida, kasutades selleks antud valdkonna asjatundjatele

hästi tuntud meetodeid, mis on kirjeldanud näiteks Sambrook et al., (1989).

[0185] Sobivad kloonimisvektorid võib konstrueerida vastavalt standardsetele tehnikatele

või need võib valida suure hulga kloonimisvektorite hulgast, mis on tehnika tasemes 10

kättesaadavad. Samal ajal kui valitud kloonimisvektor võib varieeruda vastavalt

peremeesrakule, mida kavatsetakse kasutada, on kasulikel kloonimisvektoritel üldiselt

võime replitseeruda, neil võib olla üks märklaud konkreetse restriktsiooni endonukleaasi

jaoks ja/või nad võivad kanda geene markeri jaoks, mida võib kasutada vektorit sisaldavate

kloonide valimisel. Sobivate näidete hulka kuuluvad plasmiidid ja bakteriaalsed viirused, 15

näiteks pUC18, pUC19, Bluescript (näiteks pBS SK+) ja selle derivaadid, mp18, mp19,

pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, faagi DNAd ning ülekandevektorid, nagu näiteks

pSA3 ja pAT28. Need ja paljud teised kloonimisvektorid on kättesaadavad kaubanduslikelt

edasimüüjatelt, nagu näiteks ettevõtetelt BioRad, Strategene ja Invitrogen.

20

[0186] Ekspressioonivektorid on üldiselt replitseeritavad polünukleotiidi konstruktid, mis

sisaldavad polünukleotiidi. Eeldatakse, et ekspressioonivektor peab olema peremeesrakus

replitseeritav kas episoomidena või kromosomaalse DNA integraalse osana. Sobivate

ekspressioonivektorite hulka kuuluvad mittepiiravalt plasmiidid, viirusvektorid, sealhulgas

adenoviirused, adeno-seotud viirused, retroviirused, kosmiidid ning 25

ekspressioonivektor(id), mida on kirjeldatud PCT publikatsioonis nr WO 87/04462. Vektori

komponentide hulka võivad üldiselt mittepiiravalt kuuluda üks või mitu alljärgnevatest:

signaaljärjestus; replikatsiooni alguspunkt; üks või mitu markergeeni; sobivad

transkriptsiooni kontrollivad elemendid (nagu näiteks promootorid, enhanserid ja

terminaator). Ekspresseerimiseks (st translatsiooniks) on tavaliselt vaja ühte või mitut 30

translatsiooni kontrollivat elementi, nagu näiteks ribosoomi sidumissaite, translatsiooni

käivitussaite ja stoppkoodoneid.

66 EE-EP 1 957 106 B2

[0187] Huvipakkuvaid polünukleotiide sisaldavaid vektoreid võib sisestada peremeesrakku

mis tahes erinevate asjakohaste vahenditega, sealhulgas elektroporatsiooniga,

transfektsiooniga, kus kasutatakse kaltsiumkloriidi, rubiidiumkloriidi, kaltsiumfosfaati,

DEAE-dekstraani või teisi aineid; mikrokerakeste pommitamisega; lipofektsiooniga; ja

infektsiooniga (näiteks kui vektor on nakkav aine, nagu näiteks vaktsiinia viirus). 5

Sisestatavate vektorite või polünukleotiidide valik sõltub sageli peremeesraku omadustest.

[0188] Käesolev leiutiskirjeldus pakub ka peremeesrakke, mis sisaldavad mis tahes siin

kirjeldatud polünukleotiide. Huvipakkuvat antikeha, polüpeptiidi või valku kodeerivate

geenide isoleerimise eesmärgil võib kasutada mis tahes peremeesrakke, mis suudavad 10

üleekspresseerida heteroloogilisi DNAsid. Imetaja peremeesrakkude mittepiiravate näidete

hulka kuuluvad COS, HeLa ja CHO-rakud. Vt ka PCT publikatsiooni nr WO 87/04462.

Sobivate mitteimetaja peremeesrakkude hulka kuuluvad prokarüoodid (nagu näiteks E. coli

või B. subtillis) ja pärm (nagu näiteks S. cerevisae, S. pombe; või K. lactis). Eelistatult

ekspresseerivad peremeesrakud cDNAsid tasemel, mis on ligikaudu 5 korda kõrgem, enam 15

eelistatult 10 korda kõrgem, veelgi enam eelistatult 20 korda kõrgem vastava huvipakkuva

endogeense antikeha või valgu tasemest peremeesrakkudes (kui see on seal olemas).

Huvipakkuvat antikeha või valku üleekspresseerivat rakku on võimalik tuvastada.

D. Koostised 20

[0189] Leiutisekohased kompositsioonid sisaldavad tõhusat kogust siin kirjeldatud CGRP-

vastast antagonistlikku antikeha. Selliste koostiste näiteid ning nende formuleerimist on

kirjeldatud nii ees- kui allpool. Ühes teostuses sisaldab koostis lisaks CGRP antagonisti.

Veel ühes teostuses sisaldab koostis ühte või mitut CGRP-vastast antagonist-antikeha. 25

Teistes teostustes tunneb CGRP-vastane antagonist-antikeha ära inimese CGRP. Veel

osades teistes teostustes on CGRP-vastane antagonist-antikeha humaniseeritud antikeha.

Veel ühes teostuses sisaldab CGRP-vastane antagonist-antikeha konstantset piirkonda, mis

ei käivita soovimatut immuunvastust, nagu näiteks antikeha vahendatud lüüsi või ADCC-d.

Teistes teostustes sisaldab CGRP-vastane antagonist-antikeha antikeha G1 ühte või mitut 30

CDRi (nagu näiteks ühte, kahte, kolme, nelja, viit või osades teostustes kõiki kuut CDRi

antikehast G1). Osades teostustes on CGRP-vastane antagonist-antikeha inimese antikeha.

67 EE-EP 1 957 106 B2

[0190] Siinkohal on selge, et nimetatud koostised võivad sisaldada rohkem kui ühte CGRP-

vastast antagonist-antikeha (näiteks CGRP-vastaste antagonist-antikehade segu, mis

tunnevad ära erinevaid CGRP epitoope). Teised näitlikud koostised sisaldavad rohkem kui

ühte CGRP-vastast antagonist-antikeha, mis tunnevad ära sama epitoopi (samu epitoope),

või erinevate liikide CGRP-vastaseid antagonist-antikehi, mis seonduvad erinevate CGRP 5

epitoopidega.

[0191] Käesolevas leiutises kasutatud koostis võib lisaks sisaldada farmatseutiliselt

aktsepteeritavaid tugiaineid, abiaineid või stabilisaatoreid (Remington: The Science and

practice of Pharmacy, 20. väljaanne, (2000) Lippincott Williams ja Wilkins, toim. K. E. 10

Hoover.) lüofiliseeritud formulatsioonide või vesilahuste kujul. Aktsepteeritavad tugiained,

abiained või stabilisaatorid on vastuvõtjatele kasutatud annustes ja kontsentratsioonides

mittetoksilised ning nende hulka võivad kuuluda puhvrid, nagu näiteks fosfaat, titraat ja

teised orgaanilised happed; antioksüdandid, nagu näiteks askorbiinhape ja metioniin;

säilitusained (nagu näiteks oktadetsüüldimetüülbensüül-ammooniumkloriid; 15

heksametooniumkloriid; bensalkooniumkloriid, bensetooniumkloriid; fenool-, butüül- või

bensüülalkohol; alküülparabeenid, nagu näiteks metüül- või propüülparabeen; katekool;

resortsinool; tsükloheksanool; 3-pentanool; ja m-kresool); madala molekulmassiga (vähem

kui ligikaudu 10 jääki) polüpeptiidid; valgud, nagu näiteks seerumi albumiin, želatiin või

immunoglobuliinid; hüdrofiilsed polümeerid, nagu näiteks polüvinüülpürrolidoon; 20

aminohapped, nagu näiteks glütsiin, glutamiin, asparagiin, histidiin, arginiin või lüsiin;

monosahhariidid, disahhariidid ja muud süsivesikud, sealhulgas glükoos, mannoos või

dekstraanid; kelaativad ained, nagu näiteks EDTA; suhkrud, nagu näiteks sahharoos,

mannitool, trehaloos või sorbitool; sooli moodustavad vastasioonid, nagu näiteks naatrium;

metallikompleksid (näiteks Zn-valgu kompleksid); ja/või mitteioonsed pindaktiivsed ained, 25

nagu näiteks TWEEN™, PLURONICS™ või polüetüleenglükool (PEG). Farmatseutiliselt

aktsepteeritavaid abiaineid on siin edaspidi kirjeldatud.

[0192] CGRP-vastast antagonist-antikeha ja selle koostisi võib kasutada ka koos muude

toimeainetega, mille eesmärgiks on parandada ja/või täiendada nende toimeainete tõhusust. 30

[0193] Alljärgnevad näited on pakutud käesoleva leiutise illustreerimiseks, kuid mitte selle

piiramiseks.

68 EE-EP 1 957 106 B2

Näited

Näide 1: CGRP-vastaste monoklonaalsete antikehade genereerimine ja

iseloomustamine

5

[0194] GCRP-vastaste antikehade genereerimine. CGRP-vastaste antikehade

genereerimiseks, millel on liikide ristreaktiivsus roti ja inimese CGRP puhul, immuniseeriti

hiired 25–100 µg inimese α-CGRP või β-CGRPga, mis oli konjugeeritud KLHga adjuvandis

(50 µl jalatalla kohta, kokku 100 µl hiire kohta) erinevate intervallidega. Immuniseerimist

teostati üldiselt viisil, mida on kirjeldatud allikates Geerligs HJ et al., 1989, J. Immunol. 10

Methods 124:95–102; Kenney JS et al., 1989, J. Immunol. Methods 121:157–166; ja Wicher

K et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89:128–135. Hiired immuniseeriti

kõigepealt 50 µg inimese α-CGRP või β-CGRPga, mis oli konjugeeritud KLHga CFAs

(complete Freund's adjuvant, täielik Freundi adjuvant). 21 päeva pärast immuniseeriti hiiri

teist korda 25 µg inimese β-CGRPga (hiirte puhul, keda esimesel korral immuniseeriti 15

inimese α-CGRPga) või -CGRPga (hiirte puhul, keda esimesel korral immuniseeriti inimese

β-CGRPga), mis oli konjugeeritud KLHga IFAs (incomplete Freund's adjuvant, mittetäielik

Freundi adjuvant). Kakskümmend kolm päeva pärast teist immuniseerimist teostati kolmas

immuniseerimine 25 µg roti α-CGRPga, mis oli konjugeeritud KLHga IFAs. Kümme päeva

hiljem testiti antikeha tiitreid ELISA analüüsi kasutades. Neljas immuniseerimine teostati 20

25 µg peptiidiga (roti α-CGRP-KLH) IFAs 34 päeva pärast kolmandat immuniseerimist.

Viimane võimendus teostati 100 µg lahustuva peptiidiga (roti α-CGRP) 32 päeva pärast

neljandat immuniseerimist.

[0195] Immuniseeritud hiirtelt saadi splenotsüüdid ning need ühendati NSO müeloomi 25

rakkudega vahekorras 10:1 polüetüleenglükooliga 1500. Hübriidid kanti 96 süvendiga

plaatidele DMEM-i, mis sisaldas 20% hobuse seerumit ja

2-oksaloatsetaat/püruvaat/insuliini (Sigma), ning seejärel alustati

hüpoksantiini/aminopteriini/tümidiini selekteerimist. 8. päeval lisati kõikidesse

süvenditesse 100 µl DMEM-i, mis sisaldas 20% hobuse seerumit. Hübriidide supernatantide 30

skriinimiseks kasutati antikeha püüdmise immunoanalüüsi. Antikeha klass määrati kindlaks

klassispetsiifiliste teiste antikehadega.

69 EE-EP 1 957 106 B2

[0196] Monoklonaalset antikeha tootvate rakuliinide paneel selekteeriti edasiseks

iseloomustamiseks nende inimese ja roti CGRPga seondumise alusel. Need antikehad ja

omadused on välja toodud allpool tabelites 2 ja 3.

[0197] Puhastamine ja Fab fragmendi valmistamine. Edasiseks iseloomustamiseks 5

selekteeritud monoklonaalsed antikehad puhastati hübridoomi kultuuride supernatantidest,

kasutades selleks valgu A afiinsuskromatograafiat. Supernatantide pH tasakaalustati

väärtusele 8. Seejärel laeti supernatandid valgu A kolonnile MabSelect (Amersham

Biosciences nr 17-5199-02), mille pH tasakaalustati PBSiga väärtusele 8. Kolonn pesti 5

kolonni mahuga PBSiga (pH 8). Antikehad elueeriti 50 mM tsitraat-fosfaatpuhvriga (pH 3). 10

Elueeritud antikehad neutraliseeriti 1M fosfaatpuhvriga (pH 8). Puhastatud antikehad

dialüüsiti PBSiga (pH 7,4). Antikeha kontsentratsioonid määrati kindlaks SDS-PAGE’iga,

kasutades närilise monoklonaalse antikeha standardkõverat.

