Il DNA è ilmateriale ereditario e non le proteine

S(smooth) capsulato virulentoR(rough) acapsulato non-virulento

Esperimento di Griffith 1928

Streptococcus pneumoniae

DNA

•Il ceppo S, detto anche liscio dal momento che produce colonie lisce e lucenti (grazie alla presenza di una capsula batterica polisaccaridica che avvolgeva ogni cellula). Questo ceppo è in grado di provocare la polmonite.

•Il ceppo R, detto anche rugoso dal momento che produce colonie dall'aspetto "rugoso" (a causa dell'assenza della capsula batterica). Questo

ceppo non è in grado di provocare polmonite.

Utilizzando il calore sterilizzò la soluzione contenente lo

pneumococco letale (S) con capsula, mescolò la soluzione così

ottenuta con quella contenente lo pneumococco privo di capsula

(R) non letale.

Esaminando successivamente le colonie ottenute da batteri della

soluzione finale, verificò la presenza del solo ceppo capsulato

letale.

L’informazione genetica era passata da un ceppo all’altro

(trasformazione ) gli R ricostruivano la capsula1

-Come è stato scoperto

-Quali sono le sue funzioni

PRINCIPIO TRASFORMANTE

Secondo esperimento

Per il secondo esperimento Griffith utilizzo sempre i due

ceppi di Streptococcus pneumoniae : il ceppo (R) privo di

capsula e non letale ed il ceppo (S) capsulato e letale;

come cavia nella quale iniettare i batteri utilizzo il topo.

Esegui quattro distinte inoculazioni:

Prima inoculazione - iniettando nel topo il ceppo vivo

privo di capsula (R) il topo vive

Seconda inoculazione - iniettando nel topo il ceppo vivo

capsulato (S) il topo muore

Terza inoculazione - iniettando nel topo il ceppo morto

capsulato (S) il topo vive

Quarta inoculazione - iniettando nel topo il ceppo vivo

privo di capsula (R) insieme al ceppo morto capsulato

(S) il topo muore, inoltre esaminando il tipo di batteri

presenti nel topo morto Griffith riscontrò il ceppo letale (S).

Questo esperimento dimostrò che i batteri sono in grado di

trasferire informazioni genetiche attraverso un processo

noto come trasformazione

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IDENTIFICAZIONE DEL PRINCIPIO TRASFORMANTE

O.T. Avery 1944

Ripetè l’esperimento di Griffith

Batteri patogeni S con capsula uccisi dal calore +

-DNasi

-RNasi

-Proteasi

Il topo non moriva quando veniva iniettato con

batteri R mescolati a batteri S precedentemente trattati

con DNasi

Critiche da parte della comunità scientifica (Proteine / Dna)3

Per capire quale delle due sostanze fosse ( se DNA o RNA) coinvolta ne trasferimento di materiale

genetico, divise l'estratto in due aliquote:

-una venne trattata con l'enzima ribonucleasi (RNasi) che degrada selettivamente l'RNA e non il DNA,

-l'altra venne invece trattata con desossiribonucleasi (DNasi) che degrada selettivamente il DNA e non

l'RNA.

Ciò che si osservò era la trasformazione dei batteri R in batteri S solo in seguito all'aggiunta dell'aliquota

trattata con RNasi. Il materiale genetico doveva allora essere necessariamente il DNA.

Esperimento di

Avery

4

Avery si procurò una coltura di

pneumococchi di tipo S.

A questo punto lisò le cellule (cioè ne

ruppe la parete e la membrana

cellulare) in modo da ottenere una

soluzione nella quale era disciolto il

materiale contenuto nei batteri, il

cosiddetto estratto cellulare o lisato

cellulare.

Quando una cellula battericaViene infettata da un virus……

……Solo il DNA del virus entra

5

Premesse per esperimento di Hershey-Chase1952

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Esperimento di Hershey-Chase1952

IL DNA è

IL MATERIALE EREDITARIO

Il processo utilizzato per determinare se la radioattività provenisse

dall'interno o dall'esterno delle cellule fu il seguente:

-dopo un certo tempo dall'inizio dell'infezione, il terreno di coltura veniva

posto in un omogenizzatore. La conseguente agitazione provocava il

distacco del rivestimento proteico dei virus dalla membrana cellulare (in

questo caso si parla di "ombre fagiche" poiché questi rivestimenti proteici

non contengono il DNA che è già stato iniettato nella cellula).

