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IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE Candida EN CAVIDAD ORAL DE MUJERES
EMBARAZADAS Y NO EMBARAZADAS.
Andrea Liendo Uzcategui.
UNIVERSIDAD EL BOSQUE
PROGRAMA DE ODONTOLOGÍA - FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
BOGOTÁ DC.- MAYO 2019
HOJA DE IDENTIFICACIÓN
Universidad El Bosque
Facultad Odontología
Programa Odontología
Título: Identificación de especies de Candida en cavidad
oral de mujeres embarazadas y no embarazadas.
Grupo de Investigación: Unidad de Investigación Básica Oral- UIBO
Línea de investigación: Microbiología oral
Otra(s) institución(es)
participante(s):
Facultad de Odontología - Universidad El Bosque
UIBO
Tipo de investigación: Pregrado/Grupo
Residentes: Andrea Liendo Uzcategui
Director: Dra. Diana Marcela Castillo Perdomo
Asesor metodológico: Dra. Gloria Inés Lafaurie Villamil
DIRECTIVOS UNIVERSIDAD EL BOSQUE
HERNANDO MATIZ CAMACHO Presidente del Claustro
JUAN CARLOS LOPEZ TRUJILLO Presidente Consejo Directivo
MARIA CLARA RANGEL G. Rector(a)
RITA CECILIA PLATA DE SILVA Vicerrector(a) Académico
FRANCISCO FALLA Vicerrector Administrativo
MIGUEL OTERO CADENA Vicerrectoría de Investigaciones.
LUIS ARTURO RODRÍGUEZ Secretario General
JUAN CARLOS SANCHEZ PARIS División Postgrados
MARIA ROSA BUENAHORA Decana Facultad de Odontología
MARTHA LILIANA GOMEZ RANGEL Secretaria Académica
DIANA ESCOBAR Directora Área Bioclínica
MARIA CLARA GONZÁLEZ Director Área comunitaria
FRANCISCO PEREIRA Coordinador Área Psicosocial
INGRID ISABEL MORA DIAZ Coordinador de Investigaciones
Facultad de Odontología
IVAN ARMANDO SANTACRUZ CHAVES Coordinador Postgrados Facultad de
Odontología
“La Universidad El Bosque, no se hace responsable de los conceptos emitidos por los
investigadores en su trabajo, solo velará por el rigor científico, metodológico y ético
del mismo en aras de la búsqueda de la verdad y la justicia”.
Agradecimientos
Esta meta lograda se la agradezco principalmente a mi tutora la Dra. Diana Marcela Castillo
Perdomo que con su paciencia y apoyo incondicional me oriento en cada paso con la mejor
disposición y rectitud para lograr un resultado impecable en mi trabajo de grado. De igual
forma a las Doctoras Nathaly Andrea Delgadillo Salgado, Yineth Neuta Poveda y Yormaris
Castillo Romero que estuvieron siempre presentes en el proceso y me acompañaron en el
trabajo de laboratorio incontables veces para lograr la excelencia del resultado final, gracias
totales. Y, por último, pero no menos importante a la Universidad del Bosque que me abrió
camino para convertirme en profesional bajo la ayuda de los mejores especialistas en el área
que compartieron su conocimiento y con el paso de los años nos dieron las herramientas
necesarias para ser los mejores en el campo y no solo eso, sino que nos ayudaron en nuestra
formación personal. Gracias infinitas por el conocimiento, será siempre aplicado.
Dedicatoria
Para comenzar quiero dedicarle esta meta a mi papá que es mi pilar, soporte y apoyo
incondicional en cada momento. Esto es por ti y para ti, gracias por siempre estar.
A mi familia que ante todas la adversidades y problemas continuamente me impulsan a ser
mejor persona cada día, esto no sería sin ustedes. Gracias infinitas a mi madre, Magüisa, papá
Alonso y tía Caro. Soy por ustedes.
A mi angelito Mario Alberto Méndez Sulbaran, que desde el cielo me acompaña siempre, te
dedico este triunfo es mío y tuyo también.
GUÍA DE CONTENIDO
Resumen
Abstract
Lista de tablas
Lista de figuras
Pág.
Introducción……………………………………………………………………………………………….. 1
2. Marco teórico………………………………………………………………………………………….. 2
2.1 Candida……………………………………………………………………………………………………... 2
2.2 Estructura de Candida……………………………………………………………………………… 3
2.3 Factores de virulencia…………………………………………………………………………… 3
2.4 Factores predisponentes………………………………………………………………………. 6
2.5 Epidemiología de la Candida albicans en cavidad oral………………………….. 8
2.5.1 Prevalencia de la Candidiasis oral……………………………………………………… 9
2.6 Métodos de identificación…………………………………………………………………….. 11
3. Planteamiento del problema………………………………………………………………….. 15
4. Justificación…………………………………………………………………………………………….. 16
5. Situación Actual………………………………………………………………………………………. 17
6. Objetivos…………………………………………………………………………………………………. 19
6.1 Objetivo general……………………………………………………………………………………. 19
6.2 Objetivos específicos…………………………………………………………………………….. 19
7. Metodología del Proyecto……………………………………………………………………….. 20
7.1 Tipo de estudio……………………………………………………………………………………... 20
7.2 Población y muestra……………………………………………………………………………… 20
7.3 Métodos y técnicas para la recolección de la información…………………….. 20
7.3.1 Identificación bioquímica…………………………………………………………………... 20
7.3.2 Identificación molecular por PCR………………………………………………………. 21
7.4 Plan de tabulación y análisis…………………………………………………………………. 22
a. Hipótesis estadísticas (alterna y nula)……………………………………………………. 23
8. Consideraciones éticas……………………………………………………………………………. 24
a. Sustento legal………………………………………………………………………………………….. 24
9. Resultados………………………………………………………………………………………………. 25
9.1 Fase descriptiva……………………………………………………………………………………. 25
10. Discusión………………………………………………………………………………………………. 27
11. Conclusiones…………………………………………………………………………………………. 31
12. Referencias bibliográficas…………………………………………………………………….. 32
RESUMEN
Antecedentes: La Candida, un hongo levaduriforme dimorfo que hace parte de la microbiota oral normal, se convierte en invasivo ya que puede presentar esporas y seudohifas patógenas cuando hay una perturbación en el equilibrio de la microbiota o inmunosupresión en el hospedador. La prevalencia de Candida spp aumenta durante el embarazo debido a cambios inmunitarios, hormonales, cambios en el pH salival, factores asociados con la presencia de hiperémesis gravídica, entre otras. Objetivo: Establecer si existe diferencia, entre las especies de Candida en cavidad oral de mujeres embarazadas y no embarazadas. Métodos: Se evaluaron 77 aislamientos de Candida spp almacenados en el cepario de la Unidad de Investigación Básica Oral (UIBO). Se sembraron los aislamientos en agar Saboureaud a 37°C durante 24 horas, una vez obtenidas las colonias puras con morfología típica de levaduras, colonias blancas, grandes, opacas, con olor característico, adicionalmente se realizó coloración de Gram con el objetivo de confirmar la morfología levaduriforme, posterior a esto se realizaron pruebas de identificación bioquímica con panel bioquímico Rapid Yeast Plus, adicionalmente se realizó identificación molecular con PCR convencional para C. albicans. Resultados: Entre la colonización de especies de Candida de los aislamientos de mujeres examinados en este estudio se encontró en el grupo de mujeres embarazadas que C. albicans estaba presente en un 95,6% mientras que C. tropicalis en un 4,4% casi de igual manera en el grupo de mujeres no embarazadas que se encontró C. albicans en un 92,6% y C. tropicalis en un 7,4%. La identificación molecular no logró confirmar ningún aislamiento de C. albicans por lo que podría tratarse de dificultades en la extracción para la obtención del DNA, como lo han reportado en la literatura por lo que se sugiere usar metodologías más robustas para la identificación de hongos como lo es la espectrometría de masas MALDI-TOF. Conclusiones: La identificación bioquímica no muestra diferencias entre las especies de Candida entre las mujeres embarazadas y no embarazadas. Sin embargo, la identificación molecular no es adecuada por lo que estos hallazgos deben ser confirmados por métodos más robustos como la espectrometría de masas.
