流式细胞术流式细胞术

Flow CytometrFlow Cytometr

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（（ FCMFCM ））

什么是流式细胞仪●流式细胞仪实物

BD FACSVantageBD-Calibur

1. 1. 发展历史发展历史 1934 Moldavan 1934 Moldavan 1973 Steinkamp1973 Steinkamp

一、 概述一、 概述

2. 2. 定义：对在高速流动的鞘液包括下对特异荧光定义：对在高速流动的鞘液包括下对特异荧光标记的细胞、粒子进行标记的细胞、粒子进行分析和分选分析和分选的技术的技术 ..

3. 3. 特点特点 测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个

细胞细胞 可进行多参数测量可进行多参数测量 在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离

出来，即分选技术。出来，即分选技术。

凡是能被荧光素标记的细胞或颗粒都可用流式细胞仪检测。

前提这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发

在生物检测技术中流式细胞仪是不可多得的一机多用的仪器。

4. 应用范围

二、流式细胞仪的工作原理和基本结构待测细胞以单个细胞的悬液，经特

异性荧光染料染色，放入样品管，吸入流动室。

流动室充满鞘液，作用：约束样品在喷嘴中心，防止样品靠近喷孔壁堵塞喷孔。细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱。

液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光。荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析。

基本结构

流动室和液流系统；流动室和液流系统； 激光源和光学系统；激光源和光学系统； 光电管和检测系统；光电管和检测系统； 计算机和分析系统。计算机和分析系统。

三、 流式细胞仪可检测到的细胞参数 非荧光信号非荧光信号

颗粒度

细胞大小

= 前向角散射光（ FSC ）细胞相对大小及其表面积 = 侧向角散射光（ SSC ）细胞颗粒度及细胞内细胞器

的相对复杂性

血液涂片

外周全血细胞散射光双参数点图

荧光信号荧光信号

荧光强度（荧光强度（ FLFL ）：细胞上的荧光染料被激光激发后发射出）：细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。 有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳）有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳） 高高 FLFL 细胞与低细胞与低 FLFL 细胞区分开来（强弱）细胞区分开来（强弱）

一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（ 488nm488nm ），可测出），可测出三个三个 FLFL ，即，即 FL1FL1 、、 FL2FL2 、、 FL3FL3 ，大型的流式细胞仪装有，大型的流式细胞仪装有两个或三个激光光源（两个或三个激光光源（ 488nm488nm 、、 633nm633nm 和和 325nm325nm ），可测），可测出出 66 个个 FLFL 。。

荧光信号与细胞特性荧光信号与细胞特性

荧光染料被激发而发射的光信号。

定量染色

荧光信号大小

被标记组分含量的定量

多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量

二色镜 1 2 3

带通滤波片

光电倍增管

激光束

细胞

收集透镜前向散射

光

侧向散射光，荧光

光信号分离，导向各探测通道接收并转化为电信号。

光信号收集

三 数据处理及流式报告

FSC SSC FL1 FL2 FL3

对数 线性 线性 线性 对数

脉冲处理，模数转换

光信号

电信号

记录数据，显示结果

（面积，峰高，宽度）

流式报告的图一般分为四种，即散点图、直方图、密度图和二维等高图等。最常用的为散点图和直方图。

几个概念： %Gated ：阳性细胞百分比。反映细胞群体中

阳性细胞的数量。 Mean ：平均荧光强度，与被检测物质的表达

量有关，在正态分布时一般用该值。 Geo Mean ：几何平均荧光强度，在阳性细胞

为偏态分布时一般用该值。

散点图 密度图

二维等高图 直方图

图 报告中常见的几种流式细胞图

R1

File: 4 Acquisition Date: 06-Mar-03

Quad Events % Gated X Mean Y Mean

UL 254 2.40 37.47 461.36

UR 1067 10.08 816.86 468.89

LL 5291 49.98 19.57 4.41

LR 3975 37.55 418.80 9.87

图 Annexin V/PI 双标记分析细胞凋亡和坏死

流式细胞仪数据分析 点图分析

流式细胞仪数据分析 直方图分析

图中 100 ～ 101 （ M1 ）为阴性细胞， 101 以上的（ M2 ）为阳性细胞

五、 流式细胞术的应用 细胞结构细胞结构 细胞大小细胞大小 细胞颗粒度细胞颗粒度 细胞表面积细胞表面积 核浆比例核浆比例 DNADNA 含量与细胞含量与细胞

周期周期 RNARNA 含量含量 蛋白质含量蛋白质含量 …………

细胞功能细胞功能• 细胞表面细胞表面 // 胞浆胞浆 // 核的特异性核的特异性

抗原抗原• 细胞活性细胞活性• 细胞内细胞内 // 外的细胞因子外的细胞因子• 激素结合位点、细胞受体激素结合位点、细胞受体• 蛋白磷酸化蛋白磷酸化• pHpH 值值• 钙离子浓度钙离子浓度• 细胞膜电位、线粒体膜电位细胞膜电位、线粒体膜电位 …… ……

一） 细胞一） 细胞 DNADNA 含量检测含量检测

细胞固定后用细胞固定后用 PI PI （ Propidium iodide 碘化丙啶），染色，因为染色，因为 PIPI 特异性结合于细胞特异性结合于细胞 DNADNA ，，荧光强度与荧光强度与 PIPI 的结合量呈良好的线性关系，根据的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，可测出细胞的这个原理，可测出细胞的 DNADNA 含量。用于细胞含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。周期、细胞倍体以及凋亡的检测。

