STRUTTURE DEGLI ACIDI STRUTTURE DEGLI ACIDI STRUTTURE DEGLI ACIDI

NUCLEICI,NUCLEICI,NUCLEICI,

CODICE GENETICO CODICE GENETICO CODICE GENETICO

EEE

REPLICAZIONE DEL DNAREPLICAZIONE DEL DNAREPLICAZIONE DEL DNA

26 Novembre 2011Auditorium Presidio Ospedaliero S.Chiara,

Trento

IL LABORATORIO DI BIOLOGIA MOLECOLARE:

Introduzione alle tecniche e alle loro applicazioni

Relatore: Lorenzo Zeni

Il DN

Anell’a

rte: S

usan R

ankaitis

2002, “D

NA

2”

Il corso ha l’obbiettivo di dare le

conoscenze di base

sulla struttura e

sulle funzioni

degli acidi nucleici

Introduzione

La struttura primaria:La struttura primaria:

i componenti degli acidi nucleicii componenti degli acidi nucleici

Nucleotide

Nucleoside

DNA deossiribosio / RNA ribosioDNA: Acido desossiribonucleico

RNA: Acido ribonucleico

RIBOSIO

DEOSSIRIBOSIO

Basi AzotatePurine Pirimidine

Adenina e Guanina definite purine con

struttura a doppio anello di carbonio-azoto Citosina e Timina, che nel RNA è sostituita

dall’Uracile, dette pirimidine con struttura a

singolo anello

Gruppo funzionale Fosfato

3 3

5

5

Il Significato di 5’ e di 3’

• Le estremità di una

catena di DNA e RNA

sono distinte e hanno

proprietà chimiche

diverse e vengono

denominate con 5’ e 3’.

• Il 5’ si riferisce al

carbonio dello zucchero

legato al gruppo fosfato

e 3’ a quello legato al

gruppo funzionale

ossidrile OH.

5’

5’3’

3’

La struttura secondaria del DNALa struttura secondaria del DNA

RNA singola catena polinucleotidica.

DNA struttura a doppio filamento.

La struttura secondaria

Legami Idrogeno• Nel DNA, fra le basi azotate dei filamenti si

formano legami idrogeno termodinamicamente stabili.

• I legami idrogeno sono legami deboli ma conferiscono stabilità alla doppia elica poichésono numerosi.

• In questi legami sono condivisi gli atomi di idrogeno tra due atomi elettronegativi come quelli di ossigeno e di azoto.

Legami Idrogeno

• Le basi azotate formano coppie in modo specifico

• Adenina - Timina

2 legami idrogeno

• Guanina – Citosina

3 legami idrogeno

Legami Idrogeno

1 nm

5’

3’

5’

3’

Watson e Crick, coloro che

definirono il primo modello accurato della struttura del

DNA a doppia elica nel

1953, stabilirono che la formazione di legami

idrogeno possono verificarsi soltanto se la

polarità dei due filamenti èopposta.

L’impilamento delle basi stabilizza

chimicamente la doppia elica di DNA

• Una molecola di DNA a doppio filamento ha un nucleo idrofobico composto dalle basi impilate, che contribuisce alla stabilitàchimica della struttura, con una torsione elicoidale. Questa conformazione permette di escludere la massima quantità di acqua dall’interno della doppia elica.

• All’esterno della molecola di DNA protrudono gli zuccheri e i gruppi fosfato che sono idrofilici.

Strutture secondarie insolite del DNA

La struttura terziaria del DNALa struttura terziaria del DNA

Struttura terziaria del DNA

Immagini al microscopio elettronico di un DNA circolare

rilassato (destra) e superavvolto (sinistra).

Struttura terziaria del DNA

TOPOISOMERI: forme di DNA con stessa sequenza nucleotidica ma con

diverso grado di superavvolgimento.

TOPOISOMERASI: enzimi che convertono un topoisomero di DNA in un altro

modificandone il suo superavvolgimento

LL’’organizzazione del DNA organizzazione del DNA

negli eucariotinegli eucarioti

Il genoma eucariotico

Le cellule eucariotiche

presentano nel loro

nucleo le molecole di

DNA compattate

sottoforma di

cromosoma.

Il genoma eucariotico

Nucleosoma

(8 istoni + 146 coppie di

nucleotidi di DNA)Il DNA eucariotico si

combina con proteine basiche chiamate istoni

per formare strutture note come nucleosomi.

Il genoma eucariotico

Istone Linker o H1, uno degli

istoni più variabili, non partecipa

direttamente alla formazione del

nucleosoma ma si posiziona fra

due ottameri adiacenti.

Il genoma eucariotico

Cromatina decondensata

(eucromatina)

Cromatina condensata

(eterocromatina)

Fotografia al microscopio elettronico di

cromatina decondensata che mostra i

nucleosomi con la morfologia a “collana

di perle”

Fotografia al microscopio elettronico della

fibra di cromatina di 30nm

Il genoma eucariotico

Il codice genetico Il codice genetico

Il codice genetico

Trascrizione di una sequenza di DNA in m-RNA che verrà tradotta in una sequenza amminoacidica corrispondente ad una proteina.

Il codice genetico

Il codice genetico

Il codone è la più piccola unità del

codice genetico che controlla la sintesi

di un solo aminoacido.

Il codice genetico si definisce

degenerato in quanto più codoni

possono codificare per uno stesso

aminoacido.

Le triplette che codificano lo stesso

aminoacido presentano solitamente le

prime due posizioni conservate, mentre

la terza varia.

La replicazione del DNA La replicazione del DNA

negli eucariotinegli eucarioti

La sintesi del DNA è limitata ad una fase specifica del ciclo cellulare nota come fase S.