[0198] Fabid valmistati täielike antikehade papaiini proteolüüsiga, kasutades selleks 15

Immunopure Fab komplekti (Pierce nr 44885), ning puhastati vooluga läbi valgu A

kromatograafia tootjapoolseid juhiseid järgides. Kontsentratsioonid määrati kindlaks

ELISA analüüsiga ja/või SDS-PAGE elektroforeesiga, kasutades standardsete Fabide

teadaolevaid kontsentratsioone (määrati kindlaks aminohappe analüüsiga), ning A280ga,

kasutades 10D=0,6 mg/ml (ehk teoreetilist ekvivalenti, mis põhineb aminohappe 20

järjestusel).

[0199] Fabide afiinsuse kindlaks määramine. CGRP-vastaste antagonist-antikehade

afiinsus määrati kindlaks kas 25 °C või 37 °C juures, kasutades Biacore3000™ pinna

plasmonresonantsi (SPR) süsteemi (Biacore, INC, Piscataway NJ) koos tootja enda voolu 25

puhvriga, HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% v/v

polüsorbaat P20). Afiinsus määrati kindlaks N-otsast biotinüülitud CGRP peptiidide

püüdmisega (eritellimus ettevõttelt GenScript Corporation, New Jersey või Global Peptide

Services, Colorado) eelnevalt SA kiibile immobiliseeritud streptavidiini kaudu ning mõõtes

Fab-titreeritud antikeha seondumiskineetikat üle CGRP pinna. Biotinüülitud CGRP 30

lahjendati HSB-EPsse ning pritsiti üle kiibi kontsentratsiooni juures, mis oli väiksem kui

0,001 mg/ml. Individuaalsete kiibi kanalite kohal varieeruvat vooluaega kasutades saavutati

kaks antigeeni tiheduse vahemikku: <50 vastuseühikut (RU) üksikasjalike kineetiliste

70 EE-EP 1 957 106 B2

uuringute jaoks ning ligikaudu 800 RU kontsentratsiooniuuringute ja skriinimise jaoks.

Kahe- või kolmekordsed seerialahjendused, mis olid tüüpiliselt puhastatud Fab-fragmentide

kontsentratsioonides vahemikus 1 µM – 0.1 nM (eesmärgiks oli 0,1–10 × prognoositavast

KD-st), pritsiti 1 minutiks kontsentratsioonis 100 µl/min ning seejuures võimaldati 10-

minutilisi dissotsiatsiooniaegu. Iga seondumistsükli järel regenereeriti pinnad 25 mM 5

NaOHga 25% v/v etanoolis, mis pidas vastu rohkem kui sadadele tsüklitele. Kineetiline

assotsiatsioonikiirus (kon) ja dissotsiatsioonikiirus (koff) saadi samaaegselt andmete

sobitamisel 1:1 Langmuiri seondumismudelisse (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L.

Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99–110), kasutades programmi BIA

Evaluation. Dissotsiatsioonikonstantide (KD) ehk „afiinsuste” üldine tasakaal arvutati 10

suhtarvust KD = koff/kon. Närilise Fab-fragmentide afiinsused on välja toodud tabelites 2 ja 3.

[0200] Närilise CGRP-vastaste antikehade epitoobi kaardistamine. Epitoobi kindlaks

määramiseks, mille juures CGRP antikehad seonduvad inimese α-CGRPle, mõõdeti Fab-

fragmentide seondumisafiinsusi erinevate CGRP fragmentide suhtes vastavalt eespool 15

kirjeldatule, püüdes N-otsast biotinüülitud CGRP fragmendid aminohapped 19–37 ja

aminohapped 25–37 SA sensorkiibile. Joonisel FIG 1 on kujutatud nende

seondumisafiinsused 25 °C juures mõõdetuna. Vastavalt joonisel FIG 1 näidatule

seonduvad kõik antikehad, välja arvatud antikeha 4901, inimese α-CGRP fragmentidega

19–37 ja 25–37 afiinsusega, mis sarnaneb nende seondumisafiinsusega täispikkuses inimese 20

α-CGRP (1–37) suhtes. Antikeha 4901 seondub inimese α-CGRP fragmendiga 25–37 kuus

korda madalama afiinsusega, kui see seondub täispikkuses inimese α-CGRP fragmendiga

ning seda peamiselt off-kiiruse vähenemise tõttu. Need andmed näitavad, et need CGRP-

vastased antikehad seonduvad üldiselt CGRP C-otsaga.

25

[0201] inimese α-CGRPs sisalduvate aminohapete, mis on seotud CGRP-vastaste

antikehade sidumisega, täiendavaks iseloomustamiseks viidi läbi alaniini skannimine.

Üksikute alaniini asendustega inimese α-CGRP erinevad variandid genereeriti

peptiidsünteesiga. Nende aminohappejärjestused on välja toodud tabelis 4 koos kõikide

teiste peptiididega, mida kasutati Biacore'i analüüsis. CGRP-vastaste antikehade Fab-30

fragmentide afiinsuste kindlaks määramiseks nende variantide suhtes kasutati Biacore'i

analüüsi vastavalt eespool kirjeldatule. Vastavalt joonisel FIG 1 näidatule on kõigi 12

antikeha märklauaks C-otsa epitoop, kus aminohape F37 on kõige olulisem jääk. F37

71 EE-EP 1 957 106 B2

muteerimine alaniiniks alandas afiinsust või lülitas CGRP-vastaste antikehade seondumise

peptiidiga täielikult välja. Olulisuselt järgmine aminohappejääk on G33, kuid alaniiniga

asendamine selles positsioonis avaldas mõju ainult kõrge afiinsusega antikehadele (7E9,

8B6, 10A8 ja 7D11). Aminohappejäägil S34 on samuti märkimisväärne, kuid väiksem roll

nende nelja kõrge afiinsusega antikeha seondumises. 5

Tabel 2. CGRP-vastaste monoklonaalsete antikehade inimese α-CGRPga seondumise

omadused ja nende antagonistlik toime

Antikehad KD

inimese

α-CGRP

suhtes 25

°C juures

(nM)

KD

inimese

α-CGRP

suhtes 37

°C juures

(nM)

Inimese α-CGRP

seondumise rakupõhine

blokeerimine selle

retseptoriga 25 °C juures

(cAMP aktiveerimisega

mõõdetuna)

IC50 (nM sidumis-

saidid) 25 °C juures

(toatemperatuuril)

radioligandi

seondumisanalüüsis

mõõdetuna

7E9 1,0 0,9 Jah 2,5

8B6 1,1 1,2 Jah 4,0

10A8 2,1 3,0 Jah n.d.

7D11 4,4 5,4 Jah n.d.

6H2 9,3 42 Jah 12,9

4901 61 139 Jah 58

14E10 80 179 Jah n.d.

9B8 85 183 Ei n.d.

13C2 94 379 Ei n.d.

14A9 148 581 Ei n.d.

6D5 210 647 Ei n.d.

1C5 296 652 Ei n.d.

NB: Antikeha 4901 on kaubanduslikult kättesaadav (Sigma, toode nr C7113).

72 EE-EP 1 957 106 B2

Antikehad KD

inimese

α-CGRP

suhtes 25

°C juures

(nM)

KD

inimese

α-CGRP

suhtes 37

°C juures

(nM)

Inimese α-CGRP

seondumise rakupõhine

blokeerimine selle

retseptoriga 25 °C juures

(cAMP aktiveerimisega

mõõdetuna)

IC50 (nM sidumis-

saidid) 25 °C juures

(toatemperatuuril)

radioligandi

seondumisanalüüsis

mõõdetuna

n.d. = kindlaks määramata

Tabel 3. CGRP-vastaste monoklonaalsete antikehade roti α-CGRPga seondumise omadused

ja nende antagonistlik toime

Antikehad KD roti α-

CGRP suhtes

37 °C juures

(nM)

Roti α-CGRP seondumise rakupõhine

blokeerimine selle retseptoriga 25 °C juures

(cAMP aktiveerimisega mõõdetuna)

In vivo

blokeerimine

jäsemenärvi

analüüsis

4901 3,4 Jah Jah

7E9 47 Jah Jah

6H2 54 Ei Ei

8B6 75 Jah Jah

7D11 218 Jah Jah

10A8 451 Ei n.d.

9B8 876 Ei n.d.

14E10 922 Ei n.d.

13C2 > 1000 Ei n.d.

14A9 > 1000 Ei n.d.

6D5 > 1000 Ei n.d.

1C5 > 1000 Ei n.d.

„n.d.” näitab, et antud antikeha suhtes testi ei teostatud.

73 EE-EP 1 957 106 B2

Tabel 4. Inimese α-CGRP fragmentide (SEQ ID NO:15–40) ja seotud peptiidide (SEQ ID

NOS:41–47) aminohappejärjestused. Kõik peptiidid on N-otsast amideeritud, välja arvatud

järjestused SEQ ID NO:36–40. Paksus kirjas jäägid tähistavad punktmutatsioone.

CGRP Aminohappejärjestus SEQ

ID

NO

1–37 (WT) ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF 15

8–37 VTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF 16

19–37 SGGVVKNNFVPTNVGSKAF 17

P29A (19–37) SGGVVKNNFVATNVGSKAF 18

K35A (19–37) SGGVVKNNFVPTNVGSAAF 19

K35E (19–37) SGGVVKNNFVPTNVGSEAF 20

K35M (19–37) SGGVVKNNFVPTNVGSMAF 21

K35Q (19–37) SGGVVKNNFVPTNVGSQAF 22

F37A (19–37) SGGVVKNNFVPTNVGSKAA 23

25–38A NNFVPTNVGSKAFA 24

25–37 NNFVPTNVGSKAF 25

F27A (25–37) NNAVPTNVGSKAF 26

V28A (25–37) NNFAPTNVGSKAF 27

P29A (25–37) NNFVATNVGSKAF 28

T30A (25–37) NNFVPANVGSKAF 29

N31A (25–37) NNFVPTAVGSKAF 30

V32A (25–37) NNFVPTNAGSKAF 31

G33A (25–37) NNFVPTNVASKAF 32

S34A (25–37) NNFVPTNVGAKAF 33

F37A (25–37) NNFVPTNVGSKAA 34

74 EE-EP 1 957 106 B2

CGRP Aminohappejärjestus SEQ

ID

NO

26–37 NFVPTNVGSKAF 35

19–37-COOH SGGVVKNNFVPTNVGSKAF 36

19–36-COOH SGGVVKNNFVPTNVGSKA 37

1–36-COOH ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKA 38

1–19-COOH ACDTATCVTHRLAGLLSRS 39

1–13-COOH ACDTATCVTHRLA 40

roti α (1–37) SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSEAF 41

roti α (19–37) SGGVVKDNFVPTNVGSEAF 42

inimese β (1–

37)

ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF 43

roti β (1–37) SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSKAF 44

Inimese

kaltsitoniin (1–

32)

CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP 45

Inimese amüliin

(1–37)

KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY 46

Inimese

adrenomedulliin

(1–52)

YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDK

DKDNVAPRSKISPQGY

47

Näide 2: CGRP-vastaste antagonist-antikehade skriinimine in vitro analüüsimeetodeid

kasutades.

[0202] Närilise CGRP-vastaseid antikehi skriiniti täiendavalt antagonisti aktiivsuse in vitro 5

kindlaks tegemiseks, kasutades selleks rakupõhist cAMP aktiveerimise analüüsi ja

seondumisanalüüsi.

75 EE-EP 1 957 106 B2

[0203] Antagonisti aktiivsust mõõdeti cAMP analüüsiga. Viis mikroliitrit inimese või roti

α-CGRPd (lõppkontsentratsioon 50 nM) CGRP-vastase antikeha juuresolekul või

puudumisel (lõppkontsentratsioon 1–3000 nM), või roti α-CGRP või inimese α-CGRPd

(lõppkontsentratsioon 0,1 nM-10 µM; c-AMP aktiveerimise positiivse kontrollina) doseeriti

384 süvendiga plaadile (Nunc, kat. nr 264657). Plaadi süvenditesse lisati kümme mikroliitrit 5

rakke (inimese SK-N-MC inimese α-CGRP kasutamise korral või roti L6 ATCCst roti

α-CGRP kasutamise korral) stimulatsioonipuhvris (20 mM HEPES, pH 7,4, 146 mM NaCl,

5 mM KCI, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 ja 500 uM 3-isobutüül-1-metüülksantiin (IBMX)).

Plaati inkubeeriti toatemperatuuril 30 minutit.

