Upload
dinda-noverinta
View
143
Download
6
Embed Size (px)
Citation preview
IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN CALPASTATIN DOMBA LOKAL (Ovis aries) DENGAN METODE PCR-RFLP DAN
HUBUNGANNYA DENGAN BOBOT BADAN
SKRIPSI
ROHMAT DIYONO
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI PRODUKSI TERNAK FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2007
IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN CALPASTATIN DOMBA LOKAL (Ovis aries) DENGAN METODE PCR-RFLP DAN
HUBUNGANNYA DENGAN BOBOT BADAN
ROHMAT DIYONO
D14103024
Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Peternakan pada
Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI PRODUKSI TERNAK FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2007
IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN CALPASTATIN DOMBA LOKAL (Ovis aries) DENGAN METODE PCR-RFLP DAN
HUBUNGANNYA DENGAN BOBOT BADAN
Oleh
ROHMAT DIYONO
D14103013
Skripsi ini telah disetujui dan disidangkan di hadapan Komisi Ujian Lisan pada tanggal 16 Mei 2007
Pembimbing Utama Pembimbing Anggota Dr. Ir. Cece Sumantri, MAgr.Sc. Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si
NIP. 131 624 187 NIP. 131 878 947
Dekan Fakultas Peternakan
Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Ronny R. Noor, MRur.Sc. NIP. 131 624 188
RINGKASAN
ROHMAT DIYONO. 2007. Identifikasi Keragaman Gen Calpastatin Domba Lokal (Ovis aries) Dengan Metode PCR RFLP dan Hubungannya dengan Bobot Badan. Skripsi. Program Studi Teknologi Produksi Ternak. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor. Pembimbing Utama : Dr. Ir. Cece Sumantri, M.Agr.Sc Pembimbing Anggota : Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si Domba lokal di Indonesia mempunyai produktivitas yang rendah, terutama sifat pertumbuhan dan kualitas daging. Peningkatan produktivitas domba tersebut dapat dilakukan melalui upaya seleksi berdasarkan pada penciri DNA yang disebut dengan Marker Assisted Selection (MAS). Calpastatin merupakan gen yang berfungsi untuk menghambat proses degradasi protein sel otot. Gen calpastatin diduga terkait dengan sifat pertumbuhan otot dan keempukan daging pada mamalia. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman gen calpastatin pada domba lokal (Ovis aries) dan menganalisis hubungan antara genotipe gen calpastatin dengan bobot badan. Sampel darah domba yang digunakan berjumlah 288 sampel yang terdiri dari Domba Ekor Tipis (DET) Jonggol (36), domba Garut Ciomas (29), domba Garut Margawati (29), Domba Ekor Gemuk (DEG) Indramayu (43), DEG Madura (43), 46 DEG Donggala (46), DEG Sumbawa (26), dan DEG Rote (36). Amplifikasi gen calpastatin dilakukan dengan Teknik PCR, sedangkan untuk menentukan genotipenya dilakukan dengan teknik Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP) dengan enzim restriksi MspI. Analisis hubungan antara genotipe gen calpastatin dengan bobot badan domba dilakukan dengan metode General Linear Model SAS 6.12. Gen calpastatin yang bisa terpotong sempurna menjadi 336 dan 286 pb disebut dengan genotipe MM dan yang tidak terpotong disebut dengan genotipe NN, sedangkan yang tidak terpotong sempurna disebut genotipe MN. Gen calpastatin domba lokal bersifat polimorfik pada semua populasi domba lokal, kecuali domba Rote. Tipe gen calpastatin pada domba Rote semuanya adalah NN atau monomorfik. Frekuensi alel M tertinggi ditemukan pada populasi domba Garut Ciomas (29%) dan terendah pada populasi Domba Ekor Gemuk di Sumbawa dan Madura masing-masing 4%. Frekuensi alel M untuk domba Margawati, Jonggol, Indramayu, dan Donggala secara berturut-turut yaitu 24, 16, 13 dan 12%. Keragaman genetik yang ditunjukkan dengan nilai heterosigositas, juga bervariasi antara subpopulasi dan berkisar antara 8% pada populasi domba Sumbawa dan Madura, sampai 43% pada populasi domba Garut Ciomas. Nilai heterosigositas domba Margawati, Jonggol, Indramayu, dan Donggala secara berturut-turut yaitu 37, 28, 23 dan 21%. Genotipe gen calpastatin berhubungan dengan bobot badan domba jantan (P=0,017) tetapi tidak berhubungan dengan bobot badan domba betina (P=0,847). Rataan bobot badan domba jantan dengan genotipe MN lebih tinggi dibandingkan dengan genotipe NN. Kata-kata kunci ; domba lokal, calpastatin, keragaman genetik, RFLP, bobot badan
ABSTRACT
Detection of Ovine Calpastatin Gene Polymorphisms within Indonesian Local Sheep Population Using PCR-RFLP and Its Effect on Body Weight
Diyono, R., C. Sumantri, and A. Farajallah
Genetic improvement of Indonesian Local Sheep can be gained through selection for traits having economic interest, i.e., meat and growth traits. Calpastatin (CAST) play an essential role in inhibiting muscle protein degradation and responsible for muscle hypertrophy. DNA polymorphisms within the calpastatin gene may lead to the phenotypic differences of sheep growth traits. A 622 bp of Indonesian local sheep calpastatin gene successfully amplified using Polymerase Chain Reaction (PCR) technique. An MspI restriction enzyme cut the PCR product into two different length fragments that are 336 bp and 286 bp and revealed two alleles system, M and N and two genotypes MN and NN. All of Indonesian local sheep population are polymorphic in calpastatin gene, except, Rote Fat Tailed Sheep Population. The highest M allele frequency was found in Garut Ciomas Thin Tailed Sheep population (29%) and the lowest one was found in Sumbawa and Madura Fat Tailed Sheep Population (4%). The allele M frequencies of Margawati, Jonggol, Indramayu, and Donggala Sheep population are 24, 16, 13 and 12%, respectively. The observed heterosigosity was different among population. The highest heterosigosity was found in the Ciomas Sheep (43%) and the lowest one was found in Sumbawa and Madura Sheep population (8%). The observed heterosigosities of Margawati, Jonggol, Indramayu, and Donggala were 37, 28, 23 and 21%, respectively. This research showed that there is an association beetwen calpastatin genotipe and body weight of male sheep (P=0,017) but not for female sheep (P=0,847). Male sheeps with MN genotype have higher body weight compared to NN genotipe. Keywords : sheep, calpastatin , genetic polymorphims, RFLP, body weight
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan pada tanggal 11 Juli 1985 di Temanggung Jawa Tengah.
Penulis adalah anak keempat dari empat bersaudara dari pasangan Bapak Brahim dan
Ibu Wagini (Almh).
Pendidikan dasar diselesaikan pada tahun 1997 di SDN Prangkokan,
pendidikan lanjutan menengah pertama diselesaikan pada tahun 2000 di SLTP
Negeri 2 Candiroto, dan pendidikan lanjutan menengah atas diselesaikan pada tahun
2003 di SMU Negeri 1 Parakan, Temanggung. Penulis diterima sebagai mahasiswa
IPB pada Program Studi Teknologi Produksi Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan
Teknologi Peternakan, Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi
Masuk IPB (USMI) pada tahun 2003.
Selama mengikuti pendidikan, penulis aktif di Badan Eksekutif Mahasiswa
(BEM) Fakultas Peternakan IPB periode 2004-2005. Selain aktif dalam
keorganisasian intra kampus, penulis juga aktif di organisasi mahasiswa daerah yaitu
Paguyuban Mahasiswa Temanggung Makukuhan (PMTM) dan terpilih sebagai ketua
umum periode 2004-2005. Dalam bidang akademik, penulis pernah menjadi asisten
dosen mata kuliah Matematika I dan Kalkulus I pada program Tingkat Persiapan
Bersama (TPB) tahun ajaran 2004/2005.
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis senantiasa panjatkan kepada Alloh Swt., karena atas
segala rahmat dan karunia-Nya, penulisan skripsi ini dapat terselesaikan. Skripsi ini
berjudul Identifikasi Keragaman Gen Calpastatin Domba Lokal (Ovis aries) dengan
Metode PCR-RFLP.
Domba lokal di Indonesia masih mempunyai produktivitas yang rendah
khususnya sifat pertumbuhan dan kualitas daging. Beberapa upaya telah dilakukan
untuk meningkatkan produktivitas domba diantaranya perbaikan pakan dan
manajemen pemeliharaan, seleksi, persilangan, dan kombinasi antara seleksi dan
persilangan. Akhir-akhir ini, seleksi dapat dilakukan dengan menggunakan penciri
DNA, yaitu dengan memanfaatkan hubungan antara keragaman DNA dengan sifat
kuantitatif. Selanjutnya seleksi hanya dilakukan terhadap ternak-ternak yang
mempunyai tipe DNA (alel) tertentu yang terkait dengan sifat produksi unggul.