Palabras Clave: Candida albicans, Candida tropicalis, cavidad oral, embarazo.
ABSTRACT
Background: Candida is a dimorph yeast fungus forming part of the normal oral micro-biota and it becomes invasive due to pathogen spores and pseudohyphae when there is a perturbance of its balance or an immunosuppression of the host. The prevalence of Candida spp increases during pregnancy due to immune, hormonal and salivary pH changes, factors associated with the presence of hyperemesis gravidarum, among others. Objective: to establish if there is a difference between the species of Candida in the oral cavity of pregnant and non-pregnant women. Methods: A sample of 77 isolations of Candida spp stored in cultures at the Basic Oral Research Unit (UIBO) were evaluated. These were planted in isolations of Sabouraud agar at 37 ˚C for 24 hours. Once the pure colonies were obtained with typical yeast morphology – white, large, opaque and characteristic odour – a Gram coloration was carried out in order to conform the morphology. Biochemical tests were done with the RapidYeastPlus panel and conventional PCR for identification of C. albicans. Results: The Candida colonies from women isolations had presence of C. albicans 95.6% and C. tropicalis 4.4% in the pregnant group. The non-pregnant group had C. albicans 92.6% and C. tropicalis 7.4%. Molecular identification did not confirm any isolation of C. albicans, so it may have been a difficulty in the extraction of DNA as has been reported in literature; therefore, the use of more robust methodologies for fungal identification, such as mass spectrometry MALDI-TOF are suggested. Conclusions: Biochemical identification did not show any differences of Candida between pregnant and non-pregnant women. However, molecular identification is not adequate so the results must be confirmed with more robust methods such as mass spectrometry.
Key words: Candida albicans, Candida tropicalis, oral cavity, pregnancy.
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Distribución sociodemográfica de la población……………………………………………………25
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Prevalencia de especies de Candida en mujeres embarazadas y no embarazadas…26
Figura 2. Electroforesis de PCR para la identificación de C. albicans…………………………………26
INTRODUCCIÓN
El género Candida pertenece al reino Fungí, pseudo clase de Deuteromicetos, incluye entre
150 y 200 especies, como levaduras con afinidades ascomicecas y basidiomatosas, según el
género comprende levaduras asperógenas característicamente blancas, algunas de ellas
capaces de formar hifas y pseudohifas. Una característica específica de la patogenicidad de
las especies de Candida es su capacidad para formar biofilms, que los protege de factores
externos tales como las defensas del sistema inmunitario del hospedador y los fármacos
antimicóticos. La incidencia de infecciones por Candida se ha incrementado en los últimos
años debido al uso generalizado de antibióticos de amplio espectro y al creciente número de
personas infectadas por VIH (Virus de la Inmunodeficiencia Humana) y personas
inmunocomprometidas (Neppelenbroek et al., 2014). De esta extensa familia de más de 200
especies solo algunas tienen relevancia clínica en los humanos, como Candida albicans, C.
parapsilosis, C. krusei,C. tropicalis, C. glabrata, C. guilliermondii, C. lusitaniae, C. kefyr, C.
stellatoidea, y recientemente C. ubliniensis. En individuos sanos, las especies de Candida se
consideran levaduras comensales de la cavidad oral. Sin embargo, estos microorganismos
también pueden actuar como patógenos oportunistas, particularmente las llamadas especies
de Candida no albicans, que cada vez son más reconocidas como agentes importantes de
infección humana (Cavalheiro et al., 2018). Se han documentado mayores tasas de Candida
en infecciones fúngicas locales y sistémicas resistentes a agentes antifúngicos. La candidiasis
surge de cepas comensales endógenas que habitan en la cavidad oral, el tracto
gastrointestinal y el sistema genitourinario, durante la infancia la colonización oral por
Candida puede jugar un papel importante para determinar la constitución de la microbiota
normal del adulto (Al-Rusan et al., 2017), por lo tanto este estudio tiene como objetivo
establecer si existe diferencia, entre las especies de Candida en cavidad oral de mujeres
embarazadas y no embarazadas.; lo cual se realizó en el Unidad de Investigación Básica Oral-
UIBO de la universidad el bosque mediante experimentos biológicos in vitro.
2
2. MARCO TEÓRICO
2.1 Candida
El término Candida proviene de la palabra latina candid, es decir, blanco. La Candida es
inofensiva, un hongo levaduriforme dimorfo que se convierte en invasivo ya que puede
presentar esporas y seudohifas patógenas cuando hay una perturbación en el equilibrio de la
microbiota o en la debilidad del hospedador. Este microorganismo es considerado comensal
endógeno, sin embargo, puede pasar a ser causante de enfermedades más por factores
asociados al hospedador que a factores propios del microorganismo, es bastante único en
comparación con la mayoría de las otras enfermedades infecciosas, donde se considera la
virulencia de los organismos siendo el factor clave en la patogenia. Por lo tanto, Candida y sus
especies son estrictamente oportunistas. Podría decirse con eso que ni las infecciones
superficiales ni las sistémicas podrían iniciarse en ausencia de una condición subyacente del
hospedador. Hay muchas especies de Candida, pero el más frecuente que se recupera de la
cavidad oral, tanto en el estado comensal como en los casos de candidiasis oral, es C. albicans.
Se estima que esta especie representa más de 80% de todos los aislamientos de levadura oral
(Raju et al., 2011).
La transición de Candida de un comensal inofensivo a un organismo patógeno es compleja y
está relacionado con sutiles cambios ambientales que llevan a la expresión de una gama de
factores de virulencia. Es el efecto combinado de ambos factores, el anfitrión y el candidato,
los que finalmente contribuyen al desarrollo de candidiasis oral. Independientemente del
tipo de candidiasis, la capacidad de especies de Candida a persistir en las superficies de la
mucosa, la condición inmunológica y sistémica de las personas son un factor importante que
contribuye a su virulencia. Esto es particularmente importante en la cavidad oral, donde el
organismo tiene que resistir la acción de lavado mecánico de un flujo relativamente constante
de saliva hacia el esófago (Raju et al., 2011).
3
2.2 Estructura de la Candida
La pared celular de C. albicans es un organelo dinámico, requerido para la forma celular,
protección contra el ambiente, y para el reconocimiento por el sistema inmune innato del
hospedero. Aunque es una estructura robusta, es también flexible. Los 3 principales
polisacáridos presentes son la quitina, los glucanos y los mananos, que se encuentran
organizados en dos láminas o capas: 1) la capa externa, altamente rica en O-y N- polímeros
de manosa (mananos) que están asociados covalentemente con proteínas para formar
glicoproteínas y 2) la capa interna, que contiene quitina y β-1,3-glucano, constituyentes el
esqueleto de la pared. Las proteínas de la capa externa de la pared están ancladas a la capa
interna predominantemente por glicosilfosfatidilinositol (GPI), y otras están vinculadas a la
estructura a través de β-1,6-glucano que le otorga una mayor flexibilidad (Alburquenque et
al., 2013).
2.3 Factores de virulencia de C. albians
No existe un único factor de virulencia predominante para Candida reconocido, aunque hay
una serie de factores que tienen estado implicado en la promoción del proceso de infección.
Estos incluyen atributos implicados en la adhesión de Candida a superficies orales como la
hidrofobicidad relativa de la superficie celular y presencia de moléculas específicas de
adhesina, la capacidad de resistir mecanismos de defensa inmune del hospedador como lo es
el cambio fenotípico y transición morfológica de levadura a pseudohifa conocido como
efectos, así como la liberación de enzimas hidrolíticas aspartilo secretado, proteinasas y
fosfolipasas que pueden inducir daño a las células del hospedador y que se asocian con la
invasión en el endotelio (Raju et al., 2011).