10

[0204] Pärast inkubeerimist kasutati cAMP aktiveerimiseks HitHunter™ ensüümi-

fragmendi komplementeerimise analüüsi (Applied Biosystems), järgides tootjapoolseid

juhiseid. See analüüsimeetod põhineb geneetiliselt töödeldud β-galaktosidaasi ensüümil,

mis koosneb kahest fragmendist – ensüümi aktseptorist (enzyme acceptor, EA) ja ensüümi

doonorist (enzyme donor, ED). Kui need kaks fragmenti lahutatakse, siis on ensüüm 15

mitteaktiivne. Kui need fragmendid on koos, siis võivad nad spontaanselt ümber

kombineeruda aktiivse ensüümi moodustamiseks protsessi teel, mida nimetatakse

komplementeerimiseks. EFC analüüsi platvorm kasutab ED-cAMP peptiidi konjugaati,

milles cAMPi tunneb ära cAMPi vastane antikeha. ED-fragment on suuteline EAga uuesti

ühinema aktiivse ensüümi moodustamiseks. Selles analüüsis titreeritakse cAMP vastast 20

antikeha optimaalselt ED-cAMPi konjugaadiga seondumiseks ja ensüümi moodustamise

inhibeerimiseks. cAMP tasemed rakulüsaadi proovides konkureerivad ED-cAMPi

konjugaadiga cAMP vastase antikehaga seondumise osas. Vaba ED konjugaadi kogus

analüüsis on proportsionaalne cAMP kontsentratsiooniga. Seega mõõdetakse cAMPi

aktiivse ensüümi moodustamisega, mida kvantifitseeritakse β-galaktosidaasi 25

luminestseeruva substraadi ümberpöördumisega. cAMP aktiveerimisanalüüsi teostamiseks

lisati 10 µl lüüsi puhvrit ja cAMP vastast antikeha (vahekorras 1:1), millele järgnes

inkubeerimine toatemperatuuril 60 minutit. Seejärel lisati igasse süvendisse 10 µl ED-

cAMPi reagenti ning inkubeeriti toatemperatuuril 60 minutit. Pärast inkubeerimist lisati

igasse süvendisse 20 µl EA reagenti ja CL segu (sisaldas substraati) (vahekorras 1:1) ning 30

inkubeeriti 1 kuni 3 tundi või öö läbi toatemperatuuril. Plaati loeti kiirusel 1 sekund süvendi

kohta PMT instrumendil või kiirusel 30 sekundit plaadi kohta kujutise formeerijal.

Antikehad, mis inhibeerivad cAMPi aktiveerimist α-CGRPi poolt, tuvastati (tähistatud

76 EE-EP 1 957 106 B2

vastusega „jah”) eespool tabelites 2 ja 3. Tabelites 2 ja 3 esitatud andmed näitavad, et

antikehadel, mis demonstreerisid analüüsis agonistlikku toimet, on üldiselt kõrge afiinsus.

Näiteks antikehad, millel on KD (kindlaks määratud 25 °C juures), mis on ligikaudu 80 nM

või väiksem inimese α-CGRP suhtes, või millel on KD (kindlaks määratud 37 °C juures),

mis on ligikaudu 47 nM või väiksem roti α-CGRP, näitasid käesolevas analüüsis 5

antagonistlikku toimet.

[0205] Radioligandi seondumise analüüs. Seondumisanalüüs teostati CGRP-vastase

antikeha IC50 mõõtmiseks CGRP retseptoriga seondumise blokeerimisel vastavalt

varasemalt kirjeldatule. Zimmermann et al., Peptides 16:421–4, 1995; Mallee et al., J. Biol. 10

Chem. 277:14294–8, 2002. SK-N-MC rakkudest saadud membraane (25 µg) inkubeeriti 90

minutit toatemperatuuril inkubatsioonipuhvris (50 mM Tris-HCL, pH 7,4, 5 mM MgCL2,

0,1% BSA), mis sisaldas 10 pM 125I-inimese α-CGRPd kogumahus 1 ml.

Inhibeerimiskontsentratsioonide (IC50) kindlaks määramiseks lahustati antikehad või

märgistamata CGRP (kontrollina), mis saadi ligikaudu 100 korda kõrgemast lähtelahusest, 15

varieeruvate kontsentratsioonide juures inkubatsioonipuhvris ning inkubeeriti samaaegselt

membraanide ja 10 pM 125I-inimese α-CGRPga. Inkubeerimine lõpetati filtreerimisega läbi

klaasist mikrokiudfiltri (GF/B, 1µm), mida oli blokeeritud 0,5% polüetüleenimiiniga.

Annuse vastuse kõverad joonestati ning Ki väärtuste kindlaks määramiseks kasutati

alljärgnevat valemit: Ki=IC50/(1+([ligand]/KD); kus dissotsiatsiooni tasakaalukonstant KD = 20

8 pM inimese α-CGRP puhul CGRP1 retseptori suhtes vastavalt SK-N-MC rakkudes

esitatule, ning Bmax = 0,025 pmol mg valgu kohta. Teatatud IC50 väärtus (seoses IgG

molekulidega) teisendati sidumissaitideks (korrutades selle kahega), nii et seda saaks

võrrelda afiinsustega (KD), mis määrati kindlaks Biacore'i analüüsis (vt tabelit 2).

25

[0206] Tabelis 2 on välja toodud närilise antikehade 7E9, 8B6, 6H2 ja 4901 IC50 väärtused.

Need andmed näitavad, et antikeha afiinsus on IC50 väärtusega üldiselt korrelatsioonis:

kõrgema afiinsusega (madalamate KD väärtustega) antikehadel on madalam IC50

radioligandi seondumisanalüüsis.

30

Näide 3: CGRP-vastaste antagonist-antikehade mõju roti jäsemenärvi

stimuleerimisega esile kutsutud naha vasodilatatsioonile

77 EE-EP 1 957 106 B2

[0207] CGRP-vastaste antikehade antagonistliku toime testimiseks testiti nende antikehade

mõju roti jäsemenärvi stimuleerimisega esile kutsutud naha vasodilatatsioonile, kasutades

selleks varasemalt kirjeldatud rotimudelit. Escott et al., Br. J. Pharmacol. 110:772–776,

1993. Selles rotimudelis kutsub jäsemenärvi elektriline stimuleerimine esile CGRP

vabanemise närvilõpmetest, andes tulemuseks naha verevoolu suurenemise. Verevoolu 5

isaste Sprague Dwaley rottide (170–300 g, Charles River Hollister) jäseme nahas mõõdeti

pärast jäsemenärvi stimuleerimist. Rotte hoiti anesteesia all 2% isofluraaniga. Katse alguses

anti bretüüliumtosülaati (30 mg/kg, manustati intravenoosselt), et viia jäsemenärvi

sümpateetiliste kiudude samaaegsest stimuleerimisest tingitud vasokonstriktsioon

miinimumini. Kehatemperatuuri hoiti 37 °C juures rektaalse indikaatori kasutamisega, mis 10

oli termostaatiliselt ühendatud kontrollitud temperatuuriga soojendusalusega. Ühendid,

sealhulgas antikehad, positiivne kontroll (CGRP 8–37) ja vehiikul (PBS, 0,01% Tween 20)

manustati intravenoosselt parempoolse reiearteri kaudu, välja arvatud joonisel FIG 3

kujutatud katse puhul, kus testühend ja kontroll süstiti sabaveeni kaudu, ning joonistel FIG

2A ja FIG 2B kujutatud katsete puhul, kus antikehad 4901 ja 7D11 süstiti 15

intraperitoneaalselt (IP). Positiivne kontrollühend CGRP 8–37 (vasodilatatsiooni

antagonist) manustati selle lühikese pooleluea tõttu 3–5 minutit enne närvi stimuleerimist

kontsentratsioonis 400 nmol/kg (200 µl). Tan et al., Clin. Sci. 89:656–73, 1995. Antikehasid

manustati erinevates annustes (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg ja 25 mg/kg).

20

[0208] Joonistel FIG 2A ja FIG 2B kujutatud katsete puhul manustati antikeha 4901

(25 mg/kg), antikeha 7D11 (25 mg/kg) või vehiikuli kontroll (PBS koos 0,01% Tween

20ga) intraperitoneaalselt (IP) 72 tundi enne elektriimpulsiga stimuleerimist. Joonisel FIG

3 kujutatud katse puhul manustati antikeha 4901 (1 mg/kg, 2,5 mg/kg või 25 mg/kg) või

vehiikuli kontroll (PBS koos 0,01% Tween 20ga) intravenoosselt 24 tundi enne 25

elektriimpulsiga stimuleerimist. Pärast antikehade või vehiikuli kontrolli manustamist

paljastati parempoolse tagajäseme jäsemenärv kirurgiliselt, lõigati proksimaalselt ning kaeti

kuivamise vältimiseks plastmähisega. Tagumise käpa naha mediodorsaalse külje kohale

paigutati Doppleri laserindikaator, kuna jäsemenärv ergutab selle piirkonna tegevust. Naha

verevoolu, mida mõõdeti vererakkude vooluna, jälgiti Doppleri laser-voolumeetriga. Kui 30

stabiilne baastaseme vool (vähem kui 5% varieerumist) saavutati vähemalt 5 minutiks, siis

asetati närv plaatinast bipolaarsetele elektroodidele ning seda stimuleeriti elektriliselt 60

impulsiga (2 Hz, 10 V, 1 ms, 30 sekundit) ning seejärel uuesti 20 minuti pärast.

78 EE-EP 1 957 106 B2

Kumulatiivset muutust naha verevoolus hinnati voolu-aja kõvera aluse pindalaga (AUC,

mis on võrdne muutusega voolus, mida on korrutatud muutusega ajas) iga voolu reaktsiooni

puhul elektriimpulsiga stimuleerimisele. Võeti keskmine verevoolu reaktsioon kahele

stimuleerimisele. Loomi hoiti anesteesia all üks kuni kolm tundi.

5

[0209] Vastavalt joonisel FIG 2A ja FIG 2B näidatule inhibeeris jäsemenärvile

elektriimpulsside rakendamisega stimuleeritud verevoolu suurenemist CGRP 8–37

(400 nmol/kg, manustatud intravenoosselt), antikeha 4901 (25 mg/kg, manustatud

intraperitoneaalselt) või antikeha 7D11 (25 mg/kg, manustatud intraperitoneaalselt)

olemasolu kontrolliga võrreldes. CGRP 8–37 manustati 3 kuni 5 minutit enne jäsemenärvi 10

stimuleerimist; ning antikehasid manustati 72 tundi enne jäsemenärvi stimuleerimist.

Vastavalt joonisel FIG 3 näidatule inhibeeris jäsemenärvile elektriimpulsside

rakendamisega stimuleeritud verevoolu suurenemist antikeha 4901 olemasolu erinevates

annustes (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg ja 25 mg/kg), mida manustati intravenoosselt 24

tundi enne jäsemenärvi stimuleerimist. 15

[0210] Joonistel FIG 4A ja FIG 4B kujutatud katsete puhul paljastati jäsemenärv

kirurgiliselt enne antikeha manustamist. Parempoolse tagajäseme jäsemenärv paljastati

kirurgiliselt, lõigati proksimaalselt ning kaeti kuivamise vältimiseks plastmähisega.

Tagumise käpa naha mediodorsaalse külje kohale paigutati Doppleri laserindikaator, kuna 20

jäsemenärv ergutab selle piirkonna tegevust. Naha verevoolu, mida mõõdeti vererakkude

vooluna, jälgiti Doppleri laser-voolumeetriga. Kolmkümmend kuni nelikümmend viis

minutit pärast bretüüliumtosülaadi süstimist, kui stabiilne baastaseme vool (vähem kui 5%

varieerumist) oli saavutatud vähemalt 5 minutiks, asetati närv plaatinast bipolaarsetele

elektroodidele ning seda stimuleeriti elektriliselt (2Hz, 10V, 1 ms, 30 sekundit) ning seejärel 25

uuesti 20 minuti pärast. Keskmist verevoolu reaktsiooni nende kahe stimuleerimise suhtes

kasutati baastaseme reaktsiooni (aeg 0) tuvastamiseks elektrilise stimuleerimise suhtes.

Seejärel manustati intravenoosselt antikeha 4901 (1 mg/kg või 10 mg/kg), antikeha 7E9 (10

mg/kg), antikeha 8B6 (10 mg/kg) või vehiikulit (PBS koos 0,01% Tween 20ga). Seejärel

stimuleeriti närvi (2Hz, 10V, 1 ms, 30 sekundit) 30 minutit, 60 minutit, 90 minutit ja 120 30

minutit pärast antikeha või vehiikuli manustamist. Loomi hoiti anesteesia all ligikaudu kolm

tundi. Kumulatiivset muutust naha verevoolus hinnati voolu-aja kõvera aluse pindalaga

79 EE-EP 1 957 106 B2

(AUC, mis on võrdne muutusega voolus, mida on korrutatud muutusega ajas) iga voolu

reaktsiooni puhul elektriimpulsiga stimuleerimistele.

[0211] Vastavalt joonisel FIG 4A näidatule inhibeeris jäsemenärvile elektriimpulsside

rakendamisega stimuleeritud verevoolu suurenemist antikeha 4901 olemasolu, mida 5

manustati intravenoosselt annuses 1 mg/kg, kui elektriimpulsiga stimuleerimist rakendati

60 minutit, 90 minutit ja 120 minutit pärast antikeha manustamist, ning jäsemenärvile

elektriimpulsside rakendamisega stimuleeritud verevoolu suurenemist inhibeeris antikeha

4901 olemasolu, mida manustati intravenoosselt annuses 10 mg/kg, kui elektriimpulsiga

stimuleerimist rakendati 30 minutit, 60 minutit, 90 minutit ja 120 minutit pärast antikeha 10

manustamist. Joonisel FIG 4 näha, et jäsemenärvile elektriimpulsside rakendamisega

stimuleeritud verevoolu suurenemist inhibeeris antikeha 7E9 (10 mg/kg, manustatud

intravenoosselt) olemasolu, kui elektriimpulsiga stimuleerimist rakendati 30 minutit, 60

minutit, 90 minutit ja 120 minutit pärast antikeha manustamist, ning antikeha 8B6 (10

mg/kg, manustatud intravenoosselt) olemasolu, kui elektriimpulsiga stimuleerimist 15

rakendati 30 minutit pärast antikeha manustamist.