Salah satu tujuan penulisan skripsi ini untuk memberikan informasi tentang
keragaman gen calpastatin pada domba lokal, yaitu gen yang terkait dengan sifat
pertumbuhan dan kualitas daging. Informasi keragaman gen calpastatin tersebut,
selanjutnya diharapkan menjadi dasar seleksi berdasarkan penciri DNA (marker
assisted selection) untuk meningkatkan sifat pertumbuhan dan kualitas daging domba
lokal. Penulis berharap semoga skripsi ini dapat memberikan sumbangan terhadap
pembangunan peternakan di Indonesia. Amiin.
Bogor, Mei 2007
Penulis
DAFTAR ISI
Halaman RINGKASAN…………………………………………………………... i
ABSTRACT…………………………………………………………….. ii
LEMBAR PERNYATAAN…………………………………………….. iii
LEMBAR PENGESAHAN…………………………………………….. iv
RIWAYAT HIDUP………………………………...…………………… v
KATA PENGANTAR………………………………………………….. vi
DAFTAR ISI…………………………………………………………..... vii
DAFTAR TABEL……………………………………………………..... ix
DAFTAR GAMBAR…………………………………………………… x
DAFTAR LAMPIRAN………………………………………………..... xi
PENDAHULUAN……………………………………………………… 1
Latar Belakang………………………………………………….. 1 Tujuan…………………………………………………………... 1
TINJAUAN PUSTAKA………………………………………………... 2
Domba Lokal di Indonesia……………………………………… 2 Domba Ekor Tipis Jawa………………………………… 2 Domba Priangan (Domba Garut)……………………….. 3 Domba Ekor Gemuk…………………………………… 3
Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR RFLP)............................................. 4 Keragaman Gen Calpastatin ....................................................... 4 Hubungan Antara Sistem Calpain-Calpastatin dengan Sifat Pertumbuhan …………………………………………………… 5
METODE ……………...……………………………….......................... 7
Lokasi dan Waktu………………………………………………. 7 Materi…………………………………………………………… 7
Sampel Darah…………………………………………… 7 Primer……………………………………....................... 7
Prosedur …………………...…………………………………… 7 Ekstraksi DNA dari Sampel Darah dalam Etanol 95%... 7
Amplifikasi Gen Calpastatin (CAST)dengan Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) ..................................
8
Identifikasi Genotipe Gen Calpastatin dengan Metode Restriction Fragment Lenght Polymorphisms (RFLP).....
8
Elektroforesis dan Pewarnaan Perak ............................... 8 Pendeteksian Keragaman Gen calpastatin........................ 9
Analisis Data................................................................................. 9
HASIL DAN PEMBAHASAN………………………………………..... 11
Amplifikasi Gen Calpastatin........................................................ 11 Pendeteksian Keragaman Gen Calpastatin dengan RFLP ........... 12 Keragaman Genetik Gen Calpastatin Domba Lokal ................... 14
Keragaman Genetik Domba Ekor Tipis (DET)................ 15 Keragaman Genetik Domba Ekor Gemuk (DEG)............ 16 Hubungan antara Genotipe Gen Calpastatin dengan Bobot Badan Domba .................................................................... 16
KESIMPULAN DAN SARAN………………………………………..... 19
Kesimpulan……………………………………………………... 19 Saran…………………………………………………………...... 19
UCAPAN TERIMAKASIH…………………………………………...... 20
DAFTAR PUSTAKA…………………………………………………... 21
LAMPIRAN…………………………………………………………...... 24
DAFTAR TABEL
Nomor Halaman
1. Nilai Frekuensi Genotipe, Frekuensi Alel, Standar Eror Frekuensi Alel (SE), dan Nilai Heterosigositas (ĥ) Lokus CAST-MspI Domba Lokal Indonesia........................................................ 14
2. Rataan Bobot Badan Domba ( X ) dan Simpangan Baku Rataan (SE) antara Genotipe MN dan NN.......................................... 17
DAFTAR GAMBAR
Nomor Halaman
1 Estimasi Struktur Gen Calpastatin Domba.................................. 11
2 Sekuen Nukleotida Gen Calpastatin Lokus CAST-MspI ............. 11
3 Perbedaan Sekuen Nukleotida Gen Calpastatin pada Lokus CAST-MspI......................................................................... 12
4 Pola Pita Gen Calpastatin Domba dalam Gel Poliakrilamid 6%..................................................................................... 13
DAFTAR LAMPIRAN
Nomor Halaman
1 Analisis Ragam Respon Genotipe Gen Calpastatin terhadap Bobot Badan Domba Jantan dan Hasil Uji Lanjutan (Uji Duncan)…………………………………………………………. 24
2 Analisis Ragam Respon Genotipe Gen Calpastatin terhadap Bobot Badan Domba Betina…………………………………….. 24
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Populasi domba lokal di Indonesia tergolong masih rendah, yaitu sekitar
8.307.000 ekor, sedangkan produksi daging domba hanya 66.500 ton (3,15%) dari
total produksi daging dalam negeri (DJBPP, 2005). Domba-domba lokal Indonesia
diberi nama sesuai dengan daerah dan karakteristiknya, seperti domba Donggala,
domba Garut, domba Kisar, Domba Ekor Gemuk, Domba Ekor Tipis Jawa dan
Domba Ekor Tipis Sumatera. Domba lokal mempunyai beberapa keunggulan, antara
lain mampu beradaptasi dengan baik pada lingkungan tropis, tidak mengenal musim
kawin, bersifat prolifik, dan kebal terhadap beberapa macam penyakit dan parasit.
Namun demikian, domba lokal mempunyai produktifitas yang rendah. Peningkatan
produktifitas domba lokal dapat dilakukan dengan cara seleksi. Seleksi pada domba
lokal dilakukan terhadap sifat-sifat yang mempunyai nilai ekonomis tertentu. Salah
satu sifat yang mempunyai nilai ekonomis tinggi adalah sifat pertumbuhan.
Kemajuan dalam bidang biologi molekuler memungkinkan upaya seleksi
dapat dilakukan pada tingkat DNA, yaitu dengan cara mencari keragaman gen yang
mengontrol sifat ekonomis. Pemetaan lokus terkait dengan sifat kuantitatif (QTL)
dan pencarian tipe DNA (alel) yang terkait dengan sifat unggul merupakan dasar
penerapan program MAS (Marker Assisted Selection). Metode seleksi ini dapat
digunakan untuk mendeteksi sifat unggul dari seekor ternak dalam waktu yang relatif
lebih cepat. Calpastatin merupakan sebuah gen yang berfungsi untuk menghambat
degradasi protein sel-sel otot. Peningkatan aktivitas calpastatin menyebabkan
terjadinya pertambahan massa otot (hyperthropy) dan penurunan keempukan daging.
Keragaman gen calpastatin diduga terkait dengan sifat pertumbuhan domba lokal.
Identifikasi keragaman gen calpastatin dapat dilakukan dengan metode Polymerase
Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP).
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman gen calpastatin
domba lokal (Ovis aries) lokus CAST-MspI dan menganalisis hubungan antara
genotipe gen calpastatin dan bobot badan domba.
TINJAUAN PUSTAKA
Domba Lokal di Indonesia
Domba merupakan hewan ruminansia yang berkuku belah dan termasuk
dalam subfamili Caprinae dari famili Bovidae. Semua domba termasuk dalam genus
Ovis dan yang terdomestifikasi adalah Ovis aries (Blakely dan Bade, 1991). Domba-
domba terdomestifikasi yang ada sekarang memiliki komposisi genetik dari domba
Argali (Ovis ammon) yang berkembang di Asia Tengah, domba Urial (Ovis vignei) di
Asia, domba Moufflon (Ovis musimon) di Asia Kecil dan Eropa (Devendra dan
McLeroy, 1982).
Menurut Diwyanto (1982), domba lokal Indonesia dapat digolongkan
menjadi tiga kelompok, yaitu Domba Ekor Tipis (DET), Domba Ekor Sedang (DES)
dan Domba Ekor Gemuk (DEG). Domba Ekor Tipis mempunyai lebar pangkal ekor
kurang dari 4 cm, Domba Ekor Sedang 4 - 8 cm, dan Domba Ekor Gemuk lebih dari
8 cm. Domba Ekor Tipis banyak dijumpai pada daerah-daerah yang relatif basah
seperti di Jawa Barat, sedangkan Domba Ekor Gemuk terutama tersebar pada daerah-
daerah kering seperti di Jawa Timur dan Nusa Tenggara (Sutana, 1993 ; Doho,
1994).
