In vitro 모델에서

지방유래줄기세포가 UVB로

광노화시킨 섬유모세포에

미치는 영향

연세대학교 대학원

의 학 과

이 종 희

2

In vitro 모델에서

지방유래줄기세포가 UVB로

광노화시킨 섬유모세포에

미치는 영향

연세대학교 대학원

의 학 과

이 종 희

3

In vitro 모델에서

지방유래줄기세포가 UVB로

광노화시킨 섬유모세포에

미치는 영향

지도교수 탁 관 철

이 논문을 박사 학위논문으로 제출함

2009년 12월

연세대학교 대학원

의 학 과

이 종 희

이종희의 박사학위논문을 인준함

심사위원 인 심사위원 인 심사위원 인 심사위원 인 심사위원 인

연세대학교 대학원 2009년 12월

감사의감사의감사의감사의 글글글글

본 논문을 위해서 따뜻하고 자혜로운 관심과

배려로 지도해 주시고 격려해 주신 탁관철

교수님께 깊은 감사를 드립니다. 또한 항상

많은 관심과 조언을 주신 피부과 이광훈 교수님,

생화학과 김경섭 교수님, 성형외과 유대현

교수님, 삼성 의료원 성형외과 방사익 교수님께

진심으로 감사 드립니다. 특히 연구 진행과 실

험에 많은 시간과 노력을 들여 도움을 주신 송

승용 조교수님, 전영우 조교수님, 정지은 선생님,

전여름 선생님께도 깊은 감사의 뜻을 전합니다.

지금까지 늘 사랑과 관심으로 보살펴 주시고

힘이 되어 주신 부모님께 이 기쁨을 드립니다.

변함없이 곁에서 지켜주고 격려해준 아내와

딸 나영이와도 이 기쁨을 같이 나누고 싶습니다.

2009200920092009년년년년 12 12 12 12월월월월

저자저자저자저자 씀씀씀씀

6

<차례>

국문요약··········································································1

I. 서론·············································································4

II. 재료 및 방법 ·······························································7

1. 연구대상···································································7

2. 인간섬유모세포의 분리 및 배양···································7

3. 지방유래 줄기세포의 분리···········································7

4. UVB 노출에 의한 광노화··············································8

5. 배양·········································································8

6. 결과측정···································································9

7. 통계·······································································11

III. 결과 ········································································12

1. 세포 형태 및 β-galactosidase를 이용한

노화(senescence)의 확인··········································12

2. 각 실험군에서 섬유모세포의 증식 정도 비교···············13

3. Type I collagen, MMP-1, p16의 발현량 비교···············14

4. Annexin V를 이용한 apoptosis의 양상 비교················15

IV. 고찰·········································································18

V. 결론··········································································22

참고문헌·········································································23

영문요약·········································································25

그림 차례

그림 1. UVB조사 24, 48, 72시간 후 섬유모세포의

현미경 소견···········································13

그림 2. 각 실험군의 세포 증식 정도 비교·············14

그림 3. 48시간에 측정한 type I collagen, MMP-1,

p16의 발현 정도····································15

그림 4. 48시간에 시행한 apoptosis assay·············16

1

<국문요약>

In vitro 모델에서 지방유래줄기세포가 UVB로

광노화시킨 섬유모세포에 미치는 영향

지방유래 줄기세포는 분화(differentiation)와 분비작용(paracrine effect)을 통해 다양한 질병 치료 연구에 이용되고 있으며 최근 연구에서 피부 노화에도 긍정적인 효과가 있는 것이 밝혀진 바 있다. 자외선은 피부 노화의 가장 큰 외적 요인으로 이 중 Ultraviolet B (UVB)는 광노화(photoaging)를 일으키는 주 요인이다. 한편, 섬유모세포(fibroblast)는 진피층에서 세포외기질(extracellular matrix)의 생성 및 분해를 조절하는 역할을 하고 있으며 각종 cytokine등을 생산하여 상처를 치유하고 젊은 상태의 피부를 유지하는데 핵심적인 역할을 하고 있다. 그러나 자외선에 노출된 섬유모세포는 collagen degradation의 촉진과 procollagen production의 저하라는 두 가지 기전에 의해 collagen을 감소 시키게 된다. 본 연구에서는 in vitro 환경에서 지방유래줄기세포가 광노화 된 인간섬유모세포에 미치는 영향을 확인하고 그 기전을 밝히고자 하였다. 이를 위하여 3명의 건강한 공여자로부터 진피 및 지방조직을 함께 얻은 후 이를 각각 배양하여 섬유모세포가 충분한 수로 자라면 UVB를 조사하여 광노화를 유도하고 β-galactosidase 염색을 통하여 노화를 확인하였다. 노화가 확인된 섬유모세포는 총 3개의 실험군으로 나누었다. 제 1 실험군은 대조군으로서 광노화시킨 섬유모세포를 별도의 처리를 하지