La replicazione del DNA

Replicazione semiconservativa

FILAMENTI

PARENTALI

�Modello di replicazione proposto da Watson & Crick

�Il filamento parentale diviene il filamento stampo�La nuova doppia elica ha un filamento stampo + un filamento

neoformato

�Forcella di replicazione: punto in cui i due filamenti di DNA parentale si separano per permettere la replicazione

FORCELLA DI

REPLICAZIONE

Il meccanismo della replicazione del

DNA nucleare eucariotico

Inizialmente abbiamo la

rimozione degli istoni a livello delle origini di

replicazione.

Il meccanismo della replicazione del

DNA nucleare eucarioticoLe origini della replicazione sono

siti sul DNA cromosomico in cui

inizia una coppia bidirezionale di

forcelle di replicazione

Generalmente si trovano separate da

circa 50kb, gli esseri umani ne hanno

10000-100000 origini.

Se il punto di origine fosse uno solo (come

nei procarioti) la duplicazione del DNA

umano richiederebbe circa un anno.

Il meccanismo della replicazione del

DNA nucleare eucariotico

�Formazione del complesso di pre-replicazione (pre-RC) in corrispondenza delle

origini di replicazione:

- associazione del complesso di riconoscimento dell’origine (ORC) all’origine

- richiamo di altre due proteine (Cdc6 Cdt1)

- accorpamento del complesso elicasico Mcm-2-7.

ORCCdt 1

Cdc6complesso elicasico Mcm-2-7

Il meccanismo della replicazione del

DNA nucleare eucariotico

ORCCdt 1

Cdc6complesso elicasico Mcm-2-7

�Le due proteine del complesso di pre-replicazione vengono rilasciate per essere

sostituite da altri fattori di replicazione (es: proteina di replicazione A (RPA))

�L’elicasi svolge il doppio filamento di DNA scindendo i legami idrogeno

�La topoisomerasi I e/o la topoisomerasi II risolvono i superavvolgimenti positivi

davanti alla forcella di replicazione

topoisomerasi I e/o topoisomerasi II

Il meccanismo della replicazione del

DNA nucleare eucariotico

Il meccanismo della replicazione del

DNA nucleare eucariotico

Complesso polimerasi alfa/primasi

Complesso polimerasi alfa/primasi

RNA primer

RNA primer

Complesso polimerasi alfa/primasi :

�subunità con attività DNA polimerasica

�subunità necessaria per l’assemblaggio del primer

�due piccole proteine che assieme forniscono l’attività

primasica

Inizialmente si avrà la sintesi degli RNAprimer necessari

per dare inizio alla formazione del filamento leader e di

ciascun frammento di Okazaki sul filamento ritardato.

Filamento

leader

Filamento

ritardato

Il meccanismo della replicazione del

DNA nucleare eucariotico

DNA polimerasi δ

Complesso pol alfa/primasi

DNA polimerasi δ

Filamento

leader

Il complesso pollimerasi alfa/primasi viene sostituito dalla

DNA polimerasi che estenderà la catena,

nel caso del filamento leader è coinvolta la polimerasi delta

Il meccanismo della replicazione del

DNA nucleare eucariotico

DNA polimerasi ε

Filamento

leader

Filamento

ritardato

mentre in quello ritardato la polimerasi

epsilon la quale aggiunge nuovi

nucleotidi fino al raggiungimento del RNA

primer del frammento precedente.

DNA polimerasi δ

DNA polimerasi

Filamento ritardato

Complesso

polimerasi

alfa/primasi

Frammenti di Okazaki

RNA primer

DNA polimerasi

La DNA polimerasi ha la frequenza di un errore ogni 10000-100000 bp per ciclo di replicazione.

Il meccanismo della replicazione del

DNA nucleare eucarioticoLa sintesi del filamento leader

è continua

Il filamento ritardato viene

sintetizzato sottoforma di

frammenti di Okazaki

Frammenti di Okazaki

Nel frattempo la forcella di

replicazione cresce

… e cresce

Matu

razio

ne d

el D

NA

di n

uova s

inte

si:

Ligasi I

unione dei frammenti di

Okazaki sul filamento

ritardato.

riempimento delle

interruzioni

DNA Polimerasi ε

rimozione dell’RNA

primer

Il meccanismo della replicazione del

DNA nucleare eucariotico

Il meccanismo della replicazione del

DNA nucleare eucariotico

Negli eucarioti la replicazione continua probabilmente fino a che una forcella non

incontra un’altra forcella di un replicone adiacente. Sono state anche identificate alcune

sequenze in siti specifici che possono arrestare il progresso delle forcelle di

replicazione.

Infine, ultimo passaggio, abbiamo la

deposizione degli istoni che avviene

non appena c’è abbastanza DNA

disponibile per formare un nucleosoma.

I telomeri e le telomerasi

Al completamento della sintesi del filamento ritardato e

della rimozione dei primer su un cromosoma lineare,

si ha un filamento 5’ accorciato e una sporgenza di 12-16 basi sul filamento 3’.

L’estensione delle estremità 3’ dei cromosomi avviene ad opera delle telomerasi.

I telomeri sono strutture specializzate che

incapucciano le estremità dei cromosomi,

sono costituiti da ripetizioni in tandem di una

semplice sequenza ricca di guanina, quelli

umani contengono parecchie migliaia di

ripetizioni della sequenza TTAGGG

I telomeri e le telomerasi

L’assenza dei telomeri comporta:

�fusione delle estremità dei cromosomi

�facilita la ricombinazione genetica

�scatena la morte cellulare per apoptosi.

Grazie per l’attenzione