Domba Ekor Tipis Jawa
Domba Ekor Tipis Jawa memiliki ekor tipis dan pendek. Sekitar 80 – 85%
jenis domba ini terdapat di daerah Jawa Tengah dan Jawa Barat dan sisanya
merupakan Domba Priangan. Jenis domba ini berukuran kecil. Bobot badan betina
dewasa bervariasi dari 25- 35 kg dengan tinggi badan rata-rata 57 cm. Bobot badan
domba jantan dewasa berkisar antara 40 – 60 kg dengan tinggi badan rata-rata 60
cm. Pada umumnya domba ini mempunyai bobot potong 19 kg (Devendra dan
McLeroy, 1982). Domba Ekor Tipis Jawa memiliki warna dominan putih dan
terdapat belang hitam di sekeliling mata, hidung, dan kadang-kadang diseluruh
tubuhnya. Bagian ekornya tidak menunjukkan adanya deposisi lemak. Domba jantan
memiliki tanduk yang melengkung, sedangkan domba betina biasanya tidak
bertanduk. Domba Ekor Tipis Jawa mempunyai telinga ukuran sedang dan wool
yang kasar (Mason, 1980).
Domba Priangan (Domba Garut)
Domba Priangan merupakan domba ekor tipis yang tersebar di daerah Jawa
Barat, terutama di daerah Garut sehingga disebut domba Garut (Gatenby, 1991).
Domba Priangan mulai dikembangkan pada tahun 1864 melalui persilangan tiga
bangsa domba, yaitu Domba Ekor Tipis Jawa, domba Merino dan domba Cape yang
diduga berasal dari Afrika Selatan. Domba Priangan mempunyai ukuran tubuh yang
lebih besar dibandingkan dengan Domba Ekor Tipis Jawa. Jenis domba ini
mempunyai bentuk muka yang cembung dan sering ditemukan domba dengan telinga
rumpung (tidak mempunyai daun telinga). Warna wool bermacam-macam yaitu
hitam, abu-abu, putih dan belang-belang hitam. Pada bagian pangkal ekornya
terdapat sedikit timbunan lemak. Domba betina tidak bertanduk, sedangkan domba
jantan memiliki tanduk yang melengkung. Bobot badan Domba Priangan betina
sebesar 35 – 40 kg, sedangkan bobot domba jantan mencapai 50 – 60 kg. Domba
Priangan termasuk domba yang prolifik, interval beranak yang pendek, dan jumlah
anak yang dihasilkan pertahun rata-rata sebesar 1,7. Domba Priangan banyak
digunakan untuk meningkatkan komposisi genetik (upgrading) domba lokal yang
terdapat pada daerah tersebut (Devendra dan McLeroy ,1982).
Domba Ekor Gemuk.
Domba Ekor Gemuk merupakan domba khas daerah Jawa Timur. Populasi
Domba pada awalnya banyak dijumpai di Pulau Madura kemudian menyebar ke
daerah Jawa Timur lainnya (Edey, 1983). Domba Ekor Gemuk dapat ditemukan di
pulau-pulau wilayah timur Indonesia, seperti Lombok, Sumbawa, Kisar dan Rote.
Domba jenis ini juga terdapat di bagian selatan Pulau Sulawesi, yaitu di daerah
Donggala. Domba Ekor Gemuk yang terdapat di Donggala kemudian disebut dengan
domba Donggala. Ciri-ciri kusus domba ekor gemuk adalah berbulu kasar, tidak
bertanduk, warna putih dan telinga sedang (Mason, 1980). Domba jantan kadang-
kadang bertanduk tetapi ukurannya kecil (Edey, 1983). Panjang ekor normal 15-18
tulang vertebrae, berbentuk huruf S dan menyimpan lemak dalam jumlah besar.
Bobot badan domba ekor gemuk jantan unggul dapat mencapai 43 kg, betina 40 kg
dan rataan bobot potong 24 kg. Domba betina sangat prolifik dengan selang beranak
hanya 8 – 9 bulan, umur pertama kali beranak antara 11-17 bulan, dan dapat
menghasilkan 2,34 anak sapihan pertahun (Devendra dan McLeroy, 1982).
Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment
Length Polymorphism (PCR – RFLP)
Metode Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu metode yang
dapat digunakan untuk memperbanyak segmen DNA secara in vitro (Ausubel, 1995).
Segmen DNA tersebut kemudian dapat diketahui runutan nukleotidanya, salah
satunya yaitu dengan menggunakan enzim restriksi. Enzim restriksi dapat memotong
DNA secara spesifik dan terbatas pada situs yang dikenalinya (Lewin, 1994).
Perbedaan pola pemotongan DNA dari jenis gen yang sama antar beberapa ternak
disebut Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). Pada prinsipnya, RFLP
merupakan semua mutasi yang menghilangkan atau menciptakan sekuen rekognisi
baru bagi enzim restriksi. Penyisipan (insersi), penghilangan (delesi), maupun
subtitusi nukleotida yang terjadi pada daerah rekognisi suatu enzim restriksi
menyebabkan tidak lagi dikenalinya situs pemotongan enzim restriksi dan terjadinya
perbedaan pola pemotongan DNA (Lewin, 1994). Metode RFLP telah diterapkan
untuk mendeteksi Quantitative Traits Loci (QTL) pada ternak. Pendeteksian RFLP
telah dikembangkan dan digunakan untuk studi linkage pada ternak seperti sapi,
ayam dan babi. Pendeteksian RFLP dilakukan pada sekuen DNA yang telah
diketahui fungsinya, misalnya gen (penyandi protein), dan juga pada sekuen DNA
yang belum jelas fungsinya (Montgomery dan Kinghorn, 1997).
Keragaman Gen Calpastatin
Gen calpastatin terletak pada kromosom domba nomer 5 (Hediger et al.,
1991) sedangkan pada ternak sapi (Bos taurus) terletak pada kromosom nomer 7
(Bishop et al., 1993; Kappes et al., 1997). Gen calpastatin dengan simbol CAST
terletak diantara dua penciri apit mikrosatelit MCM527 dan BMS1247 pada posisi
lokus 5q15 – q21 antara 96,057-96,136 Mb. Hasil analisis Quantitative Traits Loci
(QTL) menunjukkan bahwa gen calpastatin berasosiasi kuat dengan sifat
pertumbuhan pada domba silang balik antara DET dengan domba Merino
(Margawati, 2005).
Palmer et al. (1998) melaporkan bahwa terdapat keragaman gen calpastatin
domba Dorset pada bagian ekson 1C, intron 1 dan ekson 1D (no.akses GenBank
AF016006 dan AF016007). Hasil pemotongan produk PCR dengan enzim restriksi
MspI dan NcoI menghasilkan dua alel, yaitu alel M dan N. Enzim restriksi MspI
menghasilkan produk 336 dan 286 bp sedangkan NcoI menghasilkan potongan
produk 374 dan 248 bp. Beberapa penelitian serupa juga telah dilakukan pada ternak
sapi. Lonergan et al. (1995) menemukan keragaman DNA gen bovine calpastatin
pada lokus BamHI dan EcoRI. Chung et al. (1999) menemukan keragaman gen
calpastatin dengan metode PCR-SSCP. Primer yang didesain dari domain I cDNA
bovine calpastatin (nomor akses GenBank : L14450), berhasil mengamplifikasi lokus
CAST1 sepanjang 500 pb dan menghasilkan dua alel, yaitu alel A dan B. Keragaman
gen calpastatin tersebut terkait erat dengan sifat pertumbuhan sapi Angus jantan.
Sapi Angus dengan genotipe BB mempunyai bobot badan lebih tinggi dari pada sapi
dengan genotipe AB dan AA.
Hubungan Antara Sistem Calpain-Calpastatin dengan Sifat Pertumbuhan
Pertumbuhan adalah peningkatan ukuran tubuh dan perubahan komposisi
tubuh seiring dengan semakin bertambahnya umur anak domba. Sifat pertumbuhan
pada anak domba dipengaruhi oleh banyak faktor. Beberapa diantaranya yang adalah
tingkat pemberian pakan, genotip, jenis kelamin, kesehatan dan manajemen
pemeliharaan (Gatenby, 1991). Pada tingkat sel pertumbuhan hewan ternak dapat
didefinisikan sebagai hyperplasia yaitu pertambahan jumlah sel melalui proses
mitosis, dan hypertropi yaitu bertambahnya ukuran atau volume sel-sel otot
(Hossner, 2005). Menurut Chung et al. (1999), kejadian hypertropi ini erat kaitanya
dengan sistem calpain-calpastatin yang terdapat dalam jaringan tubuh.
Calpain merupakan sebuah enzim proteolytic terkait dengan ion kalsium
(Ca2+), yang ada dalam dua bentuk, yaitu μ-calpain dan m-calpain. μ-calpain
merupakan calpain yang memerlukan ion Ca2+ dalam konsentrasi rendah, sedangkan
m-calpain merupakan calpain yang memerlukan ion Ca2+ dalam konsentrasi tinggi.
Calpain berfungsi untuk mendegradasi protein sel-sel otot (myofibril) di dalam
jaringan otot (Goll et al., 1992). Selanjutnya dinyatakan oleh Killefer dan
Koohmaraie (1993) bahwa aktivitas calpain dalam jaringan otot postmortem dapat
menyebabkan struktur protein sel otot menjadi lemah. Hal ini berakibat pada kualitas
daging yang menjadi lebih empuk. Selain μ-calpain dan m-calpain, dalam sistem
calpain juga terdapat calpastatin. Calpastatin ini merupakan inhibitor spesifik
terhadap fungsi μ-calpain dan m-calpain. Morgan et al. (1993) melaporkan bahwa
ketika aktivitas degradasi protein pada jaringan otot hewan hidup menurun, maka
aktivitas calpastatin meningkat.