2

않고 배양하였으며, 제 2 실험군은 광노화시킨 동수의 섬유모세포를 transwell culture 용기를 이용하여 지방유래줄기세포와 함께 배양하였다. 제 3 실험군은 역시 동수의 광노화된 섬유모세포에 3일간 지방유래줄기세포를 배양하여 얻은 conditioned medium을 배지로 배양하였다. 세포 증식능을 CCK-8 kit으로 비교한 결과 24시간까지는 세 실험 군 간에 별다른 차이가 없었으나 48시간 이후에는 conditioned medium, transwell culture, 대조군의 순으로 증식이 일어나는 것으로 나타났으며, 72시간에는 conditioned medium군에서만 생존 세포수가 의미 있게 증가하였다. 배양 후 48시간 째에 시행한 RT PCR 결과 대조군에 비하여 두 가지 실험군 모두에서 type I collagen의 생성은 차이가 없었으나, MMP-1과 p16의 발현은 감소하는 결과를 보였다. 마지막으로 apoptosis 확인을 위한 annexinV-PI 염색에서는 실험군에서 광노화된 섬유모세포의 necrosis는 현저히 감소하였고 apoptosis는 오히려 증가하는 것으로 나타났다. 결과적으로 지방유래줄기세포는 광노화된 섬유모세포의 증식을 유도하고 노화시 발현되는 p16과 MMP-1을 감소시켜 노화를 역전시키며 광노화된 섬유모세포의 necrosis 억제 및 apoptosis유도 효과가 있는 것으로 생각된다. -------------------------------------------------핵심되는 말 : 지방유래줄기세포, 섬유모세포, 항노화, Ultraviolet B

3

In vitro In vitro In vitro In vitro 모델에서모델에서모델에서모델에서 지방유래줄기세포가지방유래줄기세포가지방유래줄기세포가지방유래줄기세포가 UVB UVB UVB UVB로로로로

광노화시킨광노화시킨광노화시킨광노화시킨 섬유모세포에섬유모세포에섬유모세포에섬유모세포에 미치는미치는미치는미치는 영향영향영향영향

<<<<지도교수지도교수지도교수지도교수 탁탁탁탁 관관관관 철철철철>>>>

연세대학교 대학원 의학과

이 종 희 I.I.I.I. 서론서론서론서론 노화의 외적 요인 중 자외선이 큰 역할을 한다는 것은 널리 알려진 사실이다. 이중 Ulatraviolet B(UVB)는 세포 내의 photosensitizer 및 chromatophore와 작용하여 조직의 oxidative stress를 유발해 광노화(photoaging)를 일으키는 주된 원인이다.1 기존의 여러 연구에서 in vitro 환경에서 UVB를 섬유모세포에 노출시켜 광노화를 유발시킨 후 이를 노화에 관련된 다양한 연구에 이용할 수 있다는 사실이 밝혀진 바 있다.2, 3 섬유모세포(fibroblast)는 세포외기질(extracellular matrix)의 생성 및 분해를 조절하는 역할을 하고 있으며 각종 cytokine, glycoprotein들을 생산하여 상처를 치유하고 젊은 상태의 피부를

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유지하는데 핵심적인 역할을 하고 있다.4 특히 자외선에 노출된 섬유모세포는 collagen 생성의 감소를 보이는데 이는 collagen degradation의 촉진과 procollagen production의 방해라는 두 가지 기전을 통해 일어나는 것으로 알려져 있다.5,6 또한, UVB를 인간섬유모세포에 적절하게 노출시키면 조기에 세포의 노화가 유발됨을 β-galactosidase와 p16의 발현량을 통하여 확인한 보고도 있었다.3, 7 노화(senescence)는 정상적인 세포 주기에서 나타나는 자연스러운 현상으로 노화가 진행되면 자멸사(apoptosis)에 의해 세포는 죽게 된다. 이러한 과정에 문제가 생기면 비정상적으로 세포가 증식하면서 암이 발생할 수 있으므로(carcinogenesis) 노화와 세포 자멸사, 암의 발생은 서로 밀접하게 연관되어 있다고 할 수 있다.7 임상적으로 암의 발생을 억제하면서도 노화를 막을 수 있는가는 매우 중요한 부분으로 줄기세포가 환자에게 적용될 수 있는지를 결정하는데 반드시 검증되어야 하는 요소이다. 따라서 항노화 효과를 검증하면서 세포 자멸사 또는 암의 발생에 대해 함께 연구하는 것은 매우 중요하다고 할 수 있다. 피부의 광노화에는 matrix metalloproteinase-1(MMP1)이 중요한 역할을 하는데 자외선에 의해 이 효소가 활성화 되며 collagen의 degradation이 진행된다. 이에 따라 피부는 탄력을 잃고 이차적으로 섬유모세포의 collagen 생성량이 감소하며 노화가 진행된다. 지방유래줄기세포는 2001년 Zuk 등에 의해 처음 보고된 이래 paracrine effect 또는 differentiation을 통해 창상치유와 면역기능의 조절, 세포사 예방 등의 다양한 효과가 있음이 밝혀져 왔다.8,9 최근 지방유래줄기세포가 쥐에서 광노화로 유발된 주름을 개선시키고 in vitro 환경에서 collagen의 생성을 증가시키는 효과를 나타내는 것이

