Upload
buinhu
View
228
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
IDENTIFIKASI GEN CYP2A6 PADA PEROKOK DIKALANGAN KARYAWAN FAKULTAS
KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UINSYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
Laporan Penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelarSARJANA KEDOKTERAN
OLEH :
Muflikha Mayazi
1111103000061
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI UIN SYARIF HIDATULLAHJAKARTA
1435 H / 2014 M
v
KATA PENGANTAR
Puji syukur kehadirat Allah swt yang telah memberikan rahmat dan
karunia-Nya . Salawat serta salam semoga selalu tercurah kepada Nabi
Muhammad saw . Akhirnya penulis dapat menyelesaikan penelitian dengan judul
“Identifikasi Gen CYP2a6 pada Perokok di Kalangan Karyawan Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta” .
Laporan penelitian ini disusun untuk memenuhi sebagian persyaratan guna
memperoleh gelar Strata 1 sarjana kedokteran pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu
Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
Terlaksananya penelitian ini berkat bantuan dan bimbingan dari berbagai
pihak, untuk itu penulis menyampaikan terima kasih kepada :
1. Prof. DR. (hc). Dr. M.K. Tadjudin, Sp. And. sebagai dekan Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hiadayatulah Jakarta
2. dr. Witri Ardini, M.Gizi, SpGK selaku Ketua Program Studi Program
Studi Pendidikan Dokter FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta, serta
seluruh dosen di prodi ini yang selalu membimbing serta memberikan ilmu
kepada saya selama menjalani masa pendidikan di Program Studi
Pendidikan Dokter FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
3. Ibu Zeti Harriyati , M.Biomed dan Ibu Endah S.Si . M. Biomed sebagai
dosen pembimbing yang telah membimbing serta mengarahkan penulis
dalam menyelesaikan penelitian ini.
4. dr. Flori Ratna Sari, Ph.D selaku Penanggung jawab modul Riset PSPD
2011 .
5. Kepada laboran yang terlibat, Bu Ai , Bu Suryani, Bu Lilis dan Bu Festy
yang telah membantu saya dalam melaksanakan penelitian di laboratorium
6. Kedua orang tua penulis, dr. Taufik Widiyanto dan Insani Nurul Hayati,
S.Pd, yang telah memberikan dukungan fisik maupun psikis dalam
penyelesaian penelitian ini.
vi
7. Adik-adik penulis, Lutfi Amalia Shaliha, Amoghasakti Abinawa, dan
Gusti Landung Ar-Rantissy yang selalu menyemangati penulis untuk
menyelesaikan penelitian ini.
8. Sahabat karib penulis, Lara Sofhy Wahyuni, Niken Nurul Paramesti,
Vania Utami Putri, Debtia Rahmah, dan Raeiza Olyvia yang selalu
menemani saya. Untuk teman penelitian saya , Nurohimah Fuad,
Hanindyo Rizky, Nurhabiba Edriana , Rahman Mukti Aji dan Faisal
Rachman yang sudah menemani dan membantu dalam melakukan
penelitian di laboratorium. Teman-teman VLDL , Leyli Badriah, Tiara
Putri Methas,Nadisha Refira, Herlina Rahmah, Madinatul Munawaroh,
Hania Asmarani Rahmanita, Cut Neubi Getha dan Yofara Maulidia
Muslihah terimakasih selalu menyemangati saya dalam penyelesaian
penelitian ini .
9. Nurul Khafidz Subekti, terimakasih atas canda tawa dan motivasinya..
10. Teman-teman seangkatan di Pendidikan Dokter , PSPD 2011.
11. Semua pihak yang telah memberikan kontribusi terhadap penyelesaian
penelitian ini.
Akhir kata, penulis berharap agar Allah swt berkenan membalas kebaikan
semua pihak yang telah membantu. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat.
Jakarta, September 2014
Muflikha Mayazi
vii
ABSTRAK
Muflikha Mayazi . Program Studi Pendidikan Dokter. Identifikasi GenCYP2a6 pada Perokok di Kalangan Karyawan Fakultas Kedokteran danIlmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
Gen CYP (enzim sitokrom P450) merupakan salah satu Xenobiotic MetabolizingEnzyme (XME), yaitu enzim yang berperan dalam metabolisme xenobitika.CYP2a6 adalah salah satu subfamili dari gen Cyp. CYP2a6 berperan dalammemetabolisme nikotin menjadi kotinin. Tujuan penelitian ini ialah untukmengetahui adanya gen CYP2a6 pada perokok di kalangan karyawan FakultasKedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Metode yangdigunakan ialah dengan cara isolasi genom kemudian amplifikasi dengan PCRyang kemudian hasilnya dilihat menggunakan Gel Dock. Hasil penelitian inimenunjukkan adanya pita dari Gen CYP2a6 dengan ukuran 1500 bp.
Kata kunci : Gen CYP2a6, perokok, nikotin, PCR.
ABSTRACT
Muflikha Mayazi. Medical Education Study Program. Identification ofCyp2a6 Gene on the Smokers Bodies of the Employees of the Faculty ofMedical and Health Science UIN Syarif HIdayatullah Jakarta
CYP gene (citochrome P450 enzyme) is one of the Xenobiotic MetabolizingEnzyme (XME). It’s an enzyme which has in charge in xenobiotic metabolism.CYP2a6 is one of the subfamily of CYP gene. CYP2a6 has a role in metabolizingthe nicotine into cotinine. The purpose of this research is to discover the existanceof CYP2a6 gene on the smoker’s bodies of the employees of the faculty ofmedical and health science of UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. The method ofused in this research is by isolating the genome which then we do theamplification by doing the the PCR then examine the result using Gel Dock. Theresult of this research has shown the existence of CYP2a6 gene ribbon which havesize around 1500 bp.
Keyword : CYP2a6 gene, smokers, nicotine, PCR.
viii
DAFTAR ISI
LEMBAR JUDUL....................................................................................................iLEMBAR PERNYATAAN .....................................................................................iiLEMBAR PERSETUJUAN ....................................................................................iiiLEMBAR PENGESAHAN ....................................................................................ivKATA PENGANTAR .............................................................................................vABSTRAK ...............................................................................................................viiDAFTAR ISI ............................................................................................................viiiDAFTAR TABEL ...................................................................................................xDAFTAR GAMBAR ...............................................................................................xiDAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................xiiDAFTAR ISTILAH .................................................................................................xiii
BAB I PENDAHULUAN1.1 Latar belakang......................................................................................................11.2 Rumusan masalah.................................................................................................31.3 Tujuan penelitian..................................................................................................3
1.3.1 Tujuan umum.............................................................................................31.3.2 Tujuan khusus............................................................................................3
1.4 Manfaat penelitian................................................................................................31.4.1 Bagi peneliti...............................................................................................31.4.2 Bagi institusi ..............................................................................................41.4.3 Bagi masyarakat ........................................................................................41.4.4 Manfaat Klinis ...........................................................................................4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA2.1 Landasan teori ......................................................................................................5
2.1.1 Penyakit yang ditimbulkan akibat kebiasaan merokok .............................52.1.2 Substansi yang terkandung dalam rokok ...................................................6.2.1.3 Nikotin .......................................................................................................62.1.4 Gen CYP (Enzim sitokrom P450) ...............................................................92.1.5 Peran Enzim Sitokrom P450 2A6 dalam metabolisme Nikotin
dan Cotinin ................................................................................................102.1.6 Metabolit dari Nikotin dan Cotinin ...........................................................112.1.7 Ketergantungan dan Ketagihan .................................................................132.1.8 Farmakologi Nikotin..................................................................................152.1.9 Enzim EcoR1.............................................................................................16
2.2 Kerangka teori ......................................................................................................172.2 Kerangka konsep..................................................................................................182.4 Definisi operasional .............................................................................................18
BAB III METODE PENELITIAN3.1 Desain penelitian..................................................................................................193.2 Waktu dan tempat penelitian................................................................................193.3 Sampel Penelitian.................................................................................................19
ix
3.3.1 Besar Sampel .............................................................................................193.3.2 Teknik pengambilan sampel......................................................................193.3.3 Kriteria Sampel..........................................................................................19
3.3.3.1 Kriteria inklusi ...............................................................................193.3.3.2 Kriteria Eksklusi ............................................................................19
3.4 Cara Kerja penelitian............................................................................................203.4.1 Ijin subyek penelitian.................................................................................203.4.2 Alur penelitian ...........................................................................................203.4.3 Alat dan bahan ...........................................................................................20
3.4.3.1 Alat dan bahan Phlebotomi............................................................203.4.3.2 Alat dan bahan Isolasi DNA .........................................................203.4.3.3 Alat dan bahan PCR ......................................................................213.4.3.4 Alat dan bahan Elektroforesis........................................................213.4.3.5 Alat dan bahan Pemotongan dengan enzim EcoR1.......................22
3.4.4 Cara kerja...................................................................................................223.4.4.1 Pengambilan sampel darah ............................................................223.4.4.2 Isolasi DNA ...................................................................................223.4.4.3 Amplifikasi dengan PCR...............................................................233.4.4.4 Elektroforesis DNA .......................................................................233.4.4.5 Pemotongan dengan Enzim EcoR1 ...............................................24
