Importancia del Antígeno D

Sujetos Rh Negativo productores de Anti-D:

80% de los receptores de grandes volúmenes de sangre D positivo

20% de los transfundidos con plaquetas provenientes de dadores D positivo

10% de las pacientes que han tenido hijos D positivo y ABO compatibles

Variaciones Cuantitativas del Antígeno D

Antígenos D DébilEl término Du es amplio e imprecisoLos G.R. eran aglutinados por un anti-D

pero no por otroIncluía Ags. D débil y D parcialNo existe un anticuerpo Anti-Du

La identificación de Du depende de los reactivos y los métodos empleados

Variaciones Cualitativas del Antígeno D

Corresponden a Fenotipos D Parcial, con o sin variaciones cuantitativas asociadas

Antígenos D Parcial Antígenos D Parcial Débil

Eritrocitocon

Antígenos

Ag. constituidopor Epitopes

Anticuerpos dirigidoshacia sus correspondientesEpitopes

Eritrocitocon

Antígenos

Ag. constituidopor Epitopes

Anticuerpos dirigidoshacia sus correspondientesEpitopes

Eritrocitocon

Antígenos

Ag. constituidopor Epitopes

Anticuerpos dirigidoshacia sus correspondientesEpitopes

Eritrocitocon

Antígenos

Ag. constituidopor Epitopes

Anticuerpos dirigidoshacia sus correspondientesEpitopes

Eritrocitocon

Antígenos

Ag. constituidopor Epitopes

Anticuerpos dirigidoshacia sus correspondientesEpitopes

Differences between normal D, D-weak and partial-D phenotypes

Antígeno D Normal

Differences between normal D, D-weak and partial-D phenotypes

Antígeno D Normal

Epitope Antígeno

Epitope: Normal

Cantidad de Ag: Normal

Differences between normal D, D-weak and partial-D phenotypes

Antígeno D Normal

Epitope Antígeno

Epitope: Normal

Cantidad de Ag: Normal

Differences between normal D, D-weak and partial-D phenotypes

Epitope Antígeno

Epitope: Normal

Cantidad de Ag: Normal

Antígeno D Normal D Débil

Normal

Reducido

Differences between normal D, D-weak and partial-D phenotypes

Epitope Antígeno

Epitope: Normal

Cantidad de Ag: Normal

Antígeno D Normal D Débil

Normal

Reducida

Variante D

Mutados

Normal o Reducida

Fenotipos D Parcial originados comúnmente por genes “híbridos”

Exones de Gen D Exones de Gen D

Exones de Gen CE

Exones de Gen CE Exones de Gen CE

Exón de Gen D

Ausencia de epitopes asociados con una expresión normal de antígeno D

D Parcial como resultado de la inserción de un exón D dentro de un gen CE

Vistazo de Variantes D

DVIcE ccDVI.Ee = Tipo I Raro 600 Ag/GR Caucásicos

Gen RHD

Gen RHD

Gen RHD

DVICe BARC = Tipo II CcDVI.ee Más frecuente 2400 Ag/GR Caucásicos y Japoneses

DVICe BARC = Tipo III CcDVIee Muy raro 12000 Ag/GR Caucásicos

Tipos de D Parcial de la Categoría DVI

Serología para Ag. D

• El estado D puede ser determinado empleando sueros Policlonales o Monoclonales. Ambos, no arrojan exactamente las mismas divisiones.

• El uso de Monoclonales permitió apreciar la diversidad y complejidad de los epitopes D.

Anticuerpos Policlonales

G.R. Transfundidos con Ag. extraño (p.ej. D)

Ag. extraño D

Epitopes diferentes

Las célulasplasmáticasproducen

anticuerpos heterogéneos

Anticuerpos Policlonales

Anticuerposcon

Paratopesdiferentes

Anticuerpos MonoclonalesAnticuerpos Policlonales

Anticuerpos Monoclonales

Ag. extraño D

Epitopes diferentes Selección de

un anticuerpo

específico

Anticuerposcon

Paratopesdiferentes

Producciónde siempre elmismo clon

(mismo paratope)

Produce una variedad de anticuerpos

Tipos de Reactivos Anti-D

Policlonal c/ Alta Concentración ProteicaPoliclonal c/ Modificación QuímicaMonoclonal Mezcla Policlonal/MonoclonalMezcla Monoclonal/Monoclonal

PRESENTACIONES COMERCIALES DE SUEROS HEMOTIPIFICADORES

Sistema RH

Policlonal Humano

Monoclonal Humano

Mezclas (Blends)

Anti-D IgG – IgM Polic –Monoc Monoc-Monoc

Anti-C

Anti-E

Anti-c

Anti-e

Anti-CDE

IgG IgG Qca. Modif

IgM Salino Monoclonal

Anti-Cw IgG – IgM Sal.

IgM

-

Criterios y Alcances del UsoReactivos que detectan DVI y D débil

Ideales para la clasificación de:donantes

recién nacidosde madre Rh Negativo

Es importante tipificar todas las presentaciones de Ag. D que puedan causar inmunización en sujetos Rh Negativo

Criterios y Alcances del UsoReactivos que NO detectan DVI y D débil

Ideal para la tipificación de pacientes: receptores transfusionales

obstétricas

Esta es la política transfusional segura, ya que serán transfundidos con sangre Rh Negativo aunque pertenezcan a una clasificación de D muy débil.

Anti-D Monoclonalessegún procedencia comercial

Líneas celularesIgM IgG

MarcasComerciales (*)

BS226 BiotestBS221 BiotestBS232 Biotest

H4111B7 BiotestBAC-9 CNTSP3x 61 Diagast, GrifolsHM 10 Diagast

P3x 21223 B10 Diagast, GrifolsP3x 212 11F1 Diagast

HM16 DiagastP3x 290 Diagast, GrifolsP3x 35 Diagast, GrifolsP3x 241 DiagastP3x 249 DiagastP3x 290 Diagast

TH-28 DiaMed, Immucor175-2 DiaMed, Immucor

MS-201 DiaMed, Immucor, LorneRs-1126 DiaMed, Lorne

Líneas celularesIgM IgG

MarcasComerciales (*)

LDG169 DiaMedLDG59 DiaMedLDG70 DiaMedLDG76 DiaMedLDG77 DiaMedLDMI DiaMed

MS-26 DiaMed, Immucor, LorneLHM50/3 (LDM1) DiaMed

LHM59/19 DiaMedLHM 59/20 (LDM3) DiaMed

ESD1 DiaMedESD-1M DiaMedHUMAN Gamma, Immucor, Ortho

GAMA401 GammaNELP-3 Gamma, Immucor

F8D8 GammaNa TH 28-3 C 11 Jacques Boy

LORI Jacques BoyMAD2 Ortho

ANTESDiferentes proveedores

=Sin alternativa en la capacidad de elección

AHORALos diferentes productores de Clones

ofrecen una variada gama o rangode especificidades hacia distintos epitopes

ANTESDiferentes proveedores

=Sin alternativa en la capacidad de elección

AHORALos diferentes productores de Clones

ofrecen una variada gama o rangode especificidades hacia distintos epitopes

Caracterización del tipo de D Parcial mediante Test en Gel

Principle of gel technique

Tarjeta de Gel para determinación de grupos

sanguíneos

Técnica en Gel

Microtubo

Aglutinación

Caracterización del tipo de D Parcial mediante Test en Gel

FORMAS DE ESTUDIAR LOS GRUPOS SANGUÍNEOS

AGLUTINACIÓN y HEMÓLISIS.

AGLUTINACIÓNHEMÓLISISINHIBICIÓN ABSORCIÓN Y

ELUCIÓN

ELISA

RIA

PRECIPITACIÓN

PRIMERA ETAPA

Está influenciada por las siguientes variables: Temperatura: IgM reaccionan a 4ºC, IgG a37ºC Afinidad entre Ag y Ac PH optimo :6.5 y 7.6 Concentraciòn relativa del Ag y Ac.puede ocurrir disminuciòn

de la aglutinaciòn cuando hay exceso de Ac(prozona) o exceso de Ag (postzona)

Fuerza iónica del medio : al disminuir ,disminuye la nube de cationes que rodea lo GR favoreciendo la uniòn Ag- Ac

Medios de potenciaciòn: *Soluciones de baja fuerza iònica :LISS: reduce la neutralizaciòn de cargas opuestas aumentando la velocidad de reacciòn y tambien la cantidad de Ac unido al hematíe.

Tiempo de incubación: Las diferentes reacciones Ag-Ac alcanzan el equilibrio en tiempos diferentes.

SEGUNDA ETAPA Potencial Z

Densidad del Ag

Clase de Ig involucrada

Para potenciar las reacciones de aglutinaciòn se emplean diversos métodos: centrifugación controlada, adición de medios macromoleculares, de Enzimas proteolìticas y el uso del test de Coombs permite detectar la sesibilizaciòn de los GR por IgG que generalmente no producen aglutinaciòn

ETAPAS DE LA AGLUTINACIÒN

La aglutinación se produce en dos etapas:

La primera es la unión Ag-Ac La segunda la formación de puentes

intercelulares que producen el fenómeno visible de la aglutinación.

Potencial Z

Enzimas proteolíticas que eliminan las cargas (-) de la superfície celular

Papaína Bromelina Eliminan el Acido Sálico Tripsina Otras sustancias: ● Albúmina bovina

● Dextrán

GR con menos cargas negativas en su superficie, lo que permite que se aproximen lo suficiente para que se establezcan los puentes de unión por moléculas de IgG.

Soluciòn salina de baja fuerza iónica :LISS

Permite aumentar hasta 1000 veces la afinidad entre Ag y Ac.

Aumenta la sensibilidad de la prueba de Coombs. Permite detectar Ac en baja concentración y de baja

afinidad Permite reducir el Tiempo de incubaciòn de la Coombs

de 30´ a 10´ Por esta razòn el TCI en LlSS es la prueba de elecciòn para la detecciòn e identificaciòn de Ac de tipo IgG

Se la utiliza : Prueba de compatibilidad pretransfusional y detección de Ac irregulares en donantes y receptores, detección de Ac irregulares en embarazadas y tipificación de Ag eritrocitarios.

PRUEBA ANTIGLOBULINICA ( Coombs)

Detecta Acs de tipo IgG o fracciones del C`adheridos a los GR.Existen dos técnicas:a) Directa: Detecta Acs adheridos a los GR “in

vivo”.b) Indirecta: Determina Acs existentes en el

suero o plasma del paciente, previa incubación del suero con GR apropiados.

DIRECTA: TCD● Diagnostico de AH y EHRN.● Investigación de reacciones dudosas

en una transfusión.● Investigación de enfermedades autoinmunes.

INDIRECTA: TCI● Screening de sueros de donantes y pacientes para

Acs.● Pruebas de compatibilidad previas a la

transfusión.●Identificación y titulación de Acs encontrados en

sueros.

LAVADO INADECUADO DE ERITROCITOS

MALA INTERPRETACIÓN DE PRUEBAS DÉBILMENTE (+)

PÉRDIDA DE ACTIVIDAD DE LOS REACTIVOS

CENTRIFUGACIÓN INADECUADA.

TUBOS DE VIDRIO MAL LAVADOS

SOBRECENTRIFUGACIÓN

QUE LOS ERITOCITOS AGLUTINEN ANTES DEL AGREGADO DEL SUERO DE COOMBS

FALSOS POSITIVOS

DETECCIÓN DE ACS IRREGULARES

MUESTRA • SUERO FRESCOREACTIVO • PANEL SELECTORTECNICA • LECTURA EN MEDIO SALINO Y TCI

MUESTRA• SUERO PACIENTE

REACTIVO

• HEMATIES QUE EXPRESEN EL AG CORRESPONDIENTE AL AC• A TITULAR EN SUSP ENTRE 3—5 %• S F

TECNICA• VER CUADRO

TITULACIÓN

TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 9S F - 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL

100 µL 100 µL

100 µL 100 µLDEL TUBO 2 SE TOMA 100 µL Y SE LO PASA A LOS DEMAS EN FORMA

SUCECIVARESERVAR 100 µL DEL TUBO 10

SUEROS 100 µL 100 µL

100 µL 100 µL

100 µL 100 µL

GR 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µLDILUCION 1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256

EL TÍTULO ES LA INVERSA DE LA MAYOR DILUCIÓN DE SUERO QUE PRODUCE

AGLUTINACIÓN VISIBLE

E H F N

Conjunto de manifestaciones patológicas causadas por aloimunización materna a Ag celulares presentes en el feto heredados del padre que producen una respuesta inmune (Ac) en la madre

Causas de inmunizaciónEmbarazo (parto 0,25 ml hasta 25 ml - 3er

trimestre?)TransfusiónInyecciones de sangre (intramuscular) Puede

afectar 1er embTransplantesDrogadicción

CLASIFICACIÓNSegún la especificidad del Ac

EHFN: por acs contra ags del sistema RH ( más severa )Madres RH ( neg) sensibilizadas con anti-D

EHFN: por acs contra ags del sistema ABO ( menos severa )

Madres de grupo “ 0 “

EHFN : por acs contra ags de otros sistemas

ENFERMEDED HEMOLÍTICA DEL RECIÉN NACIDO (EHRN)

* Ictericia Signos * Anemia

* Esplenomegalia* Hepatomegalia

Causas + común ( Incompatibilidad sanguínea materno-fetal)

•Acs irregulares : título e identificación 16 / 18 semSi es ( - ) repetir 28 / 32 semSi es ( + ) repetir 20 / 22 sem ó c/ 15 dias si aumenta

Estudios de LA ( mujeres con título > 16 + historia obstetrica

* Genotipificación R H D fetal

* Feto – Ultrasonido -----EC ( hígado- bazo )_ Muestra sangre fetal ( 18 sem )

ESTUDIOS EN LA MUJER EMBARAZADA

PRUEBAS DE CONFIRMACIÓN

* A la madre : Tipificación ABO Y RH ( VARIANTES DU )

Panel selector ( aloanticuerpos maternos )

* En el niño : Tipificación A B O y R H P C DH b , Hto cordón , BRR I de cordónReticulocitos

Determinación prenatal del genotipo RHD

Protocolo de estudio

Estudios inmunohematológicos en sangre materna: RhD y Anticuerpos Irregulares.

Extracción de ADN de sangre periférica materna y líquido amniótico.

Genotipificación RHD en ADN fetal.

Determinación del origen fetal del ADN obtenido del líquido amniótico.

Determinación de la cigosidad RHD paterna.

4.TRANSFUSION.ppt

E H F N ----A B O

Caso más frecuente Madre “ O “ Y feto “ A “

Frecuentemente sin significado clínico

Se puede presentar en el primer embarazo

ESTUDIOS A REALIZAR

Prenatal (embarazadas):Podría investigarse en embarazada de grupo O y esposo A/B los Ac anti-A/B de clase IgG (2-ME) pero solamente 1 de 3000 incompatibilidades ABO potenciales necesita exanguinotransfusión.Imposibilidad e inutilidad de un despitaje prenatal

PosnatalRecién nacido:

Grupo ABO y RhDTCD, TCD potenciadoMedios macromolecularesElución e identificación del Ac

MadreEstudio de Ac anti-A y/o anti-B de origen inmune y titulación.

ESTUDIOS A REALIZAR PRENATAL : ( embarazada )

madre “ O “ – esposo A / B Determinar título de Ig G

_ POS NATAL : recien nacidogrupo A B O y R H

P C D ( +, - débil )

HALLAZGOS HEMATOLÓGICOS EN EL RECIEN NACIDO

* Aumento de reticulocitos . 10- 30 %evidencia de proceso hemolítico compensado

* Eritroblastos en sangre periférica 8---15 %

* Microesferocitos 80 %