Estos patógenos son capaces de persistir dentro del hospedador debido al desarrollo de
características de patogenicidad y resistencia a múltiples fármacos, a menudo al fracaso de
las estrategias terapéuticas. Una característica específica de la patogenicidad de las especies
de Candida es su capacidad para formar biofilms, que los protege de factores externos tales
como las defensas del sistema inmune del huésped y los medicamentos antimicóticos. Las
4
características del biofilm dependen de la capacidad de cada especie para producir sustancias
poliméricas extracelulares (EPS) y mostrar crecimiento dimorfo, pero también en el sustrato
del biofilm, la disponibilidad de la fuente de carbono y otros factores. Adicionalmente, el
control transcripcional de procesos como la adhesión, la formación de biopelículas, la
filamentación, y la producción de EPS muestra una gran complejidad y diversidad dentro de
las levaduras patógenas del género Candida. Estas diferencias no solo tienen implicaciones
en la persistencia de colonización e infecciones, sino también sobre la resistencia antifúngica
que se encuentra típicamente en Candida células biofilm, potenciadas por EPS, que funciona
como una barrera a la difusión de medicamentos, y por la sobreexpresión de transportadores
de resistencia a los mismos. La capacidad de interactuar con diferentes especies en las
biopelículas de Candida in vivo también es un factor clave a considerar cuando se trata de
este problema (Cavalheiro et al., 2018).
Además, factores externos, incluida la superficie donde se forma la biopelícula, que puede ser
una capa de células epiteliales o polímeros plásticos muy diversificados, el cóctel de
nutrientes e inhibidores que están presentes en el entorno o la presencia de otros
microorganismos sinérgicos o antagonistas, puede tener un tremendo efecto sobre las
características finales de la biopelícula. Toda esta variabilidad plantea con respecto a los
desafíos del punto de vista clínico, que conduce a la persistencia exitosa de infecciones por
Candida asociadas con altas tasas de mortalidad (Cavalheiro et al., 2018).
Los mecanismos de patogenicidad claramente identificados en C. albicans son: adherencia,
dimorfirmo, «swich» o cambio fenotípico, formación de biopelículas y características de
«fitness» o adaptación, estos mecanismos los describiremos a continuación:
1. Adherencia: Es un mecanismo multifactorial en el que, utilizando varios tipos de
adhesinas dependientes de su estado morfológico, C. albicans modifica su adherencia a
distintas superficies. La máxima expresión de adherencia de esta levadura es la formación de
biopelículas en el hospedero, que persé constituye un mecanismo patogénico. Las adhesinas
más importantes son aquellas tipo aglutinina (Als) miembros de una familia de ocho
proteínas glicosiladas, genéticamente relacionadas, pero de gran variación alélica (Als1 a
Als7 y Als9). Mutaciones en estas adhesinas, se asocian a una importante disminución en la
5
virulencia de C. albicans. De estas proteínas Als3 es especialmente importante en adherencia.
Dimorfismo (morfogénesis): la morfogénesis de C. albicans se define como la transición de la
forma levaduriforme unicelular, a la forma filamentosa (pseudohifas o hifas). La transición
de la forma de levadura a hifas se ve facilitada por determinados nutrientes, un pH cercano
al neutro, una temperatura de 37°C, una concentración de CO² de aproximadamente 5,5%, la
presencia de N-acetil-Dglucosamina, suero, ciertos aminoácidos y biotina. La transición
inversa a partir de las hifas hacia la forma de levadura puede ser provocada por bajas
temperaturas, pH ácido, la ausencia de suero y una mayor concentración de glucosa. Dos
genes importantes para la regulación de la morfogénesis en C. albicans son TUP1, EFG1
(Alburquenque et al., 2013).
2. Invasión: La secreción de proteinasas es fundamental para degradar las barreras del tejido
y obtener nutrientes en el sitio de la infección. Las proteinasas aspárticas secretadas o Saps
de C. albicans hidrolizan proteínas del hospedero tales como, albumina, queratina,
hemoglobina, colágeno, laminina, fibronectina, lactomucina, interleuquina 1β (IL-1β),
cistatina A, e inmunoglobulina A (IgA). Dentro de la familia Sap, se han descrito diez proteínas
(Sap1 a Sap10) y son responsables de la invasión tisular. La producción de Saps además se
correlaciona con la formación de hifas, adherencia y el cambio fenotípico. In vitro las Saps 1,
2 y 3 se expresan en la fase de blastoconidio, mientras que Sap4, Sap5 y Sap6 se expresan en
la fase de hifas. Por su parte Sap9 y 10 se expresan en ambas fases de C. albicans. Las
isoenzimas Sap1 y Sap3, se expresan en infecciones orales y vaginales más que en la
portación. Las fosfolipasas son enzimas que hidrolizan enlaces ésteres de glico-
fosfosfolípidos y, por lo tanto, contribuyen con la invasividad de C. albicans en el tejido.
Candida albicans expresa cuatro tipos fosfolipasas: A, B, C y D, siendo la B la más importante,
teniendo un rol clave en los procesos infecciosos. Todas poseen actividad hidrolasa, pero
además también poseen actividad lisofosfolipasa transacilasa capaz de liberar ácidos grasos
a partir de fosfolípidos y luego transferir un ácido graso libre de lisofosfolípidos a otro
fosfolípido. Un trabajo en el que se compararon cepas de C. albicans aisladas del torrente
sanguíneo con cepas aisladas de cavidad oral de voluntarios sanos, se demostró que las cepas
invasoras produjeron una significativa mayor actividad de fosfolipasa extracelular que las
cepas comensales (Alburquenque et al., 2013).
6
Por otro lado, si se habla sobre C. albicans y sus factores de virulencia es importante
mencionar la participación que existe entre la inmunidad Innata y C. albicans hasta hace poco
tiempo, se sabía muy poco acerca de cómo macrófagos y neutrófilos, células importantes de
la inmunidad innata, reconocían C. albicans como patógeno o cómo la interacción hongo-
leucocito generaba una respuesta inmune. Además, se consideraba a la respuesta inmune
innata como una respuesta primitiva y no sofisticada. Actualmente se sabe que este sistema
no sólo reconoce diversos tipos de microorganismos, sino inicia y modula la respuesta
inmune adaptativa mediada por células (linfocitos) T y B que interactúan con células
presentadoras de antígeno, tales como las células dendríticas. Los tipos celulares que
participan en la inmunidad innata frente a C. albicans son: las células epiteliales y las células
fagocíticas (polimorfonucleares neutrófilos y monocitos-macrófagos y células dendríticas).
En el reclutamiento y activación de estas últimas, participan diversas citoquinas
proinflamatorias y además hay factores solubles involucrados como el sistema de
complemento y anticuerpos. Recientemente se ha descrito que células epiteliales orales y
vaginales pueden inhibir el crecimiento de C. albicans de manera contacto-dependiente.
Aunque las citoquinas proinflamatorias producidas por las células epiteliales no tienen un
efecto antifúngico directo, éstas sirven como señales para las células inflamatorias de las
mucosas para potenciar su función antifúngica. Otras moléculas importantes en la respuesta
inmune innata son las β-defensinas secretadas por las células epiteliales capaces de inactivar
a C. albicans, lo cual será discutido posteriormente. El reconocimiento de C. albicans en su
estado patogénico para activar una respuesta por parte del hospedero se realiza a través de
receptores (PRRs), que reconocen estructuras conservadas llamadas patrones moleculares
asociados a patógenos PAMPs (Alburquenque et al., 2013).
2.4 Factores predisponentes
Se sabe que Candida provoca enfermedad solo si existe un debilitamiento del estado
inmunológico de un individuo, ya sea local o sistémicamente (Alrayyes et al., 2019).
Tras la aparición del Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) y el uso generalizado de la
terapia inmunosupresora, ha habido un gran interés entre los científicos en estos hongos. De
7
las más de 200 especies conocidas de Candida, solo 40 son capaces de causar enfermedades.