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN4.1 Gambaran gen CYP2a6........................................................................................254.2 Data tambahan......................................................................................................28
4.2.1 Deskripsi perokok berdasarkan usia ..........................................................284.2.2 Deskripsi perokok berdasarkan jumlah rokok yang dihisap
per hari .......................................................................................................284.2.3 Deskripsi perokok berdasarkan lama merokok ........................................284.2.4 Deskripsi perokok dengan skor FTND......................................................294.2.5 Karakteristik subyek penelitian .................................................................29
4.3 Mekanisme terjadinya ketergantungan fisik terhadap nikotin .............................314.4 Peran gen CYP2a6 ...............................................................................................314.5 Keterbatasan penelitian ........................................................................................32
BAB V SIMPULAN DAN SARAN5.1 Simpulan ..............................................................................................................335.2 Saran ...................................................................................................................33
DAFTAR PUSTAKA ...............................................................................................34LAMPIRAN..............................................................................................................37
x
DAFTAR TABEL
Tabel 2.1 Klasifikasi mekanistik obat-obat pada system mesolimbik.......................14
Tabel 4.1 Frekuensi perokok berdasarkan usia..........................................................28
Tabel 4.2 Frekuensi perokok berdasarkan jumlah rokok yang dikonsumsi perhari ..28
Tabel 4.3 Frekuensi perokok berdasarkan lama kebiasaan merokok ........................29
Tabel 4.4 Frekuensi perokok berdasarkan skor FTND..............................................29
Tabel 4.5 Karakteristik subyek penelitian .................................................................30
xi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Struktur kimia nikotin.............................................................................7
Gambar 2.2 Metabolisme nikotin oleh CYP2a6.........................................................10
Gambar 2.3 Jalur metabolisme nikotin dan kotinin....................................................11
Gambar 2.4 Sistem mesolimbik .................................................................................13
Gambar 2.5 Hasil pemotongan enzim EcoR1............................................................16
Gambar 4.1 Foto hasil PCR sampel ...........................................................................25
Gambar 4.2 Foto hasil PCR sampel dibandingkan dengan control normal ...............26
Gambar 4.3 Foto hasil digesti sampel dengan enzim restriksi Eco R1......................27
xii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Persetujuan Etik......................................................................................37
Lampiran 2 Lembar penjelasan kepada subyek penelitian ........................................38
Lampiran 3 Lembar persetujuan setelah penjelasan ..................................................40
Lampiran 4 Data sekunder .........................................................................................41
Lampiran 5 Kuesioner FTND ....................................................................................42
Lampiran 6 Gambar penelitian Isolasi DNA ............................................................44
Lampiran 7 Gambar penelitian PCR..........................................................................47
Lampiran 8 Gambar penelitian Elektroforesis ...........................................................49
Lampiran 9 Perhitungan.............................................................................................51
Lampiran 10 Riwayat Hidup......................................................................................52
xiii
DAFTAR ISTILAH
No. Istilah Definisi
1. Nikotin Zat adiktif yang terkandung didalam daun
tembakau
2. Kotinin Bentuk penguraian nikotin
3. Brain Reward System Sistem yang dapat mengatur efek imbalan
sehingga seseorang cenderung mengulangi
perilakunya
4. Behavioral reinforcement Pengulangan perilaku
5. Sistem mesolimbik Sistem didalam otak yang mengatur
perilaku
6. Polimorfisme Variasi sehingga menyebabkan aktivitas
dan kapasitas suatu enzim dalam
menjalankan fungsinya
7. Delesi gen Hilangnya sebagian segmen kromosom
yang mengandung Gen
8. Duplikasi gen Patahnya sebagian segmen kromosom, lalu
patahan tersebut tersambung pada
kromosom homolognya
9. Ekspresi gen Rangkaian proses penerjemahan informasi
genetic (dalam bentuk urutan basa DNA
atau RNA menjadi protein)
1
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Merokok merupakan suatu penyebab kematian yang angkanya cukup tinggi
pada populasi dunia. World Lung Foundation (WLF) mencatat kematian akibat
merokok melonjak hampir tiga kali lipat dalam satu dekade terakhir. Di Indonesia,
Menurut laporan Lembaga Demografi Universitas Indonesia, jumlah perokok
mencapai 57 juta orang dan diperkirakan lebih dari separuh dari jumlah itu akan
mengalami kematian akibat berbagai macam penyakit yang ditimbulkannya dalam
jangka panjang, dengan rata-rata 427.948 kematian per tahun.1,2
Rokok merupakan suatu faktor risiko yang meningkatkan insidensi
berbagai macam penyakit degeneratif pada beberapa sistem organ karena terdapat
berbagai zat toksik, radikal bebas, dan iritan yang terkandung didalamnya.
Berbagai zat dalam rokok tersebut dapat mengakibatkan cepatnya proses penuaan
organ dengan cara akumulasi kerusakan – kerusakan organ yang kemudian
menimbukan berbagai macam penyakit atau gangguan yang terkait dengan
degenerasi fungsi beberapa sistem organ, yaitu organ pernapasan, kardiovaskular,
kulit dan integumen, gastrointestinal, muskuloskeletal, syaraf dan imun.3
Dewasa ini, sekitar 70-80% perokok mengungkapkan keinginannya untuk
berhenti merokok karena efek negatif yang ditimbulkan oleh rokok, namun dari
angka tersebut hanya 35% orang yang berusaha untuk berhenti merokok, dan
akhirnya hanya 5% yang berhasil berhenti merokok. Sulitnya seseorang berhenti
merokok erat kaitannya dengan ketergantungan terhadap nikotin yang terkandung
di dalam rokok. Efek nikotin terhadap otak sama dengan efek amfetamin, opiate
dan kokain, begitu sampai di otak, nikotin berpengaruh terhadap nicotinic
acethylcholine receptor dan dopamine yang berhubungan dengan rasa senang
yang disebabkan ketagihan pada monoamine oxidase B, nitric oxide
acethylcholine, dan gamma aminobutiryc acid. Akan tetapi, sulit berhenti
merokok bukan hanya efek dari nikotin, melainkan karena multifaktorial.4,5
Pada dasarnya, ada dua macam faktor yang mempengaruhi ketergantungan
fisik individu terhadap rokok, yaitu factor genetik dan faktor lingkungan, faktor
2
lingkungan terdiri dari tingkat pendidikan, pendapatan, pekerjaan, maupun
pergaulan. Pada berbagai laporan penelitian diketahui bahwa faktor genetik
memiliki andil sebesar 50-70% dalam mempengaruhi seseorang memiliki
ketergantungan terhadap rokok.6
Salah satu gen yang berperan dalam ketergantungan fisik terhadap nikotin
adalah gen CYP2A6, yaitu gen yang mengkode enzim sitokrom P450 2a6. Enzim
ini bertanggung jawab terhadap 70-90% metabolisme nikotin dalam darah
menjadi cotinine, dan dengan demikian menghilangkan atau menurunkan efek
nikotin untuk memberikan stimulus pada brain reward system. Sehingga
disimpulkan bahwa tidak adanya enzim yang memetabolisme nikotin akan
mempertahankan kadar nikotin dalam darah tetap tinggi. Kadar nikotin yang tetap
tinggi akan menurunkan gejala-gejala ketergantungan fisik perokok terhadap
nikotin. Sebab kadar nikotin yang tinggi dalam darah akan dapat terus
memberikan stimulusnya pada brain reward system dan menekan munculnya
behavioral reinforcement.7,8,9
Dari data penelitian The American Society for Pharmacology and
Experimental Therapeutics diketahui adanya polimorfisme pada gen tersebut yang
menghasilkan 37 alel. Polimorfisme ini dapat memberikan efek berupa menurun,
hilang atau justru meningkatkan aktivitas enzim. Jadi, dapat disimpulkan bahwa
polimorfisme pada gen CYP2A6 mempengaruhi aktivitas enzim sitokrom P4502A6
yang akhirnya berpengaruh juga terhadap kadar nikotin dalam darah. Terdapat
pula hasil penelitian yang menunjukkan bahwa sekelompok orang dengan delesi
gen CYP2A6 memiliki risiko untuk menjadi tergantung pada nikotin lebih kecil
dibandingkan dengan perokok yang mempunyai gen CYP2A6 normal (wild type)
dan pada penelitian lain menunjukkan bahwa adanya duplikasi pada gen CYP2A6
meningkatkan aktivitas enzim yang dikodenya sebanyak 1,4 kali normal dan
akibatnya, mereka mengkonsumsi rokok lebih banyak dibandingkan perokok
dengan gen normal. Pada penelitian yang dilakukan pada masyarakat Bali,
ditemukan adanya variasi alel pada gen CYP2A6 pada orang-orang yang merokok
dan adanya peningkatan ketergantungan terhadap rokok pada orang-orang
tersebut. Berdasarkan uraian diatas maka dilakukanlah penelitian ini untuk
mengetahui pola pita DNA pada perokok di kalangan karyawan Fakultas
3
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta, dengan asumsi
bahwa data yang didapat terdiri atas sampel yang heterogen.10,11,12,13,14
1.2 Rumusan Masalah
Apakah terdapat Gen CYP2a6 pada perokok di kalangan karyawan Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta?
1.3 Hipotesis
Terdapat gen CYP2a6 pada perokok di kalangan karyawan Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
1.4 Tujuan Penelitian
1.4.1 Tujuan Umum
Tujuan umum dari penelitian ini adalah untuk mengetahui adanya gen
CYP2a6 pada perokok dengan teknik PCR
1.4.2 Tujuan Khusus
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui adanya gen CYP2a6 pada
perokok di kalangan karyawan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Syarif
Hidayatullah Jakarta terkait dengan lamanya merokok pada individu tersebut.
1.5 Manfaat penelitian
1.5.1 Manfaat bagi peneliti
Manfaat penelitian ini bagi peneliti adalah menambah ilmu pengetahuan
dalam bidang penelitian biomolekular.
4
1.5.2 Manfaat bagi Institusi
Menambah referensi penelitian di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta sehingga dapat digunakan
sebagai bahan untuk melakukan penelitian lebih dalam bagi peneliti yang lain.
1.5.3 Manfaat bagi Masyarakat
Penelitian ini dapat memberikan informasi bahwa terdapat Gen Cyp2a6
pada perokok dimana gen tersebut dapat mempengaruhi tingkat ketergantungan
seseorang terhadap nikotin.
1.5.4 Manfaat Klinis
Dengan diketahuinya peran faktor genetik, dalam hal ini gen CYP2A6,
pada ketergantungan fisik perokok terhadap nikotin maka pada gilirannya
pengetahuan ini dapat digunakan sebagai dasar dikembangkannya efektivitas
terapi untuk individu dengan ketergantungan fisik terhadap nikotin.