[0212] Need andmed näitavad, et antikehad 4901, 7E9, 7D11 ja 8B6 on tõhusad CGRP

aktiivsuse blokeerimisel vastavalt roti jäsemenärvi stimuleerimisega esile kutsutud naha

vasodilatatsiooniga mõõdetule. 20

Näide 4. CGRP-vastase antikeha G1 ja selle variantide iseloomustamine

[0213] CGRP-vastase antikeha G1 raske ahela varieeruva piirkonna ja kerge ahela

varieeruva piirkonna aminohappejärjestused on välja toodud joonisel FIG 5. Antikeha ja 25

selle variantide ekspresseerimiseks ja iseloomustamiseks kasutati alljärgnevaid meetodeid.

[0214] Kasutatud ekspressioonivektor. Antikehade Fab-fragmendi ekspresseerimine oli

IPTG esile kutsutava lacZ promootori kontrolli all, mis sarnaneb sellega, mida on

kirjeldatud allikas Barbas (2001) Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, 30

NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press pg 2.10. vektor pComb3X), kuid

modifikatsioonid hõlmasid alljärgnevate täiendavate domeenide lisamist ja

ekspresseerimist: inimese kapa kerge ahela pidev domeen ja IgG2 inimese

80 EE-EP 1 957 106 B2

immunoglobuliini CH1 pidev domeen, Ig gamma-2 ahela C-piirkond, valk

deponeerimisnumbriga P01859; immunoglobuliin-kapa kerge ahel (Homo Sapiens), valk

deponeerimisnumbriga CAA09181.

[0215] Fabi väikesemahuline valmistamine. Bakterist E. Coli, mida muundati (kasutades 5

elektroporatsioon-pädevaid TG1 rakke või keemiliselt pädevaid Top 10 rakke) Fab

pangaga, kasutati üksikuid kolooniaid nii põhiplaadi (agar LB + karbenitsilliin (50 μg/ml)

+ 2% glükoos) ja tööplaadi (2 ml süvendi kohta, 96 süvendit plaadi kohta) inokuleerimiseks,

kus iga auk sisaldas 1,5 ml LB + karbenitsilliin (50 μg/ml) + 2% glükoos. Plaat kaeti gaasi

läbilaskva kattega (ABgene, Surrey, UK). Mõlemaid plaate inkubeeriti 30 °C juures 12 kuni 10

16 tundi; tööplaati raputati tugevalt. Põhiplaati säilitati 4 °C juures kuni selle kasutamiseni,

samas kui tööplaadilt saadud rakud vormiti sadestati (4000 pööret minutis, 4 °C, 20 minutit)

ning need resuspendeeriti 1,0 ml LB + karbenitsilliin (50 μg/ml) + 0,5 mM IPTG-s, et

kutsuda esile Fabide ekspresseerimist, raputades neid tugevalt 5 tundi 30 °C juures.

Indutseeritud rakke tsentrifuugiti kiirusega 4000 pööret minutis 4 °C juures 20 minutit ning 15

resuspendeeriti 0,6 mL Biacore HB-SEP puhvris (10 mM Hepes pH 7,4, 150 mM NaCl, 3

mM EDTA, 0,005% v/v P20). HB-SEP-is resuspendeeritud rakkude lüüs saavutati

külmutamise teel (-80 °C) ning seejärel sulatati need 37 °C juures. Rakulüsaate tsentrifuugiti

kiirusega 4000 pööret minutis 4 °C juures 1 tund, et eraldada Fabi sisaldavatest

supernatantidest praht, mis seejärel filtreeriti (0,2 um), kasutades Millipore MultiScreen 20

analüüsisüsteemi 96 süvendiga filtreerimisplaati ja vaakumkollektorit. Filtreeritud

supernatantide analüüsimiseks kasutati Biacore'i analüüsi, pritsides need sensorkiibil

asuvatele CGRPdele. Fabe ekspresseerivad afiinsus-selekteeritud kloonid päästeti

põhiplaadilt ning neid kasutati DNA mallina PCRi, järjestamise ja plasmiidi valmistamise

jaoks. 25

[0216] Fabi suuremahuline valmistamine. Kineetiliste parameetrite saamiseks

ekspresseeriti Fabe suuremas mahus alljärgneval viisil. Erlenmeyeri kolbe, mis sisaldasid

150 mL LB + karbenitsilliini (50 μg/ml) + 2% glükoosi, inokuleeriti 1 mL öö läbi hoitud

lähtekultuuriga üksnes afiinsus-selekteeritud Fabi ekspresseerivast E. Colist. Ülejäänud osa 30

lähtekultuurist (∼3 ml) kasutati plasmiidi DNA (QIAprep mini-prep, Qiagen komplekt)

valmistamiseks, mida kasutati järjestamiseks ja edasiseks manipuleerimiseks. Suuremat

kultuuri inkubeeriti 30 °C juures tugeva raputamisega, kuni OD600nm 1,0 saavutamiseni

81 EE-EP 1 957 106 B2

(tüüpiliselt 12 kuni 16 tundi). Rakkudest moodustati pelletid tsentrifuugimise teel kiirusega

4000 pööret minutis 4°C juures 20 minutit ning resuspendeeriti 150 mL LB + karbenitsilliin

(50 μg/ml) + 0,5 mM IPTGs. Pärast 5-tunnist ekspresseerimist 30 °C juures sadestati rakud

tsentrifuugimise teel kiirusega 4000 pööret minutis 4°C juures 20 minuti jooksul,

resuspendeeriti 10 mL Biacore HBS-EP puhvris ning lüüsiti, kasutades selleks ühekordset 5

külmutamise (-80°C)/sulatamise (37 °C) tsüklit. Rakulüsaadid sadestati tsentrifuugimise

teel kiirusega 4000 pööret minutis 4 °C juures 1 tunni vältel ning supernatant koguti kokku

ja filtreeriti (0,2 μm). Filtreeritud supernatandid laeti Ni-NTA supervoolu sefaroosi (Qiagen,

Valencia, CA) kolonnidele, mis tasakaalustati PBS-iga (pH 8), seejärel pesti need viie

kolonni mahuga PBS-iga (pH 8). Individuaalsed Fabid elueeriti erinevates osades PBS-iga 10

(pH 8) + 300 mM imidasooliga. Fabe sisaldavad osad koguti kokku ning dialüüsiti PBS-is,

seejärel kvantifitseeriti ELISA analüüsiga enne afiinsuse iseloomustamist.

[0217] Tervikliku antikeha valmistamine. Terviklike antikehade ekspresseerimiseks

klooniti raske ja kerge ahela varieeruvad piirkonnad imetaja ekspressioonivektoritesse ning 15

transfekteeriti lipofektamiini kasutades HEK 293 rakkudesse lühiajaliseks

ekspresseerimiseks. Antikehad puhastati valku A kasutades, järgides standardmeetodeid.

[0218] Vektor pDb.CGRP.hFcGI on ekspressioonivektor, mis sisaldab G1 antikeha rasket

ahelat ning sobib raske ahela lühiajaliseks või stabiilseks ekspresseerimiseks. Vektoril 20

pDb.CGRP.hFcGI on nukleotiidijärjestused, mis vastavad järgmistele piirkondadele:

närilise tsütomegaloviiruse promootorpiirkond (nukleotiidid 7–612); sünteetiline intron

(nukleotiidid 613–1679); DHFR-i kodeeriv piirkond (nukleotiidid 688–1253); inimese

kasvuhormooni signaalpeptiid (nukleotiidid 1899–1976); G1 raske ahela varieeruv piirkond

(nukleotiidid 1977–2621); inimese raske ahela IgG2 pidev piirkond, mis sisaldab 25

alljärgnevaid mutatsioone: A330P331 on muudetud S330S331-ks (aminohapete loend

viitega looduslikule IgG2 järjestusele; vt Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613–2624). Vektor

pDb.CGRP.hFcGI deponeeriti ATCCs 15. juulil 2005 ning see tähistati ATCC

deponeerimisnumbriga PTA-6867.

30

[0219] Vektor pEb.CGRP.hKGI on ekspressioonivektor, mis sisaldab G1 antikeha kerget

ahelat ning sobib kerge ahela lühiajaliseks ekspresseerimiseks. Vektoril pEb.CGRP.hKGI

on nukleotiidijärjestused, mis vastavad järgmistele piirkondadele: närilise

82 EE-EP 1 957 106 B2

tsütomegaloviiruse promootorpiirkond (nukleotiidid 2–613); inimese EF-1 intron

(nukleotiidid 614–1149); inimese kasvuhormooni signaalpeptiid (nukleotiidid 1160–1237);

antikeha G1 kerge ahela varieeruv piirkond (nukleotiidid 1238–1558); inimese kapa ahela

pidev piirkond (nukleotiidid 1559–1882). Vektor pEb.CGRP.hKGI deponeeriti ATCCs

15. juulil 2005 ning see tähistati ATCC deponeerimisnumbriga PTA-6866. 5

[0220] Biacore'i analüüs afiinsuse kindlaks määramiseks. G1 monoklonaalse antikeha või

selle variantide afiinsused määrati kindlaks kas 25 °C või 37 °C juures, kasutades selleks

Biacore3000™ pinna plasmonresonantsi (SPR) süsteemi (Biacore, INC, Piscataway NJ).

Afiinsuse kindlaks määramiseks püüti N-otsast biotinüülitud CGRP või selle fragmendid 10

kinni eelnevalt immobiliseeritud streptavidiini kaudu (SA sensorkiibil) ning mõõdeti

antikeha G1 fragmentide või variantide seondumiskineetikat, mida titreeriti kiibil asuva

CGRP või selle fragmendi kohal. Kõik Biacore'i analüüsid teostati HBS-EP voolavas

puhvris (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% v/v polüsorbaat

P20). CGRP pindade ettevalmistamiseks lahjendati N-biotinüülitud CGRP 15

kontsentratsioonini, mis oli väiksem kui 0,001 mg/mL, HBS-EP puhvrisse ning see pritsiti

erinevaid kokkupuuteaegu kasutades üle SA sensorkiibi. Madala suutlikkusega pindu, mis

vastavad püüdmistasemetele <50 vastusühikut (RU), kasutati kõrge resolutsiooniga

kineetilisteks uuringuteks, samas kui kõrge suutlikkusega pindu (ligikaudu 800 RU

kinnipüütud CGRPsid) kasutati kontsentratsiooniuuringuteks, skriinimiseks ning lahuse 20

afiinsuse kindlaks määramiseks. Kineetilised andmed saadi antikeha G1 Fabi

seerialahjendamisest kahe-või kolmekordsetes inkrementides, mille tulemusel saadi

kontsentratsioonid vahemikus 1uM-0.1nM (eesmärgiks oli 0,1–10 x prognoositud KD-st).

Proove pritsiti tüüpiliselt 1 minutiks kontsentratsioonis 100 µL/min ning seejuures

võimaldati vähemalt 10-minutilisi dissotsiatsiooniaegu. Iga seondumistsükli järel 25

regenereeriti pinnad 25 mM NaOHga 25% v/v etanoolis, mis pidas vastu rohkem kui

sadadele tsüklitele. Kõik titreerimise seeriad (mis tüüpiliselt genereeriti kahes eksemplaris)

sobisid üldiselt 1:1 Langmuiri seondumismudelisse, kus kasutati BIAevaluation

programmi. See andis tulemuseks ainulaadse kineetilise suhtarvu assotsiatsiooni- ja

dissotsiatsioonikonstantide paari (vastavalt kon ja koff) iga seondumise interaktsiooni jaoks, 30

mille suhtarv andis dissotsiatsiooni tasakaalukonstandi (KD = koff/kon). Sellisel viisil

kindlaks määratud afiinsused (KD väärtused) on loetletud tabelites 6 ja 7.

83 EE-EP 1 957 106 B2

[0221] Äärmiselt madalate off-kiirustega seondumise interaktsioonide kõrge

resolutsiooniga analüüs. Äärmiselt madalate off-kiirustega interaktsioonide puhul (eelkõige

antikeha G1 Fabi seondumine inimese □-CGRPga kiibil 25 °C juures) saadi afiinsused

kaheosalises katses. Eespool kirjeldatud protokolli kasutati alljärgnevate

modifikatsioonidega. Assotsiatsioonikiiruse konstant (kon) määrati kindlaks 2-kordse 5

titreerimisseeria pritsimisega (kahes eksemplaris), mis oli vahemikus 550 nM-1 nM, 30

sekundiks kontsentratsioonis 100 μl/min ning võimaldades seejuures üksnes 30-sekundilist

dissotsiatsioonifaasi. Dissotsiatsioonikiiruse konstant (koff) määrati kindlaks sama

titreerimisseeria (kahes eksemplaris) kolme kontsentratsiooni (kõrge, keskmise ja madala)

pritsimisega 30 sekundiks ning võimaldades seejuures 2-tunnist dissotsiatsioonifaasi. Iga 10

interaktsiooni afiinsus (KD) saadi mõlemat tüüpi katsetest saadud kon ja koff väärtuste

kombineerimise teel, nagu on näidatud tabelis 5.

[0222] Lahuse afiinsuse kindlaks määramine Biacore'iga. Antikeha G1 lahuse afiinsust roti

α-CGRP ja F37A (19–37) inimese α-CGRP suhtes mõõdeti Biacore'iga 37 °C juures. 15

Kasutati kõrge suutlikkusega CGRP kiibi pinda (tuvastamise eesmärkidel valiti kõrge

afiinsusega α-CGRP) ning HBS-EP voolaval puhvril lasti voolata kiirusega 5 μl/min.

