I

خدمات بهداشتي درماني تهراندانشگاه علوم پزشكي و دانشكده پزشكي، گروه ميكرب شناسي

تهيه و تدوين شاهسوانشادي دكتر

روه ميكرب شناسي شوراي گو

1397 تابستان

درسنامه عملي ميكرب شناسي

٢

فهرست مطالب عنوان ................................................................................................................. صفحه 9 .............................................................................................................. اول جلسه

9 ............................................................................... یعفون يماریب عامل صیتشخ مراحل

12 ...................................................................... (Pre-Analytical) یلیتحل شیپ رحلهم

12 .................................................................................. :نمونه يآور جمع در مهم نکات

17 .......................................................................................................... نمونه انتقال

19 ................................................................................. یمقدمات مشاهده و نمونه افتیدر

20 ....................................................................... ینیبال يها نمونه بازگرداندن يها شاخص

Analytic phase( ........................................................................... 21( ها نمونه زیآنال

22 ............................................................................... :کردن یعفون ضد و ونیزاسیلیاستر

22 .......................................................................................... :ونیزاسیلیاستر يها روش

22 .................................................................................................. یکیزیف يها روش

28 ..................................................................................... :کردن یعفون ضد يها روش

29 ....................................................................... کردن یعفون ضد ییایمیش يها روش: ب

31 ........................................................................................... ):دیاس کیکربول( ها فنل

32 .................................................. ینیبال يها نمونه یکروبشناسیم مطالعه يروشها :دوم جلسه

33 ......................................................................................یملکول يولوژیکروبیم -الف

Mass Spectrometry ............................................................................ 35 روش- ب

35 ..................................................................................................... کشت روش-ج

36 .......................................................................................... یکروسکوپیم يها روش

36 .................................................................................. ها کروسکوپیم میمستق مشاهده

37 .................................................................................................. :گرم يزیآم رنگ

37 .................................................................................................. گسترش هیته-الف

٣

38 ........................................................................... عیما و جامد کشت طیمح از نمونه هیته

39 ....................................................................................... جامد محیط از گسترش تهیه

40 ....................................................................................... گرم يزیآم رنگ مراحل-د

41 .................................................................................... ينور کروسکوپیم با مشاهده

41 ........................................................................................ ها يباکتر شیآرا و اشکال

43 ................................................................................................... ساده يزیآم رنگ

43 ............................................................................................ یاختصاص يزیآم رنگ

43 .............................................................(Acid fast stains) دیاس به مقاوم يزیآم رنگ

43 .................................. (Ziehl and Neelsen) نلسن لیز روش به دیاس به مقاوم يزیآم رنگ

44 .................................................................................................. فونتانا يزیآم رنگ

Albert stains ........................................................................... 45 آلبرت يزیآم رنگ

45 .......................................................................................... :تیورماالش يزیآم رنگ

46 ...................................................................................... ها يباکتر کشت: سوم جلسه

48 ................................................................................. مناسب کشت يها طیمح انتخاب

48 ............................................................................................ کشت يها طیمح انواع

49 ......................................................................................ینیبال نمونه کشت يها روش

49 ......................................................... آگار کشت طیمح يرو بر ونیزوالسیا روش به کشت

50 ............................................. ها یکلن شمارش جهت آگار طیمح يرو بر Streaking کشت

51 ......................................................................... :کشت طیمح يحاو يها لوله در شتک

52 ................................................................................. عیما طیمح يحاو لوله در کشت

53 ......................................................... :(Slant) دار بیش جامد طیمح يحاو لوله در کشت

54 ........................................................ (Semisolid) جامد مهین طیمح يحاو لوله در کشت

54 ........................................................... ها يباکتر رشد جهت مناسب رطوبت و اتمسفر دما،

55 .................................................................................................. :کشت جینتا ریتفس

٤

55 .................................................................................... یکلن یماکروسکوپ مشخصات

56 ....................................................................................................... ها یکلن شکل

57 ........................................................................ کشت يها طیمح در ها يباکتر واکنش

57 ......................................................................................آگار بالد طیمح يرو زیهمول

57 ......................................................................... :آگار طیمح در) رنگدانه( گمانیپ دیتول

59 ................................................................................... :یافتراق يها طیمح در راتییتغ

61 ................................................... )مثبت گرم يها یکوکس(ها يباکتر ییشناسا: چهارم جلسه

63 ............................................................................................. مثبت گرم يها يباکتر

64 ........................................................................................... مثبت گرم يها یکوکس

67 ..................................................................................................... کاتاالز شیآزما

68 ................................................................................. :نیتراسیباس به تیحساس شیآزما

70 ................................................................................................. :کواگوالز شیآزما

72 ..................................................................................................... زیهمول شیآزما

74 ........................................................................... :(NonHemolytic) کیهمولت ریغ

75 .............................................................................. (CAMPT test) کمپ شیآزما

76 ................................... (Ethyl hydrocupreine hydro chloride) نیاپتوچ به تیحساس

78 ............................................................................................. نیاسکول لیبا شیآزما

80 ............................................................................................... نمک تحمل شیآزما

)وگرامیـ ب یآنتـ ( یکروبیم ضد يداروها به نسبت زا يماریب يباکتر تیحساس سنجش یبررس: پنجم جلسه ........................................................................................................................ 81

84 ......................................................... یکروبیم ضد تیحساس يها شیآزما کردن استاندارد

85 ................................................................... :سکید از انتشار شیآزما انجام مراحل -الف

86 ....................................................... :ونیسوسپانس در موجود يباکتر تعداد یبیتقر نییتع -ب

٥

87 ............................................................ :مناسب کشت طیمح يرو ونیسوسپانس کشت -ج

88 ................................................................................................. :يگذار سکید -د

89 ...................................................................................................... :ونیانکوباس -ه

89 ...................................................................................................... :جینتا ریتفس -و

90 ....................................................................................... یمتوال يساز رقت روش -2

91 ......................................................................................... :انتیگراد انتشار روش -3

92 ........................................................................................... ادرار کشت: ششم جلسه

92 .............................................................................. :کشت يبرا ادرار نمونه يآور جمع

93 ...............................................................:(Midstream urine) یانیم ادرار نمونه-الف

Catheter Collection:( .......................................... 94( کاتتر از ادرار نمونه يآور جمع- ب

Supra pubic Aspiration:( ...................................... 95(مثانه از ادرار نمونه يآور جمع - ج

96 .......................................................................................... :يادرار يها نمونه کشت

97 ...................................................................... (Pyuria) ایوریپ يبرا يغربالگر شیآزما

99 ............................................................ یمنف گرم يها لیکوکوباس و ها لیباس: هفتم جلسه

101 ............................................... (Maccankey Agar) آگار یکانک مک طیمح در کشت

102 ................................................................................................. : دازیاکس شیآزما

Swarming phenomenon:( ........................................................ 104( سوارمینگ دیدهپ

KIA:( .................................................................. 105( آگار رونیگلرآیکل طیمح در کشت

SIM: ........................................................................................... 108 طیمح در کشت

110 ...................................................................................................:حرکت شیآزما

MR_VP : ............................................................................................ 112 شیآزما

VP : ..................................................................................................... 114 شیآزما

115 ...................................................................................... :تراتیس از استفاده شیآزما

117 ................................................................................................... :آز اوره شیآزما

٦

121 .................................................................... یمنف گرم يها لیباس ییشناسا: هشتم جلسه

122 ...........................................................................جلسات یتمام مطالب مرور:نهم جلسه

123 ...................................................................................... ترم انیپا آزمون: دهم جلسه

٧

به نام خداوند جان و خرد قوانین آزمایشگاه میکروب شناسی

ساعت اعالم شده در برنامه آموزشی می باشد. رأسساعت حضور در آزمایشگاه .1

در صــورت وجــود زخــم و بریــدگی در دســت هــا، بیمــاري هــایی از قبیــل کــور رنگــی و مشــکالت .2 ول آزمایشگاه اطالع دهید.سئستم ایمنی قبل از شروع کار، به مسی

پیشگیري از آلودگی لباس ها الزامی می باشد. پوشیدن روپوش سفید جهت .3

ــایر ــار س ــوش در کن ــرار دادن روپ ــالی، از ق ــاي احتم ــودگی ه ــار آل ــوگیري از انتش ــور جل ــه منظ ــه: ب نکتلوازم شخصـی خـودداري فرماییـد و بـه طـور مرتـب، جداگانـه و بـا محلـول ضـد عفـونی کننـده همچـون

ید.هیپوکلریت سدیم (با نام تجاري وایتکس و...) بشوئ به همراه داشتن کپی کارت دانشجویی جهت کارت گزارش کار الزامی است. .4

وســایل شخصــی (کیــف، کتــاب، عینــک، ســاعت، گوشــی همــراه و...) خــود را روي میــز کــار کــه .5 احتمال آلودگی آن ها زیاد است، قرار ندهید.

ــورت (بینــی، .6 ــه ســر و ص ــت زدن ب ــوردن، آشــامیدن، دس ــروب شناســی از خ ــگاه میک در آزمایش چشم، گوش و دهان) اکیداً خودداري فرمائید.

چنــان چــه در هــر مرحلــه از کــار، محــیط کشــت و یــا سوسپانســیون میکروبــی شکســته و یــا قطراتــی .7از آن ســبب آلــودگی میــز، لبــاس و دســت هــا شــود، بــه منظــور جلــوگیري از انتشــار آلــودگی، بالفاصــله

اسب اتخاذ شود.گروه یا آزمایشگاه را مطلع کرده تا تصمیمات من مسئول

گزارش کـار هـر جلسـه را بـه طـور خالصـه در کـارت گـزارش کـار مـنعکس کـرده، در حفـظ آن .8 تا پایان دوره کوشا باشید.

قبــل از خــروج از آزمایشــگاه شــیر گــاز را بســته، میــز کــار را تمیــز نمــوده، عدســی میکروســکوپ .9ــا درشــت نمــایی ــا کاغــذ مخصــوص پــاك نمــوده، ظــ 100(خصوصــاً عدســی ب روف رنــگ آمیــزي ) را ب

را در جاي خود قرار داده و از بسته بودن در آن ها اطمینان داشته باشید.

٨

ــوده در آزمایشــگاه میکــروب شناســی فقــط در ظــروف خــاص جمــع آوري شــده .10 ــوازم آل مــواد و لو اســتریل مــی گردنــد، بنــابراین از دور ریخــتن ایــن وســایل و مــواد در ســطل هــاي معمــولی جــدًا

خودداري فرمایید.

بل از ترك آزمایشگاه حتماً دست هاي خود را بشوئید.ق .11

درسنامه درس عملی در روي سایت گروه میکروب شناسی موجود می باشد. .12

غیبــت (موجــه و غیرموجــه) حــداکثر یــک جلســه مــی باشــد و کســانی کــه غیبــت بیشــتري داشــته .13 باشد، اجازه حضور در امتحان این درس را نخواهد داشت .

با آرزوي موفقیت

٩

جلسه اولرونــد تشــخیص بیمــاري هــاي عفــونی پیچیــده اســت. پزشــک متخصــص ممکــن اســت بــر اســاس ســابقه

ــه تشــخیص ک ــادر ب ــم، بررســی هــاي فیزیکــی و اطالعــات اپیــدمیولوژي ق لینیکــی بیمــاري بیمــاري، عالی باشد.

بــا اي امــا تشــخیص عامــل بیمــاري عفــونی ممکــن اســت خیلــی مشــکل تــر بــوده و وابســته بــه تهیــه نمونــه ــوژي ــگاه میکروبیول ــک آزمایش ــات ی ــایج آزمایش ــحیح و نت ــرایط ص ــال در ش ــول، انتق ــل قب ــت قاب کیفی

ــا عوامــل مختلــف مــی تواننــد همپوشــا ــالینی مــی باشــد. عالئــم ناشــی از بیمــاري هــا ب و باشــندنی داشــته ب ، جهـت درمـان بنـا بـراین همچنین یـک رونـد عفـونی مـی توانـد انـدام هـاي گونـاگونی را درگیـر کنـد،

نیاز به تشخیص عامل اصلی بیماري عفونی و استفاده ازآنتی بیوتیک هاي مؤثر می باشد.ــی مــی شــود و ــان تجرب ــه درم ــتج ب ــاري، من ــل بیم ــع عام ــه موق ــق و ب ــدم تشــخیص دقی ــع ع ــا در در واق ی

مواردي مانند بیماري با چند عامل میکروبی و ... باعث طوالنی شدن درمان شود.درمـــان تجربـــی احتمـــال واکـــنش هـــاي دارویـــی نـــامطلوب ، تغییـــر میکروبیـــوم بیمـــاران و انتخـــاب ــد ســالمت ــر مســتقیم مــی توان ــه روش غی ــه ي مقــاوم را افــزایش داده کــه ب میکــروب هــاي جهــش یافت

ر بیندازد.بیماران را به خطچنـین آسـیب هـاي جـانبی تأکیـدي بـر لـزوم آزمایشـات دقیـق و سـریعی جهـت تشـخیص عامـل بیمــاري

می باشد.خوشــبختانه امــروزه ابــزار زیــادي بــراي مبــارزه بــا بیمــاري هــا در اختیــار بشــرمی باشــد کــه همچنــان در

ده شــوند. حــال پیشــرفت اســت و ســبب شــده اســت کــه عوامــل میکروبــی بــا ســرعت بیشــتر تشــخیص دا البتــه هنــوز هــم روش هــاي قــدیمی کشــت و شناســایی بــراي برخــی (نــه بیشــتر) از بــاکتري هــا بــا اهمیــت

می باشد. ــی، در ــد درس ــن واح ــه ای ــل ارائ ــی عام ــل بررس ــد کام ــا رون ــی ب ــجویان گرام ــت دانش ــده اس ــالش ش ت

میکروبی آشنا گردند. مراحل تشخیص عامل بیماري عفونی

):1-2،شکل1-1مرحله می باشد(شکل 3بالینی شامل ارزیابی آزمایشگاهی نمونه

١٠

-Analytical( 3مرحله تحلیل Pre Analytical( 2- )مرحله پیش تحلیل ( -1 )Post Analyticalمرحله پسا تحلیل (

جهت رسیدن به نتیجه مطلوب دقت در هر یک از این مراحل ضروري و حائز اهمیت می باشد.

مایشگاهی بیماري هاي عفونیمراحل تشخیص بالینی و آز 1-1شکل

١١

مراحل تشخیص بالینی و آزمایشگاهی بیماري هاي عفونی 1-2شکل

مشاوره بیمار با پزشک و ارائه عالئم و نشانه هاي بیماري عفونی -1

معاینه بیمار توسط پزشک و تشخیص بالینی تجربی -2

هـا داراي برچسـب تهیه نمونه یا نمونـه هـاي مناسـب جهـت کشـت ،بـه طـوري کـه تمـام نمونـه -3 مشخصات باشند

درخواســت آزمایشــات بــه صــورت دســت نــویس یــا الکترونیکــی و انتقــال نمونــه هــا بــه روش -4 صحیح

ــالی در -5 ــت ارس ــه درخواس ــاس برگ ــر اس ــا ب ــت داده ه ــگاه و ثب ــط آزمایش ــه توس ــذیرش نمون پ یک فایل کامپیوتري یا یک دفتر

آزمایش مستقیم نمونه -6

ورت امکان گزارشات احتمالی به پزشک در ص -7

١٢

بررسی نمونه ها (انتخاب محیط هاي کشت، تلقیح نمونه ها و گرما گذاري) -8

بررسی محیط هاي کشت و شناسایی بر اساس دستور عمل آزمایشگاه -9

بررسی محیط هاي کشت و آزمایشاتی که جهت شناسایی انجام شده است -10

تهیه گزارش نهایی کشت و ارسال به پزشک ( کلینیک یا بیمارستان ) -11

فسیر گزارشات توسط پزشک و درمان مناسبت -12

گزارش اولیه (در صورت امکان) -13

(Pre-Analytical)مرحله پیش تحلیلی مشاوره بیمار با پزشک و ارائه عالئم و نشانه هاي بیماري عفونی -1

معاینه بیمار توسط پزشک و تشخیص بالینی تجربی -2

نمونه برداري: -3

اي مختلفـــی جهــت کشـــت میکروبــی، مطالعـــات در بررســی عامــل بیمـــاري عفــونی بایـــد نمونــه هــ سرولوژیک و یا بررسی ملکولی تهیه شود.

ــه صــحیح و مناســب و انتقــال آن در شــرایط صــحیح از مراحــل بســیار مهــم و مــؤثر در جمــع آوري نمون باشد. تشخیص عامل بیماري می

ســال یــا شناسـاندن یــک بـاکتري کومن ،نمونــه نامناسـب ســبب عـدم شناســایی عامــل اصـلی عفونــت یـک منجــر بــه درمــان نادرســت و حتــی مضــر بــراي بیمــار ودر نهایــت آلــوده کننــده بــه عنــوان عامــل عفونــت

می شود. نکات مهم در جمع آوري نمونه:

نمونه باید از محل واقعی عفونت با حداقل آلودگی تهیه شود. -1

ه هــا و بخــش بــراي مثــال در بررســی عفونــت اســترپتوکوکی حلــق، بایــد ســواپ فقــط در تمــاس بــا لــوز پشــتی حلــق باشــد و بــا ســایر قســمت هــاي دهــان و بــزاق تماســی نداشــته باشــد. چــون در ایــن نــواحی بــه ــت و ــل عفون ــحیح عام ــایی ص ــدم شناس ــبب ع ــتند و س ــاکن هس ــادي س ــاي زی ــاکتري ه ــی ب ــور طبیع ط

).1-3شکست درمانی می شود(شکل

١٣

ــد ــر مــی توانن ــال هــاي دیگ ــاکن مث ــاي س ــت وجــود بــاکتري ه (اطــراف پیشــابراه Perurethralبافــه) Perineumو) ــه (پرین ــودگی نمون ــا، آل ــانم ه ــع آوري ادرار در خ ــل از جم ــا Endometrial قب ب

ترشحات واژن و .... باشد.

:نمونه برداري از حلق توسط 1-3شکل

سواپ استریل

زمــان مناســب جمــع آوري، درهــر نمونــه بــرداري در نظــر گرفتــه شــود. بــراي تعیــین ایــن زمــان -2

naturalhistory )و )ســـــیر بیمـــــاريpathophysiology بیمـــــاري عفـــــونی اهمیـــــت زیادي دارند.

بــراي مثــال در بیمــاري تیفوئیــد (حصــبه) در طــی هفتــه اول مــی تــوان بــاکتري را از کشــت خــون ــر جداســازي ــدفوع و ادرار بهت ــه م ــاکتري از نمون ــه دوم و ســوم ب جداســازي نمــود در حــالی کــه در هفت

می شود.ســاعته جهـت کشـت بـاکتري مــی باشـد کـه بــه 24نامناسـب بــودن جمـع آوري نمونـه هـاي مثـال دیگـر

ــت ــد داش ــحیحی نخواهن ــایج ص ــت نت ــاي همزیس ــاکتري ه ــد ب ــودگی و رش ــال آل ــزایش احتم ــت اف عل ساعته ادرار و خلط). 24(مثال نمونه

١٤

مقـدار نمونـه هـاي آزمایشـات درخواســتی کـافی باشـد. نمونـه هـاي کــم ممکـن اسـت منجـر بــه -3 شود. عفونت عدم تشخیص عامل

براي مثال بـه همـین جهـت بـر روي محـیط هـاي کشـت خـون مقـدار الزم بـراي تزریـق خـون بـه محـیط ثبت شده است.

ــه ، محــیط هــاي کشــت و انتقــال بســیار -4 ــرداري، ظــروف نمون ــه ب ــزار مناســب نمون اســتفاده از ابــتفاده از آن آ ــوده، اس ــتریل ب ــد اس ــه بای ــی باشــد. ظــروف نمون ــم م ــا مه ــد، درب آن ه ــان باش س

کامالً بسته شده و هیچ گونه نشتی وجود نداشته باشد.

ــزار متــداولی بــراي جمــع آوري نمونــه هــا جهــت کشــت بــاکتري هــا مــی باشــند .البتــه در ســواپ هــا اببهتــر اســت ، مــواردي کــه امکــان آسپیراســیون ترشــحات توســط ســرنگ یــا برداشــت بافــت ممکــن باشــد

). نکاتی که در استفاده از سواپ ها باید در نظر گرفته شود:1-4کلازاین ابزاراستفاده شود(شــوده و رشــد یهــا ســواپ ــان ممکــن اســت حــاوي اســیدهاي چــرب، کلســیم و آلژینــات ب ی از جــنس کت

ریـون غالبـاً مناسـب تـر باکتري هـاي پرنیـاز را مهـار کننـد. سـواپ هـایی از جـنس داکـرون یـا پلـی اسـتر هستند.