5

보고된 바 있다. 10, 11 본 연구에서는 다른 영향 요소가 배제된 in vitro 환경에서 지방유래줄기세포가 광노화된 인간섬유모세포에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 이를 위해 transwell을 통한 coculture와 cell conditioned medium 배양 환경에서 섬유모세포의 증식 및 이것이 합성하는 각종 단백질의 mRNA 생성량을 측정하여 지방유래 줄기세포가 광노화된 인간섬유모세포에 미치는 영향을 알아보았다.

6

II.II.II.II. 재료재료재료재료 및및및및 방법방법방법방법 1.1.1.1. 연구대상연구대상연구대상연구대상 3명의 건강한 피실험자로부터 진피 및 피하 지방을 동시에 얻었다. 조직은 연세대학교 의과대학 부속 세브란스 병원에서 양성 종양 절제 또는 유방 수술시 채취한 것으로 본 실험을 위해 환자의 동의를 얻은 후 각 세포를 배양하였다. 환자의 남녀비는 2:1이었으며 평균연령은 15.7세(8~22세)였다. 2.2.2.2. 인간섬유모세포의인간섬유모세포의인간섬유모세포의인간섬유모세포의 분리분리분리분리 및및및및 배양배양배양배양 절제해 낸 정상 피부에서 진피를 채취하여 잘게 조각을 낸 후 10% fetal bovine serum(FBS, Hyclone, Logan, Utah, U.S.A), 1% penicillin-streptomycin solution(SIGMA, Steinheim, Germany)이 포함된 DMEM/F12(Invitrogen, Grand Island, N.Y, U.S.A) 배지를 이용하여 Tissue culture dish(Bectkon Dickinson, Franklin Lakes, N.J, U.S.A)에 부착시켜 배양하였다. 기존의 연구 결과에 의하면 약 25세대까지는 비교적 young cell로 볼 수 있다고 하며 본 실험에서는 6-8 passage의 세포를 이용하여 실험하였다. 3.3.3.3. 지방유래지방유래지방유래지방유래 줄기세포의줄기세포의줄기세포의줄기세포의 분리분리분리분리 인체에서 피하지방조직을 얻은 후 2시간 이내에 37℃에서 30분간 collagenase(1mg/ml in DMEM/F12)에 incubation 시켰다. 이후 DMEM/F12 배지로 collagenase를 washing 하고 원심 분리한 후

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stroma-vascular fraction과 지방세포를 분리 하였다. stroma-vascular fraction에 있는 preadipocyte를 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone, Logan, Utah, U.S.A), 1% penicillin-streptomycin solution(SIGMA, Steinheim, Germany)가 포함된 DMEM/F12 (Invitrogen, Grand Island, N.Y, U.S.A) 배지에서 배양하여 지방유래 줄기세포를 획득하였다. 4.4.4.4. UVB UVB UVB UVB 노출에노출에노출에노출에 의한의한의한의한 광노화광노화광노화광노화 Fibroblast를 6well plate에 옮겨 담은 후 single dose의 UVB를 조사하여 광노화를 유도하였다. 이때 UVB lamp(Sankyo Denki, Japan)를 사용하여 100mJ/㎠를 조사하였다. 5.5.5.5. 배양배양배양배양 대조군을 포함 총 3종류의 배양을 시행하였다. 모든 군에서 6well plate에 세포 배양을 실시하였으며 3일간 증식 정도를 24시간 간격으로 측정하였다. (1) Control(대조군) 별도의 처리 없이 UVB에 노출시킨 인간섬유모세포를 10% FBS가 포함된 DMEM/F12 배지에서 3일간 배양하였다. (2) Transwell culture 1x105의 지방유래줄기세포를 transwell chamber(0.45 μm pores; collagen coated; Corning Costar, Cambridge, MA)에 넣고 아래쪽 well에 UVB에 노출시킨 인간섬유모세포를 넣어 10% FBS가 포함된 DMEM/F12 배지에서 3일간 co-culture