Aktivitas calpastatin yang tinggi dapat ditemukan pada domba yang
mempunyai fenotipe callipyge. Kejadian hipertropi ini disebabkan oleh kandungan
DNA otot yang tinggi sehingga dapat meningkatkan kapasitas sintesis protein otot.
Kejadian hipertropi terjadi setelah hewan dilahirkan sehingga tidak menyebabkan
kesulitan beranak (dystocia). Selain itu hipertropi pada domba callipyge juga
disebabkan oleh menurunnya degradasi protein otot sebagai akibat dari
meningkatnya aktivitas calpastatin (Koohmaraie et al., 1995).
METODE
Lokasi dan Waktu
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Zoologi, Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Penelitian ini dilakukan selama 6 bulan, yaitu dari bulan Juli - Desember 2006.
Materi
Sampel Darah
Sampel darah yang digunakan adalah sampel darah dalam Etanol 95%
koleksi Dr.Ir.Cece Sumantri, MAgr.Sc., Departemen IPTP Fakultas Peternakan IPB.
Sampel darah domba yang digunakan berjumlah 288 yang berasal dari Ciomas (29),
Jonggol (36), Indramayu (43), UPTD BPPTD Margawati (29) , Madura (43),
Donggala (46), Sumbawa (26) dan Rote (36). Domba Ciomas merupakan domba
Garut tipe tangkas, sedangkan domba Margawati merupakan domba tipe pedaging.
Domba Garut dan Jonggol merupakan Domba Ekor Tipis (DET). Domba Indramayu
(domba asal Jawa Timur), Madura, Donggala, Rote dan Sumbawa merupakan bangsa
Domba Ekor Gemuk (DEG). Domba yang diambil sampel darahnya mempunyai
catatan bobot badan (kg) dan ada tiga kelompok umur yang berbeda, yaitu umur
kurang dari 1 tahun, 1-2 tahun dan 3-4 tahun.
Primer
Primer adalah molekul pendek utas tunggal DNA yang akan menempel pada
DNA cetakan pada tempat yang spesifik. Sekuen primer yang digunakan dalam
penelitian ini berdasarkan pada Palmer et al. (1998), yaitu primer foward (AF33) 5’
TGGGGCCCAATGACGCCATCGATG 3’ (ekson 1C) dan primer reverse (AF34)
5’ GGTGGAGCAGCACTTCTGATCACC 3’ (ekson 1D).
Prosedur
Ekstraksi DNA dari Sampel Darah dalam Etanol 95%
Sampel darah total yang disimpan dalam etanol 95% disentrifugasi 3500 rpm
selama 5 menit. Endapan sel-sel darah yang diperoleh dicuci dengan bufer TE
sebanyak dua kali. Sekitar 100 µl sel-sel darah yang telah bebas dari etanol
disuspensikan dengan 1 x STE sampai volume mencapai 350 µl. Sel-sel darah
kemudian dilisis dengan 20 µl proteinase K (10 mg/ml) dan 40 µl 10% SDS.
Campuran ini dikocok pelan-pelan selama 2 jam pada suhu 55 °C.
Pemurnian DNA dilakukan degan metode fenol-kloroform, yaitu dengan
menambahkan 1/10 volume 5 M NaCl, 1 x volume larutan fenol dan 1 x volume
kloroform : iso amil alkohol (24:1), kemudian dikocok pelan pada suhu ruang selama
2 jam. Fase DNA dipisahkan dari fase fenol dengan sentrifugasi pada kecepatan 7000
rpm selama 5 menit. Molekul DNA diendapkan dengan menambahkan 1/10 x
volume 5 M NaCl dan 2 x volume etanol absolut. Endapan DNA yang dihasilkan
dicuci dengan 70% etanol kemudian diendapkan lagi pada kecepatan 7000 rpm
selama lima menit. Sisa etanol dibuang dan diuapkan dengan menggunakan pompa
vakum. DNA kemudian dilarutkan dengan 80 µl 80% bufer TE.
Amplifikasi Gen Calpastatin (CAST)dengan Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) Volume pereaksi amplifikasi DNA adalah 25 µl yang terdiri dari 10-100 ng
DNA, pasangan primer masing-masing 25 pmol, 0.87 unit enzim Taq polymerase
dan buffernya (New England BioLabs), 2 mM dNTP, dan 2,5 mM MgCl2. Inkubasi
dilakukan pada mesin thermocycler (TaKaRa PCR Thermal Cycler MP4). Kondisi
PCR yang digunakan terdiri dari denaturasi awal pada suhu 94 oC selama 4 menit, 30
siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 94 oC selama 10 detik, penempelan
primer pada suhu 48 oC selama 1 menit, dan tahap pemanjangan pada suhu 72 oC
selama 2 menit. Pemanjangan akhir molekul DNA dilakukan pada suhu 72 oC selama
7 menit.
Identifikasi Genotipe Gen Calpastatin dengan Metode Restriction Fragment Lenght Polymorphisms (RFLP)
Produk PCR kemudian dipotong dengan enzim restriksi MspI (New England
BioLabs) yang mengenali situs C|CGG. Kondisi pemotongan mengikuti petunjuk
produsen, yaitu 2 µl produk PCR dicampur dengan 1-2 Unit MspI dalam 1 x bufer
(New England BioLabs), dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama semalam.
Elektroforesis dan Pewarnaan Perak
Visualisasi fragmen DNA produk PCR yang telah dipotong dilakukan dengan
teknik elektroforesis gel poliakrlamida 6 % yang diikuti dengan pewarnaan perak
(Tegelstrom, 1992). Gel dibuat dengan cara mencampurkan 12 ml air destilata; 4 ml
5 x TBE ; 4 ml akrilamida 30 % ; 15 µl TEMED, dan 160 µl APS 10 %. Sebanyak
2 µl produk inkubasi dicampur dengan Loading dye + 6µl (Bromthymol blue 0,01%,
Xylene Cyanol 0,01% dan gliserol 50%). Elektroforesis dilakukan pada tegangan
konstan 220 mVolt selama 30 menit atau setelah pewarna bromthymol blue
mencapai bagian bawah gel. Setelah elektroforesis selesai, gel diambil untuk
dilakukan pewarnaan perak.
Tapan pewarnaan perak yaitu gel dimasukkan ke dalam larutan CTAB 0,2
gram /200 ml air destilata selama delapan menit sambil digoyang. Kemudian dicuci
dengan air destilata selama 2 x 2 menit. Air tersebut di buang dan ditambahkan
larutan NH4OH (2,4 ml NH4OH/200 ml air destilata) selama 6 menit sambil
digoyang-goyang. Kemudian dilanjutkan dengan larutan perak nitrat (AgNO3)
selama 10 menit sambil digoyang-goyang. Kemudian gel dicuci kembali dengan air
destilata 2 x 2 menit. Untuk memunculkan pita, gel direndam dalam larutan yang
terdiri atas Na2CO3 dan formadehid 378%. Setelah pita muncul larutan asam asetat
dituangkan untuk menghentikan aktifitas oksidasi perak oleh formadehid.
Pendeteksian Keragaman Gen Calpastatin
Setiap pita DNA yang muncul dibandingkan ke marker untuk mengetahui
panjangnya. Setiap pita DNA dari setiap sampel diperbandingkan untuk menentukan
genotipe pita DNA. Satu posisi migrasi yang sama dianggap sebagai satu tipe atau
alel.
Analisis Data
Keragaman genotipe tiap-tiap individu dapat ditentukan dari pita-pita DNA
gen yang ditemukan. Masing-masing sampel dibandingkan berdasarkan ukuran
(marker) yang sama dan dihitung frekuansi alelnya. Frekuensi alel dihitung
berdasarkan rumus Nei (1987) :
Xi = (2nij + ∑nij)/(2n)
Keterangan :
Xi = frekuensi alel ke-i
nij = jumlah individu yang bergenotipe ii
nii = jumlah individu yang bergenotipe ij
n = jumlah sampel
Derajat heterozigositas (ĥ) dihitung berdasarkan frekuensi alel pada tiap lokus
DNA dengan rumus Nei (1987) :
ĥ = 2n (1 - ∑Xi2)/(2n – 1)
Keterangan :
Xi = frekuensi alel
ĥ = nilai heterozigositas lokus
Analisis hubungan antara genotipe gen calpastatin dengan bobot badan
dilakukan dengan metode General Linear Model (GLM) dengan program SAS 6.12,
dengan model sebagai berikut :
Yijkl = μ + Gi + Uj + Dk + G*Uij + G*Dik + Eijk Keterangan :
Y ijk = respon bobot badan
μ = nilai tengah umum
Gi = pengaruh genotipe ke-i
Uj = pengaruh umur ke-j
Dk = pengaruh kelompok daerah ke-k
G*Uij = pengaruh interaksi antara genotipe dan umur
G*Dik = pengaruh interaksi antara genotipe dan daerah asal
Eijk = pengaruh galat perlakuan pada pengamatan ke-ijk
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi Gen Calpastatin
Metode Polymerase Chain reaction (PCR) digunakan untuk mengamplifikasi
gen calpastatin lokus CAST-MspI pada domba lokal. Struktur gen calpastatin domba
lokal yang telah teramplifikasi dapat dilihat pada Gambar 1. Primer yang digunakan
berhasil mengamplifikasi ruas gen calpastatin sebesar 622 pb (Gambar 2). Suhu
penempelan primer dalam penelitian ini adalah 48°C. Kondisi ini berbeda dengan
suhu penempelan primer yang disarankan oleh Palmer et al. (1998) yaitu 62°C.