ــد مــدت طــ ــا نبای ــه ه ــده نمون ــواد تشــکیل دهن ــر ســمیت م ــد. عــالوه ب ــاقی بمانن ــر روي ســواپ ب والنی ب سواپ ها ، توانایی جذب و سپس آزادسازي نمونه ها در آنهامتفاوت می باشد.

ــا ظــروف ــال ی ــد در محــیط انتق ــا بای ــاکتري ه ــوگیري ازخشــک شــدن و مــرگ ب ــا جهــت جل ســواپ هــه هــا ماننــد تراشــه ــه در برخــی نمون ــاخن جهــت بررســی مرطــوب حمــل شــوند. البت ــا ن هــاي پوســت و ی

قارچ ها باید سواپ ها در ظروف خشک انتقال داده شوند.همچنــین نمونــه هــا بایــد توســط دو ســواپ جمــع آوري شــوند تــا نمونــه کــافی بــراي آزمایشــات مســتقیم

).1-5و کشت وجود داشته باشد(شکل

١٥

وسط سرنگ می باشد وپلیت سمت راست :پلیت سمت چپ تصویر مربوط به نمونه برداري ت 1-4شکل

مربوط به همان نمونه ،ولی برداشت توسط سواپ

:استفاده از دو سواپ براي ارسال یک نمونه 5-1شکل

بــراي جمــع آوري نمونــه هــاي بــی هــوازي، ســواپ ابــزار مناســبی نمــی باشــد و بهتــر اســت نمونــه توســط

شــک شــدن و تمــاس بــا اکســیژن یــک ســرنگ اســتریل آســپیره شــود، همچنــین نمونــه بایــد از خ

١٦

محافطــت شــود. البتــه امــروزه محــیط هــاي انتقــالی تولیــد شــده اســت کــه مــی توانــد هــم بــاکتري هــاي

). 6-1هوازي و هم بی هوازي را محافظت نماید(شکل

:انتقال نمونه هوازي/بی هوازي در ظروف و بسته بندي مخصوص6-1شکل

آنتی بیوتیک جمع آوري شوند. در صورت امکان نمونه ها قبل از تجویز -5

عالوه بر کشت باید از نمونه ها گسترش تهیه شده و مستقیماً بررسی شود. -6

یکــی از مــواردي کــه تهیــه گســترش در تشــخیص آن بســیار کمــک کننــده اســت ، بررســی نمونــه خلــط

نمونـه می باشد. مشـاهده میکروسـکوپی خلـط بـه مـا ایـن امکـان را مـی دهـد کـه بتـوانیم ماهیـت التهـابی

و وجود بـاکتري را بررسـی نمـوده و نتـایج کشـت را بـا ایـن داده هـا ارزیـابی کنـیم. بـراي مثـال اگـر در

میکروبیوتــا را مشــاهده کنــیم نبایــد نمونــه کشــت داده ســلول هــاي اپــی تلیــال و گســترش خلــط فراوانــی

شود.

ظروف حاوي نمونه باید داراي برچسب با ذکر مشخصات باشند. -7

١٧

ــام پزشــک و شــماره حــداقل مشخصــات ــه، ن ــع نمون ــام کامــل بیمــار، شــماره معــرف بیمــار، منب شــامل ن

تماس، تاریخ و ساعت جمع آوري نمونه می باشد.

ذکـر منبـع نمونـه و مصـرف آنتـی بیوتیـک بـه انتخـاب بهتـر محـیط کشـت کمـک نمـوده و همچنـین نــام

می باشد.و شماره تماس پزشک ،جهت مشاوره و اطالع رسانی یافته هاي اولیه مهم انتقال نمونه:

نکتــه اولیــه در انتقــال نمونــه هــا، فاصــله محــل نمونــه بــرداري از آزمایشــگاه مــی باشــد. راهنمــاي کنتــرل

Clinical Laboratory)کیفیـــت دســـتورالعمل هـــاي نمونـــه بـــرداري و انتقـــال آن هـــا توســـط

Standards Institute) CLSI .ارائه شده است

هـا بـا اسـتفاده از ظـروف مخصـوص بـه حـداقل مـی رسـد. نمونـه هـا خطرات بـالقوه حمـل دسـتی نمونـه

در حـین انتقـال بایـد در برابـر شـرایط محیطـی نامناسـب ماننـد سـرما یـا گرمـا، تغییـرات شـدید فشـار و یــا

را نمونــه انتقــال و نگهــداري زمــان تــوان مــی -C̊70خشــک شــدن محافظــت شــوند. بااســتفاده از فریــزر

ــه تگیبســ زمــان ایــن(داد افــزایش Guide)م دارد کــه در کتابچــه هــاي راهنمــا میکروارگانیســ نــوع ب

lines) .(مشخص شده است

ــه آزمایشــگاه منتقــل شوند ــه هــاي مــایع بایــد هرچــه ســریع تــر ب . در بیمارســتان )7-1(شــکلمعمــوالً نمون

سـاعت مـی باشـد. کـه ایـن محـدودیت 2ها معمـوًال حـداکثر زمـان بـین جمـع آوري نمونـه و ارسـال آن

ب پزشـکان بـه آزمایشـگاه مـی باشـد. البتـه جهـت رفـع ایـن شـکلی بـراي انتقـال نمونـه هـا از مطـ انی مزم

هاي خاصــی ارائــه شــده اســت. مــثالً بــراي نمونــه کشــت ادرار مــی کارمشــکل بنــا بــه نــوع نمونــه دســتور

١٨

ــا ــا ت ــرد ی ــتفاده ک ــید اس ــک اس ــی بوری ــادیر کم ــوان از مق ــداري 24ت ــه را در یخچــال نگه ــاعت نمون س

کرد.

همچنین بر طبق دستورعمل ها می توان از محیط هاي انتقال استفاده کرد.

ــه هــاي خلــط جهــت بررســی مایکوباکتریو ــی منمون ــروپیلن و پل ــد در ظــروف پ ــارچ هــا مــی توانن هــا و ق

).8-1اتیلن حمل شوند، از ظروف شیشه اي به علت احتمال شکستگی نباید استفاده شود(شکل

مونه ها: راهنماي نگهداري ن7-1شکل

:نمایش بسته بندي نمونه پرخطر در ظروف جمع آوري و انتقال 8-1شکل

١٩

دریافت نمونه و مشاهده مقدماتی

محــل خاصــی بــراي تحویــل نمونــه هــا در نظــر گرفتــه شــود. مشــاهدات مقــدماتی و حمــل نمونــه هــا بــه

ــد در یــک ــاریزا، بای ــل بیم ــا عوام ــان ب ــودگی کارکن ــل پیشــگیري از آل Biology)اتاقــک ایمــن دلی

safety cabinet) ــاس آزمایشــگاه دســتکش، 9-1انجــام گیرد(شــکل ــا پوشــیدن لب ــد ب ــان بای ). کارکن

ماســـک و... خـــود را در عوامـــل بیمـــاریزاي احتمـــالی محافظـــت نماینـــد. امـــروزه بـــه علـــت احتمـــال

پـر خطـر تمـامی نمونـه هـا، نمونـه HIVو HCVآلودگی خـون و سـایر مایعـات بـدن بـا ویـروس هـاي

در نظر گرفته می شود.

این مرحله شامل :

ثبت داده هاي مربوط به نمونه ها (کامپیوتر یا کتابچه و...). -1

بررسی و مشـاهده شـاخص هـاي نمونـه بـه عنـوان نمونـه قابـل قبـول ( شـرایط بازگشـت نمونـه را -2

نداشته باشند.

الی.رش تشخیص احتمامشاهده میکروسکوپی براي نمونه هاي خاص و گز -3

٢٠

) Safety cabinet:نمایش اتاقک ایمن( 9-1شکل نمونه هاي بالینی شاخص هاي بازگرداندن

(Specimen Rejection)

ــئول -1 ــرد مس ــک ف ــات. ی ــت آزمایش ــه درخواس ــه و برگ ــب نمون ــات برچس ــودن اطالع ــل نب کام

ممکــن عمومــاً در چنــین مــوردي اطالعــات را از محــل ارســال نمونــه تکمیــل مــی نمایــد، چــون

اســت احتمــال نمونــه گیــري مجــدد نباشــد. در ایــن حالــت در برگــه گــزارش نتیجــه، مــی تــوان

ذکر نمود کـه داده هـاي نمونـه نـاقص بـوده اسـت و توسـط فـرد (نـام و نـام خـانوادگی) تکمیـل

شده است.

٢١

نمونه هـایی کـه در فرمـالین ارسـال شـده اسـت. (اگـر قطعـات بـزرگ بـوده و تمـاس بـا فرمـالین -2

یک ساعت باشد می توان با برداشت از مرکز نمونه آن را کشت داد).کمتر از

ساعته 24نمونه هاي خلط -3

ــحات -4 ــترش ترش ــخیص Anus, Vaginal canal , Uterine cervixگس ــراي تش ب

Gram)بــه روش رنــگ آمیــزي گــرم (Neisseria gonorrhoeae)نایســر یــا گونــوره آ

stain).

اي تشخیص قارچ، باکتري و ...یک سواپ براي چند آزمایش ،مثالً بر -5

ــایع از آن -6 ــوده و نامناســب ارســال شــده باشــد و م ــر اســتریل، آل ــایی کــه درظــروف غی ــه ه نمون

ظرف نشت کرده باشد.

پلیت هاي کشت که رشد خیلی زیادي دارند و یا خشک شده اند. -7

ــیمیایی -8 ــواد ش ــا، م ــد حضــور رنــگ ه ــا آشــکار اســت مانن ــودگی در آن ه ــه آل ــایی ک ــه ه نمون

(Gastric washings)و یا باریوم روغنی

درخواســت کشــت بــی هــوازي بــراي نمونــه شستشــو معــده، ادرار، حلــق، بینــی و یــا ســایر نمونــه -9

ــاي ــدفوع ( Oropharyngealه ــانی) ،م ــی ده ــی در جراح ــت عمق ــاي باف ــه ه ــز نمون ــه ج (ب

یـــا Ileostomyســـواپهاي ، کشـــت هـــاي محیطـــی بجزبـــراي کلســـتریدیوم دیفســـیل) ،

Colostomy و Super facial .

)Analytic phase( آنالیز نمونه ها

این مرحله شامل آزمایش میکروسکوپی،کشت نمونه ها، تشخیص و آنتی بیوگرام می باشد.

٢٢

الف) آزمایش میکروسکوپی: انجام این مرحله به دالیل زیر بسیار مهم می باشد.

ــSegmented neutrophilsتعــداد و درصــد نوتروفیــل هــا( -1 وع پاســخ التهــابی ) شــاخص ن

است و می تواند کیفیت نمونه را ارزیابی کند(مانند نمونه خلط).

ــا، -2 ــاکتري ه ــاهده ب ــا مش ــارچ ه ــري (ق ــته اي و مخم ــکال رش ــی و )اش ــاي انگل ــاختمان ه ، س

Viral inclusions ــروس در ســلول ایجــاد مــی (ســاختارهاي درون ســلولی کــه توســط وی

عفونت کمک کنند.شود) می توانند به تشخیص احتمالی عامل

تشخیص احتمالی در نمونه هاي بی هوازي -3

استریلیزاسیون و ضد عفونی کردن:

) Sterilization and Disinfection(

ها) می شود. اسپوراستریلیزاسیون: روندي که منجر به کشته شدن تمامی اشکال میکروبی(حتی

یــب مــی کنــد، امــا الزامــاً تمــامی ضــد عفــونی کــردن: رونــدي اســت کــه ارگانیســم هــاي بیمــاریزا را تخر

ها را از بــین نمــی بــرد. استریلیزاســیون و ضــد عفــونی کــردن بــه دو روش اســپورمیکروارگانیســم هــا و یــا

مکانیکی و شیمیایی انجام می شود. روش هاي استریلیزاسیون:

روش هاي فیزیکی

سوزاندن -1

حرارت مرطوب -2

حرارت خشک -3

استفاده ازصافی ها -4

٢٣

اشعه هاي یونیزان -5

زاندنسو -1

ــواد ــی باشــد. م ــونی م ــاي عف ــه ه ــردن زبال ــین ب ــراي از ب ــرین روش ب ــئن ت ــرین و مطم ــول ت معم

ــاي ــاك در دم ــوزانده c̊980 - c̊870خطرن ــده س ــدیل و ش ــه تب ــتر ب ــی خاکس ــوند م ــا.ش پریونه

علــت همــین بــه رونــدو نمــی بــین از دیگــر معمــول هــاي روش توســط) عفــونی هــاي پــروتئین(

ــوزاندن ــرین س ــراي روش بهت ــ ب ــه نای ــا نمون ــی ه ــد م ــکیل. باش ــاي تش ــمی گازه ــزات و س فل

.کند می محدود را روش این از استفاده خاکستر در سنگین

(اسـتفاده از بخـار تحـت فشـار) اسـتفاده از حـرارت مرطـوب سـریع تـرین و حرارت مرطـوب -2

ــت ــوکالو جه ــام ات ــه ن ــیله اي ب ــن روش از وس ــت. در ای ــیون اس ــرین روش استریلیزاس ــاده ت س

ن مواد مقاوم به حرارت و زباله هاي عفونی استفاده می شود.استریل نمود

ــدیل بــه بخــار نمــوده، بخــار حاصــل وارد ــع گرمایشــی اتــوکالو ،آب داخــل محفظــه اولیــه را تب منب

محفظه اي که مواد و وسـایل مـورد نظـر قـرار گرفتـه شـده و چـون سـبک تـر از هـوا مـی باشـد در بـاالي

ــوا ر ــدریج ه ــه ت ــه و ب ــرار گرفت ــا، داخــل محفظــه ق ــدریج فشــار و دم ــه ت ــد. ب ا از محفظــه خــارج مــی کن

محفظــه بــاال مــی رود و توســط کنتــرل کننــده فشــار و دمــا در نقطــه اي کــه از قبــل انتخــاب شــده اســت ،

ــار ــوالً فش ــود. معم ــی ش ــت م ــاي PSI 15ثاب ــا C̊ 121، دم ــان C̊ 132 ی ــه 30-60 وزم ــاب دقیق ــی انتخ م

ــروتئین فشــار ایــن در. شــود ــه آنزیمــی و یســاختمان هــاي پ ــذیر برگشــت غیــر صــورت ب مــی تخریــب پ

. شوند

٢٤

اســتفاده ابــزار و مایعــات کشــت، هــاي محــیط نمــودن اســتریل جهــت دقیقــه 15 مــدت بــه C̊ 121دمــاي

مـی کـار بـه عفـونی هـاي زبالـه نمـودن اسـتریل بـراي دقیقـه 30 – 60 مـدت بـه C̊ 132 دمـاي و شـود می

). 12-1و 11-1، 10-1شکل(رود

:تصویر دستگاه اتوکالو10-1شکل

:تصویر دستگاه اتوکالو 11-1شکل

٢٥

: اجزادستگاه اتوکالو12-1کلش

حرارت خشک-3

استفاده از ایـن روش نیـاز بـه دمـا و زمـان بیشـتري نسـبت بـه حـرارت مرطـوب دارد. از دسـتگاهی بـه نـام

بـه ایـن روش مـی تـوان شیشـه هـا، روغـن هـا و ، فور یـا اجـاق پاسـتور اسـتفاده مـی شـود. (Oven)آون

بــه مــدت C̊160 ویــا ســاعت 1,5 مــدت بــهC̊ 180پودرهــا را اســتریل نمــود. دمــاي مــورد اســتفاده معمــوالً

).13-1ساعت می باشد(شکل 3

٢٦

:تصویر دستگاه فور13-1شکل

استفاده از صافی ها-4

ــ ــراي اســتریل کــردن محلــول هــاي حســاس ب ه حــرارت ماننــد محلــول هــاي فیلتراســیون روش انتخــابی ب

آنتـی بیــوتیکی، مـواد شــیمیایی ســمی، رادیوایزوتـوپ هــا، واکســن هـا و قنــدها مــی باشـند. معمــوالً بــراي

). 14-1محلول ها از صافی هاي استات سلولز و نیترات سلولز استفاده می شود(شکل

ــر از ــوا از ذرات بزرگت ــازي ه ــت پاکس ــا جه ــی m 3/0فیلتره ــار م ــه ک ــر) ب ــا (میکرومت ــه ب ــد. ک رون

ــاق هــاي عمــل، HEPA (High Frequency Particulate Air)اســتفاده از فیلترهــاي در ات

.(Safety Cabinet)اتاق هاي ایزوله و اتاقک هاي ایمن

٢٧

:استفاده از سرنگ جهت استریل کردن14-1شکل

پرتوهاي یونیزان:-5

اال) در میکروویوهــا و دســتگاه هــاي از ایــن پرتوهــا (اشــعه گامــا بــا طــول مــوج کوتــاه و انــرژي بــ

ــار مصــرف ــک ب ــایل ی ــتریل کــردن وس ــراي اس ــونیزان ب ــاي ی ــده اســت. پرتوه ــتفاده ش ــوگراف اس رادی

مانند سرنگ هاي پالستیکی، کاتترها و یا دستکش هااستفاده می شود.

مواد شیمیایی استریل کننده:-6

ــ ــیلن اس ــید ات ــاز اکس ــده گ ــتریل کنن ــیمیایی اس ــاده ش ــرین م ــول ت ــواد معم ــردن م ــتریل ک ــه در اس ت ک

حساس به حرارت استفاده می شود.

بخــار فرمالوئیــد و بخــار پراکســید هیــدروژن (بــه عنــوان یــک عامــل اکســید کننــده) بــراي اســتریل کــردن

استفاده می شود. (Safety cabinet)اتاقک هاي ایمن HEPAفیلترهاي

٢٨

هاي بــاکتري هــارا اســپورمــی توانـد ســاعت 1-3گلوتـار آلوئیــد، مــاده شـیمیایی دیگــري اســت در مـدت

ــا ــکوپ ه ــردن برونکوس ــتریل ک ــرد و در اس ــین بب ــوردگی (Bronchoscope)از ب ــدم خ ــت ع ــه عل ب

لنزها، فلزها و یا الستیک ها قابل استفاده می باشد.

پراســـتیک اســـید نیـــز در اســـتریل کـــردن ســـطوح وســـایل جراحـــی اســـتفاده مـــی شـــود. اســـتفاده از

اسید استریلیزاسیون سرد نامیده می شود. گلوتارآلدئید یا پراستیک روش هاي ضد عفونی کردن:

ب: روش هاي شیمیایی الف: روش هاي فیزیکی

فاده از پرتوهــاي تروش هــاي فیزیکــی ضــد عفــونی کــردن شــامل: جوشــاندن، پاستوریزاســیون واســ

غیریونیزان می باشد.

ــا اســتفاده از دمــاي جوشــاندن:-1 ــه مــدت C̊63ایــن روش ب ــ 15ب ه باعــث مــرگ اشــکال رویشــی دقیق

باکتري ها می شود.

دقیقـه اسـتفاده مـی شـود کـه عـالوه 15بـه مـدت C̊72 یـا دقیقـه 30 مـدت بـه C̊63در این روش از دمـاي

ــوا ــاریزاي موجــود در م ــاي بیم ــاکتري ه ــر کشــتن ب ــیبی در ارزش ب ــذایی ،آس ــذایی د غ ــواد غ ــم م و طع

ایجاد نمی کند.

ایـن پرتوطـول مـوج بلنـد و انـرژي کـم (UV)شـعه مـاوراء بـنفش : ماننـد ا پرتوهاي غیـر یـونیزان -3

دارد، بــه همــین دلیــل قــدرت نفــوذ بــه منافــذ را نــدارد و فقــط قــادر بــه از بــین بــردن بــاکتري هــایی اســت

که در سطح هستند.

٢٩

ب: روش هاي شیمیایی ضد عفونی کردن

ــا، آلد ــامل الکــل ه ــدو ش ــاوتی دارن ــواع متف ــیمیایی ان ــاي ش ــده ه ــونی کنن ــا، ضــد عف ــالوژن ه ــدها، ه ئی

فلزات سنگین، ترکیبات آمونیوم چهار ظرفیتی و فنل ها می باشند.

(Antiseptic)مــواد ضــد عفــونی کننــده اي کــه بــراي پوســت اســتفاده مــی شــوند مــواد آنتــی ســپتیک

نامیده می شوند.

فاکتورهایی که در عملکرد ضد عفونی کننده هاي شیمیایی مؤثر هستند عبارتند از:

غلظت ماده ضـد عفـونی کننـده -4 تعداد ارگانیسم ها -PH 3دما و -2 انیسم هانوع ارگ -1

ماهیــت ســطحی کــه بایــد ضــد -6 مقدار مواد طبیعی حاضر در محیط (خون موکوس، چرك) -5

نوع آبی کـه اسـتفاده مـی شـود -8 مدت زمان تماس مواد شیمیایی -7 عفونی شود (متخلخل یا صیقلی)

ب سخت ممکن است باعث کاهش اثر ضدعفونی کننده شود).(سختی باال یا سختی کم ) آ

مقاومت به مواد ضد عفونی در میکروارگانیسم ها متفاوت می باشد.