8

하였다. Transwell에서 배양한 지방유래줄기세포와 6well plate에서 배양하고 있는 인간섬유모세포를 co-culture하기 이전에 24시간동안 1x105의 인간섬유모세포를 0.1% FBS가 첨가된 DMEM/F12 배지에 두어 세포분열을 정지시켰다. Co-culture를 시행한 지 3일 후 아래쪽 well의 인간섬유모세포를 CCK-8 kit (Dojindo, Gaitherburg, MD)를 이용하여 세포 증식 정도를 측정하였는데 100ul의 CCK-8 solution을 첨가한 후 3시간 동안 incubation하고 450nm에서 absorbance를 microplate reader (TECAN, Grödig, Austria)를 이용하여 측정하였다. (3) Culture with conditioned medium 10% FBS가 포함된 DMEM/F12 배지에서 72시간 동안 배양한 1x105의 지방조직유래줄기세포를 원심분리(300G x 5 minutes & filtered 0.2μm syringe filter)하여 얻은 conditioned medium을 UVB에 노출시킨 인간섬유모세포와 함께 배양하였다. conditioned medium으로 배지를 바꾸기 24시간 이전에 1x105의 인간섬유모세포를 0.1% FBS가 첨가된 DMEM/F12 배지에 두어 세포분열을 정지시켰다. 이후 상기 방법으로 획득한 conditioned medium으로 배지를 바꾸어 3일간 배양하였다. 인간섬유모세포의 증식 정도는 CCK-8 kit(Dojindo, Gaitherburg, MD)를 이용하여 측정하였는데 방법은 전술한 바와 같다. 6. 결과측정결과측정결과측정결과측정 다음 (1), (2), (3)은 co-culture와 conditioned medium을 처리한

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지 24, 48, 72시간 후에 (4)와 (5)는 48시간 후에 측정하였다. (1) 현미경으로 중배율에서 섬유모세포의 형태를 관찰하여 노화를 확인하였다. 노화된 경우 세포의 형태는 편평해지거나 커지게 된다. (2) β-galactosidase activity level을 senescence detection kit (SIGMA, USA)을 이용하여 측정하였다. (3) 각군에서 CCK-8 kit을 이용하여 섬유모세포 수를 세어 세포 증식 정도를 확인하였다. (4) p16, collagen I, MMP-1의 발현 정도를 RT –PCR을 이용하여 측정하였다. RNAqueous®-Micro Kit(Ambion Inc., Austin, TX)을 이용하여 각 sample을 preparation하였다. Reverse transcription을 통해 RNA을 cDNA로 만드는 과정은 Power SYBR® Green RNA-to-CT™ 1-Step Kit(AppliedBiosystems, Darmstadt, Germany)을 이용하며 최종적인 assay는 Applied Biosystems 7500를 이용하였다. 자세한 protocol은 각 제조사의 이용 지침을 따랐다. Total RNA를 TRIzol(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 extraction시킨 후 cDNA synthesis kit(Promega, Madison, WI)을 이용하여 reverse transcription 시켰다. cDNA는 200U의 reverse transcriptase(M-MLV RT)와 20pM oligoT를 이용하여 1ug의 total RNA로부터 합성한다. 다음의 primer를 사용하였다.: p16(5’-AAATCGAAAATAAATAA CGTTTTCG-3’ and 5’-TAAACCCTTAACGATACGCTACG-3’), collagen type I(5’-tcaaggtttccaaggacctg-3’ and 5’-tcaaggtttccaaggacctg-3’), MMP-1(5’-CAT GAA AGG TGG ACC AAC AAT TT-3’, 5’-CCA AGA GAA TGG CCG AGT TC-3’), fibronectin(5’-

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tgaagaggggcacatgctga-3’ and 5’-gtgggagttgggctgactcg-3’) 각 단계에서의 세부적인 프로토콜은 kit제조사의 사용지침을 참고하였다. (5) Apoptosis양을 측정하였다. Apoptosis는 Annexin V-PI 염색을 이용한다. 이를 위해 세포를 PBS로 2회 세척한 후 0.1 M Hepes/NaOH (pH 7.4) 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2로 이루어진 binding buffer에 resuspension 시켰다. 총량을 10μL로 맞춘 후에 0.5μL의 Annexin V와 PI용액에 섞고 암실에서 15분간 vortexing 하였다. 40 μL의 binding buffer에 다시 섞고 flow cytometry로 분석하였다. 이러한 일련의 과정은 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit(BD Biosciences, USA)를 참고하였다. 7.7.7.7. 통계통계통계통계 모든 실험 결과는 평균 ± 표준 편차로 표시하였으며, 각 군간의 비교는 ANOVA test로 통계학적 유효성 여부를 검증하였다. p 값이 0.05 미만인 경우를 통계학적으로 유의한 것으로 평가하였다.