Candida albicans es la especie aislada más prevalente en casos de candidiasis sintomática y
asintomática. Además, C. parapsilosis, C. krusei, C. tropicalis, C. glabrata, C. dubliniensis, C.
lusitaniae y C. kefyr, que en conjunto son referidos como no albicans, están cada vez más
involucrados en los casos de Candida y han sido reconocidos como patógenos importantes.
En tales casos, estos comensales invaden y penetran las superficies de la mucosa y forman un
paso esencial en el desarrollo de la candidiasis. Dado que la candidiasis a menudo es causada
por una infección endógena por la especie Candida, es importante estudiar e investigar la
flora comensal normal de huéspedes asintomáticos a nivel de la población (Alrayyes et al.,
2019).
Candida se presentan con mayor frecuencia en la parte posterior del dorso de la lengua y
puede también se puede encontrar en otras superficies del cuerpo como en la vagina y el
tracto digestivo (Alrayyes et al., 2019).
Otros factores que pueden favorecer o influenciar a esta levadura son el estado demográfico
y la higiene oral. Además, las tasas de prevalencia de Candidiasis oral que se han asociado
con más frecuencia a otros factores son el género femenino, las enfermedades sistémicas,
diferentes grupos sanguíneos, el consumo de tabaco y una higiene oral deficiente. También
se han sugerido factores adicionales, como las variaciones geográficas, que afectan el
transporte oral de Candida (Alrayyes et al., 2019).
Otros factores predisponentes que pueden favorecer para que las especies de Candida se
conviertan en patógenos oportunistas, incluyen diabetes mellitus, uso de antibióticos,
anticonceptivos orales, embarazo y terapias hormonales. A pesar de su frecuencia y
morbilidad asociada, las infecciones superficiales de C. albicans no son letales (Mayer et al.,
2013).
Candida albicans pueden causar dos tipos principales de infecciones en humanos: infecciones
superficiales, como candidiasis oral o vaginal, e infecciones sistémicas que amenazan la vida
(Mayer et al., 2013).
8
2.5 Epidemiología de la Candida albicans en cavidad oral
Candida albicans es un comensal frecuente en superficies de la mucosa oral humana,
gastrointestinal y vagina. Ha sido estimado que aproximadamente el 50% de la población
humana porta especies de Candida dentro de la cavidad oral, por lo que C. albicans
comprende 70-80% de los aislamientos. Candida glabrata, Candida dubliniensis, Candida
tropicalis y Candida parapsilosis son los aislamientos de especies más frecuentes de Candida
no albicans de la cavidad oral. Siempre que el equilibrio entre el hongo, los mecanismos de
defensa del hospedador y otros miembros de la microbiota oral se mantienen, se puede
considerar la colonización oral con C. albicans como benigno. Sin embargo, la interrupción de
este equilibrio puede conducir a un crecimiento excesivo de hongos y candidiasis oral
(Hebecker et al., 2014). Por otro lado, la prevalencia conocida de levaduras depende de la
sensibilidad del método de detección, y las desigualdades en varios estudios también reflejan
diferencias en edad, sexo, presencia de dentaduras, hábito de fumar, experiencia de caries,
estado periodontal de la población examinada, y en los sitios muestreados.
Los principales cambios fisiológicos y hormonales se producen durante el embarazo (Jain et
al., 2015), ya que este es un estado dinámico evidenciado por varios cambios transitorios en
el cuerpo de la madre y la cavidad oral no es una excepción (Dhole et al., 2014). Por ello los
cambios que se presentan también tienen efectos sistémicos de gran alcance que se extienden
más allá del sistema reproductivo. La mucosa oral es sensible a muchos cambios sistémicos
dentro del cuerpo, ya sean fisiológicos, metabólicos, hormonales o químicos (Jain et al.,
2015); por este y otros motivos la membrana de la mucosa oral es un excelente indicador del
estado constitucional del paciente (Dhole et al., 2014).
La higiene bucal en mujeres embarazadas se deteriora progresivamente y gradualmente
desde los grupos del primer al segundo al tercer trimestre de la misma manera las
alteraciones fisiológicas. La saliva durante el embarazo puede jugar un papel importante en
la fisiopatología de las afecciones orales observadas como también los cambios en la dieta en
el embarazo temprano, por ejemplo, el consumo regular de bocadillos y bebidas azucaradas
9
para satisfacer los antojos o para prevenir las náuseas, pueden causar una caída en el pH de
la saliva (Jain et al., 2015).
La disminución de los niveles de pH salival durante los trimestres gestacionales está
relacionada con la disminución del tampón de bicarbonato salival, el reflujo y los vómitos
frecuentes, desplazando la microbiota oral, lo que lleva a un aumento de las levaduras,
provocando en consecuencia la manifestación de candidiasis oral (Bett et al., 2019).
Por otro lado, la tormenta de hormonas durante el embarazo, es decir, estrógeno diez veces
mayor a las condiciones fisiológicas y progesterona 30 veces mayor, además del crecimiento
fetal como ya se mencionó inducen cambios fisiológicos y físicos tanto sistémicos como
locales (Dhole et al., 2014). Los efectos de ciertas hormonas durante el embarazo pueden
predisponer a las mujeres embarazadas a la inflamación gingival. Por ejemplo, se sabe que
la progesterona conduce al desarrollo de una inflamación localizada (Jain et al., 2015).
El estrés y la ansiedad durante el embarazo contribuyen a una mala higiene oral, lo que se
potencia en un aumento en el número de lesiones intraorales. Las lesiones orales más
prevalentes durante el embarazo citadas en la literatura incluyen granuloma piógeno,
hiperplasia gingival, candidiasis oral, mordedura de mejillas, glositis migratoria benigna,
úlceras aftosas, y telangiectasia. El conocimiento por parte de los cirujanos dentales sobre la
etiopatogenia, pautas de conservación y tratamiento contribuye a un correcto diagnóstico y
manejo de tales trastornos, pero también a proporcionar instrucciones adecuadas para las
mujeres embarazadas (Bett et al., 2019).
2.5.1 Prevalencia de la Candidiasis oral
Es difícil dar una tasa de prevalencia oral precisa para C. albicans, ya que esto depende de la
edad y la salud de la población estudiada una compilación de datos de un número de informes
mostró que la tasa media para individuos sanos (sin enfermedad subyacente conocida)
17.7% (rango, 1.9-62.3%), mientras que el promedio en pacientes hospitalizados (sin
candidiasis clínica 40.6% (rango, 6.0-69.6%). Estos datos indican que la salud de un individuo
10
es una predisposición factor de colonización de C. albicans. Una gran cantidad de sitios en la
cavidad oral puede ser colonizada; en individuos sanos. C. albicans se suele aislar de la línea
media de los tercios medios y posteriores de la lengua, la mejilla, o la mucosa palatina
(Cannon et al., 1999).
Sin embargo, la tasa de prevalencia oral de estos organismos en la población general fluctúa
entre el 3 y el 75% sin que aparezca ningún síntoma (Alrayyes et al., 2019).
La colonización de la cavidad oral por C. albicans puede definirse como la adquisición y el
mantenimiento de una población estable de células de C. albicans que no da lugar a la
enfermedad clínica. La colonización depende de la velocidad de adquisición, es decir, la
velocidad a la que las células de levadura entran en el crecimiento de la cavidad oral y la
eliminación de las células de la boca por deglución e higiene oral. En un modelo simplificado,
si la tasa de eliminación es mayor que la de adquisición y crecimiento, se llevará a cabo la
limpieza. Si la tasa de eliminación es la misma que la de adquisición y crecimiento, entonces
habrá colonización. Si la tasa es más baja y hay daño tisular, dará lugar a candidiasis. La
presentación de candidiasis dependerá del tejido colonizado, los factores de virulencia
expresados por Candida y la respuesta del hospedador. Entonces, la colonización depende de
varios factores: la adquisición o entrada de células en la cavidad oral, la unión y el crecimiento
de esas células, la penetración de los tejidos y la eliminación de las células de la cavidad oral
(Cannon et al., 1999).