ــپور ــد اسـ ــپورها (ماننـ ــه ترتیـــب اسـ ــا بـ ــد از آن هـ ــد و بعـ ــترین مقاومـــت را دارنـ ــیلوس) بیشـ هاي باسـ

ارچ هـا، شـکل رویشـی ، قـ ید)، ویـروس هـاي بـدون پوشـش مایکوباکتریومها (باسـیل هـاي مقـاوم بـه اسـ

قرار می گیرند. )ترین به مواد ضد عفونی کننده حساس(باکتري ها و ویروس هاي پوشش دار

بنابراین بر اساس ایـن کـه چـه ارگانیسـمی را در چـه محلـی بایـد از بـین ببـریم، مـاده ضـد عفـونی کننـده

موکـوس آغشـته هسـتند متفاوتی اسـتفاده مـی شـود. ابـزاري کـه بـه مـواد طبیعـی ماننـد خـون، چـرك یـا

ــاده ضــد ــا م ــواد حــذف شــوند و ســپس در تمــاس ب ــن م ــه صــورت مکــانیکی (شستشــو) ای ــد ب ــدا بای ابت

عفونی کننده قرار گیرند.

٣٠

% قــدرت کشــندگی بــاالتري از الکــل 70بایــد توجــه شــود کــه الکــل اتیلیــک الکــل هــادر اســتفاده از

ــدها 90 ــدرولیز پیون ــت وجــود آب بیشــتر ســبب هی ــه عل ــرگ % دارد کــه ب ــا و در نتیجــه م ــروتئین ه در پ

میکروارگانیسم ها می شود.

ــا ایزوپروپیلیــک قــدرت کشــندگی ــابراین اســتفاده اســپورالکــل اتیلیــک ی ــد. بن ــاکتري هــا را ندارن هاي ب

ازآن محدود به ضـد عفـونی پوسـت بـه عنـوان یـک آنتـی سـپتیک، ضـد عفـونی دماسـنج و سـطح ویـال

هاي تزریقی پالستیکی می شود.

ــدفرمالد ــد ئی ــار آلدئی ــده ســطوح و گلوت ــوان ضــد عفــونی کنن ــه عن ــه علــت بخــارات آســیب زا ب ب

استفاده نمی شوند.

ــا ــالوژن ه ــاً ه ــر خصوص ــد و کل ــوند ی ــی ش ــتفاده م ــده اس ــونی کنن ــوان ضــد عف ــه عن ــدتاً ب ــر .عم کل

جهت مصارف خانگی به کار می رود. (Naocl)درترکیب هیپوکلریت سدیم

هیپوکلریــت ســدیم را بــراي تمیــز کــردن 1:10)محلــول (CDCي هــا مرکــز کنتــرل و پیشــگیري بیمــار

تخت) ، توصیه می کند.-سطوحی که به خون آغشته شده اند(میز

یــد معمــوالً بــه صــورت ترکیبــی بــا الکــل یــا بــه صــورت یــک پــدوفور همــراه یــک پلیمــر خنثــی ماننــد

نــوان آنتــی ســپتیک بــه کــار مــی رود. هــر دو ترکیــب بــه ع (Povidone- Iodine)دون آیــودین یــپو

% متعاقــب آن اســتفاده از یــک پــدوفور معمــول 70اســتفاده مــی شــوند. در واقــع اســتفاده از الکــل اتیلــک

.ترین روش ضد عفونی پوست قبل از خونگیري می باشد

٣١

به علـت سـمیت جیـوه بـراي طبیعـت، فلـزات سـنگین حـاوي جیـوه دیگـر توصـیه نمـی شـوند، امـا یـک

نایسـر یـا گونـوره نقـره هنـوز بـراي محافظـت چشـم نـوزادان از عفونـت % نیتـرات 1قطره چشـمی حـاوي

آ توصیه می شود.

د. آلـودگی سـطوح نسـطوح آزمایشـگاه اسـتفاده مـی شـو بـراي ترکیبات آمونیـوم چهـار ظرفیتـی

ــوم چهــار ظرفیتــی و فلــزات ســنگین را محــدود ــات آمونی ــا خــون و ســایر مــواد آلــی ،اســتفاده از ترکیب ب

می کند. بولیک اسید):فنل ها (کر

% در ضد عفونی و تمیز کردن سطوح میزها به کار می روند.2 -% 5این ترکیبات با غلظت هاي

نکته مهـم ایـن اسـت کـه در اسـتفاده از ضـد عفـونی کننـده هـا و بیوسـیدها، حتمـًا طبـق دسـتور کارخانـه

سازنده عمل شود.

٣٢

الینی :روشهاي مطالعه میکروبشناسی نمونه هاي ب جلسه دوم:

دستور کار:

تهیۀ گسترش از شیارلثه یا سواپ حلق ( رنگ آمیزي به روش ساده) -1

رنگ آمیزي گسترش آماده به روش گرم -2

رنگ آمیزي گسترش آماده به روش زیل نلسون -3

رنگ آمیزي گسترش آماده به روش ورماالشیت -4

ــاهده -5 ــه مش ــش خوش ــا ارای ــت ب ــرم مثب ــی گ ــکوپی کوکس میکروس

) تهیه شده از محیط کشتاي(استافیلوکوك

مشاهده میکروسکوپی باسیل گرم مثبت ، کپسول دار در نمونـه بافـت -6

(باسیلوس آنتراسیس)

یل (رنگ آمیزي فونتانا)اسپورمشاهده میکروسکوپی -7

مشاهده میکروسکوپی باسیل مقـاوم بـه اسـید(مایکوباکتریوم لپـره) در -8

نمونه بافت

ــکل(کور -9 ــاقی ش ــیل چم ــکوپی باس ــاهده میکروس ــاکتریوم مش ینه ب

دیفتریه،رنگ آمیزي آلبرت) تهیه شده از محیط کشت

٣٣

:بررسی میکروبشناسی نمونه بالینی با استفاده از روش کشت1-2شکل

میکروبیولوژي ملکولی -الف

تکنیــک هــاي ملکــولی یکــی از قــویترین ابزارهــا در بررســی میکروارگانیســم هــا مــی باشــند کــه ســرعت

تعیـــین نـــوع و مشخصـــات آن هـــا دارنـــد. ایـــن روش هـــا تحـــول بزرگـــی در آزمایشـــگاه بـــاالیی در

ــر در روش ت ــد و باعــث تغیی ــا، مشخصــات شــخیصمیکــروب شناســی ایجــاد کــرده ان میکروارگانیســم ه

٣٤

ــایی ســبب شــده اســت کــه مســتقیماً از و میــزان آن هــا شــده اســت. در برخــی ازا یــن روش هــا ایــن توان

تایج الزم را بدست آوریم.نمونه بالینی طی چند ساعت ن

بخش تقسیم می شود. 3میکروبیولوژي ملکولی بر اساس استفاده از اسیدنوکلئیک به

ــدون اســتفاده از تکثیــر اســید نوکلئیــک مــی باشــد. در ایــن روش شناســایی -1 میکروارگانیســم ب

ــگ حاصــل از هی ــا رن ــور ی ــک باز ن ــید نوکلئی ــک و اس ــید نوکلئی ــروب اس ــک پ ــیون ی ریداس

شود. استفاده می

بــا اســـتفاده از تکثیــر اســـید نوکلئیــک نـــوع میکروارگانیســم، مشخصـــات آن و میـــزان آن -2

تعیین می شود.

ــا) -3 ــه ه ــگ گون ــم (تایپین ــین میکروارگانیس ــاط ب ــین ارتب ــت تعی ــه جه ــولی ک ــاي ملک روش ه

د. باشنمی سالمت ژيیکی از ابزارهاي مهم براي اپیدمیولو ،استفاده می شوند

حل نتـایج بـه دسـت آمـده آنـالیز مـی شـوند کـه بـر اسـاس روش اسـتفاده پس از انجام این مرا

شده ،آنالیز متفاوت می باشد :

ــاترن بـــالت(Gel electrophoresisژل الکتروفـــورز ( -1 ــزا Southern Blot) سـ ) و الیـ

)EISA (

Hybridization Reveresروش -2

DNA Sequencingروش -3

٣٥

Mass Spectrometryروش -ب

عیــین مشخصــات میکروارگانیســم هــا بــر اســاس پــروتئین هــاي آن هــا مــی باشــد . در شناســایی و ت

اســـت انجـــام Mass Spectrometryکـــه نـــوعی MALDI-TOFمیکـــروب شناســـی بـــه روش

می شود.

ــه صــــورت تجــــاري( ــده بــ ــپکترومتر تأییــــد شــ ــتگاه اســ MALDI Biotypeامــــروزه دو دســ

) موجود می باشد.VITEKMSو

یـا مخمـر بـه وسـیله لیـزر فعـال مـی شـود. جـذب لیـزر سـبب تولیـد حـرارت در این روش نمونـه بـاکتري

و در نتیجــه جداســازي بخــش هــاي خــارجی نمونــه مــی شــود. میــزان ملکــول هــاي جــدا شــده در فضــایی

حرکـت مـی کننـد کـه بـر اسـاس نسـبت میـزان مـاده بـه بـارالکتریکی آن Detectorاز خالء بـه سـمت

شناسایی می شوند.، Detector و زمان رسیدن آنها به

البته ایـن روش هـم محـدودیت هـایی دارد ، مـثًال نمـی توانـد شـیگال را از اشریشـیا کلـی تمـایز دهـد. در

ــوع ــه صــرفه اي در میکروبشناســی MALDI-TOFمجم ــرون ب ــم و مق ــرفت مه ــالینیپیش ــد ب ــی باش م

که طیف گسترده اي از میکروارگانیسم ها را شناسایی می کند.

ســرعت در حــال ارتقــاء هســتند تــا بــا روش هــاي دقیــق تــر و ســریع تــري ، عوامــل روشــهاي ملکــولی بــه

عفونت و مشخصات آن ها را تعیین کنند. روش کشت-ج

مشاهده مستقیم

٣٦

روش هاي میکروسکوپی

ــی شــوند، کــه ســبب ــتفاده م ــالینی اس ــاي ب ــه ه ــاوتی در مشــاهده میکروســکوپی نمون ــاي متف تکنیــک ه

ــیمیایی ــواص بیوش ــور ،خ ــاهده حض ــی مش ــم م ــرولوژیک میکروارگانیس ــک و س ، مشخصــات فیزیولوژی

شوند.

ــاهده ــل مش ــوند قاب ــی ش ــی م ــوري بررس ــاي ن ــکوپ ه ــا میکروس ــتقیمًا ب ــی مس ــا وقت ــم ه میکروارگانیس

نیستند، به همین جهـت قبـل از بررسـی رنـگ آمیـزي مـی شـوند. البتـه در مـواردي مـی تـوان نمونـه هـاي

ــور می ــر در سیســتم ن ــا تغیی ــدون رنــگ را ب ــد اســتفاده از میکروســکوپ ب کروســکوپ مشــاهده کــرد، مانن

.(Dark field)زمینه سیاه

ــر اســاس رنــگ هــا: در بررســی میکروارگانیســم هــا از رنــگ هــاي متفــاوتی اســتفاده مــی شــود کــه ب

ــرات ــیمیایی، تغیی ــاي بیوش ــا در محــیط ه ــر رنــگ ه ــد تغیی ــوند. مانن ــی ش ــی انتخــاب م ، pHهــدف معین

یون یـا احیـاء ماننـد تغییـر رنـگ معـرف سـنجش حضـور یـا عـدم حضـور تغییر رنـگ بـه علـت اکسیداسـ

ــین ــه علــت عملکــرد فیزیولوژیــک میکروارگانیســم و همچن ــر رنــگ ب ــوازي محــیط، تغیی ــی ه شــرایط ب

استفاده از رنگ ها جهت مشاهده میکروارگانیسم ها توسط میکروسکوپ. مشاهده مستقیم میکروسکوپ ها

ــاهده میکر ــا و مش ــگ ه ــتفاده از رن ــالینی، اس ــه ب ــی نمون ــی کیف ــالینی در بررس ــاي ب ــه ه ــکوپی نمون وس

ــی ــرار م ــتفاده ق ــورد اس ــت م ــل عفون ــریع عام ــالی س ــین تشــخیص احتم انتخــاب محــیط کشــت و همچن

مـی باشـد کـه (Gram’s Stain)یکـی از معمـول تـرین رنـگ آمیـزي هـا، رنـگ آمیـزي گـرم گیـرد.

به روش زیر انجام می شود.

٣٧

رنگ آمیزي گرم:

سترشالف تهیه گ

خشک کردن-ب

ثابت کردن-ج

رنگ آمیزي-د

تهیه گسترش-الف

ــرروي یــک ــرده در محــیط کشــت را ب ــاي رشــد ک ــاکتري ه ــا ب ــالینی ی ــه ب ــازکی از نمون ــه ي ن الی

ــته ــله داش ــاي الم فاص ــاره ه ــه از کن ــت نمون ــر اس ــترانیم. بهت ــی گس ــز (الم) م ــه اي تمی ــفحه شیش ص

)2-2باشد. (شکل

: تهیه گسترش2-2شکل

اگــر نمونــه رقیــق باشــد، ابتــدا ســانتریفیوژ شــده و ســپس از آن گســترش تهیــه مــی کنــیم و اگــر نمونــه هــا

غلیظ یا جامد باشند باید آن ها را رقیق نمود، به طوري که بتوان الیه نازکی از آن تهیه کرد.

٣٨

تهیه نمونه از محیط کشت جامد و مایع

مشخص می باشد. 3-2مراحل تهیه گسترش در شکل یه گسترش از محیط کشت مایع ته

لوله آزمایش محتوي مایع را به آرامی تکان دهید -1

استریل کردن لوپ -2

برداشتن درب لوله (سرپوش) و حرارت دادن دهانه لوله -3

برداشتن یک لوپ از باکتري (در حین خارج کردن، لوپ با دیواره لوله تماس نداشته باشد) -4

ه و گذاشتن درب لولهحرارت دادن دهانه لول -5

قرار دادن محتویات لوپ در مرکز الم و تهیه گسترش (با حرکت چرخشی لوپ سوسپانسیون یکنواخت -6

ایجاد کنید و دقت کنید که گسترش خیلی ضخیم یا نازك نبوده و از کناره هاي الم نیز فاصله داشته باشد).

استریل کردن مجدد لوپ -7

٣٩

:روش تهیه گسترش از محیط جامد و مایع 3-2شکل

تهیه گسترش از محیط جامد لوپ استریل شود -1

با لوپ یک قطره آب در وسط الم گذاشته شود -2

لوپ مجددا استریل و سرد شود -3

٤٠

ختی تهیه شودمقدار بسیار کمی از کلونی باکتري برداشته و بوسیله آب روي الم ،سوسپانسیون یکنوا -4

استریل کردن لوپ-5

ک قـ : الم ها باید در مجاورت هوا خشک شوند .در نمونه هاي پر خطر این کار در اتاخشک کردن-ب

انجام می شود. (Safety cabinet)ایمن

) و یا با استفاده از صفحه گرم کننده ، نمونه بر مرتبه 3-4شعله ( رويبا عبور دادن الم از ثابت کردن:-ج

م ثابت می شود. برخی از الکل ها براي ثابت کردن نمونه استفاده می کنند.روي ال

مراحل رنگ آمیزي گرم-د دقیقه) 1پوشاندن سطح گسترش با رنگ کریستال ویوله ( .1

خالی کردن رنگ و شستشو با آب (نیازي به خشک کردن بین مراحل نیست) .2

دقیقه) 1پوشاندن سطح گسترش با محلول ید (لوگل) ( .3

کردن رنگ و شستشو با آبخالی .4

استن)، معموالً الم را با رنگ بر شستشو داده تا دیگر رنگ کریسـتال -رنگ بري با رنگ بر (الکل .5

ثانیه جهت رنگ بري استفاده شود. 10ویوله خارج نشود. در این آزمایشگاه از زمان

شستشو با آب .6

دقیقه) 1پوشاندن گسترش با سافرانین ( .7

شستشو با آب .8

م، با جریان هوا میتوان الم ها را خشک نمود.خشک کردن ال .9

٤١

نوري مشاهده با میکروسکوپ،باکتري هاي گرم مثبت به رنگ آبـی تیـره (بـنفش) و بـاکتري 100در مشاهده با عدسی با بزرگنمایی

هاي گرم منفی به رنگ صورتی مشاهده میشوند.

نــد ،تشــخیص ایــن کــه بــاکتري متغیــر دار (Gram)در مــواردي ماننــد بــاکتري هــایی کــه واکــنش گــرم

گرم مثبت یـا گـرم منفـی مـی باشـد مـی توانـد مشـکل باشـد کـه بـا انجـام سـایر آزمایشـات قابـل بررسـی

است. اشکال و آرایش باکتري ها

ــی ــا کوکس ــروي ی ــکل ک ــه ش ــه س ــی ب ــور کل ــوند، بط ــی ش ــاهده م ــاوتی مش ــکال متف ــه اش ــا ب باکتریه

) دیــده مــی شــوند. Spirilliمــارپیچی یــا اســپیریل هــا( ) و Bacilli)،میلــه اي یــا باســیل هــا(Cocciهــا(

).4-2(شکل

:اشکال متفاوت باکتریها4-2شکل

٤٢

ــا( ــا فـــوزیفرم هـ ــه شـــکل هـــاي،دوکی یـ ــیلی ممکـــن اســـت بـ ــا Fusiformاشـــکال باسـ )،هاللـــی یـ

ــو( ــکل( Curvedویبریـ ــه شـ ــا کورینـ ــاقی یـ ) Coryne form or Club form) و چمـ

).5-2مشاهده شوند(شکل)Coccobacilliوکوکوباسیل ها(

:اشکال و آرایش باکتریها5-2شکل

خــاص )کنــار هــم قــرار گــرفتن باکتریهــاآرایــش (چگــونگی داراي ،باکتریهــا عــالوه بــر شــکل مشــخص

ــند ــی باش ــت ، نیزم ــن اس ــه اي .ممک ــا خوش ــترپتو) و ی ــته اي (اس ــو)، رش ــایی (دیپل ــو )، دوت ــرد (مون منف

).5-2(شکلمشاهده شوند(استافیلو)

٤٣

یزي ساده:رنگ آم

در این رنگ آمیزي از یک رنگ استفاده می شود.

ــو -4 ثابت نمودن -3 خشک کردن -2 تهیه گسترش -1 ــیلن بلـ ــا متـ ــترش بـ ــاندن گسـ 4پوشـ

مشاهده با میکروسکوپ -7 خشک کردن -6 شستشو با آب -5 دقیقه

تمامی باکتري ها و سلول ها به رنگ آبی مشاهده می شوند. رنگ آمیزي اختصاصی:

، اســپورز رنــگ هــا و روش هــاي رنــگ آمیــزي مــی تواننــد در مشــاهده اجــزاء بــاکتري هــا ماننــد برخــی ا

کپسول، گرانولهاي ذخیره اي درون سلولی کمک نمایند.

اسـتفاده شـوند، شناسـایی و افتـراق بـاکتري هـا در دنـ مـی توان هـا رنـگ آمیـزي انـواع همچنین برخـی از

، فونتانا ،آلبرت و....(Acid fast stains)مانند رنگ آمیزي مقاوم به اسید (Acid fast stains)رنگ آمیزي مقاوم به اسید

از ایـن رنـگ آمیـزي میتـوان بـراي مشـاهده مایکوباکتریومهـا اسـتفاده کـرد. ایـن بـاکتري هابـه علــت دارا

ــري توســط محلــول اســید الکــل هســتند،با ــه رنــگ ب ــودن مــاده مــومی شــکل در ســلوال خــود مقــاوم ب ب

ــتفاده از ا ــا در اس ــاکتري ه ــایر ب ــاوتی از س ــا رنــگ متف ــا را ب ــاکتریوم ه ــایکو ب ــوان م ــی ت ــن مشخصــه م ی

گسترش مشاهده کرد. (Ziehl and Neelsen)ن نلسرنگ آمیزي مقاوم به اسید به روش زیل

تهیه گسترش -1

خشک کردن -2

ثابت نمودن -3

٤٤

دقیقه 20پوشاندن گسترش با رنگ کربول فوشین -4

شستشو با آب -5

اسـید الکــل (بــه صـورتی کــه گسـترش رنــگ خـود را از دســت مــی رنـگ بــري توسـط محلــول -6

دهد)

شستشو با آب -7

دقیقه) 4پوشاندن گسترش با رنگ متیلن بلو ( -8

خشک کردن الم -9

مشاهده با میکروسکوپ -10

باکتري هـاي مقـاوم بـه اسـید بـه رنـگ صـورتی در زمینـه ي آبـی مشـاهده مـی شـوند ،در حالیکـه سـلول

قـاوم بـه اسـید نیسـتند ،بـه رنـگ آبـی مشـاهده مـی شـوند. برخـی از هاي بافـت و سـایر بـاکتري هـا کـه م

باکتري ها مانند نوکاردیا ،می توانند به صورت مقاوم به اسید ضعیف مشاهده شوند.