5
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Landasan Teori
2.1.1 Penyakit yang Ditimbulkan akibat Kebiasaan Merokok
Angka kematian dini akibat merokok mencapai 5,4 juta kematian setiap
tahunnya pada tahun 2006. WHO memperkirakan angka tersebut masih akan terus
naik dan mencapai 10 juta kematian per tahun pada tahun 2030. Menurut laporan
Lembaga Demografi Universitas Indonesia, jumlah perokok di Indonesia
mencapai 57 juta orang .dan diperkirakan lebih dari separuh dari jumlah itu akan
mengalami kematian akibat berbagai macam penyakit yang ditimbulkannya dalam
jangka panjang, dengan rata-rata 427.948 kematian per tahun.2,14
Data penelitian menyatakan pada seseorang yang merokok terjadi
peningkatan risiko terkena penyakit jantung yang fatal sebesar 2 kali lipat
dibanding yang tidak merokok, 10 kali lipat risiko terkena kanker paru, beberapa
kali lipat risiko terkena kanker rongga mulut, esofagus, pankreas, ginjal, kandung
kemih, dan serviks; 2 sampai 3 kali lipat risiko terserang stroke dan ulkus
peptikum; 2 sampai 4 kali lipat risiko fraktur panggul, pergelangan tangan dan
vertebra, 4 kali lipat risiko terinfeksi pneumococcus; 2 kali lipat risiko terkena
katarak dan 2,5 kali terkena ARMD (Age Related Macular Degeneration).
Merokok juga dilaporkan meningkatkan risiko penyakit leukemia, kanker prostat
dan kolon, kanker payudara pada wanita post menopause, osteoporosis dan
penyakit Alzheimer. Pada umumnya seorang perokok meninggal 5-8 tahun lebih
cepat dibandingkan bukan perokok. Data penelitian lain menyebutkan, perokok
aktif ataupun perokok pasif akan mengalami destruksi komponen elastik dari
dinding aorta yang menyebabkan peningkatan risiko terbentuknya aneurisma aorta
serta memperparah atherosclerosis pada arteri karotis.15
6
Dengan demikian, penghentian kebiasaan merokok dapat menurunkan
seluruh peningkatan risiko terserang berbagai macam penyakit seperti yang
disebutkan di atas, namun hal ini sulit dilakukan megingat adanya faktor
ketergantungan. Dewasa ini, sekitar 70-80% perokok mengungkapkan
keinginannya untuk berhenti merokok karena efek negatf yang ditimbulkan oleh
rokok, namun dari angka tersebut hanya 35% orang yang berusaha untuk
berhenti merokok, dan akhirnya hanya 5% yang berhasil berhenti merokok.
Sulitnya seseorang berhenti merokok erat kaitannya dengan ketergantungan
terhadap nikotin yang terkandung di dalam rokok. Efek nikotin terhadap otak
sama dengan efek amfetamin, opiate dan kokain, begitu sampai di otak, nikotin
berpengaruh terhadap nicotinic acethylcholine receptor dan dopamine yang
berhubungan dengan rasa senang yang disebabkan ketagihan pada monoamine
oxidase B, nitric oxide acethylcholine, dan gamma aminobutiryc acid. Akan
tetapi, sulit berhenti merokok bukan hanya efek dari nikotin, melainkan karena
multifaktorial.4,5,16
2.1.2 Substansi yang Terkandung dalam Rokok
Berikut adalah komponen mayor yang terkandung dalam rokok : Nikotin,
Catechols, N-nitrosonornicotine, Fenol, Hidrokarbon Aromatik Polinuklear,
Benzena, β-Napthylamine, Nikel (karbonil), Kadmium, Arsenik, Polonium-210
dan Radium-226, Karbon monoksida, Asetaldehid, Oksida Nitrogen, Hidrogen
Sianida, Acrolein, Ammonia, Formaldehid, Urethane, Hydrazine, dan
Nitrosamin. 17
2.1.3 Nikotin
Nikotin berasal dari tanaman Nicotiana tabacum dan Nicotiana rusica,
yang termasuk dalam family Solanaceae. Nikotin merupakan amin tersier yang
terdiri atas cincin pyridine dan pyrrolydine (Gambar 2.1). Produksi nikotin
memerlukan asam nikotinat (niacin) dan kation N-methylpyrrolinium, yang
didiversikan dari ornithine. Produksi nikotin dalam daun tembakau diinduksi oleh
7
sinyal Jasmonic acid sebagai respons terhadap kerusakan daun. Sintesis nikotin
terjadi di akar tanaman kemudian ditranspor melalui xylem menuju daun dan
bagian tanaman lainnya. 18
Gambar 2.1 Struktur Kimia Nikotin(Sumber : Hukkanen, J., Jacob III, P. & Benowitz, N.L:2005.)
Pada daun tembakau, nikotin berada dalam bentuk levorotary (S)-isomer
dan ( R )-nikotin. Sebagian besar nikotin pada daun tembakau berada dalam
bentuk levorotary (S)-isomer, dan hanya sebagian kecil, sekitar 0,1-0,6% dari
nikotin total yang berada dalam bentuk (R)-nikotin. Dalam asap rokok, jumlah
(R)-nikotin meningkat sampai 10%, diperkirakan hal ini terjadi oleh karena proses
racemization selama pembakaran. Nikotin mudah menguap pada pembakaran
bersuhu rendah, sekitar 308 K. Oleh karena sifat fisiknya itu, hampir semua
nikotin dalam rokok menguap saat dibakar dan terinhalasi selama merokok.19
Nikotin termasuk xenobiotika. Hampir seluruh nikotin yang terabsorbsi
melalui lapisan mukosa mulut, saluran pernapasan, dan saluran pencernaan,
dimetabolisme di dalam hati. Disamping hati, ginjal juga berperan dalam proses
metabolism nikotin. Metabolismenya banyak melibatkan Xenobiotic Metabolizing
Enzyme (XME), yaitu enzim-enzim dalam sistem metabolisme xenobiotika, salah
satu diantara enzim tersebut adalah enzim sitokrom P450 (CYP).19
Sistem metabolisme xenobiotika terbagi mejadi dua fase, yaitu: fase
hidroksilasi dan fase perubahan senyawa terhidroksilasi oleh enzim spesifik
menjadi metabolit yang lebih polar. Reaksi hidroksilasi melibatkan enzim
monooksigenase atau sitokrom P450, hidroksilasi dapat menonaktivasi obat dalam
8
tubuh tetapi pada beberapa reaksi hidroksilasi dapat juga mengaktifkan obat
dalam tubuh. Pada fase selanjutnya, senyawa terhidroksilasi diubah dengan enzim
spesifik menjadi senyawa yang lebih polar melalui konjugasi dengan asam
glukoronat sulfat, asetat, gluthation atau dengan beberapa asam amino tertentu.
Tujuan utama dari serangkaian proses tersebut adalah meningkatkan kelarutan zat
terkait dalam air atau meningkatkan polaritasnya dan memudahkan ekskresinya
keluar tubuh.19
Ada beberapa faktor yang menyebabkan perbedaan antar individu dalam
metabolisme nikotin, yaitu:
1. Genetik
Adanya polimorfisme pada gen atau enzim yang memetabolisme
nikotin akan memberikan perbedaan pada tiap individu dalam
metabolism nikotin dala tubuhnya.19
2. Diet
Metabolisme nikotin sangat bergantung kepada aliran darah menuju ke
hepar, karena hepar merupakan organ tempat metabolisme nikotin.
Jadi, apabila ada faktor makanan atau obat yang sedang dikonsumsi
yang akan mengganggu aliran darah menuju hepar akan mengganggu
metabolisme nikotin . 19
3. Perbedaan kelamin
Penelitian oleh Benowits menyatakan bahwa clearance nikotin pada
pria lebih tinggi daripada pada wanita, namun, penelitian lain
menyatakan bahwa clearance nikotin pada wanita lebih tinggi daripada
pria terutama pada wanita yang menggunaka kontrasepsi oral,
walaupun hasil yang didapat dari kedua penelitian tersebut tidak
signifikan.19
4. Farmakokinetik nikotin
Ketika tidur, aliran darah di hepar akan menurun, sehingga
metabolisme nikotin didalam hepar pun terpengaruh.19
9
5. Usia
Semakin meningkatnya umur maka clearance nikotin pun menurun.
Hal ini disebabkan karena menurunnya aliran darah menuju hepar
maupun penurunan aktivitas enzim yang memetabolisme nikotin.19
6. Kondisi patologis
Penyakit hepatitis A, penyakit liver akibat alkohol, dan infeksi parasit
pada hepar dapat berpengaruh terhadap aktivitas enzim CYP2A6
sehingga dapat mempengaruhi metabolisme nikotin.19
2.1.4 Gen CYP (Enzim sitokrom P450)
Enzim CYP P450 banyak terdapat pada membran retikulum endoplasmik
halus (Smooth Reticulum Endoplasmic) yang merupakan bagian dari fraksi
mikrosom hepatosit. Seperti yang telah diuraikan diatas, CYP merupakan enzim
yang berperan dalam metabolisme xenobiotika
Berikut adalah reaksi yang dikatalisis oleh enzm Sitokrom P450 :
RH + O2 + NADPH + H+ R – OH + H2O + NADP
Dimana RH dalam reaksi tersebut mewakili xenobiotika.
CYP adalah biokatalisator terbaik yang pernah diketahui. Reaksi
hidroksilasi oleh CYP dalam hati disebut dengan sistem CYP, karena untuk dapat
melakukan fungsi yang seutuhnya CYP bergantung dari kehadiran enzim lain
dalam mikrosom sel-sel hepar, yaitu NADPH-sitokrom P450 reduktase. Kerja
sama antar kedua macam enzim inilah yang membangkitkan sistem CYP dalam
proses hidroksilasi substrat xenobiotik.20,21
Hingga kini CYP mempunyai banyak family, jumlahnya mencapai sekitar
150 isoform. Oleh karena itu, merupakan suatu hal yang penting untuk
menamainya sesuai dengan sistem nomenklatur yang ada. Dalam sistem
nomenklatur, enzim sitokrom P450 disingkat dengan CYP, yang diikuti dengan
angka yang menunjukkan famili, misal CYP1, CYP2 atau CYP3. CYP
dimasukkan dalam satu famili jika sedikitnya 40% sekuens asam aminonya sama.