A pesar del predominio de Candida albicans, especies de Candida no albicans como Candida
glabrata, Candida tropicalis, Candida guilliermondii, Candida dubliniensis, Candida
parapsilosis y Candida krusei están emergiendo como colonizadores y patógenos que puede
causar infecciones superficiales y sistémicas. Algunas de estas especies son más resistentes
a los agentes antifúngicos comparativamente. C. glabrata y C. krusei son innatamente más
resistentes al agente antifúngico de uso común fluconazol (Neppelenbroek et al., 2014).
Una identificación rápida y precisa de la enfermedad que puede causar una especie de
Candida es crucial para el tratamiento clínico de candidiasis sistémica. Cuando no existe un
11
diagnóstico prematuro de las infecciones fúngicas son problemáticas porque la mayoría de
los signos clínicos y los síntomas no son específicos, y los cultivos son a menudo negativos o
de ser positivo son demasiado tarde para el inicio de una terapia antifúngica efectiva
(Neppelenbroek et al., 2014).
La prevalencia global de trastornos orales durante el embarazo que fueron mencionados
anteriormente presenta una tasa del 12,4%. Mientras que en relación con los metanálisis de
las lesiones, la hiperplasia gingival fue la lesión más prevalente (17,1%), seguida de
morsicatio buccarum (9.9%) y candidiasis oral (4.4%) (Bett et al., 2019).
2.6 Métodos de identificación
Como Candida es la microbiota residente en cavidad oral, los métodos de aislamiento
apropiados son requeridos para determinar la presencia en la boca junto con su número.
También es importante identificar las cepas infectantes de Candida porque los aislamientos
de las especies de Candida difieren ampliamente, tanto en su capacidad para causar infección
y también en su susceptibilidad a los agentes antifúngicos. Hay varias técnicas fenotípicas
disponibles para identificar aislamientos de Candida, que incluyen el uso de pruebas de
cultivo morfológico, medios de agar diferencial y pruebas de asimilación bioquímica. Estos
métodos se complementan con técnicas moleculares recientes en gran parte reservadas para
investigaciones epidemiológicas (Raju et al., 2011).
Sus principales características se resumen en métodos fenotípicos, métodos no disponibles
comercialmente. Prueba de tubo germinal, formación de clamidosporas y crecimiento
temperatura: la prueba del tubo germinal se considera simple, procedimiento económico y
eficiente para diferenciar C. albicans de otras especies de Candida. Se basa en la observación
que C. albicans produce estructuras similares a tubos (llamadas tubo germinal) cuando se
incuba en suero dentro de 2-4 horas a 37°C. Un tubo germinal o pseudohifa es una extensión
no septada de la célula de levadura que difiere de las hifas verdaderas al no tener
constricciones en el punto de conexión a la célula. La prueba del tubo germinal proporciona
una prueba de identificación rápida para C. albicans que se puede realizar en cultivos
12
primarios o purificados. La formación de estos tubos germinales en suero o un medio similar
puede ser influenciada por varios factores ambientales, como temperatura, concentración de
inóculo, composición del medio, especie de Candida y cepas, pH y contaminación bacteriana.
El suero humano parece ser el mejor medio aditivo para la identificación de C. albicans en
comparación con el suero de caballo, conejo, o varios otros medios, incluyendo suero animal
y RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium). El suero humano ha mostrado una
sensibilidad del 98% y especificidad del 100% cuando se incuba durante hasta 2 h. Una
posible preocupación sobre esto técnica es que algunas especies de Candida no albicans tales
como C. dubliniensis, C. tropicalis y C. parapsilosis pueden también genera un tubo germinal o
pseudohifa en suero, lo que conduce a una identificación errónea si solo se realizan pruebas
superficiales (Neppelenbroek et al., 2014).
La metodología convencional se ha utilizado durante mucho tiempo como identificación de
referencia procedimientos para las especies de Candida. Sin embargo, estos métodos son
laboriosos, requieren mucho tiempo y no son confiables para identificar el amplio espectro
de especies de Candida y por lo general requiere pruebas adicionales. Dadas las limitaciones
de métodos convencionales, varios sistemas comerciales tienen desarrollado para producir
una identificación rápida de la levadura 1.5-72 horas. Aunque estos sistemas han sido
extensivamente utilizados para la identificación de Candida, su uso es limitado y algunas
especies no pueden ser identificadas y diferenciadas. Hoy en día, las estrategias moleculares,
como PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) o no basadas en PCR se han utilizado como
complementos a los convencionales métodos y proporcionar resultados más precisos en
menos tiempo (1.5-3 horas). Dada la alta precisión y velocidad con qué técnicas de tipado
molecular se pueden llevar a cabo y avances rápidos en la tecnología, es probable que la
mayoría de estos métodos podrían mejorar la identificación de rutina del laboratorio clínico
de especies de Candida. Sin embargo, otros estudios son necesarios para la normalización de
tales procedimientos técnicos (Neppelenbroek et al., 2014).
Con base en lo anterior, la correcta identificación de esta levadura es uno de los retos más
grandes existentes en la actualidad, en especial, porque esto pudiera retrasar la instauración
de un adecuado tratamiento en el paciente, particularmente, en el manejo de las infecciones
13
fúngicas invasoras. Para esto, se hace necesario contar con pruebas que sean rápidas y
precisas para la identificación oportuna de levaduras de interés clínico (Zuluaga et al., 2018).
Actualmente, existen diversas metodologías para la identificación de levaduras, algunas
emplean medios cromogénicos como el CHROMagarTM Candida que permiten tener una
identificación presuntiva de una manera rápida, logrando identificar especies de importancia
clínica como C. albicans, C. tropicalis y C. krusei, sin embargo, muchos autores resaltan la
importancia de complementar esta identificación con otras pruebas fenotípicas que permitan
la confirmación a especie. De igual manera, existen sistemas comerciales como el API® 20 C
AUX o el sistema Vitek® 2 Compact utilizados para la identificación de estas levaduras, los
cuales están basados en pruebas bioquímicas. Tienen la desventaja que pueden proporcionar
identificaciones erróneas por la falta de experiencia del laboratorista al interpretar los
resultados y, con alguna frecuencia estos sistemas no son capaces de diferenciar especies con
perfiles bioquímicos similares y existe la limitante de la inclusión oportuna de especies
emergentes en sus bases de datos. La espectrometría de masas, basada en la metodología
MALDI TOF (de sus siglas del inglés: matrix-assisted laser desorption ionization time-of-
flight), ha surgido como un método valioso para la identificación de microorganismos en
general, y con un buen desempeño para la identificación de levaduras, por su rapidez,
precisión y bajo precio de venta de servicio. Por tales motivos, esta tecnología ha comenzado
a emplearse con mayor frecuencia en nuestro medio, siendo los sistemas comerciales
Microflex® (Bruker Daltonics GMBH, Leipzig, Alemania) y Vitek® MS (bioMérieux, Marcy,
L’Etoile, Francia) los más populares (Zuluaga et al., 2018).
Otras de las metodologías utilizadas son las técnicas moleculares basadas en la secuenciación
de ácidos nucléicos, las cuales han sido empleadas como método de referencia para hacer
comparaciones frente a otras pruebas de identificación debido a que proporcionan una
identificación más precisa. Adicionalmente, las técnicas de secuenciación permiten
identificar especies crípticas como C. metapsilosis, C. orthopsilosis, C. nivariensis, C.
bracarensis, que exhiben frecuentemente resistencia a los antifúngicos que comúnmente son
empleados contra estos patógenos. La PCR panfungal y secuenciación tiene como limitante la
14
complejidad para ser implementadas en un laboratorio ya que requiere espacios físicos,
equipamiento especial y personal altamente entrenado (Zuluaga et al., 2018).