Il tutto veniva poi centrifugato: la parte cellulare (contenente

eventualmente il DNA marcato) rimaneva sul fondo della provetta, mentre

i rivestimenti proteici distaccati dalle membrane cellulari rimanevano in

sospensione.

A seconda di dove si misurava la maggiore radioattività era possibile

dedurre se la molecola marcata si trovasse o meno all'interno della

cellula.

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Dogma centrale della BIOLOGIA

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Acidi nucleici

• DNA(acido desossiribonucleico),

RNA (acido ribonucleico)

• Catene polinucleotidiche

• Unità base NUCLEOTIDE:

BASE AZOTATA+ZUCCHERO (ribosio nel caso dell’RNA, desossiribosio nel caso del DNA) +FOSFATO

NUCLEOSIDE

BASE AZOTATA+ZUCCHERO

Denaturazione ( rottura legami H)e rinaturazione

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Campbell-Reece, Biologia © 2009 Pearson Paravia Bruno Mondadori S.p.A

Figura 16.5

DNA = lungo polimero costituito da unità ripetute di nucleotidi.

Ogni filamento può contenere diversi milioni di nucleotidi. Ad

esempio, il più grande cromosoma umano (il cromosoma 1)

contiene quasi 250 milioni di paia di basi.

Negli organismi viventi, il DNA non è quasi mai presente sotto

forma di singolo filamento, ma come una coppia di filamenti

saldamente intrecciati tra loro, a formare una struttura definita

doppia elica.

Ogni nucleotide è costituito da uno scheletro laterale, che ne

permette il legame covalente con i nucleotidi adiacenti, e da una

base azotata, che instaura legami idrogeno con la

corrispondente base azotata presente sul filamento opposto.

La struttura laterale del DNA è composta da unità ripetute ed

alternate di gruppi fosfato e di 2-deossiribosio, uno zucchero

pentoso (a cinque atomi di carbonio) che si lega ai fosfati

adiacenti attraverso legami fosfodiesterici presso il terzo ed il

quinto carbonio. Conseguenza di questi legami asimmetrici è che

ogni filamento di DNA ha un senso, determinato dalla direzione

dei legami fosfodiesterici. In una doppia elica, il senso di un

filamento è opposto a quello del filamento complementare. Per

tale motivo, i due filamenti che costituiscono una doppia elica

sono detti antiparalleli. Le estremità asimmetriche di un

filamento di DNA sono definite estremità 5′ (cinque primo) ed

estremità 3′ (tre primo).

La principale differenza tra il DNA e l'RNA è lo zucchero pentoso

utilizzato: l'RNA, infatti, utilizza il ribosio.

La doppia elica del DNA è stabilizzata dai legami idrogeno che si

instaurano tra le basi azotate presenti sui due filamenti.

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La struttura a doppia elica del DNA consente di portare l’informazione e di autoreplicarsi:I nucleotidi si legano con legame fosfodiestereo in direzione 3’OH 5’ P

Estremità 3’ OH liberaEstremità 5’ fosfato

Watson e Crick (1953) ipotizzarono che la molecola di DNA fosse costituita da 2 catene polinucleotidiche antiparallele tenute insieme da legami ad idrogeno tra le basi

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Campbell-Reece, Biologia © 2009 Pearson Paravia Bruno Mondadori S.p.A

Figura 16.7

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Dati cristollografici

R. Franklin (Londra, 25 luglio 1920 – Londra, 16 aprile 1958 ) e M. Wilkins

Scoperta: due diverse strutture del DNA. Quando è

bagnato il DNA assume una struttura lunga e sottile (A);

quando è asciutto invece diventa corto e grosso (B).

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1950 Chargaff

Tutte e quattro le basi hanno struttura eterociclica

-ma adenina e guanina sono, dal punto di vista strutturale, derivate della purina, e pertanto

dette basi puriniche,

-mentre citosina e timina sono correlate alla pirimidina e dette basi pirimidiniche.