Kemudian, huruf kapital yang tertera setelah angka menunjukkan subfamili. Jika
10
dua enzim CYP memiliki tingkat kesamaan sekuens asam amino mencapai 55%
atau lebih, mereka berada dalam satu subfamili. Angka yang tertera setelah huruf
subfamili menunjukkan nomor anggota, sedangkan huruf terakhir setelah bintang
mengacu pada nomor alel atau varian.21
Gen CYP2A terletak pada lengan pendek kromosom 19, tepatnya pada
19p13.2. Subfamili gen CYP2A ini terdiri dari tiga gen dan dua pseudogen, yaitu
CYP2A6, CYP2A7, CYP2A13, CYP2A7P(T) dan CYP2A7P(C). Gen CYP2a6
terdiri dari 9 ekson dan 8 intron dengan ukuran sebesar 6 kilobasepairs.21
2.1.5 Peran Enzim Sitokrom P450 2A6 dalam Metabolisme Nikotin dan
Cotinin
Penelitian dengan studi in vivo dan in vitro menunjukkan bahwa pada
manusia, 70-90% nikotin dioksidasi oleh sitokrom P450 2a6 (CYP2a6) menjadi
nikotin Δ1”(5”)-iminium ion, suatu metabolit antara yang kembali dioksidasi oleh
enzim aldehid oksidase menjadi cotinine dalam sitoplasma sel hepar. Selain itu,
enzim aldehid oksidase juga mengkatalisasi perubahan cotinine menjadi, 5’-
hydroxycotinine dan norcotinine.2
11
Gambar 2.3 Metabolisme nikotin oleh Cyp2a6(Sumber : Barber S, et al : 2008)
2.1.6 Metabolit dari Nikotin dan Kotinin
Jalur Umum metabolisme nikotin dalam tubuh menghasilkan berbagai
macam metabolit derivatifnya. Beberapa di antaranya dapat berikatan dengan basa
nitrogen dalam DNA sehingga memiliki sifat karsinogenik, misalnya 4-
(metilamino)-1-(3-piridil)-1-butanon. 19
12
Gambar 2.3 Metabolit nikotin dan kotinin(Sumber : Hukkanen , et al : 2005)
2.1.7 Ketergantungan dan Ketagihan
Penelitian neurobiologik memberikan klasifikasi untuk membedakan
makna kontekstual maupun mekanistik antara ketergantungan dan kecanduan.
Kata ketergantungan lebih merujuk kepada ketergantungan secara fisik sedangkan
kata kecanduan merupakan ketergantungan secara psikologis. Setiap obat adiktif
menimbulkan berbagai macam efek akut yang khas. Terdapat kesamaan efek
antara obat adiktif yang satu dengan yang lainnya yaitu menimbulkan euphoria
13
dan imbalan (reward ) yang kuat. Terpajannya seseorang dengan zat adiktif yang
terus menerus, zat adiktif tersebut dapat menimbulkan perubahan adaptif, seperti
toleransi (peningkatan dosis untuk menimbulkan efek serupa), sekali obat tersebut
tidak tersedia timbul gejala putus obat. Kumpulan dari gejala tersebut disebut
sebagai sindrom putus obat, dimana sindrom putus oabat ini menggambarkan
ketergantungan. Di sisi lain, kecanduan merupakan tindakan penggunaan obat
berulang dan kompulsif meskipun terdapat efek negatif. 25,26
Sistem dopamin mesolimbik merupakan sasaran utama obat adiktif.
System ini berasal dari area tegmentum ventral (ATV), suatu bangunan kecil
diujung batang otak, yang menonjol ke nukleus akumbens, amigdala dan korteks
prefrontal. Sebagian besar neuron proyeksi ATV adalah neuron penghasil
dopamin. Apabila neuron dopamine TV mulai mencetuskan impuls dalam bentuk
letupan –letupan, banyak dopamin dilepaskan melalui nukleus akumbens dan
korteks prefrontal.27
Gambar 2.4 Sistem MesolimbikSumber : Carlson , Neil R :2013
14
Setiap obat adiktif memiliki sasaran molecular spesifik yang menjalankan
mekanisme sel khusus untuk mengaktifkan system mesolimbik, maka
digolongkanlah kedalam tiga golongan obat, yaitu: obat yang berikatan dengan
reseptor terkopel G10,, obat yang berinteraksi dengan resepor ionotropik atau kanal
ion dan obat yang menjadikan transporter monoamine sebagai sasarannya. Obat
dalam kelompok G10 menghambat neuron melalui hiperpolarisasi pascasinaptik
dan pengaturan pembebasan transmitter pascasinaptik. Di ATV, obat-obat ini
diperkirakan bekerja pada neuron asam ɣ aminobutirat (GABA) yang berperan
sebagai interneuron inhibitoris setempat. Obat yang berikatan dengan reseptor
ionotropik dan kanal ion dapat memiliki efek kombinasi pada neuron dopamin
dan neuron GABA sehingga meningkatkan pembebasan dopamin. Akhirnya, obat
adiktif dapat menimbulkan penumpukan dopamin ekstrasel di struktur yang
menjadi sasaran.28
Tabel. 2.1. Klasifikasi mekanistik obat-obat pada system mesolimbik
Nama Obat Sasaran Molekular Utama
Obat yang mengaktifkan reseptor terkopel protein-G
Opioid µ-OR (G10)
Kanabinoid CB1R
Asam ɣ- hidroksibutirat GABABR (G10)
LSD, mescaline, psilocybin 5HT2AR (G10)
Obat yag berikatan dengan reseptor Ionotropik dan Kanal ion
Nikotin nAChR (α2β2)
Alkohol GABAAR, 5HT3R, nAChR, NMDAR, kanal Kir3
Benzodiazepin GABAAR
Phencyclidine, ketamine NMDAR
Obat yang berikatan dengan transporter amin biogenic
Cocaine DAT, SERT, NET
Amphetamine DAT, NET, SERT,VMAT
Ecstasy DAT, SERT, NET
Sumber : Bertram G, Katzung : 2010 (Tabel telah diolah)
15
2.1.8 Farmakologi Nikotin
Nikotin adalah agonis selektif reseptor nikotinik asetilkolin (nAChR) yang
biasanya diaktifkan oleh asetilkolin. Efek imbalan dari nikotin melibatkan ATV,
tempat nAChR diekspresikan pada neuron dopamin. Ketika nikotin mengeksitasi
neuron proyeksi, dopamine dilepaskan di nukleus akumbens dan di korteks
prefrontal sehingga meenuhi persyaratan dopamin dari obat adiktif. Penelitian
terbaru telah mengidentifikasikan kanal yang mengandung α4β2 di ATV sebagai
nAChR yang diperlukan bagi nikotin untuk menimbulkan efek imbalannya.
Penelitan elektrofisiologik menyatakan nAChR homomerik yang hanya tersusun
atas subunit α7 juga berperan pada efek penguatan dari nikotin. Reseptor –
reseptor ini diekspresikan di ujung sinaptik aferen eksitatoris yang berproyeksi
kedalam neuron dopamin. Mereka juga berperan pada pembebebasan dopamin
yang dipicu oleh nikotin dan pada perubahan jangka panjang yang dipicu oleh
obat-obat yang menimbulkan kecanduan.29
Gejala putus obat nikotin cenderung dapat dkatakan ringan, yakni
menyebabkan iritabilitas dan sulit tidur. Akan tetapi, nikotin termasuk salah satu
obat yang paling sering menimbulkan kecanduan dan sering terjadi relaps pasca
penghentian obat.30
2.1.9 Enzim EcoR1
Enzim nuklease merupakan enzim yang memotong DNA dengan
memutuskan ikatan fosfodiester antara nukeotida satu dengan nukleotida
berikutnya. Enzim nuklease terbagi menjadi dua yaitu: endonuklease dan
eksonuklease. Endonuklease merupakan nuklease yang memotong bagian internal
DNA tepat pada ikatan fosfodiester. Ada 3 macam tipe enzim endonuklease yaitu
tipe I,II dan III. Tipe II lebih sering digunakan karena dapat memotong tepat pada
sekuens yang diinginkan. Salah satu enzim endonuklease tipe II adalah enzim
EcoR1, yaitu enzim yang diisolasi dari Escherichia coli dan memotong molekul
DNA pada urutan heksanukleotida 5’-GAATTC-3’.
16
Gambar 2.5 Hasil Pemotongan enzim EcoR1Sumber : http://www.ncbi.nlm.nih.gov dalam Aris Tjachyono . 2008
17
2.2 Kerangka Teori
Rokok
Menghilangkan ataumenurukan efek nikotin
nikotin
Ketergantungannikotin
kotinin
Timbul berbagai macam penyakit ataugangguan yang terkait dengandegenerasi fungsi
Terus menruskonsumsi rokok
Stimulus ke BrainReward System
Gen CYP2A6
BehavioralReinforcement
Pekerjaan
Pendidikan
Akumulasikerusakan organ
Faktor internal
Pendapatan
Lingkungan sosial
Faktor eksternal
18
2.3 Kerangka Konsep
2.4 Definisi Operasional
No. Variabel Definisi Cara Ukur Skala
1. Gen CYP2a6 Gen pengkode enzim
sitokrom P450 famili
nomor 2, subfamili a
nomor 6 yang terletak
pada kromosom 19p13.2
dan diekspresikan
di hepar, merupakan gen
yang mengoksidasi
nikotin menjadi nikotin
Δ1‟(5‟)-iminium ion
Teridentifikasi
adanya pita
DNA melalui
elektroforesis
Kategorik
Gen CYP2A6
Ketergantunganterhadap rokok
DNA Gen CYP2A6Sampel darah
19
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian dengan desain deskriptif.
3.2 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di laboratorium biologi dan biokimia Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan (FKIK) Universitas Islam Negeri Syarif
Hidayatullah Jakarta. Waktu penelitian ini dilakukan dari bulan Januari hingga
Agustus 2014.
3.3 Sampel Penelitian
Sampel adalah karyawan di Universitas Islam Jakarta Syarif Hidayatullah
Jakarta yang merokok.