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III.III.III.III. 결과결과결과결과 1. 1. 1. 1. 세포세포세포세포 형태형태형태형태 및및및및 ββββ----galactosidasegalactosidasegalactosidasegalactosidase를를를를 이용한이용한이용한이용한 노화노화노화노화(senescence)(senescence)(senescence)(senescence)의의의의 확인확인확인확인 UVB를 조사한 후 24, 48, 72시간 후에 현미경을 이용하여 세포 형태 및 β-galactosidase 염색 정도를 확인하였다. 시간이 지날수록 세포의 편평화(flattening) 및 거대화(enlarging) 소견이 뚜렷하여 광노화가 일어났음을 확인할 수 있었다. β-galactosidase의 염색 정도도 최초에 비해 뚜렷이 증가하는 양상이었다(그림 1). 그림 1. UVB조사 후 24, 48, 72시간의 섬유모세포의 현미경소견 (x100). (β-galactosidase 염색 후 관찰) 각 시간대 모두에서 세포의 편평화 및 거대화 소견이 관찰되었으며 β-galactosidase 염색양상도 뚜렷하여(녹색) 광노화가 진행되었음을 확인할 수 있었다.

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1.1.1.1. 각각각각 실실실실험군에서험군에서험군에서험군에서 섬유모세포의섬유모세포의섬유모세포의섬유모세포의 증식증식증식증식 정도정도정도정도 비교비교비교비교 24시간까지는 큰 차이를 보이지 않다가 48시간 후에 conditioned medium, co-culture의 순으로 생존 세포수가 증가되어 있는 양상이었다. 72시간에는 모든 군에서 세포 생존이 48시간 보다 감소하지만 conditioned medium은 여전히 다른 군에 비해 높은 생존률을 보였다(그림2).

그림 2. 각 실험군의 세포 증식 정도 비교. 24시간에는 차이를 보이지 않다가 48시간 이후 conditioned medium에서 가장 높은 생존 세포수를 보였다. (*p<0.05, **p<0.01)

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2.2.2.2. Type I collagen, MMPType I collagen, MMPType I collagen, MMPType I collagen, MMP----1, p161, p161, p161, p16의의의의 발현량발현량발현량발현량 비교비교비교비교 Real time RT PCR을 이용하여 type I collagen, MMP-1, p16의 발현 정도를 비교하였다. 이 실험은 48시간째에 진행되었는데 preliminary 실험에서 지방유래 줄기세포의 효과가 24, 48, 72시간 중 48시간째에 극대화되는 것으로 나타났기 때문이다. Type I collagen의 경우 세 실험군 간에 통계적으로 유의한 차이를 보이지는 않았으나 co-culture, conditioned medium, control의 순으로 실험군에서 보다 많은 collagen이 생성되는 경향을 보였다. MMP-1의 경우에는 co-culture와 conditioned medium 모두에서 발현이 감소하였으며 p16 역시 co-culture와 conditioned mediuim 모두에서 통계적으로 유의하게 발현이 감소하였다.

그림 3. 48시간에 측정한 type I collagen, MMP-1, p16의 발현 정도. 지방유래줄기세포를 투여한 군에서 MMP-1과 p16이 발현이 통계적으로 유의하게 감소하였다. (*p<0.05, **p<0.01)

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3.3.3.3. Annexin VAnnexin VAnnexin VAnnexin V를를를를 이용한이용한이용한이용한 apoptosis apoptosis apoptosis apoptosis의의의의 양상양상양상양상 비교비교비교비교 Co-culture와 conditioned medium을 apply한지 48시간 후에 각 실험군을 비교하였다. 3명의 실험 대상자로부터 3번의 실험을 반복하였으며 모든 대상자에서 viable cell의 양에는 큰 차이가 없었으나 necrotic portion의 세포 수는 줄어드는 대신 apoptotic cell의 양이 증가하는 경향을 보였다. 그림에는 대표적인 한 명의 flow cytometry 결과를 표시하였다.

Quad Events %Gated %Total UL 390 4.64 3.90 UR 32 0.38 0.32 LL 7,947 94.45 79.47 LR 45 0.53 0.45 Total Event : 10,000 Quad Events %Gated %Total UL 115 1.36 1.15 UR 108 1.28 1.08 LL 8,025 94.94 80.25 LR 205 2.43 2.05 Total Event : 10,000

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그림 4. 48시간에 시행한 apoptosis assay. 위: 대조군, 중간: conditioned medium, 아래: co-cluture. Annexin V와 PI 염색 후 FACS analysis를 시행하였다. 생존 세포수는 각 군이 비슷하였으나 conditioned medium과 co-culture군에서 대조군에 비하여 necrotic cell은 줄고 apoptotic cell이 증가하였다.