GenBank : OAU66320 GenBank : OAU66320
UTR Ex. 1C intron 1 Ex. 1D UTR
3’ 5’ 1 243 951 / 1 61 534 611/ 1089 2 416 2604 GenBank : AF016006
Gambar 1. Struktur gen calpastatin domba tctacctaca tagaggaact gggtaaaaga gaagtcacac ttcctccaaa atatagggaa cttttgaata aagaagaagg gatcgcaggg cctcctccag
actcctcgaa acccctgggg cccaatgacg ccatcgatgc cttgtcatca
AF 33
gacttcacct gcagttcccc tacagctgat gcaaagaaaa ctgagaaaga ggtattgttt ttaatgcact cagggaaact tgttagaaac tacctcccac tttaagacaa caactttttt ttaaacttta tttttgactt cgctgggtct tcattgctgt gttcgggctt tctctagttg gggcaagcga gggctattct ctagttgcga tgtgcagcct tctgcaggtg gcttctcttg ttgcagagcc ggggctctgg gtgcacaggc ttcagttgtt gtgacttgag agctctagag cacaggctca gtggtcgtgg ctcacaggct tactccacgg catgtgggat cttccctggc cagggagcga acccgtgtcc cctgcgttgc aaggcggcct cttaaccact ggccaccagg gaagccccaa gatgccaagg ctttttactt ctggttctta ccgtctggtt aatacatttc cttcatctgc cagtcaaacc ttcttttgta tttcattttt cagaaatcta cagaagaggc tttaaaagct cagtcagctg gggtgatcag aagtgctgct ccacccaaag agaaaagaag
aaaagtggaa gaggatacca tgactgagca agccctggag gccctgtctg cctccctggg cacccggaag ccaaggccag agctcgaccc cagctccatt
AF 34
Gambar 2. Sekuen nukleotida gen calpastatin lokus CAST-MspI, AF33 dan AF34 masing-masing merupakan primer foward dan primer reverse ( Sumber : www. ncbi.nlm.nih.gov)
Persentase keberhasilan primer dalam mengamplifikasi gen calpastatin lokus
CAST-MspI dalam penelitian ini hanya sekitar 70%. Sebanyak 201 sampel berhasil
teramplifikasi dari total 288 sampel. Menurut Palumbi (1996) keberhasilan dalam
mengamplifikasi DNA tergantung pada interaksi komponen campuran PCR. Al-Soud
dan Radstrom (2001) menyatakan bahwa keberhasilan amplifikasi juga dipengaruhi
oleh adanya haemoglobin yang dapat menghambat kerja enzim taq polymerase.
Dalam hal ini, diduga bahwa koleksi darah utuh dalam etanol yang sebelumnya tanpa
dilakukan pemisahan sel-sel darah memungkinkan kontaminasi haemoglobin dalam
sampel DNA (Prasetyo, 2005).
Pendeteksian Keragaman Gen Calpastatin dengan RFLP
Metode Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP) digunakan
untuk mengidentifikasi keragaman gen calpastatin domba lokal. Enzim restriksi
yang digunakan yaitu MspI yang mengenali situs pemotongan empat basa C│CGG,
yang terletak di daerah intron 1 antara ekson 1C dan 1D. Keragaman gen calpastatin
domba disebabkan oleh adanya mutasi titik yang terjadi pada posisi basa ke-261
nomor akses GenBank AF016006. Terjadinya subtitusi basa (transisi) G – A
(Gambar 3) menyebabkan situs pemotongan untuk enzim restriksi MspI berubah.
Produk PCR gen calpastatin sepanjang 622 pb berhasil dipotong dan menghasilkan
dua alel, yaitu alel M dan N.
Alel M (AF016006) : -------------TTGCAGAGCC│GGGGCTCTGG-------- Alel N (AF016007) : -------------TTGCAGAGCC│AGGGCTCTGG--------
Gambar 3. Perbedaan sekuen nukleotida gen calpastatin pada lokus CAST-MspI
yang disebabkan karena subtitusi basa G – A . Alel M mempunyai nukleotida G pada posisi basa ke-261, sedangkan alel N mempunyai nukleotida A (Nomor akses GenBank : AF016006 dan AF016007) Sumber : www. ncbi.nlm.nih.gov
Pada lokus CAST-MspI, ternak domba dikatakan mempunyai genotipe MM
apabila terdapat dua fragmen (pita) DNA dengan panjang 336 dan 286 pb. Genotipe
MN ditunjukkan dengan tiga fragment DNA yaitu 622, 336 dan 286 pb. Genotipe
NN ditunjukkan dengan terdapatnya satu fragmen DNA yaitu 622 pb (Gambar 4).
Ternak domba dengan genotipe homosigot (MM atau NN) berarti bahwa kedua tetua
masing-masing menyumbangkan gen (alel) yang sama. Domba dengan genotipe
heterosigot (MN) merupakan kombinasi gen yang berbeda dari kedua tetuanya.
Dalam penelitian ini, dari total sampel 201 domba yang berasal dari delapan daerah
tidak ditemukan ternak domba dengan genotipe MM.
Pada penelitian lain dilaporkan adanya keragaman gen calpastatin lokus yang
sama yang diidentifikasi dengan metode Polymerase Chain Reaction-Single Strand
Conformation Polymorphisms (PCR-SSCP) (Palmer et al., 1999b). Identifikasi
dengan metode PCR-SSCP pada gen calpastatin menghasilkan tiga jenis alel yaitu
alel A, B, dan C. Berdasarkan referensi nomor akses GenBank AF016006, alel M
pada penelitian ini sama dengan alel A. Nomor akses GenBank AF016007
menunjukkan bahwa alel N sama dengan B. Alel C yang ditunjukkan dengan nomor
akses GenBank AF016008 tidak dapat teridentifikasi dengan metode PCR-RFLP
pada penelitian ini.
336286
622
Gambar 4. Pola pita gen calpastatin domba dalam gel poliakrilamid 6%. MN dan NN = Genotipe. Genotipe MN ditunjukkan dengan adanya tiga pita dengan ukuran 622, 336, dan 286 pb. Genotipe NN ditunjukkan dengan satu pita 622 pb. Huruf A = marker.
Identifikasi keragaman gen calpastatin juga telah dilakukan dengan metode
PCR-SSCP. Palmer et al. (1999b) melaporkan adanya tiga jenis alel yaitu alel A, B
dan C dengan tiga genotipe yaitu AA, AB dan AC. Frekuensi alel A, B dan C
masing-masing 77, 16 dan 6% sedangkan frekuensi genotipe AA, AB dan AC
masing-masing 55, 32 dan 13%. Palmer et al. (1999a) melaporkan adanya tiga
genotipe pada Sapi Angus yaitu AA, AB dan BB untuk lokus CAST1 dan CAST5.
Sedangkan untuk lokus CAST10 terdapat genotipe AA, BB, CC, AB, AC dan BC.
Kurly et al. (2003) telah melaporkan adanya keragaman gen calpastatin pada ternak
babi Stambeek (dengan metode PCR-RFLP) dengan menggunakan enzim restriksi
HinfI, MspI dan RsaI.
Keragaman Genetik Gen Calpastatin Domba Lokal
Nei dan Kumar (2000) menyatakan bahwa keragaman genetik terjadi apabila
terdapat dua alel atau lebih dalam suatu populasi (biasanya lebih dari 1%). Menurut
Nei (1987), keragaman genetik dapat diukur secara akurat dengan Nilai
heterosigositas (ĥ). Heterosigositas disebut juga sebagai keragaman genetik. Nilai
Heterosigositas dipengaruhi oleh jumlah sampel, jumlah alel dan frekuensi alel.