3.3.1 Besar Sampel
Besar sampel pada penelitian ini adalah 10 orang dengan kontrol normal
10 orang.
3.3.2 Teknik Pengambilan Sampel
Metode pengambilan sampel yaitu dengan teknik consecutive
3.3.3 Kriteria Sampel
3.3.3.1 Kriteria Inklusi
Subyek penelitian merupakan seorang laki-laki yang merokok dengan
range usia 20 -50 tahun.
3.3.3.2 Kriteria Eksklusi
Perokok dengan usia kurang dari 20 tahun dan diatas 50 tahun
20
3.4 Cara Kerja
3.4.1 Ijin Subjek Penelitian
Seluruh subyek penelitian akan mendapatkan tujuan, manfaat serta akibat
sehubungan dengan penelitian. Bila menyetujui, subyek penelitian
menandatangani formulir ijin penelitian.
3.4.2 Alur Peneliian
3.4.3 Alat dan Bahan
3.4.3.1 Phlebotomi
Alat
Spuit, kapas alkohol, tali pembendung (tourniquet), plester, tabung
vakutener, dan sarung tangan.
3.4.3.2 Isolasi DNA
Alat
Tabung EDTA, mikrosentrifuge, mikropipet, tabung mikro, vortex,
sarung tangan, water bath, dan pipet tetes.
DNA Gen CYP2A6
PCR
Sampel darah
Isolasi darah
DNA genom
Elektroforesis
Elektroforesis
21
Bahan
Darah sampel, isopropanol, larutan nuclei lisis, larutan rehidrasi
DNA, antikoagulan, etanol 70 % ,dan larutan protein precipitation.
3.4.3.3 PCR
Alat
PCR verivy A-B, mikropipet, tabung mikro, tabung PCR,
sentrifugator, rak tabung mikro, kotak es, dan refrigerator 4°C.
Bahan
Hasil isolasi DNA genom, Human PCR Toolbox, Oligonukeotida
sintetik (primer) dari proligo Sigma dengan urutan primer sebagai
berikut :
F :5‟- CAC CGA AGT GTT CCC TAT GCT G -3‟
R : 5‟- AAA ATG GGC ATG AAC GCC C -3‟
3.4.3.4 Metode deteksi DNA dengan Elektroforesis Gel Agarose 1 %
Alat
Mikropipet, tabung mikro, sentrifugator, gelas kimia, gelas ukur, hot
plate, Horizontal Agarose Gel Electrophoresis Apparatus ( Bio-Rad) ,
UV-transluminator, Power Pac Basic (Bio-Rad), timbangan digital,
sarung tangan, spidol
Bahan
Hasil inkubasi produk PCR, Loading Dye Buffer (promega), Dna
Ladder 200 bp ( Roche) 100 ml Buffer TAE, Ethidium Bromide,
concentrated buffer (50 X)
22
3.4.3.5 Pemotongan dengan enzim EcoR1
Alat
Mikropipet , tube
Bahan
DNA template, Enzim EcoR1, 10x buffer EcoR1, dan ddH2O
3.4.4 Cara Kerja
3.4.4.1 Pengambilan sampel darah
Pengambilan sampel darah dilakukan dengan phlebotomy dengan
jumlah 1 cc, kemudian sampel disimpan kedalam tabung vakutener dan
disimpan di dalam refrigerator dengan suhu 4° C.
3.4.4.2 Isolasi DNA genom
900 cell lysis solution dimasukkan kedalam tabung microcentrifuge
steril, ditambah dengan 300 ul darah dan tabung diinkubasi selama 10 menit
dalam suhu ruang (bolak –balik 2-3 kali selama inkubasi) agar larutan
terhomogenisasi. Kemudian larutan tersebut disentrifugasi dengan kecepatan
13.000 pada suhu ruang selama 1 menit, setelah itu, supernatant dibuang tanpa
mengganggu pellet. Pellet ditambah dengan 600 ul cell lysis solution dan
kemudian tabungnya diputar agar larutannya bercampur, Ulangi tahap tersebut
sampai pellet terlihat putih. Pellet ditambahkan dengan 300ul nuclei lysis
solution. Kemudian larutan dipipet sebanyak 5-6 kali untuk melisiskan sel
darah putih dan inti sel. Larutan harus benar-benar jadi kental. Jika masih
terlihat butiran-butiran kecil setelah pencampuran, larutan diinkubasi pada suhu
37°C sampai butiran tersebut hilang. Inkubasi campuran pada suhu 37°C
selama 15 menit. Langkah selanjutnya adalah penambahan 100 ul protein
precipitation solution ke dalam lysate dan putar selama 20 detik. Setelah
diputar akan terlihat butiran protein halus. Sentrifugasi dengan kecepatan
13.000 selam 3 menit pada suhu ruang. Akan terlihat pellet dengan warna
coklat terang. Bila supernatant masih berwarna coklat, ambil supernatant
tersebut, pindahkan ke tabung microcentrifuge bersih, ulangi penambahan
23
protein precipitation dan sentrifugasi. Supernatant dipindahkan ke dalam
tabung microcentrifuge bersih yang sudah berisi 1 ml isopropanol. Tabung
dibolak-balik secara perlahan sampai terlihat benang – benang putih halus
(DNA). Untuk optimalisasi, sampel yang berupa supernatan disimpan pada
suhu -20° C overnight. Besoknya sampel disentrifugasi pada kecepatan 13.000
rpm pada suhu ruang selama 2 menit, akan terlihat pellet putih. Buang
supernatant, pellet dicuci dengan 1000 ul alkohol 70%. Kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang, sampai pellet
menjadi putih. Supernatant dibuang, kemudian pellet dikering anginkan pada
suhu ruang. DNA dilarutkan dengan 100 ul rehydration DNA. Rehidrasi DNA
pada suhu 65°C selama 1 jam atau pada suhu 4° C overnight. Setelah itu, DNA
di simpan pada suhu -20° C.
3.4.4.3 Amplifikasi dengan menggunakan PCR
Dalam penelitian ini menggunakan master mix dari Kappa. Campuran
Master Mix dimasukkan kedalam tube PCR sebanyak 20 uL, dan ditambah
DNA template sebanyak 5 uL. Setelah itu, tabung PCR dimasukkan kedalam
mesin PCR yang telah diprogram, yaitu denaturasi awal pada suhu 94°C
selama 5 menit, 35 siklus: fase denaturasi (94°C selama 20 detik ), fase
annealing (55°C selama 30 detik) dan fase extension (72°C selama 3 menit ).
setelah selesai tabung mikro diangkat dari mesin PCR , simpan pada suhu 4°C
3.4.4.4. Elektoforesis DNA
Agarosa bubuk ditimbang untuk membuat 1,5 % gel agarosa dalam
larutan buffer. Larutan agarosa tersebut dimasak sampai mendidih dan larut
semua. Larutan tersebut dibiarkan dingin sampai kira-kira 70°C, kemudian
masukkan 5 uL 0,1 % etidium bromide. Lalu, larutan agarosa dituangkan ke
dalam tray electrophoresis yang telah diiapkan terlebih dahulu dan dipasangi
sisir, agarosa dibiarkan dingin dan mengeras. Setelah gel agarosa mengeras,
tray dipasang berikut isinya kedalam chamber elektroforesis. Sisir diambil
pada gel, kemudian larutan buffer dituangkan sampai melebihi permukaan gel.
24
Larutan loading buffer + DNA dimasukkan ke dalam sumur yang telah
terbentuk dari sisir yang telah diangkat secara hati-hati dan perlahan. Alat
elektroforesis dihubungkan dengan power supply yang telah diatur dengan
voltase 90 volt selama 1 jam. Kemudian, pita DNA diamati menggunakan UV
illuminator dan Gel Dock.
3.4.4.5 Pemotongan dengan enzim restriksi
Membuat campuran yang terdiri atas 0,5 ul enzim Eco R1, 2 ul 10 x buffer
EcoR1, dan 13,5 ddH2O di dalam tube, kemudian DNA template yang telah
dilakukan amplifikasi dengan teknik PCR ditambahkan kedalam larutan tersebut
sebanyak 4 ul. Larutan tersebut diaduk agar homogen. Langkah selanjutnya
adalah melakukan inkubasi pada larutan tersebut pada suhu 37°C overnight.
25
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Jumlah perokok yang berhasil dikumpulkan dan sesuai kriteria inklusi dan
eksklusi dalam penelitian ini adalah sebanyak 10 orang perokok. Dibawah ini akan
diuraikan analisis deskriptif mengenai subyek tersebut.
4.1 Gambaran Gen CYP2a6
Sampel Marker1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Gambar 4.1 Foto hasil PCR sampel
Keterangan : = Pita gen CYP2a6
Gambar 4.1 merupakan foto hasil amplifikasi dengan teknik PCR, terdapat 4
sampel yang memperlihatkan adanya segmen dari gen CYP2a6 sepanjang 1500 bp
hampir sama dengan panjang pita yang diperoleh pada penelitian dr. Widjaya yang
mendapatkan pita sepanjang 1338 bp, sedangkan 6 sampel lainnya tidak
memperlihatkan segmen gen CYP2a6.
Kemudian dilakukan perbandingan antara hasil PCR sampel dengan hasil
PCR kontrol normal, maka didapatkan hasil sebagaimana yang tergambar pada
gambar 4.2 berikut :
25
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Jumlah perokok yang berhasil dikumpulkan dan sesuai kriteria inklusi dan
eksklusi dalam penelitian ini adalah sebanyak 10 orang perokok. Dibawah ini akan
diuraikan analisis deskriptif mengenai subyek tersebut.
4.1 Gambaran Gen CYP2a6
Sampel Marker1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Gambar 4.1 Foto hasil PCR sampel
Keterangan : = Pita gen CYP2a6
Gambar 4.1 merupakan foto hasil amplifikasi dengan teknik PCR, terdapat 4
sampel yang memperlihatkan adanya segmen dari gen CYP2a6 sepanjang 1500 bp
hampir sama dengan panjang pita yang diperoleh pada penelitian dr. Widjaya yang
mendapatkan pita sepanjang 1338 bp, sedangkan 6 sampel lainnya tidak
memperlihatkan segmen gen CYP2a6.