Antikeha G1 Fab fragmenti püsiva kontsentratsiooni 5 nM juures (eesmärgiks oli lahusel

põhineva interaktsiooni prognoositud KD tase või alla selle) inkubeeriti konkureeriva

peptiidiga, milleks oli kas roti α-CGRP või F37A (19–37) inimese α-CGRP, 20

lõppkontsentratsiooniga vahemikus 1 nM kuni 1 μM 3-kordsetes seerialahjendustes.

Antikeha G1 Fab lahused pritsiti lahusel põhineva konkureeriva peptiidi juuresolekul või

selle puudumisel kiibil olevale CGRPle ning jälgiti lahuse konkurentsi tagajärjel kiibil

tuvastatud seondumisreaktsioonide ammendumist. Need seondumisreaktsioonid teisendati

„vaba Fabi kontsentratsioonideks” kalibreerimiskõverat kasutades, mis konstrueeriti üksnes 25

titreeriva antikeha G1 Fabi poolt (5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,325 ja 0 nM) üle kiibil asuva CGRP.

„Vaba Fabi kontsentratsioonid” kavandati konkureeriva lahusel põhineva peptiidi

kontsentratsiooni suhtes, mida kasutati iga andmepunkti genereerimiseks ning sobitati

lahustumisafiinsuse mudelisse BIAevaluation tarkvara kasutades. Lahustumisafiinsused,

mis sellisel viisil (kaudselt) kindlaks määrati, on välja toodud tabelites 5 ja 7 ning neid 30

kasutati afiinsuste valideerimiseks, mis saadi siis, kui Fabid pritsiti vahetult üle kiibil

asuvate N-biotinüülitud CGRPde. Tihe kokkulepe afiinsuste vahel, mis nende kahe

84 EE-EP 1 957 106 B2

meetodiga kindlaks määrati, kinnitab, et CGRP N-biotinüülitud versiooni kinnitamine

kiibile ei muuda selle loomulikku lahuse seaondumisaktiivsust.

[0223] Alljärgnevas tabelis 5 on välja toodud antikeha G1 seondumisafiinsused inimese α-

CGRP, inimese β-CGRP, roti α-CGRP ja roti β-CGRP suhtes, mis määrati kindlaks 5

Biacore'i analüüsiga, lastes Fab-fragmentidel voolata üle SA kiibil asuvate N-biotinüülitud

CGRPde. Äärmiselt madalate off-kiirustega interaktsioonide seondumisafiinsuste paremaks

lahendamiseks määrati afiinsused kindlaks ka kaheosalises katses, et täiendada käesoleva

analüüsi suundumust, ning samuti määrati kindlaks roti α-CGRP interaktsiooni

lahustumisafiinsus (vastavalt eespool kirjeldatule). Mõlemas analüüsi suundumuses 10

mõõdetud afiinsuste tihe kokkulepe kinnitab, et loodusliku roti α-CGRP seondumisafiinsus

lahuses ei muutu, kui see N-biotinüülitakse ja kinnitatakse SA kiibile.

Tabel 5. Üle kiibil asuvate CGRPde titreeritud antikeha G1 Fabide seondumisafiinsused

15

CGRP kiibil Tempera-

tuur (°C)

kon (1/Ms) koff (1/s) KD (nM)

Inimese α-CGRP 25 1,86 × 105 7,80 × 10-6 0,042 (7%, n=4)*

Inimese α-CGRP 37 5,78 × 105 3,63 × 10-5 0,063 (4%, n=2)*

Inimese β-CGRP 37 4,51 × 105 6,98 × 10-5 0,155

Roti α-CGRP 25 5,08 × 104 6,18 × 10-5 1,22 (12%, n=2)*

Roti α-CGRP 37 1,55 × 105 3,99 × 10-4 2,57* (lahus KD=10 (50%,

n=4)**

Roti β-CGRP 37 5,16 × 105 7,85 × 10-5 0,152

* α-CGRPde (roti ja inimese) afiinsused määrati kindlaks kõrge resolutsiooniga

kaheosaleses katses, kus dissotsiatsioonifaasi jälgiti 2 tundi (kon, koff ja KD väärtused

tähistavad n replitseerimiskatsete keskmist standardhälbega, mida ekspresseeriti

protsentuaalse variatsioonina). β-CGRPde (roti ja inimese) afiinsused määrati kindlaks

üldise analüüsiga, kasutades ainult 20-minutilist dissotsiatsioonifaasi, mis ei olnud

piisavalt täpne nende päris off-kiiruste määramiseks (nende off-kiirused on tõenäoliselt

85 EE-EP 1 957 106 B2

CGRP kiibil Tempera-

tuur (°C)

kon (1/Ms) koff (1/s) KD (nM)

aeglasemad, kui siin esitatud, ning seetõttu on nende afiinsused tõenäoliselt isegi

kõrgemad). Antikeha G1 Fab eraldus ülimalt aeglaselt kõikidest CGRPdest (välja

arvatud roti α-CGRPst) off-kiirustega, mis lähenesid Biacore'i analüüsi resolutsiooni

piirile (eelkõige 25°C juures).

**Lahustumisafiinsused määrati kindlaks seondumisreaktsioonide ammendumise

mõõtmisega, mis tuvastati kiibil oleva CGRP juures antikeha G1 Fabi puhul, mida oli

eelnevalt inkubeeritud lahusel põhineva roti α-CGRP konkurendiga.

[0224] Alljärgnevas tabelis 6 on välja toodud antikehad, millel on aminohappejärjestuse

variatsioonid võrreldes antikehaga G1, ning nende afiinsused roti α-CGRP ja inimese α-

CGRP suhtes. Kõiki tabelis 6 välja toodud variantide aminohappe asendusi kirjeldatakse G1

järjestuse suhtes. Fab-fragmentide seondumisafiinsused määrati kindlaks Biacore'i 5

analüüsiga, lastes neil voolata üle SA kiibil olevate CGRPde.

Tabel 6. Aminohappejärjestused ja seondumisafiinsuse andmed antikeha G1 variantide

kohta, mis määrati kindlaks 37 °C juures Biacore'i analüüsiga.

Kloon L1 L2 H2 HC-FW3 α-rott α-rott α-inimene α-inimene

koff (1/s) KD (nM) koff (1/s) KD (nM)

G1 3,91×10-4 2,57 3,63×10-5 0,063

M1 A100L 1,10×10-3 1,73×10-4

M2 L99A 2,6×10-3 58 3,1×10-4 3

A100R

M3 L99A 2,0×10-3 61 2,1×10-4 1,7

A100S

M4 L99A 1,52×10-3 84,4 6,95×10-5 0,43

A100V

M5 L99A 7,35×10-4 40,8 3,22×10-5 0,20

86 EE-EP 1 957 106 B2

Kloon L1 L2 H2 HC-FW3 α-rott α-rott α-inimene α-inimene

koff (1/s) KD (nM) koff (1/s) KD (nM)

A100Y

M6 L99N 7,84×10-4 43,6 1,33×10-4 0,83

M7 L99N 9,18×10-4 51,0 2,43×10-4 1,52

A100C

M8 L99N 7,45×10-4 41,4 9,20×10-5 0,58

A100G

M9 L99N n,d, n,d, 1,00×10-5 0,06

A100Y

M10 L99S 1,51×10-3 83,9 1,73×10-4 1,08

A100S

M11 L99S 4,83×10-3 268,3 2,83×10-4 1,77

A100T

M12 L99S 1,94×10-3 107,8 1,01×10-4 0,63

A100V

M13 L99T 1,84×10-3 102,2 1,86×10-4 1,16

A100G

M14 L99T n,d, n,d, 1,00×10-5 0,06

A100K

M15 L99T 1,15×10-3 63,9 1,58×10-5 0,10

A100P

M16 L99T 9,96×10-4 55,3 1,65×10-4 1,03

A100S

M17 L99T 2,06×10-3 114,4 1,85×10-4 1,16

87 EE-EP 1 957 106 B2

Kloon L1 L2 H2 HC-FW3 α-rott α-rott α-inimene α-inimene

koff (1/s) KD (nM) koff (1/s) KD (nM)

A100V

M18 L99V 1,22×10-3 67,8 7,03×10-5 0,44

A100G

M19 L99V n,d, n,d, 1,00×10-5 0,06

A100R

M20 R28W L99R 1,44×10-3 80,0 1,36x10-4 0,85

A100L

M21 R28W L99S 6,95×10-4 15,2 1,42×10-4 1,23

M22 R28W L99T 1,10×10-3 61,1 1,16×10-4 0,73

M23 R28G L99T 7,99×10-4 44,4 1,30×10-4 0,81

A100V

M24 R28L L99T 1,04×10-3 57,8 1,48×10-4 0,93

A100V

M25 R28N L99T 1,4×10-3 76 1,4×10-4 1,3

A100V

M26 R28N A57G L99T 9,24×10-4 51,3 1,48×10-4 0,93

A100V

M27 R28N L99T 3,41×10-3 189,4 3,57×10-4 2,23

T30A A100V

M28 R28N E54R L99T 1,25×10-3 69,4 9,96×10-5 0,62

T30D A57N A100V

M29 R28N L99T 3,59×10-3 199,4 3,80×10-4 2,38

T30G A100V

88 EE-EP 1 957 106 B2

Kloon L1 L2 H2 HC-FW3 α-rott α-rott α-inimene α-inimene

koff (1/s) KD (nM) koff (1/s) KD (nM)

M30 R28N E54K L99T 6,38×10-3 354,4 5,90×10-4 3,69

T30G A57E A100V

M31 R28N E54K L99T 3,61×10-3 200,6 3,47×10-4 2,17

T30G A57G A100V

M32 R28N E54K L99T 2,96×10-3 164,4 2,71×10-4 1,69

T30G A57H A100V

M33 R28N E54K L99T 9,22×10-3 512,2 7,50×10-4 4,69

T30G A57N A100V

S58G

M34 R28N E54K L99T 2,17×10-3 120,6 6,46×10-4 4,04

T30G A57N A100V

S58T

M35 R28N E54K L99T 3,99×10-3 221,7 3,39×10-4 2,12

T30G A57S A100V

M36 R28N L99T 4,79×10-3 266,1 2,39×10-4 1,49

T30R A100V

M37 R28N A57G L99T 1,45×10-3 80,6 2,26×10-4 1,41

T30S A100V

M38 R28N L99T 5,11×10-3 283,9 2,18×10-4 1,36

T30W A100V

M39 R28N G50A A57N L99T 9,95×10-3 552,8 4,25×10-4 2,66

L56T S58Y A100V

M40 R28N G50A E54K L99T 0,36 20000,0 1,28×10-3 8,00

89 EE-EP 1 957 106 B2

Kloon L1 L2 H2 HC-FW3 α-rott α-rott α-inimene α-inimene

koff (1/s) KD (nM) koff (1/s) KD (nM)

L56T A57L A100V

M41 R28N G50A E54K L99T 4,53×10-3 251,7 2,10×10-4 1,31

L56T A57N A100V

E64D

M42 R28N G50A E54K L99T 7,52×10-3 417,8 4,17×10-4 2,61

L56T A57N A100V

H61F

M43 R28N G50A E54K L99T 4,53×10-3 251,7 2,63×10-4 1,64

L56T A57N A100V

S58C

M44 R28N G50A E54K L99T 6,13×10-3 443 2,10×10-4 2,05

L56T A57N A100V

S58E

M45 R28N G50A E54K L99T 5,58×10-3 259 2,11×10-4 1,85

L56T A57N A100V

S58E

E64D

M46 R28N G50A E54K L99T 2,94×10-3 163,3 5,39×10-4 3,37

L56T A57N A100V

S58E

H61F

M47 R28N G50A E54K L99T 8,23×10-3 457,2 3,32×10-4 2,08

L56T A57N A100V

90 EE-EP 1 957 106 B2

Kloon L1 L2 H2 HC-FW3 α-rott α-rott α-inimene α-inimene

koff (1/s) KD (nM) koff (1/s) KD (nM)

S58G

M48 R28N G50A E54K L99T 0,0343 1905,6 8,42×10-4 5,26

L56T A57N A100V

S58L

M49 R28N G50A E54K L99T 0,0148 822,2 5,95×10-4 3,72

L56T A57N A100V

S58Y

H61F

M50 R28N G50A E54K L99T 5,30×10-3 294,4 4,06×10-4 2,54

L56T A57R A100V

M51 R28N L56I E54K L99T 1,18×10-3 65,6 1,31×10-4 0,82

A57G A100V

M52 R28N L56I E54K L99T 2,29×10-3 127,2 2,81×10-4 1,76

A57N A100V

S58A

M53 R28N L56I E54K L99T 1,91×10-3 106,1 3,74×10-4 2,34

A57N A100V

S58G

M54 R28N G50A E54K L99T 2,16×10-3 120,0 1,79×10-3 11,19

T30A A57N A100V

S58P

M55 R28N L56S E54K L99T 5,85×10-3 325,0 4,78×10-4 2,99

T30A A57N A100V

91 EE-EP 1 957 106 B2

Kloon L1 L2 H2 HC-FW3 α-rott α-rott α-inimene α-inimene

koff (1/s) KD (nM) koff (1/s) KD (nM)