Quad Events %Gated %Total UL 49 0.60 0.49 UR 105 1.29 1.05 LL 7,752 95.09 77.52 LR 246 3.02 2.46 Total Event : 10,000

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IV.IV.IV.IV. 고찰고찰고찰고찰 줄기세포는 분화(differentiation)와 주변분비(paracrine)라는 두 가지 기전을 통해 의학의 다양한 영역에서 많은 가능성을 보여주고 있다. 특히 지방유래줄기세포는 얻기가 쉽고 그 양이 풍부하며 윤리적 걸림돌도 없어 임상에 이용되기에 매우 유리한 조건을 갖추고 있다. 본 연구는 이러한 다양한 긍정적 효과를 가지고 있는 지방유래 줄기세포가 피부의 노화에 어떠한 영향을 미치는 지에 대해 알아보았으며 이를 위해 피부 구조에서 가장 중요한 역할을 하고 있는 세포인 섬유모세포를 중심으로 실험을 진행하였다. 실험은 섬유모세포의 노화 시 나타나는 여러 현상들이 줄기 세포를 통하여 역전될 수 있는지, 알려진 노화의 유전적 지표들이 역전 되는지, 그리고 노화의 결과 나타나는 apoptosis의 양상은 어떻게 변하는지를 알아봄으로써 노화, 자연사, 발암이라는 세포의 운명에 줄기세포가 미치는 영향에 대해 이해해 보고자 하였다. 또한 실험 모델을 지방유래줄기세포와 섬유모세포를 함께 배양하는 모델(co-culture)과 세포 배양액을 이용하는 모델(conditioned medium)로 나누어 동일 조건에서 비교하였으며, 이를 통해 실제 임상에서 응용할 수 있는 효과적인 줄기세포를 이용 방법에 대한 단서를 얻고자 하였다. 노화에는 크게 내인성 노화와 외인성 노화가 있으며 본 연구에서는 UVB를 이용한 외인성 노화, 즉 광노화를 유도한 후 실험을 진행하였다. 결과에서 제시한 바와 같이 UVB에 의한 광노화는 세포의 모양 변화와 β-galactosidase 염색을 통하여 확인한 후 transwell 배지를 이용한 co-culture 모델과 conditioned medium을 이용한 모델로 나누어 실험을 진행하였다.

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CCK-8을 이용한 세포 증식능 비교에서 24시간까지는 각 실험군 간에 유의한 차이가 없었다. 48시간에는 conditioned medium, transwell coculture, 대조군의 순으로 증식을 보이다가, 72시간에는 transwell coculture의 증식률이 현저히 떨어지면서 대조군과 통계적 차이가 소실되었다. 72시간의 conditioned medium 그룹의 경우 48시간보다는 세포수가 감소하였으나 대조군 보다 월등히 많은 세포 생존률을 보였다. 본 연구는 배양기법상 지방유래줄기세포의 분화 differentiation)보다는 주위분비능(paracrine effect)에 초점을 맞추 었으며 이러한 실험 결과는 지방유래줄기세포가 본 실험의 배양 조건에서 섬유모세포의 증식을 유도하는 물질들을 다량 분비하고 있음을 의미한다고 할 수 있을 것이다. transwell co-culture에서 48시간에는 세포의 증식이 일어났으나 72시간에 급격히 이러한 경향이 감소한 것은 지방유래줄기세포와 섬유모세포간 신호 전달과정에서 더 이상의 증식이 일어나지 않는 방향으로 지방유래줄기세포가 작용하였기 때문으로 추측할 수 있다. 이는 지방유래줄기세포의 세포증식을 유도하는 분비능이 매우 강력하지만 이러한 능력이 통제 및 조절되고 있다는 반증으로 생각된다. 48시간째에 지방유래줄기세포에 의한 섬유모세포의 증식이 최대로 일어남을 확인한 후 이 시간대에 각 단백질의 생성량을 real time RT PCR을 이용하여 측정해 보았다. 우선 피부에 가장 흔히 존재하는 type I collagen을 측정해 본 결과 대조군보다 co-culture 또는 conditioned medium 그룹에서 collagen 생성의 절대치는 늘어났음을 확인할 수 있었으나 통계적 유의성은 발견할 수 없었다. 하지만 광노화를 시작시키는 물질로 알려져 있는 MMP-1을 측정해 본 결과 대조군에 비하여 두 실험군에서 현저하게 생성량이 감소했음을 확인할 수 있었다. 특히, 두 실험 군 중 conditioned medium에서