Kemudian dilakukan perbandingan antara hasil PCR sampel dengan hasil
PCR kontrol normal, maka didapatkan hasil sebagaimana yang tergambar pada
gambar 4.2 berikut :
25
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Jumlah perokok yang berhasil dikumpulkan dan sesuai kriteria inklusi dan
eksklusi dalam penelitian ini adalah sebanyak 10 orang perokok. Dibawah ini akan
diuraikan analisis deskriptif mengenai subyek tersebut.
4.1 Gambaran Gen CYP2a6
Sampel Marker1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Gambar 4.1 Foto hasil PCR sampel
Keterangan : = Pita gen CYP2a6
Gambar 4.1 merupakan foto hasil amplifikasi dengan teknik PCR, terdapat 4
sampel yang memperlihatkan adanya segmen dari gen CYP2a6 sepanjang 1500 bp
hampir sama dengan panjang pita yang diperoleh pada penelitian dr. Widjaya yang
mendapatkan pita sepanjang 1338 bp, sedangkan 6 sampel lainnya tidak
memperlihatkan segmen gen CYP2a6.
Kemudian dilakukan perbandingan antara hasil PCR sampel dengan hasil
PCR kontrol normal, maka didapatkan hasil sebagaimana yang tergambar pada
gambar 4.2 berikut :
26
Marker Sampel1 2 3 4 5
Gambar 4.2 Foto hasil PCR sampel dibandingkan dengan kontrol normal
Keterangan : = Pita Gen CYP2A6 Sampel
= Pita Gen CYP2A6 Kontrol Normal
Telah dibahas pada bab sebelumnya bahwa gen CYP2a6 berfungsi sebagai
enzim yang memetabolisme nikotin menjadi kotinin sehingga menurunkan kadar
nikotin dalam darah dimana hal tersebut dapat menurunkan stimulus pada sistem
mesolimbik sehingga menyebabkan seorang perokok akan mengonsumsi rokok lebih
sering lagi , atau biasa disebut dengan toleransi.
Tidak munculnya segmen gen CYP2a6 dapat terjadi karena beberapa hal,
misal pasien mengonsumsi obat-obatan yang menjadi inhibitor dari enzim sitokrom
P450 seperti rifampicin dan deksametason, dan dapat juga terjadi karena aktivitas gen-
gen penyandi enzim tersebut. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut
menggunakan enzim restriksi agar diperoleh polimorfisme yang terjadi pada sampel.
Untuk membuktikan adanya polimorfisme yang terjadi pada sampel yang
tidak muncul gambaran pita pada foto hasil elektroforesis dilakukan teknik
pemotongan dengan enzim restriksi. Enzim restriksi yang peneliti gunakan adalah
26
Marker Sampel1 2 3 4 5
Gambar 4.2 Foto hasil PCR sampel dibandingkan dengan kontrol normal
Keterangan : = Pita Gen CYP2A6 Sampel
= Pita Gen CYP2A6 Kontrol Normal
Telah dibahas pada bab sebelumnya bahwa gen CYP2a6 berfungsi sebagai
enzim yang memetabolisme nikotin menjadi kotinin sehingga menurunkan kadar
nikotin dalam darah dimana hal tersebut dapat menurunkan stimulus pada sistem
mesolimbik sehingga menyebabkan seorang perokok akan mengonsumsi rokok lebih
sering lagi , atau biasa disebut dengan toleransi.
Tidak munculnya segmen gen CYP2a6 dapat terjadi karena beberapa hal,
misal pasien mengonsumsi obat-obatan yang menjadi inhibitor dari enzim sitokrom
P450 seperti rifampicin dan deksametason, dan dapat juga terjadi karena aktivitas gen-
gen penyandi enzim tersebut. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut
menggunakan enzim restriksi agar diperoleh polimorfisme yang terjadi pada sampel.
Untuk membuktikan adanya polimorfisme yang terjadi pada sampel yang
tidak muncul gambaran pita pada foto hasil elektroforesis dilakukan teknik
pemotongan dengan enzim restriksi. Enzim restriksi yang peneliti gunakan adalah
26
Marker Sampel1 2 3 4 5
Gambar 4.2 Foto hasil PCR sampel dibandingkan dengan kontrol normal
Keterangan : = Pita Gen CYP2A6 Sampel
= Pita Gen CYP2A6 Kontrol Normal
Telah dibahas pada bab sebelumnya bahwa gen CYP2a6 berfungsi sebagai
enzim yang memetabolisme nikotin menjadi kotinin sehingga menurunkan kadar
nikotin dalam darah dimana hal tersebut dapat menurunkan stimulus pada sistem
mesolimbik sehingga menyebabkan seorang perokok akan mengonsumsi rokok lebih
sering lagi , atau biasa disebut dengan toleransi.
Tidak munculnya segmen gen CYP2a6 dapat terjadi karena beberapa hal,
misal pasien mengonsumsi obat-obatan yang menjadi inhibitor dari enzim sitokrom
P450 seperti rifampicin dan deksametason, dan dapat juga terjadi karena aktivitas gen-
gen penyandi enzim tersebut. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut
menggunakan enzim restriksi agar diperoleh polimorfisme yang terjadi pada sampel.
Untuk membuktikan adanya polimorfisme yang terjadi pada sampel yang
tidak muncul gambaran pita pada foto hasil elektroforesis dilakukan teknik
pemotongan dengan enzim restriksi. Enzim restriksi yang peneliti gunakan adalah
27
enzim Eco R1. Gambar 4.3 berikut memperlihatkan hasil digesti beberapa sampel dan
control normal yang dipotong dengan enzim restriksi .
Sampel Marker Sampel1 2 3
Gambar 4.3 Foto Hasil digesti sampel dengan enzim restriksi EcoR1
Keterangan : = Pita Gen CYP2A6 Kontrol Normal
= Pita Gen CYP2A6 Sampel
Tidak terdapat perbedaan hasil digesti dengan enzim EcoR1 antara sampel
perokok dengan control normal, dimana tidak ditemukan adanya poyongan dari pita
DNA gen target, hal ini kemungkinan disebabkan enzim Eco R1 belum spesifik
memotong pada gen target.
27
enzim Eco R1. Gambar 4.3 berikut memperlihatkan hasil digesti beberapa sampel dan
control normal yang dipotong dengan enzim restriksi .
Sampel Marker Sampel1 2 3
Gambar 4.3 Foto Hasil digesti sampel dengan enzim restriksi EcoR1
Keterangan : = Pita Gen CYP2A6 Kontrol Normal
= Pita Gen CYP2A6 Sampel
Tidak terdapat perbedaan hasil digesti dengan enzim EcoR1 antara sampel
perokok dengan control normal, dimana tidak ditemukan adanya poyongan dari pita
DNA gen target, hal ini kemungkinan disebabkan enzim Eco R1 belum spesifik
memotong pada gen target.
27
enzim Eco R1. Gambar 4.3 berikut memperlihatkan hasil digesti beberapa sampel dan
control normal yang dipotong dengan enzim restriksi .
Sampel Marker Sampel1 2 3
Gambar 4.3 Foto Hasil digesti sampel dengan enzim restriksi EcoR1
Keterangan : = Pita Gen CYP2A6 Kontrol Normal
= Pita Gen CYP2A6 Sampel
Tidak terdapat perbedaan hasil digesti dengan enzim EcoR1 antara sampel
perokok dengan control normal, dimana tidak ditemukan adanya poyongan dari pita
DNA gen target, hal ini kemungkinan disebabkan enzim Eco R1 belum spesifik
memotong pada gen target.
28
4.2 Data Tambahan
4.2.1 Deskripsi perokok berdasarkan usia
Data deskripsi 10 orang perokok berdasarkan usia meliputi rentang usia 20
sampai 50 tahun , sesuai dengan kriteria inklusi. Dengan rerata usia 32,4 tahun. Data
tersebut dapat dilihat dari tabel 4.1 dibawah ini.
Tabel 4.1. Frekuensi perokok berdasarkan usia
Usia Frekuensi
≤32,4 5 orang (50%)
>32,4 5 orang (50%)
Total !0 orang (100%)
4.2.2 Deskripsi perokok berdasarkan jumlah rokok yang dihisap per hari
Rata- rata dalam sehari subyek dalam penelitian ini menghisap rokok
sebanyak 12,6 batang. Data tersebut dapat dilihat pada tabel 4.2 dibawah ini
Tabel 4.2. Frekuensi perokok berdasarkan jumlah rokok yang dihisap perhari
Jumlah Rokok per Hari (batang) Frekuensi
≤12,6 9 orang (90%)
>12,6 1 orang (10%)
Total !0 orang (100%)
4.2.3 Deskripsi perokok berdasarkan lama kebiasaan merokok
Dari data didapatkan rata-rata lama kebiasaan merokok pada subyek
penelitian adalah 14,4 tahun. Data tersebut dapat dilihat pada tabel 4.3 dibawah ini .
29
Tabel 4.3 Frekuensi perokok berdasarkan lama kebiasaan merokok
Lama Kebiasaan Merokok
(tahun)Frekuensi
≤14,4 6 orang (60%)
>14,4 4 orang (40%)
Total !0 orang (100%)
4.2.4 Deskripsi perokok berdasarkan skor FTND (Fagerstrröm Test for NicotineDependence)
Berikut merupakan deskripsi perokok berdasarkan skor FTND:
Tabel 4.4 Frekuensi perokok berdasarkan skor FTND
Skor FTND Frekuensi
0-2 sangat rendah 1 (10%)
3-4 rendah 2 (20%)
5 sedang 4 (40%)
6-7 tinggi 3 (30%)
8-10 sangat tinggi 0 (0%)
4.2.5 Karakteristik subyek penelitian
Penelitian ini terdiri atas 10 sampel perokok yang menunjukkan tanda dan
gejala ketergantungan fisik terhadap nikotin berdasarkan skor FTND, yaitu sebanyak
1 orang (10% dari sampel) tergolong dalam ketergantungan fisik sangat rendah, 2
orang (20% dari sampel) tergolong dalam ketergantungan fisik rendah, 4 orang (40%
dari sampel) tergolong dalam ketergantungan fisik sedang, dan 3orang (30%)
tergolong dalam ketergantungan fisik tinggi.