S58E

E64D

M56 R28N L56S E54K L99T 9,35×10-3 519,4 4,79×10-4 2,99

T30D A57N A100V

H61F

M57 R28N L56S E54K L99T 0,0104 1,200 3,22×10-4 3,08

T30D A57N A100V

S58E

M58 R28N L56S E54K L99T No binding n,d, 1,95×10-3 12,19

T30D A57N A100V

S58I

H61F

M59 R28N L56S E54K L99T 0,0123 683,3 5,24×10-4 3,28

T30D A57N A100V

S58N

H61F

M60 R28N L56S E54K L99T 0,0272 1511,1 9,11×10-4 5,69

T30D A57N A100V

S58R

H61F

M61 R28N A51H E54Q L99T 5,21×10-3 289,4 4,59×10-4 2,87

T30G A57N A100V

H61F

92 EE-EP 1 957 106 B2

Kloon L1 L2 H2 HC-FW3 α-rott α-rott α-inimene α-inimene

koff (1/s) KD (nM) koff (1/s) KD (nM)

M62 R28N A51H E54K L99T 5,75×10-3 242 5,57×10-4 5,86

T30G L56T A57N A100V

S58E

M63 R28N G50A E54K L99T 2,65×10-3 147,2 1,50×10-3 9,38

T30G A57N A100V

S58T

M64 R28N G50A E54K L99T 0,0234 1300,0 1,32×10-3 8,25

T30G A57N A100V

S58V

M65 R28N G50A E54K L99T 4,07×10-3 226,1 8,03×10-4 5,02

T30G L56I A57C A100V

M66 R28N L56I E54K L99T 5,11×10-3 283,9 5,20×10-4 3,25

T30G A57E A100V

M67 R28N L56I E54K L99T 1,71×10-3 95,0 8,20×10-4 5,13

T30G A57F A100V

M68 R28N L56I E54K L99T 6,76×10-3 375,6 4,28×10-4 2,68

T30G A57N A100V

S58D

E64D

M69 R28N L56I E54K L99T 1,81×10-3 100,6 7,33×10-4 4,58

T30G A57N A100V

S58E

M70 R28N L56I E54K L99T 6,07×10-3 337,2 5,59×10-4 3,49

93 EE-EP 1 957 106 B2

Kloon L1 L2 H2 HC-FW3 α-rott α-rott α-inimene α-inimene

koff (1/s) KD (nM) koff (1/s) KD (nM)

T30G A57S A100V

M71 R28N L56I E54K L99T 2,12×10-3 117,8 1,28×10-3 8,00

T30G A57Y A100V

M72 R28N L56S E54K L99T 3,95×10-3 219,4 4,00×10-4 2,50

T30G A100V

M73 R28N L56S E54K L99T 3,00×10-3 166,7 2,55×10-4 1,59

T30G A57N A100V

S58Y

E64D

M74 R28N L56S E54K L99T 6,03×10-3 335,0 5,97×10-4 3,73

T30G A57S A100V

M75 R28N L56S E54K L99T 1,87×10-2 1038,9 1,16×10-3 7,25

T30G A57V A100V

M76 R28N G50A A57G L99T 1,16×10-3 64,4 3,64×10-4 2,28

T30S L56T A100V

M77 R28N G50A E54K L99T 0,0143 794,4 4,77×10-4 2,98

T30S L56T A57D A100V

M78 R28N G50A E54K L99T 0,167 9277,8 1,31×10-3 8,19

T30S L56T A57N A100V

S58T

M79 R28N G50A E54K L99T 0,19 10555,6 1,29×10-3 8,06

T30S L56T A57P A100V

M80 R28N L56I E54K L99T 0,0993 5516,7 2,09×10-3 13,06

94 EE-EP 1 957 106 B2

Kloon L1 L2 H2 HC-FW3 α-rott α-rott α-inimene α-inimene

koff (1/s) KD (nM) koff (1/s) KD (nM)

T30S A57N A100V

S58V

M81 R28N L56S E54K L99T 4,29×10-3 238,3 4,90×10-4 3,06

T30S A57N A100V

S58E

M82 R28N A51H A57N L99T 6,99×10-3 388,3 8,77×10-4 5,48

T30V L56T A100V

M83 R28N A51H E54K L99T No binding n,d, 9,33×10-4 5,83

T30V L56T A57N A100V

S58M

H61F

M84 R28N A51H E54N L99T 1,76×10-2 977,8 1,08×10-3 6,75

T30V L56T A57N A100V

Kõik CDRid hõlmavad nii Kabati kui ka Chothia CDRe. Aminohappejäägid on

nummerdatud järjestikku (vt joonist FIG 5). Kõikide kloonide L3+H1+H3 järjestused on

G1ga identsed.

KD = koff/kon. Kõik koff väärtused määrati kindlaks skriinimisrežiimis, välja arvatud need,

mis on alla joonitud, mis saadi Fabi kontsentratsiooniseeria üldise analüüsiga (G1

analüüsiti kõrge resolutsiooniga režiimis). Allajoonitud KD väärtused määrati seega

kindlaks katseliselt kon mõõtmisega. Teised kon väärtused on hinnanguliselt samad nagu

M25 puhul.

n.d. = kindlaks määramata

[0225] Epitoobi kindlaks määramiseks inimese α-CGRPl, mille tunneb ära antikeha G1,

kasutati eespool kirjeldatud Biacore'i analüüse. Inimese α-CGRP osteti N-biotinüülitud

versioonina, et võimaldada selle kõrge afiinsusega püüdmist SA sensorkiipide kaudu. G1

95 EE-EP 1 957 106 B2

Fab-fragmendi seondumine inimese α-CGRPga määrati kindlaks kiibil CGRP peptiidi

puudumisel või juuresolekul. Tüüpiliselt pritsiti üle kiibil oleva inimese α-CGRP 2000:1

mol peptiid/Fab lahust (näiteks 10 μM peptiidi 50 nM G1 Fabis). Joonisel FIG 6 on välja

toodud konkureeriva peptiidi poolt blokeeritud seondumise määr. Joonisel FIG 6 välja

toodud andmed näitavad, et peptiidid, mis blokeerivad G1 Fabi seondumist inimese 5

α-CGRP 100% ulatuses, on inimese α-CGRP 1–37 (WT), 8–37, 26–37, P29A (19–37),

K35A (19–37), K35E (19–37) ja K35M (19–37); β-CGRP 1–37 (WT); roti α-CGRP 1-37

(WT); ja roti β-CGRP 1–37 (WT). Kõik need peptiidid on C-otste juurest amideeritud.

Inimese α-CGRP peptiidid F37A (19–37) ja 19–37 (viimane ei ole C-otstest amideeritud)

blokeerisid G1 Fabi seondumist inimese α-CGRPga samuti 80% kuni 90% ulatuses. Inimese 10

α-CGRP peptiid 1–36 (ei ole C-otstest amideeritud) blokeeris G1 Fabi seondumist inimese

α-CGRPga ligikaudu 40% ulatuses. Inimese α-CGRP peptiidi fragment 19–36 (C-otstest

amideeritud); inimese α-CGRP peptiidi fragmendid 1–13 ja 1–19 (kumbki ei ole C-otstest

amideeritud); ning inimese amüliin, kaltsitoniin ja adrenomedulliin (kõik C-otstest

amideeritud) ei konkureerinud kiibil G1 Fabi inimese α-CGRPga seondumise pärast. Need 15

andmed näitavad, et G1 on suunatud CGRP C-otsa epitoobile ning et nii kõige otsmise jäägi

(F37) identsus kui ka selle amidatsioon on seondumise jaoks olulised.

[0226] Samuti määrati kindlaks G1 Fabi seondumisafiinsused inimese α-CGRP variantide

suhtes (37 °C juures). Alljärgnevas tabelis 7 on välja toodud afiinsused, mis on mõõdetud 20

vahetult G1 Fabi titreerimise teel üle kiibil asutavate N-biotinüülitud inimese α-CGRP ja

selle variantide. Tabelis 7 esitatud andmed näitavad, et antikeha G1 seondub C-otsa

epitoobiga ning et F37 ja G33 on kõige olulisemad jäägid. G1 ei seondu CGRPga, kui C-

otsale (mis on amideeritud) lisatakse täiendav aminohappejääk (alaniin).

25

Tabel 7. G1 Fabi seondumisafiinsused inimese α-CGRP suhtes ja selle variandid 37 °C

juures mõõdetuna (nende aminohappejärjestusi vt tabelist 4)

CGRP kiibil kon (1/Ms) koff (1/s) KD (nM)

1–37 (WT) 4,68×105 7,63×10-5 0,16 (kõrge resolutsioon KD = 0,06)

19–37 4,60×105 7,30×10-5 0,16

25–37 3,10×105 8,80×10-5 0,28

96 EE-EP 1 957 106 B2

CGRP kiibil kon (1/Ms) koff (1/s) KD (nM)

F27A (25–37) 3,25×105 1,24×10-4 0,38

V28A (25–37) 3,32×105 9,38×10-5 0,28

P29A (25–37) 2,26×105 1,78×10-4 0,79

T30A (25–37) 1,79×105 8,41×10-5 0,47

N31A (25–37) 2,17×105 1,14×10-4 0,53

V32A (25–37) 2,02×105 3,46×10-4 1,71

G33A (25–37) 2,07×105 0,0291 141

S34A (25–37) 2,51×105 7,64×10-4 3,04

K35A (19–37) 2,23×105 2,97×10-4 1,33

K35E (19–37) 5,95×104 5,79×10-4 9,73

K35M (19–37) 2,63×105 1,34×10-4 0,51

K35Q (19–37) 1,95×105 2,70×10-4 1,38

F37A (25–37) 8,90×104 8,48×10-3 95 (lahus KD = 172 nM)

38A (25–38A) - - Seondumist ei tuvastatud

[0227] Eespool välja toodud andmed näitavad, et epitoop, millega antikeha G1 seondub,

asub inimese α-CGRP C-otsa lõpus ning et aminohapped 33 ja 37 inimese α-CGRPl on

olulised antikeha G1 seondumise jaoks. Samuti on seondumise jaoks oluline jäägi F37

amidatsioon. 5

Näide 5: CGRP-vastase antagonist-antikeha G1 mõju roti jäsemenärvi

stimuleerimisega esile kutsutud naha vasodilatatsioonile

[0228] CGRP-vastaste antikeha G1 antagonistliku toime testimiseks testiti selle antikeha 10

mõju roti jäsemenärvi stimuleerimisega esile kutsutud naha vasodilatatsioonile, kasutades

selleks näites 3 kirjeldatud rotimudelit. Lühidalt öeldes hoiti rotte anesteesia all 2%

isofluraaniga. Katse alguses anti bretüüliumtosülaati (30 mg/kg, manustati intravenoosselt),

97 EE-EP 1 957 106 B2

et viia jäsemenärvi sümpateetiliste kiudude samaaegsest stimuleerimisest tingitud

vasokonstriktsioon miinimumini. Kehatemperatuuri hoiti 37 °C juures rektaalse indikaatori

kasutamisega, mis oli termostaatiliselt ühendatud kontrollitud temperatuuriga

soojendustekiga. Parempoolse tagajäseme jäsemenärv paljastati kirurgiliselt, lõigati

proksimaalselt ning kaeti kuivamise vältimiseks plastmähisega. Tagumise käpa naha 5

mediodorsaalse külje kohale paigutati Doppleri laserindikaator, kuna jäsemenärv ergutab

selle piirkonna tegevust. Naha verevoolu, mida mõõdeti vererakkude vooluna, jälgiti

Doppleri laser-voolumeetriga. Katsetes, mis teostati antikeha mõjude kindlaks määramiseks

kahe tunni jooksul pärast süstimist ja kolmkümmend kuni nelikümmend viis minutit pärast

bretüüliumtosülaadi süstimist, kui stabiilne baastaseme vool (vähem kui 5% varieerumist) 10

oli saavutatud vähemalt 5 minutiks, asetati närv plaatinast bipolaarsetele elektroodidele

ning seda stimuleeriti elektriliselt (2Hz, 10V, 1 ms, 30 sekundit) ning seejärel uuesti 20

minuti pärast. Keskmist verevoolu reaktsiooni nende kahe stimuleerimise suhtes kasutati

baastaseme reaktsiooni (aeg 0) tuvastamiseks elektrilise stimuleerimise suhtes. Seejärel

manustati antikeha G1 (1 mg/kg või 10 mg/kg) või vehiikulit (PBS koos 0,01% Tween 20ga 15

võrdses mahus 10 mg/kg G1ga) intravenoosselt (IV). Seejärel stimuleeriti närvi (2 Hz, 10V,

1 ms, 30 sekundit) 30 minutit, 60 minutit, 90 minutit ja 120 minutit pärast antikeha

manustamist. Loomi hoiti anesteesia all ligikaudu kolm tundi. Kumulatiivset muutust naha

verevoolus hinnati voolu-aja kõvera aluse pindalaga (AUC, mis on võrdne muutusega

voolus, mida on korrutatud muutusega ajas) iga voolu reaktsiooni puhul elektriimpulsiga 20

stimuleerimistele.