15
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La cavidad oral es un ámbito donde el crecimiento de microorganismos es próspero, por este
motivo los hongos del género Candida pueden colonizar fácilmente, sin embargo, como bien
sabemos Candida es un patógeno oportunista, pero no consigue a ser un microorganismo
patógeno gracias al sistema inmune innato que este como mencionamos anteriormente
limitan su crecimiento y proliferación y así se puede obtener un equilibrio de este en la
cavidad oral. Candida albicans es la especie aislada más comúnmente encontrada, además, C.
parapsilosis, C. krusei, C. tropicalis, C. glabrata, C. dubliniensis, C. lusitaniae y C. kefyr, que en
conjunto son referidos como no albicans, están cada vez más involucrados en los casos de
candidiasis oral y han sido reconocidos como patógenos médicamente importantes (Alrayyes
et al., 2019). Del mismo modo Candida puede convertirse en un microorganismo patógeno
cuando las condiciones del hospedador no son óptimas, los cambios hormonales que se
producen en el embarazo son favorables para el aumento de Candida albicans en pacientes
embarazadas aprovechando el desequilibrio hormonal que presentan estas pacientes, por
este motivo y ya que no se presentan suficientes investigaciones a nivel mundial sobre este
tema es pertinente realizar una investigación que esté basada en la identificación y
diferenciación entre las especies de Candida en cavidad oral de mujeres embarazadas y no
embarazadas.
16
4. JUSTIFICACIÓN
Para la mejor ejecución de las comparaciones entre mujeres embarazadas y no embarazadas
se elaboró un trabajo de investigación, donde se desarrollaron pruebas de identificación
básicas in vitro para Candida spp. de mujeres entre 18 y 45 años, así como también una
revisión bibliográfica, para validar la posibilidad de que exista algún tipo de diferencia entre
estas etapas de la vida y de este modo poder evaluar la identificación y diferenciación entre
las especies de Candida en cavidad oral de mujeres embarazadas y no embarazadas.
La prevalencia de Candida spp aumenta durante el embarazo debido a cambios inmunitarios,
hormonales, cambios en el pH salival, factores asociados con la presencia de hiperemesis
gravídica, entre otras (Bett et al., 2019). Sin embargo, solo se reporta que el 4,4% de las
mujeres embarazadas desarrollan candidiasis oral principalmente causada por C. albicans.
No existen estudios que evalúen la prevalencia de diferentes especies de Candida en muestras
orales de mujeres embarazas y que comparen las especies encontradas en mujeres no
embarazadas. La comparación entre estas dos poblaciones podría sugerir la presencia de
especies de Candida como probable factor de riesgo de candidiasis oral en las mujeres
embarazadas.
17
5. SITUACIÓN ACTUAL EN EL ÁREA DE INVESTIGACIÓN
La presencia de especies del género Candida en cavidad oral es un hallazgo muy habitual. Sin
embargo, muy pocos portadores sufren infecciones por este microorganismo. Además, las
concentraciones en saliva de este en portadores sanos son muy inferiores a las
concentraciones halladas en personas que padecen distintas formas de candidiasis, 300-800
unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/mL) frente a recuentos superiores a
20.000 UFC/mL, respectivamente. Estos datos tienen un valor limitado dado que personas
sanas pueden tolerar concentraciones altas de Candida sin padecer la enfermedad, mientras
que recuentos más bajos pueden generar infecciones en individuos inmunocomprometidos,
incluso cuando la disminución de la respuesta inmune es poca (incluso condiciones de
estrés). Se considera que más de 4/1.000 pacientes de una consulta general presentan signos
de infección. No obstante, dado que la mayor parte de los casos cursan sin sintomatología
aparente, la prevalencia debe ser mayor (Rey et al., 2015).
La mayoría de los autores coinciden en que la colonización de la cavidad oral por hongos y
más concretamente por C. albicans, es muy habitual entre personas sanas. Los factores que
afectan el estado de portador como hemos mencionado antes son la edad, el sexo,
alteraciones salivales cuantitativas y cualitativas, el tabaco, el estado de salud,
fundamentalmente alteraciones inmunológicas o endocrinas, determinados tratamientos
farmacológicos, etc. Incluso se ha podido comprobar que existen variaciones del estado de
portador a lo largo del día y una especial afinidad por colonizar el dorso lingual, el paladar y
la mucosa bucal (Rey et al., 2015).
En los últimos años ha aumentado el interés por infecciones causadas por el patógeno
oportunista Candida. La identificación de cepas infectantes de Candida es importante porque
los aislamientos de las especies se difieren ampliamente, tanto en su capacidad para causar
infección, como también en su susceptibilidad a los agentes antifúngicos (Raju, 2011). Sin
embargo, la creciente importancia de Candida también está atribuida a la aparición de la
infección por VIH y el uso más generalizado de la quimioterapia inmunosupresora (Raju et
al., 2011).
18
La identificación precisa de todos los aislados de muestras clínicas a menudo es compleja y
lleva mucho tiempo. Por lo tanto, varios sistemas comerciales rápidos automáticos y
manuales para identificar estos organismos se han desarrollado, algunos de los cuales puede
haber problemas de sensibilidad significativos. Para superar estas limitaciones, nuevas
técnicas de tipado molecular se han desarrollado que permiten la identificación rápida y
precisa de especies de Candida (Neppelenbroek et al., 2014).
La presencia de Candida en la cavidad oral de mujeres en embarazo podría no generar
ninguna sintomatología oral, sin embargo en alguno casos como se ha reportado el 4,4% de
las lesiones de la mucosa oral podrían ser causadas por este hongo, en la literatura no existe
suficiente información acerca de las especies de Candida que pueden estar presentes en la
cavidad oral de mujeres embarazadas en comparación con las especies de este hongo
presente en mujeres que no se encuentran en embarazo, en Colombia no hay datos asociados
a esta población.
19
6. OBJETIVOS
6.1. Objetivo general
Establecer si existe diferencia, entre las especies de Candida en cavidad oral de mujeres
embarazadas y no embarazadas.
6.2. Objetivos específicos
Identificar las especies de Candida en mujeres embarazadas y no embarazadas.
Evaluar si existen diferencias entre las especies de Candida en mujeres embarazadas
y no embarazadas.
20
7. METODOLOGÍA
Se evaluaron 77 aislamientos de Candida spp de pacientes que participaron en estudios
anteriores de la Unidad de Investigación Básica Oral (UIBO), los pacientes firmaron un
consentimiento informado donde se indicaba que sus muestras podrían ser utilizadas en
estudios realizados posteriormente.
Se descongelaron 27 aislamientos de Candida spp de mujeres embarazadas y 44 de mujeres
no embarazadas para la identificación de especies de este hongo, que se encontraban
almacenadas a -80°C en caldo BHI con 10% de glicerol.
7.1. Tipo de estudio:
Estudio experimental in vitro.
7.2. Población y muestra
Aislamientos clínicos de Candida spp. De mujeres embarazadas y de mujeres no embarazadas
los cuales se encuentran congelados a -80°C en el cepario del Laboratorio de Microbiología
Oral de la Unidad de Investigación Básica Oral (UIBO) de la Universidad El Bosque.
7.3. Métodos y técnicas para la recolección de la información:
Se sembraron los aislamientos en agar Saboureaud a 37°C durante 24 horas, una vez
obtenidas las colonias puras con morfología típica de levaduras, colonias blancas, grandes,
opacas, con olor característico, adicionalmente se realizó coloración de Gram con el objetivo
de confirmar la morfología levaduriforme.
7.3.1. Identificación bioquímica
Se realizó la identificación con RapID Yeast, es un panel de identificación semiautomatizado
(Thermo Fisher Scientific); el cual está descrito por la casa comercial como un micrométodo
cualitativo que utiliza sustratos convencionales y cromogénicos para la identificación de
microorganismos médicamente importantes, como levaduras, microorganismos
21
levaduriformes y microorganismos relacionados, aislados en muestras clínicas humanas
(Thermo Fisher Scientific, 2017).