30
Sebagian perokok, yaitu sebanyak 6 orang (60% dari sampel) telah memiliki
kebiasaan merokok selama kurang dari sama dengan 14,4 tahun, sedangkan 4 orang
lainnya yaitu sebanyak 4 orang (40% dari sampel) telah memiliki kebiasaan merokok
selama lebih dari 14,4 tahun dengan jumlah rata-rata rokok yang dikonsumsi perhari
pada 10 sampel tersebut adalah 12,6 batang.
Data mengenai karakteristik penelitian tersebut data dilihat pada tabel 4.5
dibawah ini.
Tabel 4.5 Karakteristik subyek penelitian
no Sampel jumlah rokok
perhari (batang)
Lama merokok
(tahun)
FTND Gen CYP2a6
1. A 12 20 5 -
2. B 12 10 3 +
3. C 12 10 5 -
4 D 12 5 3 +
5 E 12 7 5 +
6 F 12 22 6 -
7 G 24 27 7 -
8 H 12 3 6 +
9 I 6 10 2 -
10 J 12 30 5 -
Keterangan:No Skor FTND Keterangan
1 0-2 Sangat rendah
2 3-4 Rendah
3 5 Sedang
4 6-7 Tinggi
5 8-10 Sangat tinggi
Sumber : Heatherton , et al :1991
31
4.3 Mekanisme terjadinya ketergantungan fisik terhadap nikotin
Terdapat faktor genetik dan lingkungan yang menyebabkan seseorag
mengalami ketergantungan terhadap nikotin. Kedua faktor tersebut saling
mempengaruhi. Menurut penelitian yang dilakukan O’ Brian sifat nikotin yang
menimbulkan ketergantungan sebanding dengan waktu dan dosis konsumsi rokok.
Berdasar teori tersebut, terdapat pergeseran proses fisiologis tubuh apabila terjadi
akumulasi nikotin dalam tubuh, karena akumulasi nikotin yang cukup tinggi dapat
menimbulkan downregulation pada beberapa reseptor dan juga dapat menimbulkan
upregulation dari beberapa reseptor lainnya.
Merujuk dari penelitian dr. Hendy Wijaya tentang gen CYP2a6 dapat
meningkatkan tingkat ketergantungan seseorang terhadap nikotin serta teori O’Brian
mengenai ketergantungan dapat tejadi karena akumulasi nikotin dalam tubuh dimana
dosis dan lama konsumsi rokok berpengaruh didalamnya, maka proses toleransi yang
telah terjadi dapat dijadikan patokan telah terjadi ketergantungan fisik terhadap
nikotin, proses ini dapat diukur dengan menggunakan kuesioner FTND.
4.4 Peran gen CYP2a6
Salah satu faktor risiko yang dapat menimbulkan ketergantungan fisik
terhadap nikotin adalah tingginya jumlah rokok dengan kadar yang tinggi yang
dihisap perharinya, dengan demikian dapat menyebabkan kadar enzim yang
memetabolisme nikotin, CYP2a6, meningkat. Ketika kadar gen CYP2a6 meningkat
maka kadar nikotin dalam darah perokok akan turun dibawah batas rangsang, jadi
stimulus pada sistem mesolimbik dan area lain akan menurun, sehingga perokok akan
mengalami proses toleransi dengan cara semakin sering merokok, dimana gejala
tersebut merupakan gejala ketergantungan.
4.5 Keterbatasan penelitian
32
Selama penelitian berlangsung, banyak hambatan yang didapat antara lain:
1. Kurangnya waktu yang diberikan untuk penelitian, sehingga peneliti harus
mengambil waktu kuliah dalam melakukan penelitian
2. Kurangnya sarana dan prasarana di lembaga, misal alat PCR sempat
rusak,sehingga peneliti harus melaksanakan penelitian di tempat lain sehingga
waktunya kurang efektif dan efisien.
33
BAB V
SIMPULAN DAN SARAN
5.1 Simpulan
1. Setelah dilakukan isolasi DNA genom dan dilanjutkan dengan amplifikasi
menggunakan teknik PC didapatkan pita DNA dengan ukuran 1500 bp
pada 4 sampel perokok dan 2 kontrol normal,
2. Tidak terdapat pita DNA pada 6 sampel perokok yang diperiksa, hal ini
kemungkinan terjadi karena konsentrasi DNA template terlalu kecil.
5.2 Saran
Adapun hal yang dapat disarankan untuk peneliti selanjutnya adalah:
1. Perlu dikembangkan lebih lanjut dengan menggunakan enzim restriksi
untuk mengetahui adanya polimorfisme yang terjadi pada gen tersebut.
2. Perlu dilakukan penelitian dengan jumlah sampel yang lebih banyak .
3. Perlu dilakukan penelitian dengan desain analitik untuk meganalisis
korelasi antara gen yang dimiliki dengan beberapa faktor yang
berpengaruh terhadap ketergantungan nikotn
34
DAFTAR PUSTAKA
1. World Lung Foundation (WLF). Angka Kematian akibat rokok dalam tigadecade terakhir. New York, 2008. p 34
2. Barber S, Adioetomo SM, Ahsan A, dan Setyonaluri D. Ekonomi Tembakaudi Indonesia. Laporan Penelitian. Lembaga Demografi Fakultas EkonomiUniversitas Indonesia. Jakarta, 2008. p 26.
3. Tyndale RF, Sellers E. Variable CYP2A6-Mediated Nicotine MetabolismAlters Smoking Behavior and Risk. The American Society for Pharmacologyand Experimental Therapeutics. 2005 . Vol. 29, No. 4. p 11.
4. Burns DM. Nicotine Addiction. In DL. Kasper, E. Braunwalds, AS. Fauci,SL Hauser, DL Longo, dan JL. Jameson (Eds), Harrison’s Principles ofInternal Medicine, 16th Edition, New York, McGraw-Hill. 2005. p 2573-2577
5. O‟Brian CP. Drug Addiction and Drug Abuse. In L.L. Brunton, JS. Lazo, &KL. Parker (Eds), Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis ofTherapeutics, 11th Edition, New York, McGraw-Hill. 2006. p 203-206
6. Caron L, Karkazis K, Raffin TA, Swan G dan Koenig BA. Nicotine addictionthrough a neurogenomic prism: Ethics, public health, and smoking. NicotineTob Res .Vol. 7, No. 2. 2005. p 11-17.
7. Gullstén, H. Significance of Polymorphism in CYP2A6 Gene. Disertation.Department of Pharmacology and Toxicology University of Oulu. Oulu,2000.p 56.
8. Yoshida R, Nakajima N, Watanabe Y, Kwon J. dan Yokoi T. GeneticPolymorphisms in Human CYP2A6 Gene Causing Impaired NicotineMetabolism. Journal Of Clinical Pharmacology .Vol. 54, Oulu, 2002. p 511-517.
9. Munafö MR, Clark TG, Johnstone EC, Murphy MFG dan Walton RT. TheGenetic Basis for Smoking Behavior: A Systematic Review and Meta-Analysis. Nicotine and Tobaco Research. Vol. 6, No. 4. 2003. p 231
10. Rao Y, Hoffmann E, Zia M, Bodin L, Zeman M, Sellers EM dan Tyndale RF.Duplications and Defects in The CYP2A6 Gene: Identification, Genotyping,and In Vivo Effects on Smoking. The American Society for Pharmacologyand Experimental Therapeutics. Vol. 58, 2000. p 112
35
11. Nussbaum RL, McInnes RR dan Willard HF. Genetic Variation in Individualsand Population: Mutation and Polymorphism. In R.L. Nussbaum, R.R.McInnes & H.F. Willard (Eds), Thompson and Thompson Genetics inMedicine, 7th Edition. Saunders Elsevier, Philadelphia, 2007. p 175-199.
12. Davies GE , Soundy TJ. The Genetics of Smoking and Nicotine Addiction,2009: South Dakota Medicine. (Online), (Available from www.sdsma.org/documents /Davies.pdf, diakses pada December ,2013).
13. Fukami T, Nakajima M, Yamanaka, H Fukushima, McLeod HL dan Yokoi T.A Novel Duplication Type of CYP2A6 Gene in African- AmericanPopulation. The American Society for Pharmacology and ExperimentalTherapeutics. Vol. 35, No. 4. 2007. p 186.
14. Wijaya H. Gen CYP2A6 Meningkatkan Ketergantungan Fisik Perokokterhadap Nikotin . 2010. (Diakses pada September, 2013)
15. McPhee SJ, Pignone M. Disease Prevention and Health Promotion. In SJ.McPhee, MA Papadakis, dan LM Tierney Jr (Eds), Current MedicalDiagnosis and Treatment, 47th Edition, New York: McGraw- Hill. 2007. p 1-16
16. Arking R. The Biology Of Aging, 3rd Edition. Oxford University Press. NewYork, 2005. p 9-11.
17. Benowitz NL. Cotinine as Biomarker of Environmental Tobacco SmokeExposure. The Johns Hopkins University School of Hygiene and PublicHealth. Vol. 18, No. 2. 1996 . p 14.
18. Hoffman D, Hoffman I. Chemistry and Toxicology, 1999: Smoking andTobacco Control Monograph. (Online), (diunduh dari :http://dccps.ncbi.nih.gov /TCRB/monographs/9/m9_3.PDF, diakses pada 23januari 2014).
19. Hukkanen J, Jacob III P, dan Benowitz NL. Metabolism and DispositionKinetics of Nicotine. The American Society for Pharmacology andExperimental Therapeutics. Vol. 57, 2005 . p 80.
20. McKee T, McKee J.R. Aerobic Metabolism II: Electron Transport andOxidative Phosphorylation. Biochemistry: The Molecular Basis of Life, 3rdEdition, Mc Graw Hill, Philadelphia, 2003. P 298-330.