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더욱 현저한 MMP-1의 감소를 보였다. 광노화를 매개하는 수많은 단백질 중 극히 일부만 확인한 결과이지만 이는 지방유래줄기세포의 주위 분비 작용을 통해 광노화가 차단될 수 있음을 시사해주는 결과라고 생각된다. 한편, p16은 종양억제 유전자의 하나로 대표적인 노화의 지표로 알려져 있다. 진피 및 거의 모든 장기의 세포에 존재하고 있으며 이 유전자의 양과 노화는 비례관계에 있음이 기존의 여러 연구 결과에서 밝혀진 바 있다. p16은 세포주기를 조절하는 유전자로서 발현되면 G1 phase에서 arrest가 일어나고 세포 증식이 멈추게 되면서 노화가 일어난다. 12, 13 p16의 발현량을 살펴본 결과 대조군에 비하여 두 실험군 모두에서 비교적 큰 폭의 감소를 보여 노화가 역전될 가능성을 확인할 수 있었다. 이는 단순히 지방유래줄기세포의 주위 분비 작용이 섬유모세포의 단백질 분비를 조절하는 작용에만 국한되어 있는 것이 아니라 근본적으로 세포의 노화를 역전시킬 수 있다는 단서를 제공하는 결과라고 생각된다. 지방유래줄기세포가 특정 세포가 필요한 환경에서 그 세포로 분화하여 조직의 항상성을 유지할 수 있는 것으로 생각되어 왔으나 본 실험 결과에 의하면 주위 분비능(paracrine effect)에 의해 기존의 세포 환경을 개선시키는 것으로 생각되며 이는 성형외과적으로 응용 가능성이 높다고 볼 수 있다. 기존의 연구에서 지방유래줄기세포의 항산화 효과 및 anti-apoptotic 효과가 밝혀진 바 있다.14 본 실험의 결과가 줄기세포가 분비하는 여러 cytokine과 항산화 효과 때문일 것으로 추측할 수는 있으나 정확히 어떤 cytokine과 기전에 의해 유전자 수준에서까지 항노화 현상이 일어나는지에 대해서는 추가적인 실험이 필요할 것으로 생각된다. 다른 보고에서도 본 실험에서와 유사하게 지방유래줄기세포의

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conditioned medium이 섬유모세포의 proliferation을 촉진시키고 이것의 collagen 생성을 증가시키며 MMP-1 생성은 감소시킨다는 결과와 피부에서 항노화 효과가 있음을 밝힌 바가 있다.15 이 논문에서 저자들은 지방유래줄기세포의 conditioned medium과 섬유모세포의 conditioned medium을 비교하였고 이러한 효과가 지방유래줄기세포에서 일어나는 특이한 결과임을 증명하였다.11 본 실험은 이러한 사실에 더하여 지방유래줄기세포와의 co-culture와 지방유래줄기세포에서 얻은 conditioned medium의 효과를 비교 하였고 더 나아가 유전자 수준에서 노화의 역전을 확인하였으며 세포 사멸 양상을 비교함으로써 임상 적용에서의 가능성을 높이고자 하였다. 세포 사멸 정도를 측정해본 결과 생존해 있는 세포(viable cell)이 전체에서 차지하는 비율은 거의 변화가 없었으나 necrotic cell은 현저히 줄어들었으며 이에 반해 apoptotic cell은 그만큼 늘었다. 이를 어떻게 해석할 것인가는 논란의 여지가 있으나,16 일반적으로 괴사(necrosis)보다 apoptosis가 더 생리학적인 과정임을 고려한다면 지방유래줄기세포는 광노화시킨 섬유모세포를 정상적인 세포사 쪽으로 유도하여 발암 가능성을 낮추는 역할을 하는 것으로 생각된다. 이는 그동안 지방유래줄기세포가 발암의 가능성 때문에 임상적 사용에 어려움이 있었다는 점을 고려하면 매우 희망적인 결과로 생각되나 in vitro 환경에서 섬유모세포에 대한 영향만 측정한 결과이므로 실제 임상적용을 위해서는 보다 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다. 또한, 발암단계에서는 세포의 출생(birth) 및 사망(apoptosis)이 모두 증가한다는 보고도 있으므로 해석에 보다 주의가 필요할 것이다. 또한 다른 연구에서는 지방유래줄기세포가 apoptosis를 감소시켜 전체적인 cell viability를 증가시켰다는 보고도

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있었는데14 결과적으로는 necrotic cell을 apoptotic cell로 apoptotic cell들은 viable cell로 전환시켰다는 점에서 의미 있는 결과로 해석할 수 있을 것으로 생각된다. Conditioned medium과 co-culture간의 결과를 비교해보면 세포증식률에서는 전자가 보다 좋은 효과를 보였고 MMP-1 감소량, apoptosis에서는 transwell을 이용한 co-culture가 보다 좋은 효과를 보였으며, type I collagen 생성량 및 p16발현 감소 정도는 양쪽이 비슷하였다. 하지만 결론적으로 두 가지 방법 모두에서 비슷한 경향으로 광노화의 역전에 긍정적인 결과를 보였다. 특히, conditioned medium은 인체에 적용도 쉬워 임상적 사용이 용이할 것으로 생각된다. 세부적인 측정 항목에서 두 실험군이 다소 다른 결과를 보인 것은 세포간 교류(cell to cell communication)에 의한 것으로 생각되나 본 연구에서는 기전까지 다루지는 않았으므로 차이의 원인까지 밝히는 것은 다소 무리가 있었다. 하지만 본 연구를 통해 단순히 지방유래줄기세포가 분비한 수용성인자(soluble factor)에 의한 배양 결과와 transwell을 이용해 지방유래줄기세포와 섬유모세포를 함께 배양했을 때의 결과가 유사하지만 다른 점도 있다는 것은 지방유래줄기세포 외의 환경이 지방유래줄기세포에 미치는 영향이 분명히 있으며(feedback mechanism) 이에 의해 지방유래줄기세포의 기능도 달라질 수 있음을 시사한다고 할 수 있을 것이다. 이에 대해서는 추가적인 연구가 필요하리라고 생각된다. 본 연구가 기존에 이루어진 지방유래줄기세포의 항노화 연구10,15보다 의미 있는 이유는 다음과 같다. 첫째로 실제 임상에서 지방유래줄기세포를 항노화 목적으로 사용하려 할 경우 직접 세포를 투여하는 방법과 conditioned medium을 투여하는 방법을 고려할 수 있는데 본 실험은 이중 어떠한 방법이 더 우월한지에 대한 단서를