El sistema RapID Yeast Plus se compone de (1) paneles RapID Yeast Plus, (2) reactivo RapID
Yeast Plus A y (3) reactivo RapID Yeast Plus B. Cada panel RapID Yeast Plus tiene varios
pocillos de reacción moldeados en la periferia de una bandeja de plástico desechable. Los
pocillos de reacción contienen reactivos deshidratados y la bandeja permite la inoculación
simultánea de cada uno de ellos con una cantidad predeterminada de inóculo. Como inóculo
que rehidrata e inicia las reacciones de prueba se usa una suspensión del micro-organismo
de prueba en el líquido de inoculación RapID. Después de incubar el panel, se examina la
reactividad de cada pocillo de prueba observando el desarrollo de un color. En algunos casos,
se deben añadir reactivos a los pocillos para obtener el cambio de color (Thermo Fisher
Scientific, 2017).
Las pruebas usadas en el sistema RapID Yeast Plus se basan en la degradación microbiana de
sustratos específicos detectados por varios sistemas indicadores. Los reactivos utilizados son
una combinación de pruebas convencionales y pruebas cromogénicas de monosustrato.
Los paneles se montaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, y fueron
incubadas una temperatura de 30°C en una incubadora sin CO² durante 4 horas. Los paneles
RapID Yeast Plus contienen 18 pocillos de reacción que proporcionan 18 puntuaciones de
prueba (Thermo Fisher Scientific, 2017).
Las identificaciones se hacen con las puntuaciones individuales de la prueba en los paneles
RapID Yeast Plus junto con otra información de laboratorio para producir un patrón
numérico con la reactividad conocida de los géneros registrados en la base de datos RapID.
Estos patrones se comparan mediante el uso del software ERIC® on line (Thermo Fisher
Scientific, 2017).
7.3.2. Identificación molecular por PCR (reacción en cadena de la polimerasa)
A todos los aislamientos se les realizó la técnica de PCR convencional para esto inicialmente
se realizó la extracción del DNA del hongo de la siguiente manera:
22
Varias colonias de levaduras del mismo aislamiento fueron disueltas en 1,5mL de agua grado
molecular en tubos cónicos de 15mL, a cada tubo se le adicionó 4 perlas de vidrio estériles,
posteriormente se mezclaron vigorosamente en vortex durante 30 minutos, este paso
permite el rompimiento mecánico de la pared muy gruesa de la levadura. Pasado este tiempo
se adicionó SDS al 10% (dodecil sulfato de sodio) y se incubó a 70°C durante 30 minutos para
permitir la acción detergente de esta sustancia y terminar romper la pared y membrana de
la levadura.
Inmediatamente después de este tiempo de incubación se almacenaron a -80°C durante toda
la noche con el fin de generar un choque térmico, pasado este tiempo los tubos se pasaron a
ebullición durante 30 minutos para generar de nuevo un choque térmico y terminar de
generar la liberación del DNA de las levaduras, posteriormente se centrifugó a 14.000rpm a
4°C y los sobrenadantes fueron transferidos a un nuevo tubo, en este sobrenadante se
encuentra el DNA extraído de cada aislamiento.
Una vez obtenido el DNA de cada aislamiento fue cuantificado usando el NanoDrop 2000
(Thermo Fisher Scientific) y se valoró la concentración del DNA en ng/uL y la pureza del
mismo mediante la relación 260/280.
Una vez obtenidos todas las muestras de DNA se realizó la identificación por PCR
convencional usando los primers reportados por Mahmoundi-Rad et al., (2012): F: 5′-
GGTTTGCTTGAAAGACGGTAG-3′ y R: 5′-AGTTTGAAGATATACGTGGTAG-3′, siguiendo las
recomendaciones del autor. Las muestras se consideraron positivas por la presencia de un
fragmento de 218 pb, como control positivo se empleó DNA de la cepa de referencia ATCC
90028 y como control negativo agua estéril grado molecular.
7.4. Plan de tabulación y análisis.
Se creó una base de datos en Excel versión 16.0 (Excel 2016) donde se recolectó la
información de cada aislamiento con género y especie, además de los datos del paciente como
nombre, número de cédula, edad y código del estudio donde participaron anteriormente.
23
Se realizó una estadística descriptiva donde se evaluó el porcentaje de especies de Candida
en mujeres en estado de embarazo y no embarazo.
Hipótesis estadística:
Ho: NO existen diferencias entre las especies de Candida.
Ha: SI existen diferencias entre las especies de Candida.
24
8. CONSIDERACIONES ÉTICAS
a) Sustento legal
Éticamente la presente investigación no presenta riesgo según las NORMAS CIENTÍFICAS,
TÉCNICAS Y ADMINISTRATIVAS PARA LA INVESTIGACIÓN EN SALUD RESOLUCIÓN
Nº008430 de 1993 del Ministerio de Salud. La investigación que se realice en seres humanos
será desarrollada conforme a los criterios TITULO I ARTÍCULO 4, TÍTULO II CAPÍTULO VI
ARTÍCULO 47 y el Título II Capítulo 1 Artículo 11. Esta investigación está clasificada sin
riesgo.
Todas las pacientes firmaron consentimiento informado de los proyectos en los cuales de
recolectaron los aislamientos de Candida.
25
9. RESULTADOS
9.1. Fase descriptiva
Entre las características sociodemográficas encontramos 71 aislamientos de pacientes las
cuales estaban divididas en 2 grupos 27 aislamientos de mujeres embarazadas y 45
aislamientos de mujeres no embarazadas, la edad de la población estudiada está entre un
rango de edad de 15 a 45 años, con un promedio de edad en el grupo de mujeres embarazadas
de 26,4 con una desviación estándar de 4,5, mientras que en el grupo de mujeres no
embarazadas se encontró un rango de edad de 36 años y una desviación estándar de 6.6.
(tabla 1)
Embarazo No embarazo
Pacientes N 27 45
Edad
Media ± DE 26,4 ±4,5 36±6,6
Tabla 1. Distribución sociodemográfica de la población.
La colonización de especies de Candida de los aislamientos de mujeres examinados en este
estudio se encontró en el grupo de mujeres embarazadas que C. albicans estaba presente en
un 95,6% mientras que C. tropicalis en un 4,4% casi de igual manera en el grupo de mujeres
no embarazadas que se encontró C. albicans en un 92,6% y C. tropicalis en un 7,4% (ver figura
1).
En la figura 2 se observa un corrido electroforético de la amplificación de C. albicans con PCR
convencional, se puede observar que ningún aislamiento fue positivo para este hongo por
este método, sin embargo, los controles técnicos están adecuados.
26
Porcentaje de especies de Candida en grupos de mujeres embarazadas
Figura 1. Prevalencia de especies de Candida en mujeres embarazadas y no embarazadas
Figura 2. Electroforesis de PCR para la identificación de C. albicans.
MP: Marcador de peso molecular; líneas 1 a 17 muestras evaluadas; línea 18 control positivo;
línea 19 control negativo.
27
10. DISCUSIÓN
De acuerdo con lo reportado por Bett et al., (2019), la presencia de Candida spp en cavidad
oral durante el embarazo aumenta en relación con mujeres no embarazadas, debido a
cambios inmunitarios, cambios hormonales, pH salival y en algunas mujeres las náuseas
matutinas.
En el presente estudio se comparó las especies de Candida en dos grupos de mujeres
embarazadas y no embarazadas, no se encontraron diferencias en estas especies, en donde
C. albicans se encontró en el 95,6% en embarazo versus el 92,6% en mujeres no embarazadas.
Aunque por el diferente tamaño de los grupos no se hayan podido parear por edad.