Frekuensi genotipe, frekuensi alel dan nilai heterosigositas gen calpastatin domba
lokal dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Nilai Frekuensi Genotipe, Frekuensi Alel dan Nilai Heterosigositas (ĥ) Lokus CAST-MspI Domba Lokal Indonesia
Daerah
Jumlah sampel
(n)
Genotipe frekuensi genotipe
Frekuensi Alel
Heterosigositas (ĥ)
MM - MN 7 (0,58) Ciomas
(DET) 12 NN 5 (0,42)
M = 0,29 N = 0,71 0,43
MM - MN 7 (0,32) Jonggol
(DET) 22 NN 15 (0,68)
M = 0,16 N = 0,84 0,28
MM - MN 14 (0,48) Margawati
(DET) 29 NN 15 (0,52)
M = 0,24 N = 0,76 0,37
MM - MN 9 (0,25) Indramayu
(DEG) 36 NN 27 (0,75)
M = 0,13 N = 0, 87 0,23
MM - MN 10 (0,24) Donggala
(DEG) 41 NN 31 (0,76)
M = 0,12 N= 0,88 0,21
MM - MN 2 (0,07) Madura
(DEG) 28 NN 26 (0,93)
M = 0,04 N = 0,96 0,08
MM - MN 1 (0,08) Sumbawa
(DEG) 13 NN 12(0,92)
M = 0,04 N = 0,96 0,08
MM - MN - Rote
(DEG) 20 20 (1,00)
M = 0,00 N = 1,00 0,00
NN
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa gen calpastatin lokus CAST-MspI
bersifat polimorfik (beragam) yaitu pada populasi domba Ciomas, Jonggol,
Margawati, Indramayu, Madura, Donggala dan Sumbawa. Gen CAST-MspI pada
populasi domba Rote bersifat monomorfik (seragam). Polimorfisme pada gen
calpastatin juga telah dilaporkan pada berbagai ternak meliputi domba Dorset Down,
domba Hoggets, Dorset Down x Coopworth sheep, domba Kurdi, domba Corridale,
domba Karakul, serta pada sapi Angus dan babi (Chung et al.,1999; Palmer et al.,
1999a; Nassiry, 2005; Shahroudi et al., 2006).
Frekuensi alel adalah frekuensi relatif dari suatu alel dalam populasi atau
jumlah suatu alel terhadap jumlah total alel yang terdapat dalam suatu populasi (Nei
dan Kumar, 2000). Populasi domba lokal di Indonesia mempunyai frekuensi alel N
yang lebih tinggi dibandingkan alel M pada semua subpopulasi. Hasil penelitian ini
berlawanan dengan beberapa penelitian sebelumnya yang dilakukan terhadap
populasi domba di luar negeri. Palmer et al.(1999b) melaporkan bahwa genotipe
calpastatin pada domba Corridale yaitu MM, MN dan NN, dengan frekuensi alel
untuk alel M dan N masing-masing 79 dan 21%. Hasil yang sama juga diperoleh
Shahroudi et al.(2006) yang melakukan penelitian serupa pada domba Karakul di
Iran. Nassiry (2005) menemukan frekuensi alel sebesar 88% untuk alel M dan 12%
untuk alel N dan frekuensi genotipe MM, MN dan NN masing-masing 76, 24 dan
0%, serta nilai heterosigositas 36% pada populasi domba Kurdi Iran.
Keragaman Genetik Domba Ekor Tipis (DET)
Gen calpastatin pada populasi DET bersifat polimorfik pada semua daerah.
Frekuensi genotipe MN dan NN untuk domba Ciomas yaitu 58 dan 42%, dengan
nilai heterosigositas 43%. Frekuensi Genotipe MN dan NN domba Margawati yaitu
48 dan 52%, dengan nilai heterosigositas 37%. Frekuensi genotipe MN dan NN
untuk domba Jonggol yaitu masing-masing 32 dan 68% dengan frekuensi alel M
16% dan nilai heterosigositas 28%. Frekuensi alel M terbesar terdapat pada populasi
domba Ciomas dan domba Margawati masing-masing sebesar 29 dan 24%. Populasi
domba dari kedua daerah ini merupakan domba Garut. Domba Ciomas dan
Margawati mempunyai nilai heterosigositas yang berbeda, hal ini kemungkinan
disebabkan karena perbedaan sejarah seleksi yang dilakukan terhadap kedua jenis
domba tersebut. Domba Margawati merupakan domba Garut tipe pedaging,
sedangkan domba Ciomas merupakan domba Garut tipe tangkas. Secara umum nilai
heterosigositas DET lebih tinggi dibandingkan dengan nilai heterosigositas DEG.
Secara umum, populasi domba di bagian barat wilayah Indonesia mempunyai
frekuensi alel M yang lebih tinggi dibandingkan dengan populasi domba di bagian
timur. Frekuensi genotipe domba Ciomas dan Margawati mempunyai frekuensi
genotipe MN yang tinggi masing-masing 58 dan 48% dibandingkan dengan domba-
domba dari daerah lain. Elyasi et al. (2005) melaporkan hasil yang hampir sama
yaitu frekuensi genotipe MN yang tinggi pada domba Arkhamerino (47,62%) dan
domba persilangan Ghezel x Arkhamerino (46,67%). Hal ini kemungkinan
disebabkan terdapatnya darah domba Merino baik pada domba Ciomas, domba Garut
Margawati, domba Arkhamerino, dan domba Persilangan Ghezel x Arkhamerino.
Keragaman Genetik Domba Ekor Gemuk (DEG)
Pada umumnya populasi DEG mempunyai frekuensi alel M yang rendah.
Frekuensi alel M untuk populasi bangsa domba ekor gemuk (DEG) bervariasi antar
subpopulasi. Bangsa DEG yang terletak dibagian timur wilayah Indonesia cenderung
mempunyai frekuensi alel M yang lebih kecil. Frekuensi genotipe MN dan NN untuk
domba Indramayu, Donggala, Madura dan Sumbawa secara berurutan yaitu ; 25 dan
75% ; 24 dan 76% ; 7 dan 93%, serta 8 dan 92%. Frekuensi alel M pada domba
Madura dan Sumbawa mempunyai nilai yang sama kecilnya yaitu 4%. Frekuensi alel
M pada domba Indramayu dan Donggala masing-masing sebesar 13 dan 12%. Lebih
tingginya frekuensi alel M pada domba Indramayu kemungkinan disebabkan telah
adanya usaha seleksi untuk sifat pertumbuhan. Domba Donggala kemungkinan telah
mengalami persilangan dengan domba lokal sehingga frekuensi alel M relatif lebih
tinggi dibandingkan dengan domba ekor gemuk lainnya yaitu domba Madura dan
Sumbawa. Berbeda dengan bangsa DEG lainnya, gen calpastatin domba Rote
bersifat monomorfik. Nilai Heterosigositas tertinggi pada bangsa DEG ditemukan
pada populasi domba Indramayu yaitu 23% dan terendah pada populasi domba Rote
yaitu 0%. Nilai heterosigositas untuk populasi domba Donggala yaitu 21%,
sedangkan untuk populasi domba Sumbawa dan Madura mempunyai nilai
heterosigositas yang sama yaitu 8%.
Hubungan Antara keragaman Gen Calpastatin dengan Bobot Badan Domba
Data genotipe yang digunakan untuk analisis hubungan antara genotipe
dengan bobot badan hanya 99 yang terdiri dari 45 data genotipe domba jantan dan 54
data genotipe domba betina. Data genotipe tersebut berasal dari Ciomas, Jonggol,
Margawati dan Indramayu. Data genotipe domba Donggala tidak digunakan untuk
analisis hubungan antara genotipe dengan bobot badan karena faktor lingkungan
pemeliharaan yang masih beragam. Data genotipe domba dari daerah Madura,
Sumbawa dan Rote tidak memungkinkan untuk dilakukan analisis hubungan dengan
bobot badan. Hal ini disebabkan karena tingkat polimorfisme genotipe gen
calpastatin dari ketiga daerah tersebut sangat rendah.
Hasil analisis ragam (Lampiran 1 dan 2) menunjukkan bahwa genotipe gen
calpastatin berpengaruh nyata terhadap bobot badan domba jantan (P=0,017) tetapi
tidak berpengaruh nyata terhadap bobot badan domba betina (P=0,847). Hasil Uji
lanjut menunjukkan bahwa rataan bobot badan domba jantan dengan genotipe MN
lebih besar dibandingkan dengan genotipe NN (Tabel 2). Berdasarkan hasil analisis
tersebut, alel M kemungkinan terkait dengan sifat bobot badan yang lebih unggul.
Rendahnya frekuensi alel M dan tidak terdapatnya genotipe MM kemungkinan
sebagai akibat dari seleksi negatif terhadap sifat bobot badan unggul yang terjadi
pada populasi domba lokal di Indonesia.