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제공하였다. 또한 Annexin V-PI 염색 및 flow cytometry를 이용해 apoptosis의 양상을 비교함으로써 UV로 인한 cytotoxicity에 의해 nonviable해진 섬유모세포의 운명을 추적하여 지방유래줄기세포 또는 그 conditioned medium이 cytotoxicity를 줄여줄 수 있다는 결론을 얻을 수 있었다. 이에 더하여 대표적인 aging marker gene인 p16의 발현 정도를 측정함으로써 이러한 항노화 또는 항독성 효과가 단순히 단백질 분비를 통해 이루어지는 것이 아니라 유전자 수준에서 항노화가 이루어지고 있을 것이라는 단서를 얻을 수 있었다. 이러한 점들이 본 연구가 기존에 이루어졌던 연구에 더하여 임상적 응용의 가능성을 높인 부분이라 할 수 있을 것이다.

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V.V.V.V. 결론결론결론결론 본 연구에서는 in vitro 환경에서 광노화시킨 섬유모세포에 지방유래 줄기세포가 미치는 영향을 알아보았으며 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. 지방유래줄기세포는 transwell co-culture와 conditioned medium을 이용한 섬유모세포의 배양에서 노화를 어느 정도 역전 시키는 효과를 보인다. 2. 지방유래줄기세포의 conditioned medium이 transwell co-culture 배양에 비해 섬유모세포의 증식과 MMP-1의 감소를 더 많이 일으킨다. 3. 지방유래줄기세포는 transwell co-culture와 conditioned medium을 이용한 섬유모세포의 배양에서 광노화된 섬유모세포의 괴사를 줄이고 apoptosis를 늘려 보다 physiological한 cell cylcle이 되게 한다.

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AbstractAbstractAbstractAbstract Effect of Adipose Derived Stem Cells

on UVB Irradiated Human Dermal Fibroblast

: in vitro model

Jong Hee Lee

Department of Medicine

The Graduate School, Yonsei University

(Directed by Professor Kwan Chul Tark)

Many studies were conducted using adipose derived stem cell. It exerts favorable effects on various human diseases via differentiation and paracrine effect. Recent study revealed that adipose derived stem cells might have anti-aging action in skin. Ultraviolet light is a dominant factor of extrinsic skin aging. Especially, UVB(Ultraviolet B) is mainly associated with photoaging. Fibroblast of human dermis produces and regulates extracellular matrix and also produces multiple cytokines and glycoproteins. It has a crucial role in maintaining youthful skin. But when skin was exposed by UV, collagen degradation was promoted and procollagen production was decreased.

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In vitro culture model was designed for investigation of effect between adiposed derived stem cell and photoaged human dermal fibroblast. Primary human fibroblasts were obtained from fat tissue was harvested from three healthy donors. They were cultured separately, and UVB was irradiated to fibroblast and the photoaging of primary human fibroblasts was introduced by UVB irradiation and confirmed by microscopic observation and β-galactosidase staining. The first study group was transwell coculture model and the second group was fibroblast culture with conditioned medium. The last group was control. The control group was only irradiated by UVB and no other procedure was done. Proliferation of fibroblast was measured with CCK-8 kit at 24, 48 and 72 hours. Type I collagen, matrix metalloproteinase-1, p16 production were measured by real time PCR and apoptosis was also measured using annexin-V stain in each study group. Fibroblast, exposed to UVB, showed microscopic phenotype photoaging and induced β-galactosidase activities which is one of characteristics of senescence. Proliferation assay revealed increased viable cell count was noted in order of conditioned medium, transwell coculture and control at 48 hours. Real time RT-PCR was also conducted at 48 hours. Two study groups showed the decrease in MMP-1 and p16 compared with control, but no difference in type I collagen production. Two study groups showed the decrease in necrotic portion but the increase in apoptotic portion. Adipose derived stem cell induced proliferation of photoaged

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human dermal fibroblast and decreased p16 and MMP-1. So, It seemed to reverse cellular aging. Adipose derived stem cell leads photoaged dermal fibroblast to more natural course of cell destiny by decreasing necrotic portion and increasing apoptotic portion of the photoaged fibroblast. -----------------------------------------------

Key Words : adipose derived stem cell, human dermal

fibroblast, antiaging, Ultraviolet B