Sin embargo estos hallazgos no son completamente claros ya que la confirmación por
métodos moleculares como la PCR no arrojó ningún resultado. Los métodos clásicos para la
identificación de levaduras comienzan con el aislamiento de los microorganismos desde la
clínica. La identificación completa por métodos convencionales de las especies puede tardar
entre 24–48 horas o incluso más en el cultivo de sangre. Pero usualmente es posible
distinguir los aislamientos de Candida en medios de cultivo utilizando métodos, que incluyen
la prueba de tubo germinal, formación de clamidiosporas y fermentación o asimilación de
azúcares. La prueba del tubo germinal es un método de identificación rápida para C. albicans
(2–4 h), pero no siempre es 100% preciso, aproximadamente el 5% de los aislamientos de C.
albicans no producen tubos germinales, mientras que algunos aislamientos de C. tropicalis
también son productores de tubos germinales como se ha podido observar en este estudio.
En el caso de los métodos en los que se evalúa la asimilación o fermentación de azúcares, la
identificación completa puede llevar entre 18 y 72 h. (Alam, 2014). Los procedimientos de
diagnóstico convencionales, como los hemocultivos y las pruebas bioquímicas, carecen del
grado de sensibilidad y especificidad que aseguraría un diagnóstico confiable y temprano de
las infecciones invasivas por Candida (Duarte et al., 2009).
28
En cuanto a los resultados de las pruebas de panel bioquímico RapID Yeast Plus en conjunto
con los resultados arrojados del ensayo de PCR descritos anteriormente fueron
completamente contradictorios en cuanto a la identificación de especies de Candida extraídas
de muestras de pacientes. El sistema RapID Yeast Plus como ya mencionamos es un micro
método que utiliza 18 sustratos convencionales y cromogénicos para la identificación de
levaduras clínicamente importantes, organismos similares a las levaduras y patógenos de
levadura emergentes de muestras clínicas después de solo 4 h de incubación. Varios estudios
han evaluado la utilidad del sistema RapID para la identificación de levaduras, patógenos de
levadura comunes y emergentes. Este sistema ha demostrado ser muy preciso en la
identificación de los más comunes, donde se encontró excelente identificación de
aislamientos de levaduras comunes tales como C. albicans, C. tropicalis y C. glabrata con un
porcentaje de 99%. Estos autores Espinel-Ingroff et al, 1998; Heelan et al, 1998; Wadlin et al,
1999 encontraron que el sistema RapID plus de levaduras identificó el 100% de C. albicans,C.
tropicalis, y C. krusei, y 91% de C. glabrata, 92% de C. parapsilosis, y 86% de C. lusitaniae. Sin
embargo, Según Espinel-Ingroff et al., (1998), este método debe usarse con precaución
cuando se identifique algo infrecuente. Además, los marcadores de identificación bioquímica
son a veces difíciles interpretar porque las reacciones de color son ambiguas en algunas
instancias. Tal fallo del sistema de identificación de levaduras RapID plus podría estar
relacionado con la dificultad de distinguir los tonos amarillos de los medios cromogénico
(Neppelenbroek et al., 2014).
Por otro lado, los métodos de identificación molecular se están volviendo populares debido
a su alta precisión, sensibilidad (bajo falso positivo), y especificidad (tasas bajas falsas
negativas) para la identificación y diferenciación de C. albicans de otras especies. Para su
identificación molecular se han propuesto varios procedimientos para detectar y diferenciar
las especies de Candida, ya sea basado en la reacción de cadena polimerasa (PCR) o no basado
en PCR (Neppelenbroek et al., 2014).
En comparación con los hemocultivos y los métodos fenotípicos, varios laboratorios
microbiológicos han adoptado técnicas basadas en el ADN para la identificación rápida y
objetiva de C. albicans. La sensibilidad de un ensayo basado en ADN depende de la
29
preparación de la muestra, el cebador y el ADN, la selección de objetivos, extracción de ADN
y eficacia de la amplificación. El éxito del método de amplificación depende en gran medida
de la selección del ácido nucleico dirigido. El ADN diana puede obtenerse de bases de datos
utilizando información específica de la especie o puede seleccionarse arbitrariamente del
genoma fúngico. Sin embargo, las secuencias específicas de la especie siempre dan mejores
resultados que las secuencias arbitrarias. Secuencias altamente conservadas de los genes de
ARN ribosomal 5.8S, 18S y 28S son apropiadas para diferenciar especies de Candida. Las
regiones espaciadoras transcritas internas (ITS) ubicadas entre estos genes son muy
prometedoras para la identificación molecular de C. albicans, ya que contienen áreas de alta
conservación así como áreas de alta variabilidad. Entre ellos, se utilizan principalmente ITS1
e ITS2, y la combinación de estos dos polimorfismos de longitud puede producir mejores
resultados que cualquiera de los dos solos (Alam et al., 2014).
En este estudio se utilizaron técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
ya que esta técnica es prometedora en términos de velocidad, economía y potencia de
resolución, sin embargo la extracción de DNA a partir de levaduras es bastante compleja,
aunque se confirmaron las concentraciones de DNA y se tenía tanto puro como con una alta
concentración no hubo amplificación en ninguna de las muestras, los controles de la técnica
fueron los adecuados y específicos.
Al realizar el análisis, se pudo determinar que los métodos basados en la bioquímica RapID
Yeast Plus fueron los que nos proporcionaron menores tiempos para la identificación de
especies de Candida, como ha sido mencionado anteriormente, y al comparar este método
empleado con los métodos basados en PCR convencionales, nuestros resultados reflejaron
una controversia al ser comparados. Cabe resaltar que esta tecnología permite resultados
precisos, superando a las técnicas de identificación bioquímicas, por eso este hallazgo
demuestra la necesidad de realizar pruebas basadas en ADN ya que está demostrado que son
más precisas y confiables.
Es importante mencionar que pueden ocurrir retrasos en la generación de resultados cuando
hablamos de PCR, debido a factores que son esenciales al proceso, y que son dependientes de
30
factores externos, la viabilidad de los aislamientos, el requerimiento o no de un paso
adicional de extracción, la viabilidad de primers, los días designados para el procesamiento
de muestras, la disponibilidad de equipos del laboratorio o el tiempo de respuesta para el
análisis de las secuencias. Un cambios en algunos de estos requerimientos y se generará una
diferencia a la hora de entregar resultados en el momento oportuno.
Las pruebas bioquímicas y morfológicas no lograron inequívocamente identificar y
diferenciar las especies de Candida. En consecuencia, se han utilizado otras metodologías
como la PCR. Sin embargo, la detección de especies de esta levadura en mujeres embarazadas
y no embarazadas y las diferencias entre los grupos mencionados anteriormente no se logró
describir con la metodología utilizada. El objetivo de este estudio fue establecer si existe o no
diferencia, entre las especies de Candida en cavidad oral de mujeres embarazadas y no
embarazadas, el cual se desarrolló mediante pruebas de panel bioquímico RapID Yeast Plus
en conjunto con un ensayo de PCR convencional altamente específica y precisa, capaz de
diferenciar C. albicans de otras especies médicamente importantes, lo que se atribuye a la
presencia de propiedades fenotípicas similares entre los complejos de la levadura, al fallo del
sistema de identificación RapID Yeast plus con la dificultad de distinguir los tonos amarillos
de los medios cromogénico encontrados en los pozos, a la difícil extracción del ADN de
Candida debido a su robusta pared celular o a las exigencias técnicas de la realización de la
PCR.
Por lo anterior se deben usar otros métodos más robustos para poder identificar de manera
más específica y confirmar los resultados generados en este trabajo para la identificación de
hongos como lo es la espectrometría de masas MALDI-TOF.
31
11. CONCLUSIONES
1. No se encontraron diferencias entre las especies de Candida entre mujeres
embarazadas y no embarazadas, ya que se confirmó por identificación bioquímica la
presencia de C. albicans y C. tropicalis en la misma proporción en los grupos
evaluados.
2. Hay discrepancia entre los resultados de la identificación de C. albicans por la PCR y
el método bioquímico, por lo que se sugiere confirmar los resultados por métodos más
robustos como la espectrometría de masas MALDI-TOF.
32
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