رنگ آمیـزي بـا نقـره (بـه روش فونتانـا) برخـی از بـاکتري هـا ماننـد اسـپیروکتها و یـا برخـی باسـیل هـاي

ول رنــگ نمــی شــوند. رنــگ آمیــزي بــا نقــره بــراي مشــاهده کوچــک ماننــد بــارتونال بــا روش هــاي معمــ

این باکتري ها از جمله تریپونما پالیدوم عامل بیماري سفیلیس استفاده شده است. رنگ آمیزي فونتانا:

بـا اسـتفاده از ایـن رنـگ آمیــزي بـاکتري را بـه رنـگ قهـوه اي تیــره در یـک زمینـه قهـوه اي روشـن مــی

توان مشاهده نمود.

٤٥

Albert stainsلبرت رنگ آمیزي آ

ــی ــتفاده م ــا اس ــاکتریوم ه ــه ب ــک در کورین ــاي متاکروماتی ــه ه ــاهده دان ــراي مش ــزي ب ــگ آمی ــن رن از ای

شود.

ــا رنــگ آلبــرت ( -4 ثابت کردن -3 خشک کردن -2تهیه گسترش -1 9پوشــاندن گســترش ب

6پوشــاندن گســترش بــا محلــول لوگــل ( -6 خالی کردن رنگ بدون شستشو با آب -5 دقیقه)

مشاهده با میکروسکوپ -9 خشک کردن -8 شستشو با آب -7 دقیقه)

بـه ایــن روش بـاکتري هــا بـا رنــگ ســبز و دانـه هــاي کرومتاتیـک بــه رنــگ آبـی مایــل بـه ســیاه مشــاهده

می شوند. رنگ آمیزي ورماالشیت:

ها در باکتري ها استفاده می شود.اسپوراز این رنگ آمیزي براي مشاهده

پوشاندن رنگ با محلول ماالشیت گـرین -4 ثابت کردن -3 خشک کردن -2تهیه گسترش -1

پس از اولین مشاهده بخار، شعله را کنار گذاشته وکمی بعد (دقیقه) 5و استفاده از حرارت به مدت

دقیقه از مشاهده اولین بخـار از الم مـی باشـد. توجـه 5مجدداً الم را حرارت می دهیم . زمان الزم

شستشـو -6خالی کردن رنگ و کمی زمان تا الم سرد شود -5 )شود محلول رنگ نباید بجوشد.

خشک کردن -9 شستشو با آب -8دقیقه) 3پوشاندن گسترش با رنگ سافرانین ( -7 با آب

مشاهده با میکروسکوپ -10

ها به رنگ سبز و باکتري ها به رنگ صورتی دیده می شوند.اسپوربا این روش

٤٦

جلسه سوم: کشت باکتري ها

: دستور کار

کشت از دست ،پس از شستشو در محیط نوترینت آگار -1

( Slant)برداشت ازمحیط کشت جامد و کشت در محیط جامد شیب دار -2

(Broth)برداشت از محیط کشت جامد و کشت در محیط مایع -3

بی و کشت برروي پلیت به روش ایزوالسیونوبرداشت از سوسپانسیون میکر -4

حیط کشت تلوریت پتاسیم مشاهده کلنی هاي کورینه باکتریوم در م -5

TCBSمشاهده کلنی هاي ویبریو کلرا در محیط -6

ــاکتریوم در محــیط کشــت لونشــتاین جانســون آگــار( -7 مشــاهده کلنــی مایکوب

Lowenstein Jensen Agar(

)Bactecمشاهده محیط کشت دو فازي ( -8

٤٧

عفونیمراحل تشخیص بالینی و آزمایشگاهی بیماري هاي

ــا کشــت داده ــه ه ــد نمون ــتقیم بای ــالینی، پــس از مشــاهده مس ــه ب ــا در نمون ــاکتري ه ــایی ب ــد شناس در رون

شوند.

ــیط ــد مح ــه بای ــن مرحل ــاي در ای ــا، ه ــاي دم ــدي ه ــین نیازمن ــوند و همچن ــاب ش ــب انتخ ــت مناس کش

ر نظر گرفته شوند.د (Incubation)اتمسفر و زمان گرماگذاري

ــد ــوده ان ــه رشــد نم ــر روي محــیط کشــت اولی ــه ب ــایی ک ــاکتري ه ــدي ب ــه بع ــاي ،در مرحل در محــیط ه

ــه آنتــی بیوتیــک هــا ــاکتري و همچنــین حساســیت ب ــوع ب ــه جهــت شناســایی و تعیــین ن کشــت دیگــري ب

ند.وکشت داده می ش

٤٨

انتخاب محیط هاي کشت مناسب

حـاوي آگـار) اسـتفاده مـی - Solidهـاي کشـت جامـد ( جهت کشـت اولیـه نمونـه هـا عمومـاً از محـیط

استفاده می شود. (Broth)شود ولی در مواردي مانند کشت خون، محیط کشت اولیه مایع :محیط هاي کشت انواع

د بـاز دارنـده هـا مـی باشـند و فاقـ محیط هاي انتخابی یا غیـر انتخـابی: محـیط هـاي غیـر انتخـابی -1

ــالین ــه ب ــدار رشــد بیشــتر باکتریهــاي نمون Blood)ی را حمایــت مــی کننــد. محــیط ژلــوز خون

Agar) ــزودن یمحیطــ ــا اف ــر انتخــابی اســت و ب ــه محــیط آگــار 5غی درصــد خــون گوســفند ب

تهیه می شود.

آن رابـه آگـار بـالد محـیط بـه می تـوان بـا افـزودن آنتـی بیوتیـک هـا یـا مـواد شـیمیایی ممانعـت کننـده،

ت انتخـابی سـبب تقویـت رشـد یـک بـاکتري شـده د. محـیط هـاي کشـ نمـو یک محـیط انتخـابی تبـدیل

هستند. در این محیط ضعیف تر قادر به رشد به صورت ولی انواع دیگر نیز

محــیط هــاي کشــت افتراقــی: ایــن دســته از محــیط هــاي کشــت بــا افــزودن یــک رنــگ معــین، -2

بـه طـوري کـه بـاکتري هـایی کـه در ایـن محـیط ،قندها یا سایر مـواد شـیمیایی تهیـه مـی شـوند

ماننــد محــیط .شــد مــی کننــد بــا نشــانه هــاي خاصــی از ســایر بــاکتري هــا مشــخص مــی شــوند ر

کلنـی دارنـد، قنـد الکتـوز را توانـایی تخمیر ایی کـه هـ ک کـانکی آگـار کـه بـاکتري مـ کشت

هاي صورتی رنگ و آن هایی کـه ایـن قنـد را تخمیـر نمـی کننـد کلنـی هـاي بـی رنـگ تولیـد

می کنند.

٤٩

:نمونه بالینیکشت روش هاي

در ایـــن مرحلـــه بایـــد تمـــامی نکـــات الزم جهـــت پیشـــگیري از انتقـــال عامـــل عفونـــت بـــه کارکنـــان

آزمایشــگاه بــه عمــل آیــد، ماننــد پوشــیدن لبــاس مخصــوص، دســتکش، ماســک و ســایر ابــزار محافظــت

کننده در صورت لزوم.

ــوپ ــد ل ــیله برداشــت مانن ــتفاده از یــک وس ــا اس ــین ب ــدار (Swab)، ســواب (Loop)همچن ي از و... مق

،انتقال نمونــه و کشــت بایــد درکنــار شــعله شــودمــی نمونــه بــالینی بــه محــیط هــاي کشــت مناســب منتقــل

باشد،تا فقط باکتریهاي موجود در نمونه رشد نمایند . کشت به روش ایزوالسیون بر روي محیط کشت آگار

ــیط کشــت -1 ــر روي مح ــت ب ــمتی از پلی ــالینی را در قس ــه ب ــداري از نمون ــدا مق ــتریل ابت ــرار داده و اس ق

ــیم (شــکل ــی کن ــار قســمت تقســیم م ــه چه ــه صــورت فرضــی ب ســپس .) 1-3ســطح محــیط کشــت را ب

اســتریل بــه صــورت خطــوط رفــت و برگشــتی در منطقــه اول پخــش مــی نمــائیم لــوپنمونــه بــالینی را بــا

می نماییم.را توسط شعله استریل لوپسر.

درجـه نسـبت 90ت و بـا زاویـه سپس بـا چرخانـدن محـیط کشـت در جهـت خـالف عقربـه هـاي سـاع -2

ــل ــه قب ــه مرحل ــن عمــل را ســه ،ب ــه و ای ــل، خطــوط رفــت و برگشــتی گرفت ــه قب مجــدداً از خطــوط مرحل

.تریل می کنیم سرا توسط شعله ا لوپاز هر مرحله لقب (مرتبه تکرار می کنیم

ــه و کشــت مــی دهــیم. در -3 در منطقــه چهــارم خطــوط رفــت و برگشــت را فقــط از خــط انتهــایی گرفت

استریل شود. لوپپایان کار حتماً

٥٠

مــی هــدف از ایــن نحــوه کشــت رقیــق ســازي نمونــه بــالینی و جداســازي بــاکتري هــاي موجــود در نمونــه

ــه صــورتی کــه روي ســطح پلیــت باشــد، ــا فاصــله تشــکیل ،ب ــی هــایی ب ــوان در مراحــل شــونکلن ــا بت د ت

شناسایی از آن ها استفاده نمود.

، مســتقیماً توســط همــان ســواب بــه محــیط کشــت دارســال شــده انــنمونــه هــاي بــالینی کــه توســط ســواب

ــوپ توســط 4و3، 2منتقــل شــده و خطــوط منطقــه ــن ل ــه بســیار مهــم ای اســتریل کشــیده مــی شــوند. نکت

استریل شود. لوپاست که در پایان کار حتماً

:کشت به روش ایزوالسیون 1-3شکل نی ها:بر روي محیط آگار جهت شمارش کل Streakingکشت

ــد ســتفادهمعمــوالً جهــت کشــت ادرار ا مــی شود.توســط یــک لــوپ کــالیبر شــده اســتریل کــه مــی توان

)2-3انجام می شود. (شکل نماید،) برداشت ml 001/0 – 01/0حجم معینی از ادرار (

٥١

جهت شمارش تعداد باکتري ها Streaking :کشت به روش2-3شکل

ــ ــه ص ــوپ را ب ــدا ل ــده ابت ــت ش ــول برداش ــامی محل ــپس تم ــوده و س ــه ادرار نم ــودي وارد نمون ورت عم

شـود. مـی بـر روي سـطح محـیط تخلیـه ،توسط لوپ با کشـیدن یـک خـط در مرکـز پلیـت محـیط آگـار

ت را در ســطح پلیــت کشــســپس بــا کشــیدن خطــوط رفــت و برگشــت، نمونــه قــرار گرفتــه درروي خــط

ــده 90، ســپس پلیــت را مکشــت مــی دهــی ــیم درجــه چرخان در انتهــاي .و همــین عمــل را تکــرار مــی کن

ــا دو ــد اســتریل شــود. در برخــی آزمایشــگاه ه ــین بای ــد ویالت ــا حجــم کشــت،یکیکــار فیل و ml01/0ب

جهـت کنتـرل کیفـی، کشـت داده مـی شـوند. البتـه امـروزه ابـزار دقیـق تـري ml001/0دیگري بـا حجـم

براي برداشت حجم معینی از ادرار وجود دارد.

له هاي حاوي محیط کشت:کشت در لو

محیط هاي کشت داخل لوله ها می تواند، مایع، جامد و یا نیمه جامد باشند.

٥٢

حاوي محیط مایع لوله کشت در

ــه ــک زاوی ــد در ی ــه بای ــود 30لول ــم ش ــه خ ــته و درج ــوش آن را برداش ــعله ،درپ ــط ش ــه آن را توس دهان

نشـان داده شـده اسـت بـه شـکل کـه در سـپس نمونـه مـورد نظـر را در محلـی از مـایع . حرارت می دهیم

ــده ودر پــوش آن را مــی گــذاریم. )3-3محــیط مــایع منتقــل مــی کنیم(شــکل ــه را از شــعله گذران .در لول

.در پایان کشت باید استریل شود لوپنکته مهم

:کشت در محیط مایع3-3شکل

٥٣

:(Slant)حاوي محیط جامد شیب دار لولهکشت در

وارد لوله نموده و از کمی باالتر از لوپآن باشد، نمونه را توسط یسطح بخشدرکشت اگر هدف فقط

.)5-3(شکلسطحی که شیب محیط شروع می شود به صورت خطوط زیگزاگی کشت می دهیم

ــدف ــر ه ــتفاده از ،اگ ــا اس ــه را ب ــد، نمون ــطح باش ــق و س ــت در عم ــکل Straight wireکش ــا ش (ی

ــوپســوزنی ــین را از ل ــه پالت ــد، میل ــا برس ــه انته ــه ب ــن ک ــل از ای ــوده و قب ــی نم ــدا وارد قســمت عمق ) ابت

ــه صــ ــه مهــم .رت زیگــزاگ کشــت مــی دهــیم وبخــش عمقــی خــارج نمــوده و در ســطح ب ــوپنکت در ل

.پایان کشت باید استریل شود

جامد:کشت عمقی و سطحی در لوله حاوي محیط 5-3شکل

٥٤

(Semisolid)کشت در لوله حاوي محیط نیمه جامد

معموًال ایـن کشـت بـراي بررسـی توانـایی حرکـت بـاکتري اسـتفاده مـی شـود. بـه همـین جهـت نمونـه را

ــه انتهــاي محــیط کشــت در ــا یــک میلــه پالتــین ســوزنی وارد محــیط کشــت نمــوده و قبــل از رســیدن ب ب

).6 -3(شکلدر پایان کشت باید استریل شود لوپ ،نکته مهم.همان راستا خارج می نمائیم

:کشت در محیط نیمه جامد 6-3شکل

دما، اتمسفر و رطوبت مناسب جهت رشد باکتري ها

. برخــی در طیــف گســترده اي از دمــا دارنــددمــاي مناســب جهــت رشــد ،نیازبــه میکروارگانیســم ها

یار محــدود اســت. دمــاي مناســب بســدیگر در حــالی کــه ایــن طیــف بــراي برخــی ،توانــایی رشــد دارنــد

می باشد.سانتیگراد 35̊براي رشد بیشتر میکروارگانیسم هاي

٥٥

بیشــتر بــاکتري هــا در همچنــین افــزایش مــی یابــد. Co2 %5 -10رشــد بیشــتر میکروارگانیســم هــا توســط

% یا باالتر بهتر رشد می کنند.70رطوبت

تفسیر نتایج کشت:

ــا ــاکتري ه ــایج کشــت ب ــس از گر 48-24تفســیر نت ــاســاعت پ ــل بررســی اســت ، گــذاري م ــه قاب ــاز ب نی

مهــارت داشــته و یــک میکروبشــناس بایــد از اولــین مشــاهده، کلنــی هــاي ایزولــه شــده را ارزیــابی کنــد و

تصمیم گیري نماید چه مسیرهایی براي شناسایی آن ها مورد نیاز می باشد.

یافتــه، نتیجــه رنــگ آمیــزي مشخصــات کلنــی هــا، تعــداد کلنــی هــا، خلــوص کلنــی بــاکتري هــاي رشــد

ــی ــرم کلن ــگ و... ،گ ــر رن ــد تغیی ــت مانن ــیط کش ــاهده در مح ــل مش ــرات قاب ــؤثر در تغیی ــاي م فاکتوره

ارزیابی کلنی ها و تصمیم گیري براي مراحل شناسایی می باشند.

:ماکروسکوپی کلنیمشخصات

ــاکتري مشــاهده ــی ب ــوع کلن ــد ن ــان چن ــم زم ــالینی ممکــن اســت ه ــه هــاي ب شــوند.پلیت در کشــت نمون

کلنی ها بررسی می شوند. ،کشت شده را در دست گرفته و در چند جهت در مقابل نور

می توان از یک عدسی دستی یا میکروسکوپ نیز براي دیدن کلنی ها استفاده کرد. البته براي نمونه هاي پر

: ،عبارتند ازشود خطر باید شرایط محافظت به دقت انجام شود. مشخصات کلنی که در شناسایی استفاده می

قوام -8 چگالی -7 سطح -6 رنگ -5 حاشیه -4 تحدب -3 شکل -2اندازه -1

٥٦

شکل کلنی ها:

ــد ــاوتی دارن ــا اشــکال متف ــی ه ــد گرد، ،کلن ــی توانن ــند ریزم ــامنظم و ... باش ــدي، ن ــم .)7-3(شــکل وئی ه

رشته اي و... ،چنین حاشیه کلنی ها نیز می تواند اشکال مختلفی داشته باشد کامل

ذکــر اســت جهــت پیشــگیري از عفونــت الزم بــه ،برخــی از بــاکتري هــا بــوي خاصــی تولیــد مــی کننــد

نباید پلیت ها را استشمام کرد.

اشکال مختلف کلنی ها،سطح و حاشیه آنها )7-3(شکل

٥٧

هاي کشت واکنش باکتري ها در محیط آگاربالد همولیز روي محیط

ــا ــد ت ــوادي ،گلبــول هــاي قرمــز خــون را لیز(تخریــب) نمایند برخــی از باکتریهــا قادرن ــا تولیــد م (شــکل ب

3-8(.

باشد.لیز گلبولهاي قرمز در حد جزئی و متمایل به رنگ سبز ،همولیز آلفا: اگر اطراف کلنی ها

همولیز بتا: اگر اطراف کلنی لیز گلبول هاي قرمز کامل و اطراف کلنی شفاف باشد.

اطراف کلنی مشاهده نشود. همولیز گاما: هیچ تغییري در

همولیز آلفا Cهمولیز بتا وشکل B: کشت در بالد آگار،شکل )8-3(شکل

تولید پیگمان (رنگدانه) در محیط آگار:

):9-3(شکل برخی باکتري ها پیگمان هاي متفاوتی در محیط کشت ایجاد می کنند

محلول در آبپیگمان هاي -1

٥٨

پیوسانین -2

پیگمان هاي فلورسنت -3

پیگمان هـاي غیـر نفوذپـذیر کـه فقـط کمـی رنـگ مـی گیـرد و تغییـري در رنـگ محـیط ایجـاد -4

نمی کند.

تولید پیگمان سبزتوسط باکتري )9-3(شکل

٥٩

تغییرات در محیط هاي افتراقی:

معـرف هـاي فعالیـت هـاي آنزیمـی و سـایر تغییراتـی کـه توسـط pHمانند تغییـر در رنـگ هـا، معرفهـاي

).10-3در محیط ایجاد می شود(شکل

تغییر رنگ محیط اولیه به رنگ صورتیAمحیط کشت اولیه ،لوله B:لوله )10-3(شکل

ــه روش ،هــاي متفــاوت ،کلنــی در نهایــت اگــر در محــیط کشــت قابــل تمــایز از هــم نباشــند مــی تــوان ب

هاي زیر یک کشت خالص تهیه نمود:

از سطح یک کلنی و کشت مجدد آن در پلیت دیگر برداشت -1

استفاده از محیط انتخابی -2

استفاده از مواد شیمیایی ممانعت کننده -3

هاي آنتی بیوتیکدیسک استفاده از -4

٦٠

نکتــه قابــل توجــه ایــن اســت کــه کلنــی بایــد خــالص باشــد تــا بتــوان مراحــل بعــدي

شناسایی را ادامه داد.