Esiste una quinta base, di tipo pirimidinico, chiamata uracile (U), ma essa non è di norma

presente nelle catene di DNA. L'uracile è altresì presente nei filamenti di RNA al posto della

timina14

Campbell-Reece, Biologia © 2009 Pearson Paravia Bruno Mondadori S.p.A

Figura 16.8

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DNA B Watson e Crick 1953

Elica a doppio filamento

Diametro uniforme 2 nm

Complementarietà fra le basi

Elica destrorsa

Filamenti antiparalleli16

LEGAME FOSFODIESTEREO

FRA DUE NUCLEOTIDI

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18

Premesse per

replicazione

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20

Ipotesi per replicazione DNA

Meselson eStahl

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Per iniziare la replicazione,

occorre anzitutto

-l'apertura della forca replicativa,

attraverso la parziale

denaturazione del DNA a doppia

elica, grazie a elicasi e dalle

single-strand-binding proteins

(SSBPs):

: le elicasi sono enzimi che

separano attivamente i due

filamenti usando l'energia dell'ATP;

le SSBPs sono in grado di

mantenere la denaturazione del

DNA legandosi esclusivamente

alle porzioni a singolo filamento e

stabilizzandole.

Nelle molecole di DNA circolari dei

procarioti si ha una sola regione di

origine della replicazione dalla

quale partono due forche

replicative (la struttura prende il

nome di bolla di replicazione).

Quando le due forche si

incontrano dal lato opposto la

replicazione è completata.

Negli eucarioti la replicazione di

ogni cromosoma inizia invece in

più punti22

DNA batterico

23

DNA eucariotico

24

25

Le eliche del DNA devono essere tenute separate durante la replicazione DNA elicasi, topoisomerasi e proteine destabilizzatrici dell’elica

La sintesi procede in direzione 5’ 3’ la DNA polimerasi forma legami fosfodiesterei tra il3’ OH della catena in allungamento ed il 5’P di un nuovo nucleotide

La sintesi necessita di un iniziatore di RNA Primasi

La sintesi avviene in modoContinuoDiscontinuo frammenti di Okazaki

Deossiribonucleosidi trifosfati (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)Ligasi

La DNA polimerasi non è in grado di iniziare la sintesi di un filamento ex novo, mentre può allungare un filamento

polinucleotidico preesistente. In una cellula in replicazione, dunque, è indispensabile la presenza di un filamento preesistente

(detto primer), che consiste solitamente in un breve segmento di RNA complementare allo stampo, sintetizzato da enzimi

specifici detti primasi.

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27

Dalla Bolla di replicazione…..

Dal momento che le DNA polimerasi sono in grado di svolgere la loro attività solo in direzione 5'-3',

esse hanno messo a punto diversi meccanismi per copiare i due filamenti della doppia elica.

Un filamento (chiamato filamento guida) può essere replicato in modo quasi continuo, man mano

che viene esposto,

-l'altro (filamento lento) risulta invece disseminato da brevi filamenti di DNA di nuova sintesi (i

frammenti di Okazaki), ognuno dei quali presenta un innesco iniziale di RNA.

I nuovi filamenti devono essere quindi completati mediante la rimozione degli inneschi da parte di

endonucleasi e il riempimento degli spazi rimasti ad opera di polimerasi di riparazione.

Successivamente tutti questi frammenti di DNA di nuova sintesi del filamento lento vengono legati

dalle DNA ligasi.

lllgggeeerrreee lllaaa lllooorrrooo aaattttttiiivvviiitttààà sssooolllooo iiinnn dddiiirrreeezzziiiooonnneee 555''' 333'''

28

29

In realtà quasi tutti i passaggi sono svolti da un unico ed enorme complesso proteico di più

di 1.000 kDa che si associa al DNA e lo fa scorrere sintetizzandolo, esso comprende le

elicasi, le polimerasi e così via.30

2

1

3

4

5

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DNA polimerasi II: correttore delle bozze

Altrimenti: mutazioni puntiformi

alleli

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Dogma della Biologia

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