单参数直方图

图中 2N 代表 G0/G1 期细胞， 4N 代表 G2/M 期细胞，两者中间代表 S 期细胞。这是以 2 倍体和 4 倍体细胞为主的流式 DNA 图

DNA 细胞周期分析

细胞周期

GG22MM GG00

GG11

ss

200 400 600 800 1000

GG00GG11

ss GG22 MM

DNADNA 分析分析

DNA 含量

细胞数量

2N2N 4N4N

2倍体

异倍体

4倍体

肿瘤组织中的各种 DNA倍体

含量与凋亡关系

DNA亚 G1峰的检测：利用 PI 染色，检测具有亚 G1 期 DNA 含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。

凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将 DNA降解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的 DNA 片段从细胞内流出，造成总体 DNA含量减少，成为亚 2倍体。

二）肿瘤诊断与抗肿瘤药物研究

1. 肿瘤诊断 DNADNA 异倍体的出现是癌变的一个重要标志异倍体的出现是癌变的一个重要标志 细胞的增殖能力的大小也可反映肿瘤的生物细胞的增殖能力的大小也可反映肿瘤的生物

学特征学特征 利用流式细胞仪进行细胞周期分析和利用流式细胞仪进行细胞周期分析和 DNADNA

倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括监测癌前病倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括监测癌前病变、肿瘤的早期诊断和肿瘤细胞学诊断。变、肿瘤的早期诊断和肿瘤细胞学诊断。

2倍体

异倍体

4倍体

肿瘤组织中的各种 DNA倍体

2. 凋亡研究 在在 GG00/G/G11 峰前出现一峰前出现一

个亚二倍体峰，即凋个亚二倍体峰，即凋亡峰。亡峰。

检测调亡，可进行抗检测调亡，可进行抗肿瘤药物研究和某些肿瘤药物研究和某些因素对细胞的损伤机因素对细胞的损伤机理的研究。理的研究。

Annexin V Assay

R1

File: 4 Acquisition Date: 06-Mar-03

Quad Events % Gated X Mean Y Mean

UL 254 2.40 37.47 461.36

UR 1067 10.08 816.86 468.89

LL 5291 49.98 19.57 4.41

LR 3975 37.55 418.80 9.87

图 Annexin V/PI 双标记分析细胞凋亡和坏死

Date acquired: 14-Jan-03File: 7Gy 4hr.001Source: dongboDIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M: 9.59 % at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04

Apoptosis: 13.66 % Mean: 27.48

R1

图 FCM 测试细胞周 期分布和凋亡

根据凋亡细胞的特点来检测

在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏

凋亡细胞的 FSC ？ SSC ？ 细胞坏死时，细胞肿胀， FSC ？， SSC ？

CD3(TCD3(T 细胞，细胞， CD4CD4 、、 CD8))CD8)) 、、 CDCD1919 （（ BB 细胞）、细胞）、 CD16CD16 、、 CD56CD56 （（ NKNK细胞），原发性或继发性免疫缺陷病、细胞），原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴细胞增殖病、肿自身免疫性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与预后判断、移植免疫检测瘤疗效观察与预后判断、移植免疫检测等。等。

三）淋巴细胞分类淋巴细胞分类

R1

M1M1

流式细胞术检测细胞表型

流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体作分子探针，多参数分析白血病细胞的免疫表型，了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。

FCM 分析白血病免疫表型 , 快速、特异、准确，重复性好，能区分细胞起源、划分其分化发育阶段等，对白血病的诊断与分型、治疗方案选择与预后判断、发病机理研究等有重要价值。

四）白血病的免疫分型

五） 细胞内蛋白的分析： 细胞破膜后将细胞内某一蛋白细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧光标记，用流式细胞仪进行成分进行荧光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型分析一样，可以测量测量分析，同表型分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和这种蛋白的相出这种阳性细胞的数量和这种蛋白的相对含量。荧光探针多为对含量。荧光探针多为 FITCFITC 。。

荧光信号 使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量

荧光样本制备

双色直接染色

端粒（荧光蛋白）

　　

六）细胞内钙离子测定1×106/ml 的细胞悬液，加入终浓度为 1-5μmol/ml Fluo-3/AM，充分混匀，室温避光作用 60分钟。以 HEPES缓冲的 Hank’s平衡盐溶液洗三次，重悬于 0.5ml 同样的溶液，上流式细胞仪检测。根据报告中给出的样品荧光强度计算细胞内钙离子的浓度。

FCM检测胞内钙离子、膜电位和线粒体功能

M1 阴性界限划分完全是根据阴性对照！如下图：红色部分代表阴性对照，即：所检测的物质在阴性组中的基础表达量，可以理解为背景、静息状态下、基础水平、未受刺激时等。蓝色部分即阳性组，也就是接受刺激后，功能状态下、药物作用后等。

六 . 分选： 用荧光探针标记的细胞，可被有效地分离出来，用荧光探针标记的细胞，可被有效地分离出来， 用于分选的效率较高的仪器国内较少，台式机用于分选的效率较高的仪器国内较少，台式机

一般分选速度为每秒钟一般分选速度为每秒钟 300300个细胞，个细胞， 大型机分选速度可达到每秒上万个细胞大型机分选速度可达到每秒上万个细胞

488 nm laser

+-

Fluorescence Activated Cell Sorting

Charged Plates

Single cells sortedinto test tubes

FALS Sensor

Fluorescence detector

对比对比 ---------- 流式细胞仪是一种特殊的显微镜

流式细胞仪 显微镜

流动的细胞 静止的细胞样本

数量大 数量少

高速分选 样本难以再利用

细胞群体特征量分布 揭示细胞内部结构信息

流式细胞仪 蛋白电泳

多参数 单参数

量化的分布 平均值

容易检测各个参数间的相关性 不容易

谢谢谢谢大大家家