ــی ک ــوق کمــک م ــا مشخصــات ف ــد ت ــاي ک نن ــتفاده از محــیط ه ــا اس ــایر آزمایشــات ب ــی و س شــت افتراق

شناسایی باکتري نهایی شود.،

ــه از ،مــی تــوانپــس از دســتیابی بــه کلنــی خــالص روشــهاي مختلــف ماننــد روشــهاي ملکــولی وابســته ب

DNA، اسپکترومتري (Mass spectrometry) ....در شناسایی باکتري استفاده نمود.و

٦١

اسایی باکتري ها(کوکسی هاي گرم مثبت)جلسه چهارم: شن تفسیر نتایج جلسه قبل -1دستور کار :

رنگ آمیزي گرم از کلنی هاي کشت جلسه قبل -2

مشاهده آزمایش کاتاالز -3

کشت در محیط مولر هینتون آگارجهت آزمایش حساسیت به باسیتراسین -4

کشت در پالسما جهت آزمایش کواگوالز -5

حــیط بــالد آگــار جهــت آزمــایش همــولیز ،حساســیت بــه اپتــوچین کشــت در م -6 وباسیتراسین

کشت در محیط بالد آگار جهت آزمایش کمپ -7

کشت در محیط بایل اسکولین -8

%و فاقد آن5/6کشت در محیط مایع حاوي نمک -9

مشاهده میکروسکوپی استرپتوکوك در گسترش تهیه شده از محیط کشت مـایع -10 به روش گرم

مشاهده میکروسکوپی دیپلوکوك گرم مثبت در گسترش تهیه شـده از نسـج بـه -11 روش گرم (مثال پنوموکوك)

مشاهده میکروسکوپی دیپلوکوك گرم منفی در گسترش تهیـه شـده از نسـج بـه -12 نایسریا مننژیتیدیس)-روش گرم (مثال نایسریا گونوره آ

چرك مشاهده استافیلوکوکوس درگسترش تهیه شده از-13

مشاهده استافیلوکوکوس درگسترش تهیه شده از محیط کشت -14

٦٢

مراحل تشخیص بالینی و آزمایشگاهی بیماري هاي عفونی

شناســایی باکتریهــا بــا اســتفاده از روشــهاي متعــددي انجــام مــی شــود.امروزه در آزمایشــگاه هــاي مجهــز،

ــپکترومت ــا اســتفاده از اس ــرو ارگانیســم در ب ــاي خــالص میک ــی ه (Maas spectrometry)ري کلن

ــه هــا مــی باشــد ،ولــی مســتقیماً شناســایی مــی شــوند. اگرچــه ایــن روش صــرفه جــویی در زمــان و هزین

ــتفاده از خصوصــیات بیوشــیمیایی ــا اس ــی نیســت. روش دیگــر شناســایی میکروارگانیســم ب ــده آل روش ای

دارد.آن ها است. این روش نیاز به وقت و هزینه بیشتري دارد ،ولی دقت باالیی

ــه شناســایی میکروا ــا ب ــه و تفســیر آن ه ــی رمشــاهده ي محــیط هــاي کشــت اولی گانیســم هــاي کمــک م

کند.

٦٣

ــتفاده از ــا اس ــرم، ب ــه روش گ ــزي ب ــگ آمی ــس از رن ــا پ ــاکتري ه ــالص ب ــاي خ ــی ه ــن روش ،کلن در ای

ــی ــا بررس ــک ه ــی بیوتی ــه آنت ــیت ب ــت حساس ــت جه ــده و در نهای ــایی ش ــیمیایی شناس ــات بیوش آزمایش

خواهند شد.

در این آزمایشگاه روش دوم آموزش داده خواهد شد.

با اسـتفاده از رنـگ آمیـزي گـرم، بـاکتري هـا بـه دو گـروه بـزرگ بـاکتري هـا ي گـرم مثبـت و بـاکتري

هاي گرم منفی تقسیم می شوند.

باکتري هاي گرم مثبت:

یوانــات نیــز ایــن بــاکتري هــا،در طبیعــت بــه طــور گســترده اي وجــود دارنــد، همچنــین از بــدن انســان و ح

جداسـازي مــی شــوند. بــه همــین علــت شناســایی و معرفـی آن هــا بــه عنــوان عامــل یــک بیمــاري عفــونی

کار مشکلی می باشد.

بــاکتري هــاي گــرم مثبــت بــا اســتفاده از مورفولــوژي (شــکل شناســی) بــه دو گــروه کوکســی هــاي گــرم

کوکسـی هـاي گـرم مثبـت مثبت و باسیل هاي گـرم مثبـت تقسـیم بنـدي مـی شـوند. بـا توجـه بـه اهمیـت

)1-4در نمونه هاي عفونی به روش زیر به شناسایی آن ها می پردازیم (شکل

٦٤

): تقسیم بندي باکتریها بر اساس رنگ آمیزي گرم1-4(شکل

کوکسی هاي گرم مثبت:

بـه شـکل کـروي یـا کوکسی هاي گرم مثبـت ، تنـوع زیـادي دارنـد. ایـن بـاکتري هـا زیـر میکروسـکوپ

بیضــوي بــوده و آرایــش متفــاوتی دارنــد. مــی تواننــد بــه شــکل مونوکــوك، دیپلوکــوك ،اســترپتوکوك

ــیه ــزرگ میکروکوکاس ــانواده ب ــا در دو خ ــاریزاي آن ه ــواع بیم ــتر ان ــوند. بیش ــده ش ــتافیلوکوك دی و اس

(Micrococcaceae) و استرپتوکوکاســـیه(Streptococcaceae) نـــی قـــرار دارنـــد. ابتـــدا از کل

بــاکتري هــاي رشــد یافتــه بــر روي محــیط کشــت، گســترش تهیــه و ســپس بــه روش گــرم رنــگ آمیــزي

٦٥

گســترش، کوکسـی هــاي گـرم مثبــت مشـاهده شــوند، بـا آزمایشــات زیــر مـی شــود. در صـورتی کــه در

به شناسایی آن ها می پردازیم.

از رنگ آمیزي گرم ): تقسیم بندي اولیه باکتریها پس2-4(شکل

٦٦

رنگ آمیزی گرم ↓

کوکسی ھای گرم مثبت↓

کاتاالز↓

_ +

استرپتوکوکاسیھ↓

ھمولیز روی محیط بالدآگار↓

میکروکوکاسیھ↓ /اکسیدازباسیتراسین

حساس/+ مقاوم/_

استافیلوکوک میکروکوک↓

کواگوالز↓

آلفاھمولتیک↓ اپتوچین دیسک

↓

غیرھمولتیک↓

اسکولینبایل ↓

_ +

Coagulase Negative Staphylococci

S.aureus S. lugdunessis S.intermedius S,hycus

ساس_ +

GroA

استرپتوکوک غیر ھمولتیک

رشد در نمک ۵/۶%

↓ + _

حساس مقاوم

Streptococcus pneu

moniae

بایل اسکولین↓ _ +

GroupD Entrococcus SPP. ۵/۶رشد در نمک%

↓ Viridia

grou_ +

GroupD

Entro

Entrococcus SPP.

رم مثبت):شناسایی کوکسی هاي گ3-4(شکل

٦٧

آزمایش کاتاالز:

): کاتاالز مثبت(سمت چپ تصویر)، کاتاالز منفی(سمت راست تصویر)4-4(شکل هدف:

ــانواده هـــدف از ایـــن آز ــتافیلوکوك) از خـ ــیه (میکروکـــوك و اسـ ــانواده میکروکوکاسـ مـــایش جداســـازي خـ

استرپتوکوکاسیه می باشد. پایه و اساس آزمایش:

ــی ــد م ــین تولی ــوع توکس ــود دو ن ــی خ ــم طبیع ــیر متابولیس ــاري در مس ــوازي اختی ــی ه ــوازي و ب ــاي ه ــاکتري ه ب

O2)و رادیکال سوپر اکسید (H2O2)نمایند، پراکسید هیدروژن -).

این دسته از باکتري ها جهت خنثی سازي این توکسین ها ،دو آنزیم تولید می کنند .یکی از این آنزیم ها، کاتاالز

):4-4است که قادر است پراکسید هیدروژن (آب اکسیژنه) را به آب و اکسیژن (حباب گاز)تجزیه نماید (شکل

2H2O2 2H2O + O2 روش کار:

% مستقیماً روي کلنی قرار می گیرد.3ژن یک قطره از پراکسید هیدرو

٦٨

A B

محدودیت ها:

اگــر محــیط کشــت بــاکتري، بالدآگــار باشــد ممکــن اســت نتیجــه مثبــت کــاذب بــه دســت آیــد ،چــون گلبــول -1

هاي قرمز در تماس با آب اکسیژنه واکنش مثبت ضعیفی ایجاد می کنند.

ــا (خــانواده استرپتوکوکاســیه)، پراکســیدازي -2 ــد کــه خیلــی آهســته برخــی از انتروکــوك ه ــد مــی کنن تولی

پراکسید هیدروژن را می شکند و واکنش ضعیفی ایجاد می کند.

نتیجه:

خـــانواده میکروکوکاســـیه (اســـتافیلوکوك، میکروکـــوك) بـــا ایجـــاد حبـــاب هـــاي اکســـیژن، نتیجـــه مثبـــت و

استرپتوکوکوکاسیه با عدم ایجاد حباب یا واکنش بسیار ضعیف، نتیجه منفی خواهند داشت.

مایش حساسیت به باسیتراسین:آز

:حساسیت به باسیتراسین افتراق استافیلوکوك و میکرو کوك (هاله عدم رشد اطراف دیسک نشان A:5-4شکل

A : حساسیت به باسیتراسین افتراق استرپتوکوك گروهBدهنده حساسیت میکروکوك می باشد،).

٦٩

هدف:

ــه هــاي اســتافیل ــین درتشــخیص مــی باشــد،وکوك از میکروکوکهــا هــدف از ایــن آزمــایش ، تمــایز گون هــم چن

استفاده می شود.از سایرانواع (پیوژنز) Aاسترپتوکوك گروه پایه و اساس آزمایش:

). 5-4(شکل آنتی بیوتیک باسیتراسین سنتز دیواره سلولی باکتري ها را مهار می کند

ــار: ــه باسیتراســین، جهــت روش ک ــا و م بررســی حساســیت ب ــتافیلوکوك ه ــر روي اس ــا ب محــیط یکروکــوك ه

جهــت افتــراق انــواع اســترپتوکوك هــا کشــت بــر روي محــیط .مولرهینتــون آگــار کشــت داده مــی شــود

بالدآگار انجام می شود.

ــه 04/0ســپس یــک دیســک باسیتراســین (حــاوي ــرار داده و در گرمخان ــر روي کشــت ق واحــد باسیتراســین) را بC̊ 37 - ̊35 هــا اســترپتوکوك بــراي ( یمدهــ مــی قــرار ســاعت 18-24 مــدت بــه CO2 10 %- 5 نیــاز مــی%

باشد). محدودیت ها:

این آزمایش در شناسـایی انـواع اسـترپتوکوك هـا، خیلـی اختصاصـی نمـی باشـد. بـه طـوري کـه بـه جـز -1

ــروه ــترپتوکوك گـ ــروه A ،10اسـ ــاي گـ ــترپتوکوك هـ ــاي 5و Gو C% از اسـ ــترپتوکوك هـ %از اسـ

نشان می دهند. نیز به باسیتراسین حساسیت Bگروه

.همچنین نحوه نگهداري و تاریخ مصرف دیسک ، در نتایج مؤثر است و باید در نظر گرفته شود -2

نتیجه:

افتراق استافیلوکوك و میکروکوك: -1

میکروکوك ها به این آنتی بیوتیک حساس هستند و استافیلوکوك ها مقاوم می باشند.

٧٠

افتراق انواع استرپتوکوك ها: -2

B%از اســترپتوکوك هــاي گــروه 5و Gو C% از اســترپتوکوك هــاي گــروه A ،10اســترپتوکوك گــروه

حساس هستند ، که بـا آزمایشـات دیگـر افتـراق داده خواهنـد شـد .نتیجـه منفـی زمـانی اسـت کـه هالـه عـدم رشـد

وجود ندارد. آزمایش کواگوالز:

هدف:

ــوس از اســتافیلوکوك ــراق اســتافیلوکوك اورئ ــایش ،جهــت افت هــاي کواگــوالز منفــی اســتفاده مــی از ایــن آزم

).6-4شود(شکل

:آزمایش کواگوالز.6-4شکل

: کواگوالز آزادB:کواگوالز باند، شکل Aشکل

٧١

پایه و اساس آزمایش:

ــتافیلوکوك اورئــــوس دو شــــکل از آنــــزیم کواگــــوالز را تولیــــد مــــی کند..کــــه شــــامل کواگــــوالز اســ

ــد( ــ Clumping Factorبان ــوالز آزاد م ــاکتري اســت و ) و کواگ ــلول ب ــه س ــد متصــل ب ــد.کواگوالز بان ی باش

بررسی می شود. (Slide test)مستقیماً با فیبرینوژن واکنش می دهد و با روش آزمایش بر روي الم

بررســـی مـــی شـــود. کـــه در اثـــر عملکـــرد آنـــزیم (Tube test)کواگـــوالز آزاد بـــه روش آزمـــایش لولـــه

). 8-4برین) تشکیل می شود(شکلکواالگوالز بر روي فیبرینژن، لخته (فی

روش کار آزمایش کواگوالز آزاد:

ــاکتري را در ــی ب ــد کلن ــیله 5/0چن ــه وس ــوش (ب ــده خرگ ــق ش ــماي رقی ــر از پالس ــی لیت ــوط EDTAمیل ) مخل

C̊ 37-35ســـاعت در دمـــاي 4کـــرده تـــا یـــک امولســـیون شـــیري رنـــگ بـــه دســـت آیـــد. ســـپس بـــه مـــدت

ــذاري ــی گرماگ ــیم م ــس. کن ــاعت 4 از پ ــر س ــهل اگ ــکیل اي خت ــد، تش ــه نش ــاي در لول ــاق دم ــا ات ــاعت 24 ت س

.شود می بررسی لخته حضور مجدداً و نموده نگهداري

محدودیت ها:

ــد در ــه مــی توان ســاعت گرماگــذاري شــود 24ســاعت تشــکیل شــود و اگــر 4در آزمــایش کواگــوالز آزاد، لخت

ممکن است این لخته از بین برود.

٧٢

نتیجه:

ــه ــرین) نتیج ــه (فیب ــاد لخت ــوس و ایج ــتافیلوکوك اورئ ــط اس ــزیم توس ــن آن ــد ، ای ــی باش ــایش م ــن آزم ــت ای مثب

تعدادي دیگر از استافیلو کوك ها تولید می شود.

نتیجه منفی زمانی است که لخته مشاهده نشود. آزمایش همولیز:

هدف:

هدف تقسیم بندي انواع استرپتوکوك ها بر اساس نوع همولیز آن ها می باشد. مایش:پایه و اساس آز

-Oxygen)،اســـترپتولیزین O (Oxygen-labile)بـــاکتري هـــا بـــا تولیـــد مـــوادي ماننـــد اســـترپتولیزین

Stable) S و پراکســید هیــدروژن قــادر مــی باشــند ،گلبــول هــاي قرمــز محــیط بالدآگــار را لیــز نماینــد

ــ s).اســتریتولیزین 7-4(شــکل اســت هدهمشــال مقــاوم بــه اکســیژن مــی باشــد، در نتیجــه در کشــت ســطحی هــم قاب

کـه حسـاس بـه اکسـیژن اسـت در شـرایط بـی هـوازي عمـل مـی کنـد، بـه همـین جهـت در O.ولی استریپتولیزین

).7-4(عمقی) محیط بالدآگار عمل می کند(شکل Stabقسمت

٧٣

:همولیز گاما(عدم همولیز)C: همولیز بتا، شکل B:همولیز آلفا ، شکل Aشکل : انواع همولیز.7-4شکل روش کار:

) بــر روي پلیــت بــالد آگــار کشــت داده مــی شــود. بــه طــوري کــه 8-4(شــکل streak-stabبــاکتري بــه روش

ــه ایــن ترتیــب (stab) بــه صــورت عمقــی وارد محــیط کشــت مــی شــود لــوپپــس از مرحلــه نهــایی کشــت ، . ب

(حســاس بــه اکســیژن) فــراهم مــی گــردد. پلیــت در دمــاي Oمحــیط بــدون اکســیژن جهــت فعالیــت اســترپتولیزین C̊ 35 7 تا% 5 حضور در %CO2 ساعت گرماگذاري می شود. 24-48یا هواي معمولی به مدت

٧٤

براي مشاهده همولیز streak-stab: روش کشت 8-4شکل محدودیت ها:

ــه ــی ب ــوا ول ــاً کشــت در اتمســفر ه ــه همــین جهــت عموم ــد، ب ــزایش مــی یاب ــاهمولیز اف ــی هــوازي بت در اتمســفر ب

انجام می شود. Streak-stabروش نتیجه:

: لیـز جزئـی گلبـول هـاي قرمـز باعـث تولیـد رنـگ خاکسـتري مایـل بـه سـبز یـا متمایـل بـه قهـوه (α)همولیز آلفـا

اي در اطراف کلنی می شود.

: لیز کامل گلبول هاي قرمز باعث ایجاد یک هاله شفاف در زیر و اطراف کلنی می شود.(β)همولیز بتا :(NonHemolytic)غیر همولتیک

لیز گلبول قرمز انجام نمی گیرد و در نتیجه تغییري در زیر و اطراف کلنی ایجاد نمی شود.

٧٥

(CAMPT test)آزمایش کمپ

نام این آزمایش از حروف ابتداي اسامی ابداع کنندگان این روش گرفته شده است. هدف:

اســترپتوکوك هــا اســتفاده مــی (اســترپتوکوك آگاالکتیــه) از ســایر Bجهــت افتــراق اســترپتوکوك هــاي گــروه

شود.

مپ منفیک: B:کمپ مثبت شکل A:آزمایش کمپ : شکل 9-4شکل

پایه و اساس:

ــروتئین همولیتیــک خــارج ســلولی یباکتریهــایی کــه در ایــن آزمــایش نت ــایی تولیــد یــک پ ــد، توان جــه مثبــت دارن

(CAMP factor) ــ ــد در محــیط کشــت منتشــر شــود. اگــر ای ــد کــه مــی توان ــروتئین در مجــاورت را دارن ن پ

ــرار بگیــرد، اثــر همــولتیکی فــاکتور کمــپ تشــدید مــی شــود. در ایــن حالــت ــالیزین اســتافیلوکوك اورئــوس ق بت

ــه صــورت ــر آن کشــت دهیــد واکــنش مثبــت ب ــاکتري را در مجــاورت اســتافیلوکوك اورئــوس و عمــود ب اگــر ب

. )9-4شکل( یک کمان یا فلش که همولیز کامل دارد مشاهده می شود

٧٦

ش رو

ــزین را ــا لی ــد بت ــایی تولی ــالد آگــار یــک خــط از اســتافیلوکوك اورئوســی کــه توان ــر روي محــیط کشــت ب ب

دارد، کشت داده شـود. عمـود بـر ایـن خـط کشـت ، بـاکتري مـورد نظـر را کشـت داده ،بـه طوریکـه بـا خـط

ر تصــوی 8-4میلــی متــر فاصــله مناســب اســت) (شــکل 2کشــت اســتافیلوکوك اورئــوس تالقــی نداشــته باشــد (

ساعت گرماگذاري شود. 24به مدت 35-37 سمت راست) .در دماي

نتیجه

همـولیز بتـا یـا کامـل بـه شـکل کمـان یـا فلـش در محـل تقـاطع کشـت اسـتافیلوکوك اورئـوس و نتیجه مثبـت:

) 9-4استرپتوکوك (شکل

: عدم افزایش همولیز نتیجه منفی محدودیت ها:

ــه Aوه درصــد بســیار کمــی از اســترپتوکوك هــاي گــر نیــز ممکــن اســت واکــنش کمــپ مثبــت داشــته باشــند. ب

همین جهـت ایـن آزمـایش فقـط بـراي اسـترپتوکوك هـایی کـه همـولیز ندارنـد یـا همـولیز خیلـی ضـعیفی دارنـد

نزدیک می باشند ،انجام شود. Bو همچنین کلنی هایی که از نظر مورفولوژي به استرپتوکوك گروه

(Ethyl hydrocupreine hydro chloride)حساسیت به اپتوچین

پایه و اساس آزمایش:

.هدف:

شناسایی استرپتوکوکوس پنومونیه از سایر استرپتوکوك ها

٧٧

، مــی توانــد از رشــد برخــی بــاکتري هــا ممانعــت Aptaxآنتــی بیوتیــک اپتــوچین بــا تــداخل در عملکــرد آنــزیم

). 10-4نماید(شکل

ن: بررسی حساسیت به دیسک اپتوچی10-4شکل

:مقاوم به اپتوچینB:حساس به اپتوچین(استرپتوکوکوس پنومونیه)، شکل Aشکل

روش:

ــر روي محــیط بالدآگــار کشــت داده شــده ، ســپس یــک دیســک حــاوي ــاکتري ، ب ــی از ب ــی ســه کلن دو ال

اپتوچین بر روي کشت باکتري قرار داده می شود.

ــاي ــدت 5در حضــور 35 در دم ــه م ــربن ب ــید ک ــاع 18-24% دي اکس ــدم س ــه ع ــپس هال ــذاري و س ت گرماگ

زه گیري می شود.ارشد اطراف دیسک اند

محدودیت ها:

میلـی متـر مـی باشـد، بایـد بـا آزمـایش حاللیـت 14براي باکتري هـایی کـه قطـر هالـه عـدم رشـد آن هـا کمتـر از

صفرا جهت شناسایی استرپتوکوکوس پنومونیه بررسی شوند.

٧٨

نتیجه:

میلی متر، نتیجه مثبت در نظر گرفته می شود. 14هاله عدم رشدبزرگتر یا مساوي

نتیجه منفی زمانی است که هاله عدم رشد وجود نداشته باشد. آزمایش بایل اسکولین:

هدف:

ــروه ــا ي گ ــترپتوکوك ه ــا و اس ــراق انتروکــوك ه ــر گــروه Dافت ــدانس غی ــاي ویری ــترپتوکوك ه ــی Dاز اس م

باشد.

:پایه و اساس آزمایش

ت دیگـر غیـر از اسـترپتوکوك هـا و انتروکـوك هـا قـادر بـه رشـد در حضـور نمـک هـاي باکتري هاي گـرم مثبـ

ــه رشــد در حضــور نمــک هــاي صــفراوي( ــادر ب ــایی کــه ق ــاکتري ه ــد 4صــفرا نیســتند. ب %) هســتند و مــی توانن

ــا ســیاه (واکــنش اســکولتین و ــره ی ــد، ســبب ایجــاد رنــگ قهــوه اي تی ــدرولیز نماین ــه اســکولیتن هی اســکولین را ب

Fe3+ 11-4حیط کشت) در محیط کشت می شوند(شکلم.(

٧٩

: آزمایش بایل اسکولین11-4شکل

: منفیB:مثبت ، شکل Aشکل

روش کار:

ــاي ــود و در دم ــاکتري روي محــیط کشــت داده ش ــالص از ب ــی خ ــا دو کلن ــک ت ــدت 35-37 ی ــه م 48ب

ساعت گرماگذاري شود.

نتیجه:

ه در محیط، نتیجه مثبت براي این آزمایش می باشد.نتیجه مثبت :رشد باکتري و ایجاد رنگ سیا

نتیجه منفی :رشد باکتري و عدم ایجاد رنگ سیاه نتیجه منفی براي این آزمایش می باشد.

محدودیت ها:

برخی از باکتري ها ممکن است در این محیط رشد ضعیفی داشته باشند یا نتوانند رشد کنند.

٨٠

آزمایش تحمل نمک:

ــ ــایش جه ــن آزم ــدف: ای ــک ( ه ــاالي نم ــت ب ــل غلظ ــد و تحم ــایی رش ــی توان ــاکتري 5/6ت بررس ــط ب %) توس

% را دارنــد ،از 5/6اســتفاده مــی شــود. بــا ایــن روش انتروکــوك هــا کــه توانــایی رشــد در حضــور نمــک

استرپتوکوك هاي دیگر افتراق داده می شوند

پایه و اساس آزمایش:

ن را دارند.انتروکوك ها قدرت تحمل باالي نمک و رشد در حضور آ

روش:

ــاوي ــایع ح ــیط م ــاکتري در مح ــی از ب ــا دو کلن ــک ت ــاي 5/6ی ــیح ودر دم ــک تلق ــه 35-35-37 % نم ب

ساعت گرماگذاري شود.روزانه جهت مشاهده رشد باکتري بررسی شوند. 48مدت

نتیجه:

نتیجه مثبت: زمانی که کدورت رشد باکتري در محیط مشاهده شود.

رشد باکتري در محیط مشاهده نشود. نتیجه منفی: زمانی که کدورت

٨١

اروهاي ضد میکروبی (آنتی جلسه پنجم: بررسی سنجش حساسیت باکتري بیماري زا نسبت به د )بیوگرام

دستور کار :

تفسیر آزمایشات شناسایی باکتري جلسه چهارم -1

انجام آنتی بیوگرام براي باکتري شناسایی شده جلسه چهارم -2

٨٢

مراحل تشخیص بالینی و آزمایشگاهی بیماري هاي عفونی

نقش اولیه آزمایشگاه میکروب شناسی بالینی فراهم آوردن اطالعات براي پزشکان است ،تا به وسیله ایـن اطالعـات

-1که شامل پزشک بتواند بیماري عفونی را شناسایی و درمان کند. این اطالعات داراي دو قسمت بسیار مهم است

کدام آنتی بیوتیک اثرات درمانی مناسبی را فراهم می آورد. ایفاي صحیح این -2آیا یک عامل عفونی مطرح است

نقش مزایاي فراوانی را به همراه می آورد. به بیان دیگر انتخاب آنتی بیوتیکی که براي درمـان کـامال مناسـب باشـد

باعث می شود که موارد زیر کاهش یابد:

میزان مرگ و میر -1

٨٣

تعداد آزمایشات مورد نیاز -2

ICUتعداد روز هاي بستري شدن در -3

طول زمان دریافت درمان آنتی بیوتیکی -4

هزینه بیمارستان -5

بیشتر باکتري هاي بیماریزا می توانند فنوتیپ مقاومت نسبت به ترکیبـات ضـد میکروبـی را بـه دسـت آورده و بـروز

تفاوتی در ایجاد مقاومت به آنتی بیوتیک ها دخالت دارند.یافته هاي جدید نشان می دهند کـه دهند. مکانیسم هاي م

بعضی آنتی بیوتیک ها باعث افزایش موقت میزان موتاسیون در باکتري ها می گردند. بدین ترتیب آنتی بیوتیک ها

ه می توانند القا کننده ایجاد مقاومـت نیـز نه تنها به عنوان انتخاب کننده دسته هاي مقاوم باکتري فعالیت می کنند بلک

باشند.

، فـاکتور هـاي زیـادي بایـد مـد نظـر قـرار بگیـرد ،کـه تشـخیص در انتخاب آنتی بیوتیک مناسب براي درمان عفونت

ارگانیسم عفونی و یا حداقل حدس مستدل آن و نیز اطالعاتی در مورد حساسیت آن به آنتـی بیوتیـک هـا دو فـاکتور

آن است. سایر فاکتورها مربوط به بیمار مورد درمان است. این فاکتور ها شامل: اصلی و اولیه

سابقه واکنش جانبی به ماده ضد میکربی (مثل آلرژي به پنی سیلین) -1

سن بیمار -2

نابهنجاري هاي متابولیک و ژنتیکی بیمار -3

بارداري بیمار -4

عملکرد کبد و کلیه -5

٨٤

ت و سلول هاي میزبانمحل عفونت و انتشار آنتی بیوتیک در باف -6

وضعیت سیستم ایمنی بیمار -7

زایی و بیماریزایی باکتري عفونت -8

شدت بیماري -10

بنابراین میکرب شناس می تواند با بررسی آزمایشگاهی وضعیت مقاومت و یا حساسـیت بـاکتري جـدا شـده از نمونـه

نسبت به آنتی بیوتیک ها به کار عفونی کمک بزرگی نماید. روش هاي مختلفی که براي سنجش مقاومت باکتري ها

اولـین شـرکتی کـه تولیـد کننـده نامیـده مـی شـوند. می روند به نام سنجش حساسیت ضد میکروبی(آنتـی بیـوگرام)

را بر آن نهاد.» آنتی بیوگرام«نام تجاري ،مجموعه اي براي ارزیابی حساسیت باکتري ها به مواد ضد میکربی بود

حساسیت ضد میکروبیاستاندارد کردن آزمایش هاي به منظور جلوگیري از بروز خطا در آزمایشگاه و یا بین آزمایشگاه ها، روش هاي آزمایش باید کامالً استاندارد باشند.

رعایت استاندارد در موارد زیر ضروري است:

مقدار باکتري تلقیح شده -

ه می شود)هینتون آگار استفاد-نوع محیط کشت (در بیشتر موارد محیط کشت مولر -

، غلظت کاتیون ها، افزودنی هایی مانند خون و سرمPHشرایط محیط کشت ازنظر -

اتمسفر انکوباسیون -

دماي انکوباسیون -

٨٥

زمان انکوباسیون -

غلظت ماده ضد میکروبی -

به منظور سنجش حساسیت ماده ضد میکروبی روش هاي مختلفی وجود دارد کـه سـه روش آن در آزمایشـگاه هـاي

ینی بیشتر استفاده می شود که شامل:بال

)Disk Diffusion(انتشاراز دیسک -1

(Minimum Inhibitory Concentration: MIC)رقت سازي سریال -2

(E-test)انتشار گرادیانت -3

روش انتشار از دیسک:-1

مین جهت نام دیگر روش ارائه شد و به ه Bauerو Kirbyاین روش براي نخستین بار توسط دانشمندانی به نام هاي

است. در این روش از دیسک هاي کاغذي آغشته به آنتـی بیوتیـک اسـتفاده Kirby-Bauerانتشار دیسک، روش

می شود.

مراحل انجام آزمایش انتشار از دیسک: -الفده از یک لـوپ یـا کامل یا اولیه باکتري ،باید سوسپانسیونی از آن را آماده نمود. بدین منظور با استفا شناساییپس از

از قبـل سواب حداقل چهار کلنی مشابه از نمونه تعیین هویت شـده بـه یـک لولـه آزمـایش داراي سـرم فیزیولـوژي (

.استریل شده) منتقل می شود

٨٦

تعیین تقریبی تعداد باکتري موجود در سوسپانسیون: -بهاي اشتباه خواهـد شـد، اسـتفاده از تعـداد مناسـب به دلیل اینکه به کار بردن تعداد کم و یا زیاد باکتري منجر به یافته

باکتري مورد آزمایش بسیار مهم است. بنابراین باید پـس از آمـاده سـازي سوسپانسـیون بـاکتري از روش کـدورت سـنجی

استفاده کرده و تعداد تقریبی باکتري را در آن محلول مشخص نمـود. ایـن مرحلـه را در اصـطالح اسـتاندارد نمـودن تعـداد

و 1-5کتري می گویند. براي این منظور در آزمایشگاه ها از محلول استانـدارد نیم مک فارلند اسـتفاده مـی شـود (کـادر با

). بدین ترتیب سوسپانسیون باکتري را با مایع نیم مک فارلند مقایسه نموده و اگر از نظر کدورت مشابه هـم باشـند 1-5شکل

). بـراي CFU/ml 108 ×5/1بـاکتري وجـود دارد( 5/1×108یتر از سوسپانسـیون تعـداد ،به این معنا می باشد که در هر میلی ل

مقایسه کدورت این دو می توان از چشم غیر مسلح و یا از دستگاه هاي کدورت سنجی و یا اسپکتروفتومترنیز استفاده نمود.

: سوسپانسیون مک فارلند ترکیبي حاوي کلرید باریم و اسید سولفوریک است کھ در نسبت ھاي مختلف با ھم ١-٥کادرترکیب مي شوند. ترکیب این دو با ھمدیگر منجر بھ تشكیل محلولي کدر مي گردد. ھر چھ میزان کلرید باریم این

میزان کدورت بیشتر خواھد بود. مجموعھ بیشتر باشد

٨٧

کشت سوسپانسیون روي محیط کشت مناسب: -جحساسیت میکروبی ،عموما از محیط کشت مولر هینتون آگار استفاده می شود.در مورد باکتري هـاي براي انجام تست

تنظـیم زمـان از دقیقـه 15 مـدت ) می توان مواد افزودنی مانند خون به این محـیط اضـافه نمـود. در Fastidious( پرنیاز

چنـد نمـوده، سوسپانسیون حاوي لوله داخل ار سواب استریل کار این داده شود. براي کشت باید سوسپانسیون کدورت،

مولر سطح در گرفته شود. سواب آن اضافی مایع تا داده، فشار لوله داخلی دیواره به مایع سطح از چرخانیده و باالتر بار

رشـود. تکرا درجه، 60 به میزان بار هر پلیت، چرخاندن با )بار 3دیگر(در مجموع بار 2 باید کشت داده شودو آگار هینتون

بایـد سـواب پایـان مـی گـردد. در حاصـل اطمینان پتري ظرف سطح بر سوسپانسیون یکنواخت پخش از ترتیب، این به

).2-5آگاررا نیزکشت دهد(شکل خارجی حاشیه

مقایسھ كدورت لولھ حاوي سوسپانسیون باكتري با : ١-٥شكل لولھ نیم مك فارلند

٨٨

دیسک گذاري: -د. غلظت مناسب دارو حداکثر تا پانزده دقیقه پس از تلقیح باید دیسک هاي آنتی بیوتیکی را بر روي سطح آن قرار داد

تعیین شده و روي هر دیسک نوشته شده است. نـام آنتـی بیوتیـک هـا نیـز بـه صـورت CLSI براي هر دیسک قبالً توسط

). پس از کشت دادن بـاکتري دیسـک هـاي انتخـاب شـده در شـرایط 3-5اختصاري روي دیسک نوشته شده است (شکل

). دیسـک بایـد فقـط 4-5ت بر روي سطح آگار قرار داده می شـود (شـکل استریل و با استفاده از پنس به صورت کامالً تخ

یک بار با سطح آگار تماس یابد و از گذاشتن و برداشتن آنها خودداري کنید. پس از

گذاردن همه دیسک ها آنها را با کمی فشار ثابت کنید که با وارونه کردن پلیت از سطح آگار جدا نشوند.

دیسک ھاي حاوي آنتي بیوتیک. بھ حروف اختصاري آنتي بیوتیک و غلضت آن بر حسب میکرو گرم توجھ کنید. :٣-٥شکل

E ،اریترومایسین =N ،نئومایسین =AMیکاسین و = آمPپني سیلین =

از چپ بھ راست: سواب آغشتھ بھ باکتري را در : روش کشت جھت آنتی بیوگرام.٢-٥شکل مولر ھینتون آگار بکشید. بھ و در انتھا حاشیھ خارجی محیط ھت ھاي مختلف روي سطح ج

.صورتیکھ باکتري در تمام سطح آن پخش شود

٨٩

میلی متر (مرکز به مرکز) باشد. دیسک ها از دیواره پلیت نیز باید 15دیسک دیگر نباید کمتر از فاصله هر دیسک از

میلی متر فاصله داشته باشند. 12

انکوباسیون: -هپس از دیسک گذاري پلیت را نام گذاري نموده و آنرا در داخل انکوباتور قرار دهید. در مورد بسـیاري از ارگانیسـم

ساعت انجام می گردد. مواردي نیز به عنوان استثناء وجود دارد 18درجه سانتیگراد و زمان 35اسیون در دماي ها انکوب

انکوبه گردند. روش انتشار دیسک براي ارگانیسم هائی که به زمان زیـادي CLSIکه باید بر اساس قواعد استاندارد

براي رشد نیاز دارند مناسب نمی باشد.

تفسیر نتایج: -وپیش از خواندن نتیجه باید پلیت را از نظر رشد مناسب، هم گون و خالص بودن گونه باکتري بررسی کـرد (کلنـی هـا

باید یک شکل باشند). اگر هاله عدم رشد نامشخص و درهم باشد تکـرار آزمـایش الزم اسـت. در صـورت خـالص

). در مرحله اندازه 5-5آن انجام گیرد (شکل بودن کشت و نیز مشخص بودن هاله عدم رشد باید مراحل اندازه گیري

روش دیسک گذاری بر روي سطح :٤-٥شکل ط آگ

٩٠

گیري بدون باز کردن در پلیت و تنها از پشت پلیت و استفاده از خط کش (یا کـولیس) قطـر هالـه عـدم رشـد انـدازه

ارائه شده CLSIگیري و بر اساس میلی متر ثبت می شود. به منظور تفسیر این نتایج از جداول استانداردي که توسط

فاده می گردد. با استفاده از این جداول و اندازه قطر هاله عدم رشد هر داروي ضد میکروبی، باکتري در است، است

).1-5یکی از دسته هاي مقاوم، نیمه حساس و حساس قرار می گیرد (جدول

روش رقت سازي متوالی -2اشـد. در ایـن روش لولـه این روش بر اساس مواجهه باکتري جداشده با رقت هاي متوالی داروي ضد میکربـی مـی ب

آزمایشی که در آن باکتري رشد قابل مشاهده را ندارد (داراي کدورت نیسـت) داراي اهمیـت اسـت. غلظـت آنتـی

بیوتیک در این لوله به عنوان کم ترین غلظت آنتی بیوتیک که از رشد قابل مشاهده باکتري در شرایط آزمایشگاهی

Minimum Inhibitory Concentrationن غلظت به اصـطالح جلوگیري می کند در نظر گرفته می شود. ای

نامیده می شود. این روش اطالعاتی در مورد غلظت دقیق دارو در اختیار پزشک قرار مـی دهـد و او را در MICیا

انتخاب دقیق دارو و میزان مناسب آن راهنمایی می نماید.

: قطر هاله عدم رشد براي خانواده استافیلوکوك1-5جدول Susceptible

(S) Intermediate

(I) Resistant

(R) Antibiotic ≥29 ≤28 Ampicillin (10 μg) AMP

≥18 15-17 ≤14 Cefazolin (30 μg) CZ, CFZ

≥21 14-20 ≤13 Ceftriaxone (30 μg) CRO, CTR

≥21 16-20 ≤15 Ciprofloxacin (5 μg) CIP, CP ≥21 15-20 ≤14 Clindamycin (2 μg) CD, CC ≥23 14-22 ≤13 Erythromycin (30 μg) E, ERY ≥15 13-14 ≤12 Gentamicin (10 μg) GEM ≥18 14-17 ≤13 Kanamycin (30 μg) K

٩١

:روش انتشار گرادیانت -3باشـد. در ایـن روش غلظـت هـاي مـی انتشـار و سـازي رقیق روش دو از ) ترکیبیE.testروش انتشار گرادیانت (

بطور مستقیم MICمختلف یک ماده ضد میکروبی روي یک نوار (به صورت شیب غلظتی) تلقیح شده است و مانند روش

ی را به صورت کمی براي ما مشخص می کند. میکروبحساسیت ضد

مشخص مـی را بیوتیک آنتی به نبودن یا بودن حساس است فقط انتشار اساس بر که آگار دیفیوژن دیسک روش

اسـتفاده از غلظـت دلیـل بـه بیوتیکی آنتی مقاومت یا حساسیت مشخص شدن بر عالوه E.testروش در حالیکه در نماید

از پس روش نای هاي مختلف یک آنتی بیوتیک به صورت شیب غلظتی، میزان موثر آنتی بیوتیک را نیز نشان می دهد. در

نوارهـاي سـپس و نمـوده منتقـل آگـار هینتون مولر روي پلیت را آن فارلند مک نیم روش به باکتریایی تهیه سوسپانسیون

E.test 37در انکوباسـیون ساعت 24 از پس و داده قرار آگار بر روي بود بیوتیک آنتی نوع یک معرف کدام هر که را

) ،سپس با مراجعـه بـه جـداول ارائـه شـده 6-5بیضی شکل ایجاد می شود (شکلمثلثی یا بصورت رشدي عدم درجه منطقه

حساس، نیمه حساس و یا مقاوم بودن نسبت به آنتی بیوتیک مذکور مشخص می گردد. CLSIتوسط

افزایش علت بھ شكل مثلثي یا بیضی رشد عدم منطقھ : ایجاد٦-٥شکلرشد باکتري و نوار آنتي عدمیوتیک. تقاطع بین محل ھالھ آنتی ب

در MICرنگ نشان داده شده است بھ عنوان سفیدبیوتیک کھ با فلش

٩٢

جلسه ششم: کشت ادرار

ــراي ــاي) و مج ــوي، میزن ــه کلی ــا، لگنچ ــه ه ــانی (کلی ــراي ادراري فوق ــه دو بخــش مج ــتگاه ادراري ب ادراري دس

ــت ــار عفون ــد دچ ــی توانن ــتگاه م ــن دس ــزاء ای ــود.هریک از اج ــی ش ــیم م ــراي ادراري) تقس ــه و مج ــانی (مثان تحت

شوند.

ــه ــایی پرین ــاي باکتری ــاي (Perineal)میکروبیوت ــاکتري ه ــت، ب ــی اس ــه گوارش ــا لول ــاء آن ه ــاً منش ــه عموم ک

ــا ــن ب ــته از ای ــاً آن دس ــند. خصوص ــی باش ــتگاه ادراري م ــول دس ــاریزاي معم ــاي بیم ــه داراي فاکتوره ــا ک کتري ه

اتصال به سلول هاي اپی تلیال ادراري هستند و اتصال را تسهیل می کنند.

فاکتورهـــایی احتمـــال عفونـــت ادراري را افـــزایش مـــی دهنـــد، بـــراي مثـــال افـــرادي کـــه طـــوالنی مـــدت از

رنــد . بــاکتري هــا مــی کاتترهــاي ادراري اســتفاده مــی کننــد ، احتمــال بــاالتري بــراي عفونــت دســتگاه ادراري دا

ــی ــد ط ــی 5توانن ــی م ــزش جنس ــوند.همچنین آمی ــزه ش ــاي ادراري کلنی ــد کاتتره ــارجی مانن ــام خ روز در اجس

تواند ورود باکتري ها به مجراي ادراري زنان را تسهیل کند و احتمال عفونت ادراري را افزایش دهد. جمع آوري نمونه ادرار براي کشت:

ــاطی مجــراي اد ــاء مخ ــز غش ــه ج ــتگاه ادراري طبیعــی، ب ــد، دس ــی کن ــا را حمایــت م ــد میکروبیوت ــه رش رار ک

نــی مــی توانــد بــا بــاکتري هــاي کانــال واژینــال، پرینــه و یــا میکروبیوتــاي مجــراي hبــاکتري نــدارد. ادرار بــه آس

ــه عنــوان آلــودگی در ادرار محســوب مــی شــوند 1-6ادراري آلــوده شــود. جــدول فهرســت میکروبیوتــایی کــه ب

که بیماریزاي بالقوه دستگاه ادراري هستند را نشان می دهد. و آن هایی را

٩٣

:برخی ازباکتریهاي میکروبیوتا وپاتوژن هاي بالقوه مجراي ادراري1-6جدول

:(Midstream urine)نمونه ادرار میانی -الف

ــه روش ــانی ب ــه ادرار می ــاً جهــت کشــت ادرار، نمون ــع آوري Clean-catchعموم ــود. جم ــی ش ــع آوري م جم

بــا آلــودگی ،مســتعد هــا خــانم ، تناســلی–رار میــانی در خــانم هــا (بــه واســطه آنــاتومی دســتگاه ادراري اد

گــاز 2-3 بــا پرینـه و ادراري مجــراي اطـراف ناحیــه. دارد آمـوزش بــه نیــاز) باشـند مــی پرینـه و واژینــال ترشـحات

ــه آغشــته ــه جلــو ســمت از صــابون و آب ب ــ عقــب ب ــا ســرم تمی نمکــی اســتریل ز مــی گــردد. ســپس توســط آب ی

ــا ،دور ــاکتري ه ــراي ادراري از ب ــردن مج ــاك ک ــه ادرار جهــت پ ــر اولی ــی لیت ــد میل ــود. چن ــی ش ــو داده م شستش

ریخته می شود.

بخــش میــانی ادرار در یــک ظــرف دهانــه گشــاد اســتریل جمــع آوري شــده و درب آن کــامال بســته شــود. جهــت

ــه ادرار ــا، توصــیه مــی شــود نمون ــر میکروبیوت ــوگیري از تکثی ــال کــه حــاوي جل ــه هــاي انتق ــال در لول جهــت انتق

یک نگهدارنده هستند حمل شوند م یا سریعا کشت داده شوند.

٩٤

نیـاز بـه پـاك کـردن توسـط آب صـابون نمـی باشـد. ترجیحـًا تمیـز کـردن سـاده جمع آوري ادرار آقایـان:

ــ ــتریل جم ــانی در ظــرف اس ــد. ســپس ادرار می ــی کن ــت م ــع آوري کفای ــل از جم ع آوري محــل خــروج ادرار قب

می گردد.

معمــوالً ایــن دســتورات بــه صــورت یــک کــارت یــا تایــپ شــده در محــل جمــع آوري ادرار بایــد وجــود داشــته

ــا ــه آن ه ــات را ب ــتار نک ــا پرس ــروي کمکــی ی ــک نی ــد ی ــد ، بای ــد بخوانن ــی توانن ــه نم ــارانی ک ــراي بیم ــد، ب باش

آموزش دهد.

ــه ادرار توســط تعــداد کلنــی هــایی کــه روي محــیط کشــت رشــد مــی کننــد کنتــرل مــی دقــت جمــع آوري نمون

شوند.

ــا ــاکتري ی ــیچ ب ــوالً ه ــد معم ــت ادراري ندارن ــرادي کــه عفون ــه ادرار اف ــی 104 – 102در نمون ــر میل ــاکتري در ه ب

ــر ــر (CFU/ML)لیت ــا در ه ــاکتري ه ــداد ب ــونی تع ــاي عف ــه ه ــالی کــه در نمون ــد، در ح ــی کنن از ادرار رشــد م

شتر می باشد.باکتري یا بی 105 (CFU/ML)میلی لیتر

ســاعت پــس از جمــع آوري، کشــت داده شــوند، تــا بتــوان بــه تعــداد دقیــق 2نمونــه هــاي ادرار حــداکثر بایــد طــی

کلنی ها دست یافت. اگر زمان بیشتري براي انتقال نیاز می باشد باید از مواد نگهدارنده استفاده کرد.

):Catheter Collectionجمع آوري نمونه ادرار از کاتتر (-ب

ــه روش ــه جمــع آوري ادرار ب ــادر ب ــه بیمــارانی مــی شــود کــه ق ــه از کــاتتر محــدود ب -Cleanجمــع آوري نمون

catch ــاي ــاکتري ه ــال ورود ب ــون احتم ــرد ،.چ ــع آوري ک ــاتتر، ادرار جم ــد از ک ــان نبای ــد امک ــا ح ــتند. ت نیس

بیماریزا را باال می برد.

٩٥

شــرایط آســپتیک در نظــر گرفتــه شــود و چنــد میلــی در صــورت لــزوم نمونــه گیــري از کــاتتر ادراري ،حتمــاً بایــد

ــه، نبایــد از کیســه ادرار گرفتــه شــود. در کودکــان لیتــر ابتــداي ادرار کــاتتر بایــد دور ریختــه شــود. همچنــین نمون

ــه دســت ــه هــاي ب ــایج نمون جمــع آوري ادرار توســط کیســه ادراري رایــج مــی باشــد. در هــر صــورت تفســیر نت

ت خاص خود را دارد.آمده از کیسه هاي ادراري مشکال

):Supra pubic Aspirationجمع آوري نمونه ادرار از مثانه( -ج

) .در ایـن 1-6معموال این نـوع نمونـه گیـري بیشـتر بـراي نـوزادان و بچـه هـاي کوچـک اسـتفاده مـی شـود (شـکل

ه بــی روش بایــد مثانــه پــر باشــد. پــس از ضــد عفــونی کــردن پوســت در ناحیــه مثانــه، بــا تزریــق زیــر جلــدي مــاد

ــرنگ مخصــوص ــا س ــود. ب ــی ش ــیون ادرار م ــرنگ آسپیراس ــاده ورود س ــه آم ــر از ادرار 10حســی، ناحی ــی لیت میل

مثانــه آســپیره مــی شــود. ایــن نــوع نمونــه گیــري بــه علــت ایــن کــه روشــی تهــاجمی اســت، بنــدرت اســتفاده مــی

شود.

): جمع آوري نمونه ادرار از مثانه1-6(شکل

٩٦

کشت نمونه هاي ادراري:

بـراي کشـت اولیـه نمونـه ادرار، هـم محـیط هـاي انتخـابی و هـم غیـر انتخـابی مـورد نیـاز مـی باشـد. معمـوًال یـک

درصــد خــون گوســفند کفایــت مــی کنــد. توســط یــک 5پلیــت مــک کــانکی آگــار و یــک پلیــت بالدآگــار بــا

ــه میلــی لیتــر از ادرار را برداشــت نمــوده، در روي محــیط هــاي کشــت تلقــی 01/0کــالیبر شــده لــوپ ح نمــوده و ب

)نشان داده شده است ، کشت داده می شود. 2-6روشی که در شکل (

:روش کشت ادرار 2-6شکل

ــان ــم زم ــر باشــد ، ه ــق ت ــا دقی ــی ه ــن کــه شــمارش کلن ــراي ای ــا ب از 001/0و ml 01/0در برخــی آزمایشــگاه ه

35-37 ســـاعت در دمـــاي 24ادرار در پلیـــت هـــاي مجـــزا کشـــت داده مـــی شـــود. پلیـــت هـــا بـــه مـــدت

گرماگذاري می شوند.

٩٧

ــت ، ــرده در پلی ــد ک ــاکتري رش ــداد ب ــر تع ــوال اگ ــر( 105معم ــی لیت ــر میل ــاکتري در ه Colony Formingب

Unit ،ــه شــده ــوان عفونــت در نظــر گرفت ــا بیشــتر محاســبه شــود،به عن ــی ) ی ــه آنت شاســایی و بررســی حساســیت ب

بیوتیک ها انجام می شود.

ــین ــا ب ــی ه ــمارش کلن ــه ش ــامی ک ــا CFU/ML)Colony Forming Unit (105 – 104هنگ ــد ی ــی باش م

انـواع مختلفـی بـاکتري از یـک نمونـه ادرار رشـد کــرده اسـت، مسـئول آزمایشـگاه بایـد جهـت شناسـایی بــاکتري

ــا هــا و حساســیت آنتــی بیــوتیکی آن هــا ت صــمیم گیــري نمایــد. کشــت هــاي نمونــه هــاي کــاتتر و ســوپراپوبیک ب

از باســیل هــاي گــرم منفــی CFU/ML 102هـر تعــداد بــاکتري بــه دقــت پیگیــري و بررســی مــی شــوند. همچنــین

ــر صــورت ــد. در ه ــت باش ــائز اهمی ــد ح ــی توان ــاد، م ــندرم ادراري ح ــت س ــاي داراي عالم ــانم ه روده اي در خ

در شمارش هاي پایین کشت ادرار باید در نظر گرفته شود.بررسی آلودگی نمونه ادرار

مشاهده میکروسـکوپی نمونـه ادرار سـانتریفیوژ نشـده، مـی توانـد بـه تفسـیر نتـایج کشـت کمـک کنـد، بـه طـوري

ــدود ــمارش ح ــداقل ش ــود، ح ــده ش ــاکتري دی ــک ب ــکوپی ی ــر صــفحه میکروس ــر در ه ــه اگ CFU/ML 105ک

خواهد بود.

کـــه مـــی تواننـــد حضـــور نیتریـــت در ادرار را نشـــان دهنـــد (نشـــانه عفونـــت بـــا همچنـــین از نوارهـــاي ادراري

انتروباکتریاســه هــا) اســتفاده نمــود. البتــه نتــایج مثبــت کــاذب در ایــن روش مشــاهده مــی شــود ، کــه بایــد در نظــر

گرفته شود. (Pyuria)آزمایش غربالگري براي پیوریا

مـی باشـد،که یکـی از علـت هـاي آن ،عفونـت باکتریـایی پیوریا ، بـه معنـاي حضـور گلبـول هـاي سـفید در ادرار

ادرار می باشد.

٩٨

ــد LEآزمــایش (لوکوســیت اســتراز) کــه توســط لوکوســیت هــاي پلــی مورفونــوکلئر تولیــد مــی شــود، مــی توان

توسط یک نـوار ادراري بررسـی شـود. ایـن آزمـایش جهـت بررسـی رونـد التهـابی انجـام مـی شـود .نتـایج مثبـت

درار حــاوي مقــادیر زیــادي اســید اســکوربیک، آلبــومین، پــاك کننــده هــا و یــا کــاذب در مــواردي کــه ا

نگهدارنده باشند، مشاهده شود.

ــین ــا ب ــل ه ــداد نوتروفی ــه تع ــانی ک ــز، زم ــاذب نی ــی ک ــوارد منف High Power Field (/HPF10- 5 (م

است، مشاهده می شود.

ا را مشــخص کنــد، خصوصــاً وقتــی بهتــر از شـمارش نوتروفیــل هــا مــی توانــد پیوریـ LEدر هـر صــورت آزمــایش

فاصله بین نمونه گیري ادرار و آزمایش زیاد باشد.

٩٩

جلسه هفتم : باسیل ها و کوکوباسیل هاي گرم منفی

دستور کار:

تفسیر کشت ادرار -1

تهیه گسترش و رنگ آمیزي گرم از کلنی هاي کشت ادرار -2

انجام آزمایش کاتاالز و اکسیداز -3

ی روي محیط مکانکی آگار .کشت باسیل گرم منف -4

کشت نقطه اي کلنی باسیل گرم منفی در محیط نوترینت آگار -5

کشت کلنی باسیل گرم منفی در محیط کلیگلر آیرون آگار -6

SIMکشت کلنی باسیل گرم منفی در محیط -7

(دو لوله)MR-VPکشت کلنی باسیل گرم منفی در محیط -8

آگار کشت کلنی باسیل گرم منفی در محیط سیمون سیترات -9

کشت کلنی باسیل گرم منفی در محیط اوره -10

١٠٠

:تقسیم بندي باکتریهاي گرم منفی براساس شکل آنها در رنگ آمیزي گرم 1-7نمودار

ــه باســیل هــا و کوکوباســیل هــاي گــرم منفــی، دســته بزرگــی از باکتریهــا را شــامل مــی شــوند، کــه مــی تواننــد ب

ــا ــده، اشــکال متفــاوتی مشــاهده شــوند: باســیل هــایی ب ــر، باســیل هــاي خمی ــدازه متغی ــذیري ضــعیف و ان رنــگ پ

). بــاکتري هــاي ایــن دســته بــا اســتفاده 1-7باســیل هــاي معمــولی (صــاف و کشــیده) و یــا کوکوباســیل هــا(نمودار

از خصوصیات بیوشیمیایی در خانواده هاي متفاوت طبقه بندي می شوند.

یعنـی انتروباکتریاسـه و باسـیل هـاي گـرم منفـی غیـر در این بخـش بـه شناسـایی دو گـروه بـزرگ از ایـن باکتریهـا

تخمیري می پردازیم.

١٠١

(Maccankey Agar)کشت در محیط مک کانکی آگار

: کشت در محیط مک کانکی آگار1-7شکل

هدف :

وباکتریاسه ها می باشد. هدف از این کشت جداسازي باکتري هاي گرم منفی و افتراق انتر

پایه و اساس :

ــاري مــی باشــد. ایــن ــی هــوازي اختی ــراي باســیل هــاي گــرم منفــی هــوازي و ب یــک محــیط انتخــابی و افتراقــی ب

ــتال ــگ کریس ــی ، رن ــز خنث ــرف قرم ــوز، مع ــدیم، الکت ــفراوي، کلرورس ــاي ص ــروتئین ، نمکه ــاوي پ ــیط ح مح

نمـک هـاي صـفراوي و کریسـتال دیولـه مـی باشـد کـه ویوله و آگار اسـت.انتخابی بـودن محـیط بـه علـت وجـود

از رشد باکتري هاي گرم مثبت جلوگیري می کند و اجازه رشد به باسیل هاي گرم منفی می دهد.

١٠٢

افتراقــی بــودن محــیط بــه علــت وجــود قنــد الکتــوز مــی باشــد . انــواعی کــه قادرنــد الکتــوز را تخمیــر نماینــد، بــه یط کشــت ،کلنــی هــاي صــورتی یــا قرمــز تولیــد کــرده و از انــواعی علــت ایجــاد اســید و تغییــر رنــگ معــرف محــ

) . 1-7که الکتوز را تخمیر نمی کنند و کلنی هاي بی رنگ دارند متمایز می شوند (شکل

روش :

بـــه 35-37مقـــداري از نمونـــه بـــالینی یـــا کلنـــی بـــاکتري را در ســـطح محـــیط ، کشـــت داده و و در دمـــاي د.ساعت گرما گذلري می شو 18-24مدت

نتیجه :

مشاهده کلنی در سطح محیط کشت ،توانایی رشد باکتري در این محیط را نشان می دهد.

). 1-7توانایی تخمیر الکتوز با تشکیل کلنی به رنگ صورتی یا قرمز مشخص می شود(شکل

). 1-7عدم توانایی تخمیر الکتوز با تشکیل کلنی بی رنگ مشخص می شود(شکل

آزمایش اکسیداز :

: آزمایش اکسیداز،رنگ ارغوانی تصویر سمت چپ نتیجه مثبت را نشان می دهد. 2-7شکل

١٠٣

هدف:

تعیــین حضــور ســیتوکروم اکســیداز، جهــت شناســایی انتروباکتریاســه (اکســیداز منفــی) از ســایر باســیل هــاي گــرم

منفی

پایه و اساس:

ــل ــاده تترامتیــ ــیداز، مــ ــیتوکروم اکســ ــور ســ ــورت حضــ ــارافنیلن دي آ -در صــ ــد پــ ــین دي هیدروکلرایــ مــ

)Tetramethyl-P-phenylene diamine dihydrochlorideشــده و تبــدیل بــه مــاده ) اکســید

اندوفنل (ارغوانی تیره) می شود. در صورت عدم حضور اکسیداز تغییر رنگی وجود ندارد.

روش :

ــاکتري بــر روي دیســک ــا پالتینــی مقــداري از کلنــی ب ــا اســتفاده از یــک ســواپ چــوبی ی % 1کاغــذي (حــاويب

ــی در ــیح کلن ــل تلق ــگ در مح ــر رن ــی تغیی ــته شود.بررس ــد) گذاش ــین هیدروکلرای ــارافنیلن دي آم ــل پ 10تترامتی

ثانیه بررسی گردد.

نتیجه :

) 2-7ایجاد رنگ ارغوانی تیره در محل تلقیح کلنی (شکلمثبت:

) 2-7عدم تغییر رنگ در محل تلقیح کلنی (شکلمنفی:

١٠٤

محدودیت ها :

ــا آهــن ســبب ایجــاد نتیجــه ي مثبــت کــاذب آزمــایش مــی اســت ــا جــنس کــروم ی فاده از وســیله برداشــت کلنــی ب

شود.

):Swarming phenomenonپدیده سوارمینگ (

پدیـده ســوارمینگ کــه در برخـی از باکتریهــا مشــاهده مــی شـود ،نتیجــه تولیــد یــک الیـه نــازك از رشــد بــاکتري

ــه ــر روي محــیط آگــار مــی باشــد کــه ب ــن متحــرك ب ــواجی در محــیط گســترده مــی شــود. مرکــز ای صــورت ام

).3-7امواج محل تلقیح اولیه باکتري می باشد(شکل

): پدیده سوارمینگ در محیط کشت بالدآگار3-7(شکل

هدف:

بررسی پدیده سوارمینگ .

١٠٥

پایه واساس آزمایش:

یـد کشـت نقطـه اي پروتئـوس در یکی از پدیده هایی که به تشخیص جنس پروتئوس کمک شایان توجهی می نماسطح پلیت حاوي ژلوز ساده یا بالد آگار است که با تشکیل پرده اي مواج ( پدیده سوارمینگ) خود را نمایـان مـی

) .3-7سازد (شکل

روش کار:

ــا اســتفاده از ــوپب ــاي ل ــه صــورت نقطــه اي در پلیــت کشــت داده و در دم ــاکتري برداشــت نمــوده وب -37از ب ساعت گرما گذلري می شود. 18-24به مدت 35

نتیجه:

).3-7مشاهده حرکت موجی در محیط کشت آگار نتیجه مثبت محسوب می شود (شکل

): KIAکشت در محیط کلیگلرآیرون آگار( این آزمایش جهت افتراق اعضاي خانواده انتروباکتریاسه از سایر باسیل هاي گرم منفی استفاده می شود.

ط کلیگلر آیرون آگار: کشت در محی4-7شکل

١٠٦

A ،اسید/اسید،گاز مثبت:H2S منفی B ،قلیا/اسید،گاز مثبت :H2S منفی

C ،قلیا/اقلیا،گاز منفی :H2S منفیDمحیط بدون تلقیح باکتري:

هدف:

ده می شود. استفا H2Sوتولید (CO2)این محیط جهت بررسی تخمیر گلوکز، الکتوز، تولید گاز

پایه و اساس:

ــزان ــه می ــوز ب ــامل الکت ــیط ش ــب مح ــک 10ترکی ــدها) فری ــر قن ــرف تخمی ــل رد (مع ــون، فن ــوکز، پیت ــر گل براب

آمونیوم سیترات و سدیم تیوسولفات می باشد.

ــده و 12-8در ــل ش ــید حاص ــوکز، اس ــر گل ــورت تخمی ــیط، در ص ــن مح ــاکتري در ای ــت ب ــس از کش ــاعت پ س

بــه رنــگ زرد تغییــر رنــگ مــی دهــد. رنــگ زرد حاصــل در عمــق لولــه بــاقی مــی معــرف فنــل رد از رنــگ قرمــز

جهــت تخمیــر مهیــا مــی (An aerobic)مانــد، بــه ایــن علــت کــه در عمــق محــیط کشــت شــرایط بــی هــوازي

). B 7 -4و Aباشد( شکل

رنــگ زرد در بخــش شــیب دار محــیط بــه علــت اکســید شــدن محصــوالت حاصــل از تخمیــر، پایــدار نمــی باشــد.