Tabel 2. Rataan Bobot Badan Domba ( X ) dan Simpangan Baku Rataan (SE) antara Genotipe MN dan NN
Genotipe Jumlah sampel (ekor)
X + SE (kg)
MN 15 43,4 + 4,0a
NN 30 35,1 + 2,9b
Keterangan : Superskrip (a,b) yang berbeda menyatakan berbeda nyata (P<0,05)
Penelitian lain menunjukkan bahwa genotipe gen calpastatin terkait dengan
sifat pertumbuhan. Nassiry et al. (2005) melaporkan adanya hubungan antara
genotipe gen calpastatin domba Kurdi Iran (metode PCR-SSCP) dengan sifat
pertumbuhan. Genotipe AB terkait dengan pertambahan bobot badan domba harian
prasapih dan pertambahan bobot badan harian dari umur 9 bulan sampai umur 1
tahun (AB>AA>AC). Hasil yang sama juga dilaporkan oleh Tahmoorespour (2005)
yang melaporkan bahwa genotipe AB>AA>AC terkait dengan pertambahan bobot
badan harian prasapih pada domba Baluchi. Berbeda dengan Palmer et al.(1999b)
yang melaporkan bahwa domba dengan genotipe AC memiliki keunggulan dalam
sifat produksi dibandingkan dengan genotipe AA. Domba dengan genotipe AC
memiliki bobot badan hidup lebih besar 12-17%, memiliki bobot karkas yang lebih
besar 15-18%, tetapi lebih rendah tingkat keempukan dagingnya 4-12%. Pada daerah
amplifikasi lain, Chung et al. (2001) menyatakan bahwa sapi dengan genotipe BB
mempunyai bobot badan yang lebih tinggi dibandingkan dengan genotipe AB dan
AA.
Penelitian ini merupakan yang pertama dilakukan untuk mengetahui
keragaman gen calpastatin pada populasi domba lokal di Indonesia. Informasi yang
tersedia masih sangat sedikit untuk dapat dijadikan sebagai perbandingan. Hasil
penelitian ini memberikan informasi bahwa gen calpastatin bersifat polimorfik dan
dapat digunakan untuk studi keragaman populasi domba lokal di Indonesia. Selain
itu, informasi keragaman ini dapat digunakan dalam penelitian berikutnya untuk
menganalisis hubungan antara genotipe gen calpastatin dengan sifat pertumbuhan
dan keempukan daging domba lokal. Hasil analisis ragam dalam penelitian ini
menunjukkan bahwa terdapat hubungan antara genotipe gen calpastatin dengan
bobot badan. Seleksi terhadap bobot badan dapat dilakukan terhadap ternak yang
mempunyai alel M. Namun demikian, perlu dilakukan penelitian lain dengan materi
ternak yang lebih banyak dan lebih seragam baik dari faktor lingkungan maupun
umur, untuk mengetahui hubungan antara gen calpastatin dengan parameter sifat
pertumbuhan lainnya serta dengan kualitas daging.
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Gen calpastatin lokus CAST-MspI pada populasi domba lokal di Indonesia
bersifat polimorfik (beragam), kecuali pada populasi domba Rote. Identifikasi
keragaman gen calpastatin dengan teknik Restriction Fragment Lenght
Polymorphisms (RFLP) menghasilkan dua alel yaitu M dan N, serta dua genotipe
yaitu MN dan NN. Frekuensi alel M tertinggi ditemukan pada populasi Domba Garut
Ciomas (29%) dan terendah pada populasi Domba Ekor Gemuk di Sumbawa dan
Madura masing-masing 4%. Frekuensi alel M untuk domba Margawati, Jonggol,
Indramayu, dan Donggala secara berturut-turut yaitu 24, 16, 13 dan 12%. Nilai
heterosigositas bervariasi antara subpopulasi dan berkisar antara 8% pada populasi
domba Sumbawa dan Madura, sampai 43% pada populasi domba Garut Ciomas.
Nilai heterosigositas domba Margawati, Jonggol, Indramayu, dan Donggala secara
berturut-turut yaitu 37, 28, 23 dan 21%. Genotipe gen calpastatin dalam penelitian
ini berhubungan dengan bobot badan domba jantan (P=0,017) tetapi tidak
berhubungan dengan bobot badan domba betina (P=0,847). Domba jantan dengan
genotipe MN mempunyai rataan bobot badan lebih tinggi dibandingkan dengan
genotipe NN.
Saran
Seleksi domba terhadap bobot badan unggul dapat dilakukan terhadap domba
yang mempunyai alel M pada gen calpastatin. Namun demikian, perlu dilakukan
penelitian lebih lanjut untuk melakukan analisis hubungan antara gen calpastatin
dengan parameter sifat pertumbuhan lainnya serta dengan kualitas keempukan
daging, dengan menggunakan domba dalam jumlah yang lebih banyak dan lebih
seragam dalam hal faktor lingkungan dan umur. Penelitian lanjutan tersebut
sebaiknya menggunakan populasi domba dengan keragaman gen calpastatin yang
tinggi yaitu domba Garut, domba Jonggol, domba Indramayu, dan domba Donggala.
UCAPAN TERIMA KASIH
Alhamdulillahirabbilal’alamin, puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat
Allah SWT atas segala limpahan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulisan skripsi
ini dapat terselesaikan. Rasa hormat dan bangga, serta ucapan terimakasih yang
sebenarnya tidak cukup hanya dengan kata-kata, penulis sampaikan kepada Bapak
dan Ibu (Almh) yang telah berjuang untuk menyekolahkan anak-anaknya hingga
pendidikan tinggi, dan atas segala do’a, nasehat, bimbingan, motifasi, serta dukungan
baik moril maupun materil.
Penulis mengucapkan rasa terimakasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Ir.
Cece Sumantri, MAgr.Sc. dan Dr. Ir. Achmad Farajallah, MSi selaku pembimbing
utama dan anggota, atas segala bimbingan, perhatian, saran, dan arahan, serta atas
materi penelitian yang telah diberikan. Rasa terimakasih penulis sampaikan kepada
Dr. Ir. Supraptini Mansjoer dan Dr. Ir. Asep Sudarman, MRur.Sc. selaku dosen
penguji yang telah memberikan saran dan masukan dalam penulisan skripsi ini. Rasa
terimakasih juga penulis sampaikan kepada Ir. Rukmiasih, Msi selaku pembimbing
akademik atas segala perhatian dan bimbingannya selama penulis menjalani studi di
IPB. Ucapan terimakasih tak lupa penulis sampaikan kepada Dr. Ir. Bambang
Suryobroto sebagai Kepala Bagian Zoologi atas izin dan kesempatannya melakukan
penelitian di Bagian Zoologi FMIPA, IPB.
Rasa terimaksih penulis sampaikan kepada Pak Adi dan rekan-rekan di Lab.
Zoologi : Ogi, Astri, Wildan, Lusi, Nico, Ruth, Mbak Ani, Mbak Anifa, Mbak Zul,
dan Indra atas kebersamaanya, serta kepada seluruh kelurga besar zoologi atas
suasana kekeluargaannya. Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada Mas
Rizal yang telah memberikan arahan dan bimbingan selama penulis tinggal di Graha
Ar-Rahman. Terakhir, kepada teman-teman TPT 40 yang tidak dapat disebutkan satu
persatu penulis ucapkan terimakasih atas semangat persahabatannya.
Bogor, Mei 2007
Penulis
DAFTAR PUSTAKA
Al-Soud, W.A dan P. Radstrom. 2001. Purification and characterization of PCR inhibitory components in bloods cells. J. Clin. Microbiol. : 485-493
Ausubel. 1995. Short Protocol in Molecular Biology. 3rd edition. New York
Bishop, M.D., M. Koohmaraie, J.Killefer, and S. Kappes.1993. Restriction fragment length polymorphisms of the bovine calpastatin gene. J. Anim. Sci. 71:2277.
Blakely, J. dan D.H. Bade. 1991. Ilmu Peternakan Edisi ke-4. Terjemahan. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.
Chung, H.Y., M.E Davis, H.C. Hines, D.M. Wulf. 1999. Effect of the calpain proteolysis and calpain genotype on meat tenderness of Angus bulls. J. Anim. Sci. 77: 31-38
Delgado, E.F., G.H. Geesink, J.A. Marchello, D.E. Goll, and M. Koohmaraie. 2001. The calpain system in three muscle of normal and callipyge sheep. J. Anim. Sci. 79:398-412
Devendra, C dan G.B. McLeroy. 1982. Goat and Sheep Production in The Tropics. Longman Group Limited, London.
DJBPP. 2005. Buku Statistik Peternakan. Departemen Pertanian RI.
Doho, S.R. 1994. Parameter fenotipik beberapa sifat kualitatif dan kuantitatif pada Domba Ekor Gemuk. Thesis. Fakultas Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Bogor
Diwyanto, K. 1982. pengamatan fenotip domba priangan serta hubungan antara beberapa ukuran tubuh dengan bobot badan. Tesis. Fakultas Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor. Bogor
Edey, T.N. 1983. Tropical Sheep and Goat Production. Australian Universities. International Development Program (AUIDP), Canberra, Australia.
Elyasi-zaringhabaee, G., J. Shodja, M.R. Nassiry, O. Pirahary, and A. Javanmard. 2005. Determination of ovine calpastatin gene polymorphisms using PCR-RFLP. In: Sharoudi, F.E., M.R.Nassiry, R.Valizadh, A.H.Moussavi, M.T. Pour, and H. Ghiasi (Editor). Genetic polymorphisms at MTNR1A, CAST, and CAPN loci in Iranian Karakul Sheep. Iranian J. Biotechnol. 4:117-122
Falconer, D.S., and T.F.C Mackay. 1996. Introduction to Quantitative Genetics. 4th edition Longman Group Ltd. Essex, England.