36
21. Kennely PJ, Rodwell VW. Proteins: Myoglobin and Hemoglobin. In RKMurray, DK Granner, dan VW Rodwell (Eds), Harper’s IllustratedBiochemistry, 27th Edition, Mc Graw Hill, New York,2006. p 41- 48.
22. Murray RK. Metabolism of Xenobiotics. In RK Murray, DK Granner, danVW Rodwell (Eds), Harper’s Illustrated Biochemistry, 27th Edition, McGraw Hill, New York,2006. p 633-640.
23. Oscarson M. Genetic Polymorphism in The Cytochrome P450 2A6 (CYP2A6)Gene: Implication for Interindividual Differences in Nicotine Metabolism.The Journal Of Pharmacology and Experimental Therapeutics. Vol. 29, No.2. 2001 . p 58.
24. Nakajima M, Kwon JT, Tanaka N, Zenta T, Yamamoto Y, Yamamoto H,Yamazaki H, Yamamoto T, Kuroiwa, Y dan Yokoi T. Relationship BetweenInterindividual Differences in Nicotine Metabolism and CYP2A6 GeneticPolymorphism in Humans. Clinical Pharmacology and Therapeutics. Vol. 69.No. 1. 2001. p 231-232.
25. Bertram G, Katzung. Farmakologi dasar dan klinik, Edisi 10. Jakarta : EGC .2010. p 674.
26. Robinson TE, Berridge KL . Addiction . Annu Rev Psychol, New York, 2003.p 32.
27. Ungless MA. Dopamine : The Salient Issue . Trends Neurosci, New York,2004. P 481.
28. L. Usher C., Ungless MA. The Mechanistic Classification of Addictive Drugs.PloS Med , New York. 2006. Dalam Bertram G, Katzung. Farmakologi dasardan klinik, Edisi 10. Jakarta : EGC . 2010. p 674.
29. Maskos U, et al. Niicotine reinforcement and cognition restored by targetedexpression of nicotinic receptor s. Nature, New York, 2005. Dalam BertramG, Katzung. Farmakologi dasar dan klinik, Edisi 10. Jakarta : EGC . 2010. p674.
30. Morton J. Pharmacology and Neurotoxicity . Curr Opin Pharmacol, NewYork, 2005. p 98.
37
Lampiran 1
38
Lampiran 2
Lembar Penjelasan Kepada Subyek Penelitian
Assalamualaikum wr wb
Saya Muflikha Mayazi yang sedang menjalani pendidikan S1 kedokteran
Umum di Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.Saya akan
mengadakan penelitian dengan judul “Identifikasi Gen CYP2a6 pada perokok di
kalangan karyawan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta”. Saya
mengikutsertakan Anda dalam penelitian ini yang bertujuan untuk mengetahui adanya
ekspresi gen CYP2a6.
Gen Cyp2a6 merupakan Gen pengkode enzim sitokrom P450 famili nomor 2,
subfamili a nomor 6 yang terletak pada kromosom 19p13.2 dan diekspresikan di
hepar, dengan cara pengambilan arah melalui vena perifer, kemudian ekstraksi sesuai
protocol DNA kemudian diamplifikasi menggunakan PCR maka didapatkan ekspresi
dari gen Cyp2a6, dimana ekspresi ini akan muncul pada seseorang yang merokok
karena efek metabolisme nikotin.
Manfaat dari penelitian ini adalah diketahuinya peran faktor genetik, dalam
hal ini gen CYP2A6, pada ketergantungan fisik perokok terhadap nikotin maka pada
gilirannya pengetahuan ini dapat digunakan sebagai dasar dikembangkannya tata cara
penatalaksanaan baru kepada para perokok. Tata cara yang dimaksud yaitu baik dari
segi penggunaan agen-agen farmakologis baru ataupun dengan penggunaan uji
diagnostik baru demi menunjang efektivitas terapi untuk individu dengan
ketergantungan fisik terhadap nikotin. Jika efektifitas terapi untuk membantu para
perokok berhenti merokok dapat ditingkatan, maka diharapkan terjadi peningkatan
angka harapan hidup, yang kemudian akan diikuti dengan peningkatan kualitas hidup.
Dalam penelitian ini anda akan menjalani pemeriksaan darah yang diambil
dari pembuluh darah di lengan anda . Sampel darah yang saya dapatkan akan
39
diperiksa di laboratorium Biologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah
Jakarta .
Saya akan mencatat identitas anda (nama, jenis kelamin, usia, suku, alamat,
nomor telepon yang bisa dihubungi) pada lembar penelitian.
Partisipasi anda dalam penelitian ini bersifat sukarela.
Pada penelitian ini identitas anda dirahasiakan . Hanya peneliti, anggota
peneliti dan anggota komisi etik yang bisa melihat data anda. Kerahasiaan data akan
dijamin sepenuhnya. Bila data anda dipublikasi kerahasiaan identitas anda tetap
dijaga.
Terimakasih
Wassalamualaikum wr wb
40
Lampiran 3
Lembar Persetujuan Setelah Penjelasan
Saya yang bertanda tangan di bawah ini :
Nama :
Umur :
Jenis Kelamin :
Alamat :
Nomor Telp. :
Setelah mendapatkan keterangan dan penjelasan secara lengkap, maka dengan penuhkesadaran dan tanpa paksaan saya menandatangani dan menyatakan bersediaberpartisipasi dalam penelitian ini
Ciputat,
Peneliti Peserta Penelitian
Muflikha Mayazi ( )
Saksi
( )
41
Lampiran 4
Data Sekunder
Nama :
Usia :
Apakah Anda seorang perokok aktif ? A. ya B. tidak
*Jika ya, berapa batang rokok yang Anda habiskan dalam 1 hari?
Sudah berapa lama Anda merokok?
*Jika tidak, apakah setidaknya Anda pernah mencoba merokok? A. ya B. tidak
Jika ya, kapan Anda mencoba merokok?
Berapa batang rokok yang Anda coba?
42
Lampiran 5
Kuesioner FTND
(Fagerstrröm Test for Nicotine Dependence)
(Heatherton et al., 1991)
1. Berapa lama jarak waktu antara Anda bangun pagi dan rokok pertama yanganda hisap?
a) Setelah 60 menit atau satu jam (0)
b) 31-60 menit (1)
c) 6-30 menit (2)
d) Dalam waktu 5 menit (3)
2. Apakah Anda merasa kesulitan untuk tidak merokok di tempat-tempattertentu bebas rokok?
a) Tidak (0)
b) Ya (1)
3. Aktivitas merokok saat apa yang paling susah Anda hilangkan?
a) Rokok pertama di pagi hari (1)
b) Selain pagi hari (0)
4. Berapa batang rokok per hari yang Anda hisap?
a) 10 batang atau kurang (1)
b) 21-30 batang (2)
c) 31 batang atau lebih (3)
43
5. Apakah Anda lebih sering merokok di saat-saat setelah bangun tidurdibandingkan saat lain?
a) Tidak (0)
b) Ya (1)
6. Apakah Anda tetap merokok meskipun sakit dan harus beristirahatsepanjang hari?
a) Tidak (0)
b) Ya (1)
Interpretasi:
0-2 : Ketergantungan fisik sangat rendah
6-7 : Ketergantungan fisik tinggi
3-4 : Ketergantungan fisik rendah
8-10 : Ketergantungan fisik sangat tinggi
5 : Ketergantungan fisik sedang
44
Lampiran 6
Gambar Penelitian
Isolasi DNA
(Gambar 6.1 Persiapan alat) (Gambar 6.2 Sampel darah )
(Gambar 6.3 Penambahan CLS) (Gambar 6.4 Sentrifuge 1500rpm)
45
(Gambar 6.5 Nuclei Lysis Solution) (Gambar 6.6 Inkubasi 37 0 C )
(Gambar 6.7 Protein Precipitation) (Gambar 6.8 Sentrifuge 3600rpm)
(Gambar 6.9 Isopropanol dingin ) ( Gambar 6.10 Sentrifuge 13000rpm)
46
(Gambar 6.11 pencucian dengan etanol) (Gambar 6.12 Pergeringan)
(Gambar 6.13 DNA Rehydration)
47
Lampiran 7
Gambar Penelitian
PCR
(Gambar 6.14 Persiapan alat PCR) ( Gambar 6.15 Master mix Kappa )
(Gambar 6.17 Primer F) (Gambar 6.18 Primer R)
(Gambar 6.19 ddH2O) (Gambar 6.20 DNA template)
48
( Gambar 6.21 up and down ) ( gambar 6.22 PCR)
49
Lampiran 8
Gambar Penelitian
Elektroforesis
(Gambar 6.23 Menimbang Agarose) ( Gambar 6.24 Menuang TAE 100 ml)
(Gambar 6.25 Pencampuran larutan) (Gambar 6.26 Penuangan ke tray)
50
(Gambar 6.27 Ethidium Bromide) ( Gambar 6.28 meletakkan sisir)
(Gambar 6.29 Menaruh Chamber) (Gambar 6.30 Menuang DNA template)
( Gambar 6.31 Elektroforesis ) (Gambar 6.32 Pengamatan pada Jeal Dock )
51
Lampiran 9
a. Perhitungan rata-rata usia perokok
Rata-rata =
=
= 32,4 tahun
b. Perhitungan rata-rata jumlah rokok yang dihisap setiap hari
Rata-rata =
=
= 12,6 batang
c. Perhitugan rata-rata lama kebiasaan merokok
Rata-rata =
=
= 14,4 tahun
52
Lampiran 10
RIWAYAT HIDUP
Nama : Muflikha Mayazi
Tempat, Tanggal Lahir : Surakarta, 27 Jauari 1993
Jenis Kelamin : Perempuan
Agama : Islam
Alamat : Jalan Raya Paku Sadeng.02/04. Bogor.
No.Hp : 085711640505
Email : [email protected]
Riwayat Pendidikan:
1997-1999 : TK Aisyah No. 20 Pajang. Surakarta
1999-2003 : SDN Bratan III Surakarta
2003-2005 : SDN Sadeng II Bogor
2005-2008 : SMPN I Leuwiliang Bogor
2008-2011 :SMAN I Leuwiliang Bogor
2011- sekarang :Program Studi Pendidikan Dokter UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta