Importancia del Antígeno D
Sujetos Rh Negativo productores de Anti-D:
80% de los receptores de grandes volúmenes de sangre D positivo
20% de los transfundidos con plaquetas provenientes de dadores D positivo
10% de las pacientes que han tenido hijos D positivo y ABO compatibles
Variaciones Cuantitativas del Antígeno D
Antígenos D DébilEl término Du es amplio e imprecisoLos G.R. eran aglutinados por un anti-D
pero no por otroIncluía Ags. D débil y D parcialNo existe un anticuerpo Anti-Du
La identificación de Du depende de los reactivos y los métodos empleados
Variaciones Cualitativas del Antígeno D
Corresponden a Fenotipos D Parcial, con o sin variaciones cuantitativas asociadas
Antígenos D Parcial Antígenos D Parcial Débil
Eritrocitocon
Antígenos
Ag. constituidopor Epitopes
Anticuerpos dirigidoshacia sus correspondientesEpitopes
Eritrocitocon
Antígenos
Ag. constituidopor Epitopes
Anticuerpos dirigidoshacia sus correspondientesEpitopes
Eritrocitocon
Antígenos
Ag. constituidopor Epitopes
Anticuerpos dirigidoshacia sus correspondientesEpitopes
Eritrocitocon
Antígenos
Ag. constituidopor Epitopes
Anticuerpos dirigidoshacia sus correspondientesEpitopes
Eritrocitocon
Antígenos
Ag. constituidopor Epitopes
Anticuerpos dirigidoshacia sus correspondientesEpitopes
Differences between normal D, D-weak and partial-D phenotypes
Antígeno D Normal
Differences between normal D, D-weak and partial-D phenotypes
Antígeno D Normal
Epitope Antígeno
Epitope: Normal
Cantidad de Ag: Normal
Differences between normal D, D-weak and partial-D phenotypes
Antígeno D Normal
Epitope Antígeno
Epitope: Normal
Cantidad de Ag: Normal
Differences between normal D, D-weak and partial-D phenotypes
Epitope Antígeno
Epitope: Normal
Cantidad de Ag: Normal
Antígeno D Normal D Débil
Normal
Reducido
Differences between normal D, D-weak and partial-D phenotypes
Epitope Antígeno
Epitope: Normal
Cantidad de Ag: Normal
Antígeno D Normal D Débil
Normal
Reducida
Variante D
Mutados
Normal o Reducida
Fenotipos D Parcial originados comúnmente por genes “híbridos”
Exones de Gen D Exones de Gen D
Exones de Gen CE
Exones de Gen CE Exones de Gen CE
Exón de Gen D
Ausencia de epitopes asociados con una expresión normal de antígeno D
D Parcial como resultado de la inserción de un exón D dentro de un gen CE
Vistazo de Variantes D
DVIcE ccDVI.Ee = Tipo I Raro 600 Ag/GR Caucásicos
Gen RHD
Gen RHD
Gen RHD
DVICe BARC = Tipo II CcDVI.ee Más frecuente 2400 Ag/GR Caucásicos y Japoneses
DVICe BARC = Tipo III CcDVIee Muy raro 12000 Ag/GR Caucásicos
Tipos de D Parcial de la Categoría DVI
Serología para Ag. D
• El estado D puede ser determinado empleando sueros Policlonales o Monoclonales. Ambos, no arrojan exactamente las mismas divisiones.
• El uso de Monoclonales permitió apreciar la diversidad y complejidad de los epitopes D.
Anticuerpos Policlonales
G.R. Transfundidos con Ag. extraño (p.ej. D)
Ag. extraño D
Epitopes diferentes
Las célulasplasmáticasproducen
anticuerpos heterogéneos
Anticuerpos Policlonales
Anticuerposcon
Paratopesdiferentes
Anticuerpos MonoclonalesAnticuerpos Policlonales
Anticuerpos Monoclonales
Ag. extraño D
Epitopes diferentes Selección de
un anticuerpo
específico
Anticuerposcon
Paratopesdiferentes
Producciónde siempre elmismo clon
(mismo paratope)
Produce una variedad de anticuerpos
Tipos de Reactivos Anti-D
Policlonal c/ Alta Concentración ProteicaPoliclonal c/ Modificación QuímicaMonoclonal Mezcla Policlonal/MonoclonalMezcla Monoclonal/Monoclonal
PRESENTACIONES COMERCIALES DE SUEROS HEMOTIPIFICADORES
Sistema RH
Policlonal Humano
Monoclonal Humano
Mezclas (Blends)
Anti-D IgG – IgM Polic –Monoc Monoc-Monoc
Anti-C
Anti-E
Anti-c
Anti-e
Anti-CDE
IgG IgG Qca. Modif
IgM Salino Monoclonal
Anti-Cw IgG – IgM Sal.
IgM
-
Criterios y Alcances del UsoReactivos que detectan DVI y D débil
Ideales para la clasificación de:donantes
recién nacidosde madre Rh Negativo
Es importante tipificar todas las presentaciones de Ag. D que puedan causar inmunización en sujetos Rh Negativo
Criterios y Alcances del UsoReactivos que NO detectan DVI y D débil
Ideal para la tipificación de pacientes: receptores transfusionales
obstétricas
Esta es la política transfusional segura, ya que serán transfundidos con sangre Rh Negativo aunque pertenezcan a una clasificación de D muy débil.
Anti-D Monoclonalessegún procedencia comercial
Líneas celularesIgM IgG
MarcasComerciales (*)
BS226 BiotestBS221 BiotestBS232 Biotest
H4111B7 BiotestBAC-9 CNTSP3x 61 Diagast, GrifolsHM 10 Diagast
P3x 21223 B10 Diagast, GrifolsP3x 212 11F1 Diagast
HM16 DiagastP3x 290 Diagast, GrifolsP3x 35 Diagast, GrifolsP3x 241 DiagastP3x 249 DiagastP3x 290 Diagast
TH-28 DiaMed, Immucor175-2 DiaMed, Immucor
MS-201 DiaMed, Immucor, LorneRs-1126 DiaMed, Lorne
Líneas celularesIgM IgG
MarcasComerciales (*)
LDG169 DiaMedLDG59 DiaMedLDG70 DiaMedLDG76 DiaMedLDG77 DiaMedLDMI DiaMed
MS-26 DiaMed, Immucor, LorneLHM50/3 (LDM1) DiaMed
LHM59/19 DiaMedLHM 59/20 (LDM3) DiaMed
ESD1 DiaMedESD-1M DiaMedHUMAN Gamma, Immucor, Ortho
GAMA401 GammaNELP-3 Gamma, Immucor
F8D8 GammaNa TH 28-3 C 11 Jacques Boy
LORI Jacques BoyMAD2 Ortho
ANTESDiferentes proveedores
=Sin alternativa en la capacidad de elección
AHORALos diferentes productores de Clones
ofrecen una variada gama o rangode especificidades hacia distintos epitopes
ANTESDiferentes proveedores
=Sin alternativa en la capacidad de elección
AHORALos diferentes productores de Clones
ofrecen una variada gama o rangode especificidades hacia distintos epitopes
Caracterización del tipo de D Parcial mediante Test en Gel
Principle of gel technique
Tarjeta de Gel para determinación de grupos
sanguíneos
Técnica en Gel
Microtubo
Aglutinación
Caracterización del tipo de D Parcial mediante Test en Gel
FORMAS DE ESTUDIAR LOS GRUPOS SANGUÍNEOS
AGLUTINACIÓN y HEMÓLISIS.
AGLUTINACIÓNHEMÓLISISINHIBICIÓN ABSORCIÓN Y
ELUCIÓN
ELISA
RIA
PRECIPITACIÓN
PRIMERA ETAPA
Está influenciada por las siguientes variables: Temperatura: IgM reaccionan a 4ºC, IgG a37ºC Afinidad entre Ag y Ac PH optimo :6.5 y 7.6 Concentraciòn relativa del Ag y Ac.puede ocurrir disminuciòn
de la aglutinaciòn cuando hay exceso de Ac(prozona) o exceso de Ag (postzona)
Fuerza iónica del medio : al disminuir ,disminuye la nube de cationes que rodea lo GR favoreciendo la uniòn Ag- Ac
Medios de potenciaciòn: *Soluciones de baja fuerza iònica :LISS: reduce la neutralizaciòn de cargas opuestas aumentando la velocidad de reacciòn y tambien la cantidad de Ac unido al hematíe.
Tiempo de incubación: Las diferentes reacciones Ag-Ac alcanzan el equilibrio en tiempos diferentes.
SEGUNDA ETAPA Potencial Z
Densidad del Ag
Clase de Ig involucrada
Para potenciar las reacciones de aglutinaciòn se emplean diversos métodos: centrifugación controlada, adición de medios macromoleculares, de Enzimas proteolìticas y el uso del test de Coombs permite detectar la sesibilizaciòn de los GR por IgG que generalmente no producen aglutinaciòn
ETAPAS DE LA AGLUTINACIÒN
La aglutinación se produce en dos etapas:
La primera es la unión Ag-Ac La segunda la formación de puentes
intercelulares que producen el fenómeno visible de la aglutinación.
Potencial Z
Enzimas proteolíticas que eliminan las cargas (-) de la superfície celular
Papaína Bromelina Eliminan el Acido Sálico Tripsina Otras sustancias: ● Albúmina bovina
● Dextrán
GR con menos cargas negativas en su superficie, lo que permite que se aproximen lo suficiente para que se establezcan los puentes de unión por moléculas de IgG.
Soluciòn salina de baja fuerza iónica :LISS
Permite aumentar hasta 1000 veces la afinidad entre Ag y Ac.
Aumenta la sensibilidad de la prueba de Coombs. Permite detectar Ac en baja concentración y de baja
afinidad Permite reducir el Tiempo de incubaciòn de la Coombs
de 30´ a 10´ Por esta razòn el TCI en LlSS es la prueba de elecciòn para la detecciòn e identificaciòn de Ac de tipo IgG
Se la utiliza : Prueba de compatibilidad pretransfusional y detección de Ac irregulares en donantes y receptores, detección de Ac irregulares en embarazadas y tipificación de Ag eritrocitarios.
PRUEBA ANTIGLOBULINICA ( Coombs)
Detecta Acs de tipo IgG o fracciones del C`adheridos a los GR.Existen dos técnicas:a) Directa: Detecta Acs adheridos a los GR “in
vivo”.b) Indirecta: Determina Acs existentes en el
suero o plasma del paciente, previa incubación del suero con GR apropiados.
DIRECTA: TCD● Diagnostico de AH y EHRN.● Investigación de reacciones dudosas
en una transfusión.● Investigación de enfermedades autoinmunes.
INDIRECTA: TCI● Screening de sueros de donantes y pacientes para
Acs.● Pruebas de compatibilidad previas a la
transfusión.●Identificación y titulación de Acs encontrados en
sueros.
LAVADO INADECUADO DE ERITROCITOS
MALA INTERPRETACIÓN DE PRUEBAS DÉBILMENTE (+)
PÉRDIDA DE ACTIVIDAD DE LOS REACTIVOS
CENTRIFUGACIÓN INADECUADA.