ــر رنــگ حاصــل تشــکیل ایــن ــایی مــی H2O, CO2تغیی ــه آمــین هــاي قلی و اکســید شــدن پیتونهــا در محــیط ب

باشد.

١٠٧

اگـر بــاکتري عـالوه بــر گلــوکز بتوانـد الکتــوز را تخمیــر نمایـد، مقــادیر زیــاد محصـوالت تخمیري(اســید)، رنــگ

).. A 7 -4شــکل قلیــایی بخــش شــیب دار را خنثــی نمــوده و تغییــر رنــگ زرد را در ایــن بخــش خــواهیم داشــت(

ساعت باید بررسی شوند. 18-24نتایج محیط کشت طی

ــود( شــکل CO2تشــکیل ــی ش ــایی در محــیط کشــت مشــخص م ــا شــکاف ه ــا ی ــه صــورت حبابه ). A 7 -4ب

تولیــد مــی شــود بــا فریــک H2Sنیــز بــه صــورت رنــگ ســیاه در محــیط مشــخص مــی شــود. وقتــی H2Sتشــکیل

ــب ــد ترکی ــیترات واکــنش داده و تولی ــوم س ــی شــود( شــکل آمونی ــگ م ــیاه رن ــن س ــولفید آه ــن B 7 -4 س ). ای

واکنش نیازمند شرایط اسیدي می باشد، پس حتماً در این بخش از محیط تخمیر صورت گرفته است.

روش :

)از یــک کلنــی خــالص برداشــت شــده و ابتــدا از حــد فاصــل قســمت عمقــی و Needleبــه وســیله یــک نیــدل (

ــه صــورت عمقــی وارد م ــدل را ســطحی محــیط کشــت، ب ــه، نی ــه عمــق لول حــیط کشــت شــده و قبــل از رســیدن ب

) .در محــیط کشــت 5-3خــارج کــرده و در ســطح شــیب دار بــه صــورت مــارپیچی کشــت داده مــی شــود (شــکل

ساعت گرماگذاري می کنیم. 18-24، به مدت 35 -37را بسته در دماي

نتیجه :

از قنـد توسـط بـاکتري مـی باشـد، بـه صـورت سطح قلیایی و عمـق بـدون تغییـر رنـگ نشـان دهنـده عـدم اسـتفاده

K/K (Alkeline/ Alkaline) گزارش می شود. (شکل C 7-4 . (

١٠٨

ــورت ــه ص ــد و ب ــی باش ــوز م ــر الکت ــدم تخمی ــوکز و ع ــر گل ــده تخمی ــان دهن ــیدي نش ــق اس ــایی و عم ــطح قلی س

(Alkaline/ Acid) K/A گزارش می شود( شکل B 7 -4.(

گــزارش A/Aتخمیــر گلــوکز و الکتــوز مــی باشــد و بــه صــورت ســطح اســیدي و عمــق اســیدي نشــان دهنــده

).A 7 -4می شود( شکل

).A 7 -4می باشد( شکل CO2ایجاد حباب یا شکاف معرف تولید

). B 7 -4 می باشد. ( شکل H2Sمشاهده رنگ سیاه در عمق محیط کشت معرف تولید

: SIMکشت در محیط

.SIM: محیط 5-7شکل

یک محیط نیمه جامد می باشد که براي آزمایشات زیر استفاده می شود.

١٠٩

آزمایش اندل:

هدف:

این آزمایش جهت تعیین توانایی تولید آنزیم تریپتوفاناز توسط باکتري استفاده می شود.

پایه و اساس:

ــود درم ــان موج ــدیل تریپتوف ــایش تب ــن آزم ــان در ای ــود. تریپتوف ــی ش ــی م ــدل بررس ــب ان ــه ترکی ــیط کشــت ب ح

ــواکس ــرف ک ــد. مع ــی نمای ــدل م ــاك و ان ــرووات، آمونی ــد پی ــده و تولی ــدرولیز ش ــاز هی ــزیم تریپتوفان توســط آن

(Dimethylamine- benzaldehyde – hydrochloride) مـــی توانـــد بـــا ترکیـــب انـــدل واکـــنش

داده و ایجاد رنگ قرمز می نماید.

روش:

ــط ن SIMیــدل از کلنــی خــالص بــاکتري برداشــت نمــوده و در راســتاي یــک خــط راســت درمحــیط توس

ــاي ــود). در دم ــاي محــیط وارد نمــی ش ــا انته ــدل ت ــود و نی ــی ش ــار انجــام م ــود ( کشــت یکب ــی ش کشــت داده م

قطــره معــرف کــواکس بــه 1-2ســاعت گرماگــذاري شــده و ســپس بــا افــزودن 18-24، بــه مــدت 35 -37

). 5-7اندل بررسی می شود(شکل محیط کشت ، تولید

نتیجه

) A 7-5 ایجاد رنگ صورتی یا قرمز (با افزودن معرف کواکس) (شکلمثبت:

) B7-5عدم تغییر رنگ محیط با افزودن معرف کواکس (شکلمنفی:

١١٠

آزمایش حرکت: هدف :

هدف از این آزمایش بررسی متحرك بودن باکتري می باشد.

محیط نیمه جامد و بررسی حرکت : کشت در 6-7شکل

پایه و اساس :

باکتري در مرکـز محـیط کشـت نیمـه جامـد بـه صـورت یـک خـط ، تلقـیح مـی شـود. بـاکتري کـه متحـرك مـی

ــا تمــام محــیط کــدورت ــد و در اطــراف خــط کشــت وی ــه ســمت خــارج نفــوذ مــی کن باشــد، از خــط کشــت ب

ایجاد می نماید.

١١١

روش :

ــاکت ــی خــالص ب ــدل از کلن SIMري برداشــت نمــوده و در راســتاي یــک خــط راســت درمحــیط توســط نی

کشــت داده مــی شــود ( کشــت یکبــار انجــام مــی شــود و نیــدل تــا انتهــاي محــیط وارد نمــی شــود). در دمــاي

ــه مــدت 35 -37 ــه 18-24، ب ــاکتري قابــل مشــاهده نباشــد ،ب ســاعت گرماگــذاري شــده و اگــر رشــد ب

ی می شود. روز گرماگذاري شده و روزانه بررس 7مدت

نتیجه :

) 6-7شکل : رشد باکتري فراتر از خط کشت (مثبت

) 6-7شکل : باکتري غیرمتحرك در خط کشت رشد کرده و باقی می ماند. (منفی

:محدودیت ها

ــی ــراي بررس ــی ب ــات تکمیل ــه آزمایش ــین جهــت ب ــه هم ــد، ب ــی دهن ــان نم ــافی را نش ــد ک ــا رش برخــی از باکتریه

حرکت، نیاز می باشد.

نکته:

.توسط باکتري می باشد H2Sهمچنین تشکیل رنگ سیاه، نشان دهنده تولید SIMدر محیط

١١٢

: MR_VPآزمایش

منفیB: MRمثبت ، MR_VP . A: MR :7-7شکل

C: VP ، مثبتD: VP منفی

هدف :

ــایش ــدف از آزمـ ــانواده _VP)Voges Proskauer (Methyl Red (MR)هـ ــاء خـ ــراق اعضـ افتـ

انتروباکتریاسه می باشد.

١١٣

پایه و اساس:

ایــن آزمــایش جهــت تعیــین توانــایی بــاکتري بــراي تولیــد محصــوالت خنثــی از تخمیــر گلــوکز (ماننــد اســتوئین)

،تولیداسید از گلوکزو بقاء باکتري در این شرایط استفاده می شود.

(اســیدیته) PH، کـه ســبب کــاهش آزمـایش متیــل رد، تولیــد اسـید مخلــوط را در نتیجــه تخمیــر بررسـی مــی کنــد

به رنگ زرد می باشد. PH= 2/6، به رنگ قرمز و در PH= 4/4محیط می شود. معرف متیل رد در

). A 7-7و B شکل( در نتیجه رنگ زرد، واکنش منفی و رنگ قرمز نشان دهنده واکنش مثبت است

طیف رنگ نارنجی، نشان دهنده واکنش منفی است.

ــه اســتوئین و ، تبــدیل VPآزمــایش ــدیول تعیــین مــی کنــد. باکتریهــایی کــه از 3-2محصــوالت اســیدي را ب بوتان

ــا VPمســیر ــادر نیســت ب ــد کــه ق ــراهم مــی نماین ــوکز ف ــر گل ــاچیزي اســید از تخمی ــد، مقــادیر ن اســتفاده مــی کنن

ــرف ــل( MRمع ــا نفت ــام آلف ــه ن ــرف ب ــک مع ــد. ی ــاد کن ــز ایج ــگ قرم ــب آن Alpha- naphtol، رن )و متعاق

ــز ایجــاد VPپتاســیم، جهــت بررســی مســیر هیدروکســید ــات بااســتوئین رنــگ قرم اســتفاده مــی شــود،این ترکیب

). C 7-7 شکلمی نمایند(نتیجه مثبت) (

:روش

ــوپتوســط ــاکتري (کشــت ل ــی خــالص ب ــه از محــیط 24از یــک کلن ــه دو لول تلقــیح شــده MR-VPســاعته) ب

ــاي ــدت 35-37 ودر دم ــه م ــداقل ب ــود. ا 48ح ــذاري ش ــاعت گرماگ ــایج کشــت س ــر نت ــاعته واضــح 48گ س

١١٤

روز توصــیه مــی شــود. همچنــین مــی تــوان همزمــان 5-4نبــود، کشــت مجــدد در محــیط و گرماگــذاري بــه مــدت

نیز انجام شود. 25کشت در

میلــی لیتــر از محــیط اضــافه شــود و فــوراً نتیجــه 5بــه ازاي MRقطــره معــرف MR ،6-5جهــت آزمــایش

خوانده شود.

ــراي آزمــایش ــه VPب ــدا 1ازاء هــر ، ب ــر از محــیط کشــت ابت ــل وســپس 6میلــی لیت قطــره 2قطــره معــرف آلفانفت

دقیقه خوانده شود. 5هیدروکسید پتاسیم اضافه شود، محیط و معرف کامالً مخلوط گردند و نتیجه تا

نتیجه:

:MRآزمایش

).A 7-7 شکل: حضوررنگ قرمز پس از افزودن معرف (مثبت

).B 7-7 شکلن معرف (: رنگ زرد پس از افزودمنفی

: طیف رنـگ نـارنجی نشـانگر نتیجـه منفـی مـی باشـد ولـی نـارنجی متمایـل بـه قرمـز مـی توانـد نشـان دهنـده نکته

نتیجه مثبت ضعیف باشد.

: VPآزمایش

).C 7-7 شکلرنگ قرمز پس از افزودن معرف ( حضورمثبت:

).D 7-7 شکلمی باشد(رنگ زرد پس از افزودن معرف نشان دهنده نتیجه منفی منفی:

١١٥

محدودیت ها:

ســاعت گرماگــذاري خوانــده شــود. چــون ممکــن اســت اســید بــه انــدازه کــافی 48نبایــد قبــل از MRآزمــایش

ــاي ــاکتري ه ــا ب ــد نشــده باشــد و ی ــتوئین MRتولی ــه اس ــه ب ــدیل محصــوالت اولی ــراي تب ــی فرصــت کــافی ب منف

نداشته باشند و مثبت کاذب شوند.

باید همراه با آزمایشات دیگر براي افتراق اعضا انتروباکتریاسه استفاده شود. MR- VPنتایج آزمایش

آزمایش استفاده از سیترات:

: آزمایش سیترات8-7شکل

١١٦

: هدف

هــدف از ایــن آزمــایش بررســی توانــایی بــاکتري در اســتفاده از ســیترات بــه عنــوان تنهــا منبــع کــربن و اســتفاده از

ــه ــوم ب ــوان خــانواده نمــک هــاي آمونی ــایش مــی ت ــا اســتفاده از ایــن آزم ــروژن مــی باشــد. ب ــع نیت ــوان تنهــا منب عن

ــانواده ــن خ ــاء ای ــایی اعض ــین در شناس ــراق دادو همچن ــی افت ــرم منف ــاي گ ــاکتري ه ــایر ب ــه رااز س انتروباکتریاس

کمک می کند.

پایه و اساس :

ات پرمــه آز تولیــد مــی کننــد کــه بــاکتري هــایی کــه قادرنــد روي ایــن محــیط رشــد کننــد، آنزیمــی بــه نــام ســیتر

ــی ــد م ــرژي تولی ــاکتري شــده و ان ــرووات وارد چرخــه متابولیســم ب ــد. پی ــدیل مــی کن ــرووات تب ــه پی ســیترات را ب

کند.

باکتریهــایی کــه قادرنــد در ایــن محــیط رشــد و ســیترات را مصــرف کننــد و همچنــین قادرنــد فســفات آمونیــوم را

PHماینــد، ســبب قلیــایی شــدن محــیط کشــت مــی شــوند. در ایــن بــه آمونیــاك و هیدروکســید آمونیــوم تبــدیل ن

-A 7معرف بـرم تیمـول بلـو موجـوددر محـیط کشـت از رنـگ سـبز، بـه رنـگ آبـی تغییـر رنـگ مـی دهد(شـکل

8 .(

روش :

ــوپتوســط ــاکتري (کشــت ل ــی خــالص ب ــر روي محــیط ســیمون ســیترات 24کمــی از کلن ســاعته) برداشــت و ب

ــود. در دمــاي ــار کشــت داده ش ــدت 35-37 آگ ــیط کشــت، 7بــه م ــه مح روز گرماگــذاري شــودو روزان

جهت رشد و تغییر رنگ بررسی شود.

١١٧

نتیجه :

).A 7-8رشد روي محیط کشت با تغییر رنگ و بدون تغییر رنگ (شکلمثبت:

).B 7-8: عدم رشد در روي محیط کشت (شکلمنفی

:محدودیت ها

ولــی تغییــر رنــگ ایجــاد نمــی کننــد. در ایــن مــوارد برخــی باکتریهــا قــادر بــه رشــد روي محــیط کشــت هســتند،

رشد باکتري به عنوان نتیجه مثبت تلقی می شود. آزمایش اوره آز:

:آزمایش اوره آز 9-7شکل

هدف:

این آزمایش جهت تعیین تولید آنزیم اوره آز توسط باکتري استفاده می شود.

١١٨

پایه و اساس:

هاي آمینه می باشد. اوره محصول دکربوکسیالسیون اسید

و آمونیــاك مـی شــود. آمونیــاك ســبب قلیــایی شـدن محــیط کشــت مــی شــود. CO2هیـدرولیز اوره ســبب تولیــد

ــر ــن تغیی ــد ای ــی توان ــل رد م ــرف فن ــل رد در pHمع ــد. فن ــان ده ــن در PH=6.8را نش ــارنجی روش ــگ ن ــه رن ب

PH=8.1 ــزیم اوره ــه تولیــد آن ــادر ب ــاکتري کــه ق ــه رنــگ صــورتی مــی باشــد. ب آز باشــد ،ســبب تغییــر رنــگ ب

). 9-7ساعت می شود(شکل 24محیط اوره به رنگ صورتی در مدت

روش:

ســاعته) برداشــت و بــه محــیط اوره تلقــیح مــی شــود. در 24توســط فیلــد پالتــین از کلنــی خــالص بــاکتري (کشــت

روز 7ســـاعت الـــی 48بـــه مـــدت 35-37 محـــیط کشـــت را بســـته (کمـــی در بازبمانـــد) و در دمـــاي

گذاري شود. گرما

نتیجه:

) A 7-9تغییر رنگ محیط به رنگ صورتی (شکلمثبت:

)B 7-9عدم تغییر رنگ (شکلمنفی:

محدودیت ها:

بـه علـت اینکـه ایـن واکـنش ممکـن اسـت زمـان طــوالنی نیـاز داشـته باشـد، امکـان دارد، پیتـون یـا سـایر پــروتئین

ت کاذب حاصل شود.محیط را افزایش دهندو نتیجه مثب PHها استفاده شده و

١١٩

MAC رشد روي محیط

-

یلوس،پاستورال فھمو و...

+

گنمیسوار

+

پروتئوس

-

تخمیر گلوکز در /اکسیداز KIA

±/+

،روموناسئآ

،پلزیوموناس

،ھایویبروبرخی

برخی پسودوموناس

ھا

-/-

برخی باسیل ھای ،ری یخمتغیر

،وباکتراسینتاستئوتروفوموناس

و

-+/

انتروباکتریاسھ

١٢٠

) :تقسیم بندي اولیه باسیل هاي گرم منفی2-7(نمودار

اوره حرکت سیترات KIA Indoe MR VPنام باکتري

A/A اشرشیاکلی

Gas+

H2S-

+ + - - + -

K/A شیگال

Gas-

H2S-

- + - - - -

A/A انتروباکتر

Gas+

H2S-

- - + + + -

K/A پروتئوس

Gas-

H2S+

/+- + /+- /+- + +

باسیل گرم منفی ،اکسیداز منفی ، تخمیرکننده گلوکز :اطالعات الزم جهت شناسایی1-7جدول

١٢١

جلسه هشتم: شناسایی باسیل هاي گرم منفی

دستور کار:

فسیر نتایج جلسه قبلبررسی و ت -1

شناسایی باسیل گرم منفی ادراري توسط نمودارها و جدول. -2

باسیل گرم منفی منحنی(مثال ویبریو کلرا) مشاهدة میکروسکوپی -3

(مثال بروسال) کوکوباسیل گرم منفیمشاهدة میکروسکوپی -4

هلیکوباکتر در بافت (رنگ آمیزي ساده) مشاهدة میکروسکوپی -5

یل گرم منفی (مثال اشریشیا کلی،سودوموناس و...)باس مشاهدة میکروسکوپی -6

کشت به روش ایزوالسیون (تمرین جهت آزمون پایان ترم) -7

١٢٢

جلسه نهم:مرور مطالب تمامی جلسات

دستور کار:

بررسی کشت ایزوالسیون -1

مشاهده میکروسکوپی تمامی الم ها. -2

مشاهدة و مرور تمامی محیط هاي کشت -3

گسترش هاي بافتی آلوده به ویروسی مشاهدة میکروسکوپ -4

پاسخ گویی به سواالت دانشجویان و رفع اشکال -5

١٢٣

جلسه دهم: آزمون پایان ترم دستور کار:

امضاکارت گزارش کار توسط دانشجو -1

کشت به روش ایزوالسیون. -2

)به روش گرم،طبق دستور کار جزوه.gرنگ آمیزي الم ( -3

لسون،طبق دستور کار جزوه.)به روش زیل نZرنگ آمیزي الم ( -4

)به روش ورماالشیت،طبق دستور کار جزوه.Vرنگ آمیزي الم ( -5

مرحله دوم پاسخ گویی به سواالت تئوري ، سواالت محیط هاي کشت و الم ها . -6

در کارت کلمه (جلسه آزمون )نوشته شود و مقابل آن امضاء شود.که به منزله حضور دانشجو در آزمون .1

می باشد.شماره کارت گزارش کار)و شماره المها را با مشخصات -ثبت شده روي پلیت (نام خانوادگیمشخصات .2

خود مطابقت دهید و در صورت اختالف به مسئول کالس اطالع دهید

جهت انجام ایزوالسیون ، ابتدا مایع داخل لوله را به آرامی تکان داده تا یکنواخت گردد.سپس یک لوپ از .3ت آگار کشت دهید.الزم به ذکر است ،کشت در کنار شعله انجام شود و از محلول را در پلیت نوترین

در پایان کار اطمینان حاصل فرمایید.پلیت کشت داده شده را روي کارت گزارش کار لوپاستریل کردن خود قرار دهید تا جمع آوري گردد

کار جزوه،رنگ آمیزي جهت رنگ آمیزي الم ها ،ابتدا سمت گسترش را تعیین نمایید .سپس طبق دستور .4 نمایید.الم ها را بدون خشک کردن بر روي کارت گزارش کار خود قرار دهید تا جمع آوري گردد.

امکان گرفتن پلیت و الم مجدد وجود ندارد،لذا در انجام آزمایشات دقت فرمایید. .5

.پاسخ گویی به سواالت کتبی می باشد. .6

با آرزوي موفقیت

١٢٤

مراجع

1. Patricia M. Tille .BAILEY & SCOTT’S DIAGNOSTIC MICROBIOLOGY . .South Dakota State University Brookings, South Dakota Thirteen edition . Copyright © [2014] by Mosby.

2. W. Procop, Deirdre L. Church, Geraldine S. Hall, William M. Janda, Elmer. Koneman’s color atlas and textbook of diagnostic microbiology . Philadelphia : Wolters Kluwer Health, Seventh edition. Lippincott Williams & Wilkins, [2017].

3. Leber, Amy L.Clinical microbiology procedures handbook. Department of Laboratory Medicine, Nationwide Children’s Hospital, Columbus, Ohio.4th edition. Washington, DC : ASM Press, [2016]