Gatenby, R.M. 1991. Sheep. Macmilalan Education Ltd. London
Goll, D.E., V.F. Thompson, R.G. Taylor, and J. A. Christiansen. 1992. Role of the calpain system in muscle growth. Biochimie. 74:225-237.
Hediger, R., H. A. Ansari, and G. F. Stranzinger. 1991. Chromosome banding and gene localizations support extensive conservation of chromosome structure between cattle and sheep. Cytogenet. Cell Genet. 57:127.
Hossner, K.L. 2005. Hormonal Regulation of Farm Animal Growth. http://www.cabi-publishing.org [8 Juni 2006]
Kappes, S.M., J.W. Keele, R.T. Stone, T.S.Sonstegard, T.P.L. Smith, R.A. Mcgraw, N.L.Lopezcorrales, and C.W.Beattie. 1997. A second-generation linkage map of the bovine genome. Genome Res. 7:235.
Killefer, J., and M. Koohmaraie. 1994. Bovine skeletal muscle calpastatin : clonning, squence analysis, and stady-state mRNA expression. J. Anim. Sci. 72 : 606
Koohmaraie, M., S.D. Shackelford, T.L. Wheeler, S.M. Lonergan, and M.E. Doumit. 1995. A muscle hypertrophy condition in lamb (callipyge): characterization of effects on muscle growth and meat quality traits. J. Anim. Sci. 73:3596–3607.
Kurly, J., W. Kapelanski, M. Pierzchala, S. Grajewska, and M. Bocian. 2003. Preliminary observation on the effects of calpastatin gene (CAST) polymorphisms in carcass traits in pigs. Anim.Sci.Paper and report. 2:87-95
Lewin,B. 1994. Genes V. Oxford University Press. New York
Lonergan, S.M., C.W. Ernst, M.D. Bishop, C.R. Calkins, and M. Koohmaraie. 1995. Relationship of restriction fragment length polymorphisms at the bovine calpaststin locus to calpastatin activity and meat tenderness. J. Anim. Sci. 73:3608-3612
Margawati, E.T. 2005. Pemetaan quantitative traits loci (QTL) sifat pertumbuhan pada populasi domba silang balik ekor tipis dan merino. Disertasi. Fakultas Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Bogor
Mason, I.L. 1980. Prolific Tropical Sheep. Food and Agriculture Organization of The United nation, Roma
Montgomery G.W and Kinghorn. 1997. Recent developments in gene mapping and progress towards marker-assisted selection in sheep. Aust. J. Agric. Res. 48:729-741.
Morgan, J .B., T.L.Wheeler, M. Koohmaraie, J. W. Savell, and J. D. Crouse. 1993. Meat tenderness and the calpain proteolytic system in the longissimus muscle of young bulls and steers. J. Anim. Sci. 71:1471.
Nassiry, M.R., A. Javadmanesh, M. Nosraty, A. Mohammadi, and A. Javanmard. 2005. Genetics polymorphisms of ovine calpastatin locus in Iranian Kurdi Sheep by PCR-RFLP. Proc. of 3rd Moscow International Congress, Biotechnology. State of art and prospects of development. P:291
Nei, M. 1987. Molecular Evolutionery Genetics. Columbia University Press, new York.
Nei, M and S. Kumar. 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics. Oxford University Press, Inc., New York
Palmer,B.R., N. Roberts, J.G.H. Hickford, and R. Bickerstaffe. 1998. Rapid Communication : PCR- RFLP for MspI and NcoI in the ovine calpastatin gene. American Society of Animal Science
Palmer, B.,R. Morton, and J.D. Robert. 1999a. marker assited selection for meat quality and the ovine calpastatin gene. In: Sharoudi, F.E., M.R.Nassiry, R.Valizadh, A.H.Moussavi, M.T. Pour, and H. Ghiasi (Editor). Genetic polymorphisms at MTNR1A, CAST and CAPN loci in Iranian Karakul Sheep. Iranian J. Biotechnol. 4:117-122
Palmer, B.R., N. Robert, and M.P. Kent. 1999b. A candidate gene approach to animal quality traits. In: Sharoudi, F.E., M.R.Nassiry, R.Valizadh, A.H.Moussavi, M.T. Pour, and H. Ghiasi (Editor). Genetic polymorphisms at MTNR1A, CAST and CAPN loci in Iranian Karakul Sheep. Iranian J. Biotechnol. 4:117-122
Palumbi, S.R. 1996. Nucleic acids II: The polymerase chain reaction. In: D.M. Hillis, C. Moritz dan B.K.Mable (Editor). Molecular Systematics. 2nd Edition. Sinauer Associates. Inc., Massachusetts USA
Prasetyo, A. 2005. Metode ekstraksi DNA dan identifikasi gen kappa kasein (k-Kasein) pada sapi Friesian Holstein (FH) di peternakan rakyat. Skripsi. Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Bogor
Roberts, N., B. Palmer, J.G.H. Hickford, and R. Bickerstaffe. 1996. PCR-SSCP in the ovine calpastatin gene. Anim. Genet. 27:211-222.
Sambrok, J., F. Fritsch and T. Miniatis. 1989. Molecular Clooning Laboratory manual. 3rd Edition. Cold Spring Harbor laboratory press, New York
Sharoudi, F.E., M.R. Nassiry, R. Valizadh, A.H. Moussavi, M.T. Pour, and H. Ghiasi. 2006. Genetic polymorphisms at MTNR1A, CAST and CAPN loci in Iranian Karakul Sheep. Iranian J. Biotechnol. 4:117-122
Smith T. 2003. Genetic Selection for Tenderness. In: Margawati, E.T (Editor). 2005. Pemetaan quantitative traits loci (QTL) sifat pertumbuhan pada populasi domba silang balik ekor tipis dan merino. Disertasi. Fakultas Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Bogor
Sutana, I.K. 1993. Domba Ekor Gemuk di Indonesia: Potensi dan Permasalahannya. Prosiding sarasehan usaha ternak domba dan kambing menyongsong Era PJPT II. 13-14 Desember 1992. Diterbitkan oleh Ikatan Sarjana Peternakan Indonesia (ISPI) Cabang Bogor dan Himpunan Pengusaha Domba dan Kambing Indonesia (HKDI) Cabang Bogor, Bogor.
Tahmoorespour, M. 2005. Genetic polymorphism in calpain and calpastatin genes and association with growth traits in Baluchi sheep. In: Sharoudi, F.E., M.R.Nassiry, R.Valizadh, A.H.Moussavi, M.T. Pour, and H. Ghiasi (Editor). Genetic polymorphisms at MTNR1A, CAST and CAPN loci in Iranian Karakul Sheep. Iranian Journal. Biotechnol. 4:117-122
Tegelstrom, H. 1992. Mitochondrial DNA in natural population : An improved routine for screening of genetic variation based on sensitive silver stainning. Electrophoresis. 7:226-229
LAMPIRAN
Lampiran 1. Analisis Ragam Respon Genotipe Gen Calpastatin terhadap Bobot
Badan Domba Jantan dan Hasil Uji Lanjutan Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 9638.97417793 876.27037981 16.53 0.0001 Error 33 1749.49826652 53.01509899 Total 44 11388.47244444 R-Square C.V. Root MSE BB Mean 0.846380 19.24758 7.28114682 37.82888889 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F GENOTIPE 1 337.41173869 337.41173869 6.36 0.0166 UMUR 2 4164.24960633 2082.12480317 39.27 0.0001 ASAL 3 2357.58230317 785.86076772 14.82 0.0001 GENOTIPE*UMUR 2 94.76473578 47.38236789 0.89 0.4188 GENOTIPE*ASAL 3 62.91516723 20.97172241 0.40 0.7570 Hasil Uji Duncan : Duncan Grouping Mean N GENOTIPE A 43.380 15 MN B 35.053 30 NN Keterangan : Duncan grouping dengan huruf berbeda menunjukkan
berbeda nyata (P<0,05)
Lampiran 2. Analisis Ragam Respon Genotipe Gen Calpastatin terhadap Bobot Badan Domba Betina
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 1607.34781413 146.12252856 12.18 0.0001 Error 41 491.80463870 11.99523509 Total 52 2099.15245283
R-Square C.V. Root MSE BB Mean 0.765713 13.44966 3.46341379 25.75094340 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F GENOTIPE 1 0.45140803 0.45140803 0.04 0.8471 UMUR 2 558.53717608 279.26858804 23.28 0.0001 ASAL 3 445.76017475 148.58672492 12.39 0.0001 GENOTIPE*UMUR 2 5.10590251 2.55295125 0.21 0.8092 GENOTIPE*ASAL 3 83.56657193 27.85552398 2.32 0.0892