TUBOS DE VIDRIO MAL LAVADOS
SOBRECENTRIFUGACIÓN
QUE LOS ERITOCITOS AGLUTINEN ANTES DEL AGREGADO DEL SUERO DE COOMBS
FALSOS POSITIVOS
DETECCIÓN DE ACS IRREGULARES
MUESTRA • SUERO FRESCOREACTIVO • PANEL SELECTORTECNICA • LECTURA EN MEDIO SALINO Y TCI
MUESTRA• SUERO PACIENTE
REACTIVO
• HEMATIES QUE EXPRESEN EL AG CORRESPONDIENTE AL AC• A TITULAR EN SUSP ENTRE 3—5 %• S F
TECNICA• VER CUADRO
TITULACIÓN
TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 9S F - 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL
100 µL 100 µL
100 µL 100 µLDEL TUBO 2 SE TOMA 100 µL Y SE LO PASA A LOS DEMAS EN FORMA
SUCECIVARESERVAR 100 µL DEL TUBO 10
SUEROS 100 µL 100 µL
100 µL 100 µL
100 µL 100 µL
GR 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µLDILUCION 1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256
EL TÍTULO ES LA INVERSA DE LA MAYOR DILUCIÓN DE SUERO QUE PRODUCE
AGLUTINACIÓN VISIBLE
E H F N
Conjunto de manifestaciones patológicas causadas por aloimunización materna a Ag celulares presentes en el feto heredados del padre que producen una respuesta inmune (Ac) en la madre
Causas de inmunizaciónEmbarazo (parto 0,25 ml hasta 25 ml - 3er
trimestre?)TransfusiónInyecciones de sangre (intramuscular) Puede
afectar 1er embTransplantesDrogadicción
CLASIFICACIÓNSegún la especificidad del Ac
EHFN: por acs contra ags del sistema RH ( más severa )Madres RH ( neg) sensibilizadas con anti-D
EHFN: por acs contra ags del sistema ABO ( menos severa )
Madres de grupo “ 0 “
EHFN : por acs contra ags de otros sistemas
ENFERMEDED HEMOLÍTICA DEL RECIÉN NACIDO (EHRN)
* Ictericia Signos * Anemia
* Esplenomegalia* Hepatomegalia
Causas + común ( Incompatibilidad sanguínea materno-fetal)
•Acs irregulares : título e identificación 16 / 18 semSi es ( - ) repetir 28 / 32 semSi es ( + ) repetir 20 / 22 sem ó c/ 15 dias si aumenta
Estudios de LA ( mujeres con título > 16 + historia obstetrica
* Genotipificación R H D fetal
* Feto – Ultrasonido -----EC ( hígado- bazo )_ Muestra sangre fetal ( 18 sem )
ESTUDIOS EN LA MUJER EMBARAZADA
PRUEBAS DE CONFIRMACIÓN
* A la madre : Tipificación ABO Y RH ( VARIANTES DU )
Panel selector ( aloanticuerpos maternos )
* En el niño : Tipificación A B O y R H P C DH b , Hto cordón , BRR I de cordónReticulocitos
Determinación prenatal del genotipo RHD
Protocolo de estudio
Estudios inmunohematológicos en sangre materna: RhD y Anticuerpos Irregulares.
Extracción de ADN de sangre periférica materna y líquido amniótico.
Genotipificación RHD en ADN fetal.
Determinación del origen fetal del ADN obtenido del líquido amniótico.
Determinación de la cigosidad RHD paterna.
4.TRANSFUSION.ppt
E H F N ----A B O
Caso más frecuente Madre “ O “ Y feto “ A “
Frecuentemente sin significado clínico
Se puede presentar en el primer embarazo
ESTUDIOS A REALIZAR
Prenatal (embarazadas):Podría investigarse en embarazada de grupo O y esposo A/B los Ac anti-A/B de clase IgG (2-ME) pero solamente 1 de 3000 incompatibilidades ABO potenciales necesita exanguinotransfusión.Imposibilidad e inutilidad de un despitaje prenatal
PosnatalRecién nacido:
Grupo ABO y RhDTCD, TCD potenciadoMedios macromolecularesElución e identificación del Ac
MadreEstudio de Ac anti-A y/o anti-B de origen inmune y titulación.
ESTUDIOS A REALIZAR PRENATAL : ( embarazada )
madre “ O “ – esposo A / B Determinar título de Ig G
_ POS NATAL : recien nacidogrupo A B O y R H
P C D ( +, - débil )
HALLAZGOS HEMATOLÓGICOS EN EL RECIEN NACIDO
* Aumento de reticulocitos . 10- 30 %evidencia de proceso hemolítico compensado
* Eritroblastos en sangre periférica 8---15 %
* Microesferocitos 80 %