[0229] Nagu joonisel FIG 7 näha, inhibeeris jäsemenärvile elektriimpulsside

rakendamisega stimuleeritud verevoolu suurenemist antikeha G1 olemasolu

kontsentratsioonis 1 mg/kg (manustatud intravenoosselt) võrreldes vehiikuliga, kui 25

jäsemenärvi stimuleeriti elektriliselt 90 minutit pärast antikeha manustamist. Jäsemenärvile

elektriimpulsside rakendamisega stimuleeritud verevoolu suurenemist inhibeeris antikeha

G1 olemasolu kontsentratsioonis 10 mg/kg (manustatud intravenoosselt) võrreldes

vehiikuliga, kui jäsemenärvi stimuleeriti elektriliselt 90 minutit ja 120 minutit pärast

antikeha manustamist. 30

[0230] Katsetes, mille eesmärgiks oli jäsemenärvi analüüsis kindlaks määrata antikehade

mõjud pikema aja jooksul, süstiti rottidele intravenoosselt näidustatud annustes antikeha 24

98 EE-EP 1 957 106 B2

tundi või 7 päeva enne loomade ettevalmistamist jäsemenärvi stimuleerimiseks vastavalt

eespool kirjeldatule. Nendes katsetes oli baastaseme reaktsiooni individuaalsetes rottides

elektriimpulsiga stimuleerimise suhtes enne annustamist võimatu kindlaks määrata, seetõttu

võrreldi töödeldud rühmi loomadega, kellele annustati vehiikulit (PBS, 0,01% Tween 20)

24 tundi või 7 päeva varem. 5

[0231] Nagu joonistel FIG 8A ja FIG 8B näha, oli jäsemenärvi stimuleerimisega esile

kutsutud verevoolu suurenemised dorsomediaalse tagajäseme nahas märkimisväärselt

inhibeeritud loomade rühmades, kellele annustati 10 mg/kg või 3 mg/kg G1 kas 24 tundi

või 7 päeva enne stimuleerimist võrreldes samadel ajahetkedel vehiikulit saanud 10

rühmadega.

[0232] Joonisel FIG 8C on kujutatud joonistel FIG 8A ja FIG 8B esitatud annuse-

reaktsiooni andmete lähendusanalüüsi tulemusi, et määrata kindlaks annus, mis on vajalik

maksimaalsest mõjust 50% saavutamiseks (EC50). EC50 24 tunni juures on 1,3 mg/kg ja 15

EC50 7 päeva juures on pisut madalam (0,8 mg/kg).

Näide 6: CGRP-vastase antagonist-antikeha mu7E9 akuutne mõju sääremarja arteri

(suletud kraniaalse akna) analüüsis

20

[0233] Suletud kraniaalse akna mudel: Käesoleva katse eesmärgiks oli kindlaks määrata

CGRP-vastaste antagonist-antikehade akuutne mõju ning võrrelda seda CGRP retseptori

antagonisti BIBN4096BS akuutse mõjuga. Katsed teostati vastavalt varasemalt kirjeldatule

(Williamson et al., Cephalalgia 17(4):518–24 (1997)), millesse olid tehtud alljärgnevad

modifikatsioonid. Sprague Dawley rotid (300–400 g) anesteseeriti intraperitoneaalselt 70 25

mg/kg pentobarbitaaliga. Anesteesiat säilitati intravenoosselt 20 mg/kg/h pentobarbitaaliga.

Rotid kanüüliti kägiveeni kaudu kõikide ravimite manustamiseks. Vererõhku jälgiti

indikaatoriga (mikrootsaga kateeder, Millar Instruments), mis suunati reiearteri kaudu

kõhuaorti. Rotid trahheostomeeriti ning hingamise kiirust säilitati 75 hingetõmbe juures

minutis mahus 3,5 ml. Pärast pea fikseerimist stereotaktilises instrumendis ja peanaha 30

eemaldamist tehti vasakpoolse kiiruluu piirkonda vahetult sagitaalse lahi küljele 2×6 mm

suurune ava luu õhendamisega hambapuuri abil. Mikromanipulaatorit kasutades langetati

pinnale plaatinast bipolaarne elektrood ning kaeti raske mineraalõliga. Elektroodi akna

99 EE-EP 1 957 106 B2

küljele tehti veel üks 5×6 mm suurune ava ning see täideti raske mineraalõliga, mille kaudu

jälgiti keskmise meningeaalse arteri (MMA) haru läbimõõtu pidevalt CCD kaamera ja video

dimensiooni analüsaatoriga (Living Systems). Rotid pandi puhkama mitte vähem kui 45

minutiks pärast ettevalmistust. Baastaseme reaktsioon elektriimpulsile tuvastati (15 V, 10

Hz, 0,5 ms impulsid, 30 sekundit) ning seejärel annustati rottidele intraperitoneaalselt katses 5

kasutatud ühendit (10 mg/kg mu7E9, 300 µg/kg BIBN4096BS või PBS 0,01% Tween 20).

Täiendavad elektristimulatsioonid teostati 5 (BIBN4096BS), 30, 60, 90 ja 120 minutit pärast

annustamist. Kõik andmed salvestati Chart tarkvara kasutades (ADInstruments).

[0234] Nagu joonisel FIG 9 näha, blokeerib mu7E9 kontsentratsioonis 10 mg/kg 10

märkimisväärselt elektriväljaga stimuleerimisega esile kutsutud MMA dilatatsiooni

60 minuti jooksul pärast annustamist ning säilitab selle mõju kogu analüüsi kestuse jooksul

(120 minutit). Võrdluseks – BIBN4096BS blokeerib MMA dilatatsiooni 5 minuti jooksul

pärast annustamist, kuid see mõju on täielikult kadunud 90 minutiga. Blokeerimise

suurusjärk BIBN4096BS ja mu7E9 vahel on võrreldavad. 15

Näide 7: CGRP-vastase antagonist-antikeha G1 krooniline mõju sääremarja arteri

(suletud kraniaalse akna) analüüsis

[0235] Käesoleva katse eesmärgiks oli kindlaks määrata, kas CGRP-vastane antikeha 20

suudab 7 päeva pärast annustamist endiselt blokeerida elektriliselt stimuleeritud MMA

dilatatsiooni. Rotid valmistati ette täpselt samamoodi nagu eespool kirjeldatud akuutse katse

puhul (näide 6), kuid alljärgnevate eranditega. Rotte süstiti intravenoosselt (10 mg/kg, 3

mg/kg või 1 mg/kg G1) 7 päeva enne ettevalmistava suletud kraniaalse akna tegemist ja

stimuleerimist. Erinevalt akuutsest katsest oli selle katse puhul võimatu tuvastada 25

baastaseme dilatatsiooni reaktsiooni elektrilise stimulatsiooni suhtes enne annustamist,

mistõttu võrreldi antikeha rühmi vehiikulit (PBS, 0,01% Tween 20) saanud kontrollrühma

MMA dilatatsiooni suhtes. Pärast seda, kui rottidel lasti puhata mitte vähem kui 45 minutit,

stimuleeriti jäsemenärve elektriliselt 30-minutiliste intervallide järel. Stimulatsioonid

teostati 2,5 V, 5 V, 10 V, 15 V ja 20 V, kõik 10 Hz juures, 0,5 ms impulssidega 30 sekundi 30

jooksul.

100 EE-EP 1 957 106 B2

[0236] Nagu joonisel FIG 10 näha, blokeeris G1 kontsentratsioonides 10 mg/kg ja 3 mg/kg

märkimisväärselt elektrilise stimulatsiooniga vahemikus 10 kuni 20 volti esile kutsutud

MMA dilatatsiooni. Need andmed näitavad, et G1 suudab blokeerida elektriliselt

stimuleeritud MMA dilatatsiooni kuni 7 päeva pärast annustamist.

5

Näide 8: Morfiinivõõrutuse nn hot-flush-mudel (võrdlusnäide)

[0237] Morfiinivõõrutuse rotimudel on väljakujunenud närilise mudel menopausiga

kaasnevate kuumahoogude mehhanismide jaoks (Sipe et al., Brain Res. 1028(2):191–202

(2004); Merchenthaler et al., Maturitas 30:307–316 (1998); Katovich et al., Brain Res. 10

494:85–94 (1989); Simpkins et al., Life Sciences 32:1957–1966 (1983)). Põhimõtteliselt on

rottidest tehtud morfiinisõltlased naha alla morfiinigraanulite siirdamisega. Sõltuvuse ajal

süstiti loomadele naloksooni (opioidi antagonist), mis kutsub viivitamatult esile

võõrutusnähud. Võõrutusega kaasneb nahatemperatuuri suurenemine, sisetemperatuuri

langemine, pulsi suurenemise ja seerumi luteiniseeriva hormooni suurenemise. Kõik need 15

nähud sarnanevad oma suurusjärgu ja ajastuse poolest sellele, mis toimub inimeses

kuumahoogude ajal (Simpkins et al., Life Sciences 32:1957–1966 (1983)). Lisaks, kui rotte

töödeldi enne võõrutusnähtude esile kutsumist östradiooliga, olid kuumahoogude

sümptomid väiksemad (Merchenthaler et al., Maturitas 30:307–316 (1998)). Just seetõttu

arvataksegi, et morfiinivõõrutuse mudel matkib kliinilisi kuumahoogusid. 20

[0238] Ettevõttelt Charles River Laboratories telliti ovariektoomia läbinud rotid. Rottides

tekitati mitte vähem kui 7 päeva pärast ovariektoomia teostamist morfiinisõltuvus

morfiinigraanuli (75 mg morfiini) subkutaanse siirdamise teel. Kaks päeva hiljem siirdati

veel 2 graanulit. Järgmisel päeval süstiti rottidele intravenoosselt 10 mg/kg 4901 [**] või 25

vehiikulit (PBS, 0,01% Tween). Kaks päeva pärast teist graanulite siirdamist anesteseeriti

rotid ketamiiniga (90 mg/kg) ja hoiti kergelt vaos. Pinnatemperatuuri termoelement kinnitati

teibiga saba alla ning sisetemperatuuri mõõtmiseks kasutati rektaalset termoelementi.

Andmete salvestamiseks kasutati Chart tarkvara (ADInstruments). Pärast stabiilse

baastaseme temperatuuri salvestamist 15 minuti jooksul süstiti subkutaanselt naloksooni (1 30

mg/kg). Temperatuuri salvestati pidevalt järgmise 60 minuti jooksul. Tulemused on välja

toodud joonistel FIG 11A ja FIG 11B.

101 EE-EP 1 957 106 B2

Bioloogilise materjali deponeerimine

[0239] Alljärgnevad materjalid deponeeriti Ameerika tüübikultuuri kollektsiooniga

(American Type Culture Collection), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia

20110–2209, USA (ATCC): 5

Materjal Antikeha nr ATCC nr Deponeerimise kuupäev

pDb.CGRP.hFcGI G1 raske ahel PTA-6867 15. juuli 2005

pEb.CGRP.hKGI G1 kerge ahel PTA-6866 15. juuli 2005

[0240] Vektor pEb.CGRP.hKGI on polünukleotiid, mis kodeerib G1 kerge ahela

varieeruvat piirkonda ja kerge ahela kapa konstantset piirkonda; ning vektor

pDb.CGRP.hFcGI on polünukleotiid, mis kodeerib G1 raske ahela varieeruvat piirkonda ja

raske ahela IgG2 konstantset piirkonda, mis hõlmab alljärgnevaid mutatsioone: A330P331 10

on muudetud S330S331-ks (aminohapete loend viitega looduslikule IgG2 järjestusele; vt

Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613–2624).

[0241] Need deponeeringud tehti vastavalt mikroorganismide patendiekspertiisiks

deponeerimise rahvusvahelise tunnustamise Budapesti lepingu (Budapesti leping) ja sellega 15

kaasnevate määruste sätetele. See tagab deposiidi elujõulise kultuuri säilimise 30 aastaks

alates deponeerimise kuupäevast. Deposiidid tehakse kättesaadavaks ATCC poolt vastavalt

Budapesti lepingu tingimustele ning kokkuleppele Rinat Neuroscience Corp. ja ATCC

vahel, mis tagab hoiustatud kultuuri järglaskonna püsiva ja piiramatu kättesaadavuse

avalikkusele asjakohase USA patendi väljastamisel või mistahes USA või välismaise 20

patenditaotluse avaldamisel, ükskõik kumb juhtub esimesena, ning mis tagab järglaskonna

kättesaadavuse USA patentide ja kaubamärkide komisjoni liikme poolt määratud isikule,

kes omab sellist õigust vastavalt 35 USC § 122 ja sellega kooskõlas olevatele eeskirjadele

komisjoni liikmete jaoks (sealhulgas 37 CFR § 1.14 konkreetse viitega 886 OG 638).

25

[0242] Patenditaotluse volitatud isik nõustub sellega, et kui deponeeritud materjalide

kultuur, mida kultiveeritakse sobivates tingimustes, sureb või läheb kaduma või hävineb,

asendatakse vastava teate esitamisel see kohe teise samasugusega. Deponeeritud materjali

102 EE-EP 1 957 106 B2

kättesaadavust ei tõlgendata kui luba leiutise praktikas kasutamiseks vastuolus õigustega,

mis on tagatud vastavuses patendiõigusega ja kooskõlas mistahes valitsuse lubadega.

Antikeha järjestused

5

[0243]

G1 raske ahela varieeruva piirkonna aminohappejärjestus (SEQ ID NO:1)

G1 kerge ahela varieeruva piirkonna aminohappejärjestus (SEQ ID NO:2)

10

G1 CDR H1 (laiendatud CDR) (SEQ ID NO:3)

GFTFSNYWIS

G1 CDR H2 (laiendatud CDR) (SEQ ID NO:4)

EIRSESDASATHYAEAVKG

G1 CDR H3 (SEQ ID NO:5) 15

YFDYGLAIQNY

G1 CDR L1 (SEQ ID NO:6)

KASKRVTTYVS

G1 CDR L2 (SEQ ID NO:7)

GASNRYL 20

G1 CDR L3 (SEQ ID NO:8)

SQSYNYPYT

G1 raske ahela varieeruva piirkonna nukleotiidijärjestus (SEQ ID NO:9)

G1 kerge ahela varieeruva piirkonna nukleotiidijärjestus (SEQ ID NO:10) 25

103 EE-EP 1 957 106 B2

G1 raske ahela tervikliku antikeha aminohappejärjestus (sealhulgas modifitseeritud IgG2

vastavalt siin kirjeldatule) (SEQ ID NO:11)

G1 kerge ahela tervikliku antikeha aminohappejärjestus (SEQ ID NO:12) 5

G1 raske ahela tervikliku antikeha nukleotiidijärjestus (sealhulgas modifitseeritud IgG2

vastavalt siin kirjeldatule) (SEQ ID NO:13)

G1 kerge ahela tervikliku antikeha nukleotiidijärjestus (SEQ ID NO:14) 10

104 EE-EP 1 957 106 B2

[0244] Inimese ja roti CGRP (inimese α-CGRP (SEQ ID NO:15); inimese β-CGRP (SEQ

ID NO:43); roti α-CGRP (SEQ ID NO:41); ja roti β-CGRP (SEQ ID NO:44))

aminohappejärjestuste võrdlus: 5

NH2-ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-CONH2 (inimese

α-CGRP) NH2-ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF-CONH2

(inimese β-CGRP) NH2-SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSEAF-

CONH2 (roti α-CGRP) NH2-SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSKAF-

CONH2 (roti β-CGRP). 10

105 EE-EP 1 957 106 B2

Patendinõudlus

1. CGRP-vastane antagonistlik antikeha kasutamiseks indiviidil peavalu ravis või

ärahoidmisel, kusjuures CGRP-vastane antagonistlik antikeha on inimese antikeha või

humaniseeritud antikeha, mille seondumisafiinsus (KD) inimese α-CGRP suhtes on 50 nM 5

või väiksem mõõdetuna pinnaplasmonresonantsiga temperatuuril 37 °C.

2. CGRP-vastane antagonistlik antikeha kasutamiseks vastavalt nõudluspunktile 1, mille

korral CGRP-vastane antagonistlik antikeha seob C-terminaalset fragmenti, mis sisaldab

CGRP aminohappeid 25–37. 10

3. CGRP-vastane antagonistlik antikeha kasutamiseks vastavalt nõudluspunktile 2, mille

korral CGRP-vastane antagonistlik antikeha seob C-terminaalset fragmenti CGRP

aminohapete 25–37 ulatuses.

15

4. Antikeha kasutamiseks vastavalt mis tahes nõudluspunktile 1 kuni 3, mis sisaldab:

a. VH CDR3 järjestusega SEQ ID NO: 5 või järjestusega, mis erineb järjestusest SEQ

ID NO: 5 1 või 2 konservatiivse aminohappeasenduse poolest; ja

b. VL CDR3 järjestusega SEQ ID NO: 8 või järjestusega, mis erineb järjestusest SEQ

ID NO: 8 1 või 2 konservatiivse aminohappeasenduse poolest. 20

5. Antikeha kasutamiseks vastavalt mis tahes eelnevale nõudluspunktile, mis sisaldab VH-

domeeni, mille aminohappejärjestus on vähemalt 90% identne järjestusega SEQ ID NO: 1,

ja VL-domeeni, mille aminohappejärjestus on vähemalt 90% identne järjestusega SEQ ID

NO: 2. 25

6. Antikeha kasutamiseks vastavalt nõudluspunktile 5, kus aminohappejääk SEQ ID NO: 1

positsioonis 99 on L või asendatud A, N-i, S-i, T, V või R-iga ning kus aminohappejääk

SEQ ID NO: 1 positsioonis 100 on A või asendatud L-i, R-i, S-i, V, Y-i, C G, T, K või P-

ga. 30

7. Antikeha kasutamiseks vastavalt nõudluspunktile 1, mis sisaldab VH-domeeni, mis

sisaldab SEQ ID NO: 1, ja VL-domeeni, mis sisaldab SEQ ID NO: 2.

106 EE-EP 1 957 106 B2

8. Antikeha kasutamiseks vastavalt mis tahes eelnevale nõudluspunktile, kus antikeha on

IgG-, IgM-, IgE-, IgA- või IgD-molekul või neist tuletatud.

9. Antikeha kasutamiseks vastavalt mis tahes eelnevale nõudluspunktile, mis sisaldab rasket 5

ahelat, mis on saadud ekspressioonivektoriga ATCC registrinumbriga PTA-6867.

10. Antikeha kasutamiseks vastavalt mis tahes eelnevale nõudluspunktile, mis sisaldab

kerget ahelat, mis on saadud ekspressioonivektoriga ATCC registrinumbriga PTA-6866.

10

11. Antikeha kasutamiseks vastavalt mis tahes eelnevale nõudluspunktile, mis koosneb SEQ

ID NO. 11 kohasest raske ahela järjestusest ja SEQ ID No. 12 kohasest kerge ahela

järjestusest.

12. CGRP-vastane antagonistlik antikeha kasutamiseks vastavalt mis tahes nõudluspunktile 15

1–11, mis sisaldab häiritud efektorfunktsiooniga Fc-piirkonda.

13. CGRP-vastane antagonistlik antikeha kasutamiseks vastavalt mis tahes eelnevale

nõudluspunktile, kusjuures antikeha on humaniseeritud antikeha.

20

14. Antikeha kasutamiseks vastavalt mis tahes eelnevale nõudluspunktile, kus nimetatud

vasomotoorne sümptom on auraga või aurata migreen, hemipleegiline migreen,

kobarpeavalu, migreenne neuralgia, krooniline peavalu või pingepeavalu.

15. Antikeha kasutamiseks vastavalt mis tahes nõudluspunktile 1 kuni 13, kus antikeha on 25

formuleeritud süsteemseks manustamiseks.

EE-EP 1 957 106 B2

1/10

EE-EP 1 957 106 B2

2/10

EE-EP 1 957 106 B2

3/10

EE-EP 1 957 106 B2

4/10

EE-EP 1 957 106 B2

5/10

EE-EP 1 957 106 B2

6/10

EE-EP 1 957 106 B2

7/10

EE-EP 1 957 106 B2

8/10

EE-EP 1 957 106 B2

9/10

EE-EP 1 957 106 B2

10/10

EE-EP 1 957 106 B2

JÄRJESTUSTE LOETELU

[0245]

<110> Rinat Neuroscience Corp. Zeller, Joerg Poulsen, Kristian Abdiche, Yasmin Pons,

Jaume Sierra, Jones Rosenthal, Arnon 5

<120> Kaltsitoniini geeniga seotud peptiidi vastane antagonist-antikeha ja meetodid selle

kasutamiseks

<130> PC19499A

<160> 47

<170> PatentIn versioon 3.3 10

<210> 1

<211> 122

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus

<220> 15

<223> Humaniseeritud antikeha raske ahela variaabel regioon

<400> 1

<210> 2

<211> 107 20

<212> PRT

2

EE-EP 1 957 106 B2

<213> Sünteetiline järjestus

<220>

<223> Humaniseeritud antikeha kerge ahela variaabel regioon

<400> 2

5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus

<220> 10

<223> Humaniseeritud antikeha CDR H1

<400> 3

<210> 4

<211> 19 15

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus

<220>

<223> Humaniseeritud antikeha CDR H2

<400> 4 20

3

EE-EP 1 957 106 B2

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus

<220> 5

<223> Humaniseeritud antikeha CDR H3

<400> 5

<210> 6

<211> 11 10

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus

<220>

<223> Humaniseeritud antikeha CDR L1

<400> 6 15

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus 20

<220>

<223> Humaniseeritud antikeha CDR L2

<400> 7

<210> 8 25

<211> 9

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus

<220>

<223> Humaniseeritud antikeha CDR L3 30

<400> 8

4

EE-EP 1 957 106 B2

<210> 9

<211> 366

<212> DNA

<213> Sünteetiline järjestus

<220> 5

<223> Humaniseeritud antikeha raske ahela variaabel regioon

<400> 9

<210> 10 10

<211> 321

<212> DNA

<213> Sünteetiline järjestus

<220>

<223> Humaniseeritud antikeha kerge ahela variaabel regioon 15

<400> 10

<210> 11

<211> 448

<212> PRT 20

<213> Sünteetiline järjestus

<220>

<223> Humaniseeritud antikeha raske ahela täispikkus

<400> 11

5

EE-EP 1 957 106 B2

6

EE-EP 1 957 106 B2

7

EE-EP 1 957 106 B2

<210> 12

<211> 214

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus 5

<220>

<223> Humaniseeritud antikeha kerge ahela täispikkus

<400> 12

8

EE-EP 1 957 106 B2

<210> 13

<211> 1347

<212> DNA

<213> Sünteetiline järjestus 5

<220>

<223> Humaniseeritud antikeha raske ahela täispikkus

<400> 13

9

EE-EP 1 957 106 B2

<210> 14

<211> 645

<212> DNA

<213> Sünteetiline järjestus 5

<220>

<223> Humaniseeritud antikeha kerge ahela täispikkus

<400> 14

<210> 15 10

<211> 37

<212> PRT

<213> inimene

<400> 15

15

<210> 16

<211> 30

<212> PRT

<213> inimene

<400> 16 20

10

EE-EP 1 957 106 B2

<210> 17

<211> 19

<212> PRT 5

<213> inimene

<400> 17

<210> 18

<211> 19 10

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus

<220>

<223> inimese alfa-CGRP fragmendi variant

<400> 18 15

<210> 19

<211> 19

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus 20

<220>

<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment

<400> 19

<210> 20 25

<211> 19

<212> PRT

11

EE-EP 1 957 106 B2

<213> Sünteetiline järjestus

<220>

<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment

<400> 20

5

<210> 21

<211> 19

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus

<220> 10

<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment

<400> 21

<210> 22

<211> 19 15

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus

<220>

<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment

<400> 22 20

<210> 23

<211> 19

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus 25

<220>

<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment

<400> 23

12

EE-EP 1 957 106 B2

<210> 24

<211> 14

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus 5

<220>

<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment

<400> 24

<210> 25 10

<211> 13

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus

<220>

<223> Inimese alfa-CGRP fragment 15

<400> 25

<210> 26

<211> 13

<212> PRT 20

<213> Sünteetiline järjestus

<220>

<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment

<400> 26

25

<210> 27

<211> 13

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus

<220> 30

13

EE-EP 1 957 106 B2

<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment

<400> 27

<210> 28

<211> 13 5

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus

<220>

<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment

<400> 28 10

<210> 29

<211> 13

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus 15

<220>

<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment

<400> 29

<210> 30 20

<211> 13

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus

<220>

<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment 25

<400> 30

<210> 31

<211> 13

<212> PRT 30

<213> Sünteetiline järjestus

<220>

14

EE-EP 1 957 106 B2

<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment

<400> 31

<210> 32

<211> 13 5

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus

<220>

<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment

<400> 32 10

<210> 33

<211> 13

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus 15

<220>

<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment

<400> 33

<210> 34 20

<211> 13

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus

<220>

<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment 25

<400> 34

<210> 35

<211> 12

<212> PRT 30

<213> Sünteetiline järjestus

<220>

15

EE-EP 1 957 106 B2

<223> Inimese alfa-CGRP fragment

<400> 35

<210> 36

<211> 19 5

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus

<220>

<223> Inimese alfa-CGRP fragment

<400> 36 10

<210> 37

<211> 18

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus 15

<220>

<223> Inimese alfa-CGRP fragment

<400> 37

<210> 38 20

<211> 36

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus

<220>

<223> Inimese alfa-CGRP fragment 25

<400> 38

16

EE-EP 1 957 106 B2

<210> 39

<211> 19

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus 5

<220>

<223> Inimese alfa-CGRP fragment

<400> 39

<210> 40 10

<211> 13

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus

<220>

<223> Inimese alfa-CGRP fragment 15

<400> 40

<210> 41

<211> 37

<212> PRT 20

<213> Rott

<400> 41

<210> 42 25

17

EE-EP 1 957 106 B2

<211> 19

<212> PRT

<213> Sünteetiline järjestus

<220>

<223> Roti alfa-CGRP fragment 5

<400> 42

<210> 43

<211> 37

<212> PRT 10

<213> Inimene

<400> 43

<210> 44

<211> 37 15

<212> PRT

<213> Rott

<400> 44

<210> 45 20

<211> 32

<212> PRT

<213> Inimene

<400> 45

18

EE-EP 1 957 106 B2

<210> 46

<211> 37

<212> PRT

<213> Inimene 5

<400> 46

<210> 47

<211> 52

<212> PRT 10

<213> Inimene

<400> 47