Índices químicos para caracterização de fármacos lipídicos

Índice de Saponificação.

Define-se o Indice de saponificação como o número de miligramas de hidróxido de Potássio necessários para saponificar os ésteres e neutralizar os ácidos gordos

livres de 1 grama de amostra. O hidróxido de Potássio em meio alcoólico e a quente, saponifica os ésteres

e neutraliza os ácidos. A quantidade deste reagente, consumida nestas condições e relativamente a um peso determinado de amostra, é um indicador quantitativo dos ésteres e dos ácidos livres presentes. No caso dos óleos, o seu valor é interpretado como indicador de qualidade, atendendo à sua dependência da massa molar dos compostos predominantes em análise (os triacilglicerol) e, consequentemente, da massa molar dos ácidos gordos que os constituem. Para cada óleo o índice de saponificação assume valores de intervalos estreitos e bem determinados.

O método proposto para determinação do índice de saponificação baseia-se

no doseamento, por titulação com um ácido diluído, do KOH não consumido em condições saponificação da amostra com um excesso deste reagente.

A realização simultânea de um ensaio branco permite por diferença calcular a quantidade de KOH que reage com o peso de amostra tomado para o ensio real.

Índices de Hidroxiácidos

Índice de Hidroxilo

Exprime-se o índice de hidroxilo no número de miligramas de hidróxido de potássio necessário para neutralizar o ácido acético que se combina por

acetilação com os hidroxilos livres de 1 grama de amostra. O valor deste índice é um indicador quantitativo sobre a composição da

amostra em compostos hidroxilados. A determinação é valiosa para a caracterização de fármacos gordos cuja

composição inclui percentagens significativas de compostos hidroxilados, em especial ésteres de ácidos gordos hidroxilados. É o caso do óleo de rícino cuja composição inclui cerca de 90% de ricinoleína, o éster glicérico de ácido ricinoleico (12-hidroxi-9-octadecenoico).

Um método proposto para a determinação recomenda a acetilação com

anidrido acético, em excesso, na presença de piridina. Esta desempenha o papel de catalizador da condensação e diluente do anidrido acético. Após a acetilação o anidrido acético não consumido na reacção é hidrolisado e o ácido acético titulado com uma solução de hidróxido de potássio. A execução em paralelo de um ensaio branco, que avalia o ácido acético total, permite por diferença determinar o ácido acético que se combina por acetilação com o peso de amostra tomado para o ensaio.

Devido ao fundamento deste método, o valor determinado pode vir afectado

de erros. Por exemplo, os ácidos livres presentes na amostra são neutralizados pelo hidróxido de potássio titulante, o que implica que em amostras extensamente hidrolisadas o valor do índice de hidroxilo determinado possa vir afectado por defeito. O valor desse erro é igual ao valor do índice de ácido da amostra.

Determinação do Índice de hidroxilo

Ensaio real

O

O

O

CH3

CH3

+ R-OH

>Piridina CH COO-R + CH COOH3 3

Acetilação

O

O

O

CH3

CH3

>H O

2 CH COOH32

Hidrólise do anidrido acético

>FenolftaleínaCH COOH3 + KOH CH COOK + H O3 2

Titulação do ácido acético

Ensaio branco

Cálculo

Seja: «P» o peso de amostra tomado para o ensaio; «C» a concentração do hidróxido de potássio titulante; «vr» o volume de titulante consumido no ensaio real; «vb» o volume de titulante consumido no ensaio branco.

1000ml de KOH M <> 56,1g de KOH (massa molar do KOH) 1000ml de KOH C <> C x 56,1g de KOH 1ml de KOH C <> C x 56,1mg de KOH (vb-vr)ml de KOH C <> (vb-vr) x C x 56,1mg de KOH então,

(vb-vr) x C x 56,1mg de KOH <> P I.H. <> 1g de amostra

e o Índice de Hidroxilo é dado pela expressão:

I Hv v C

Pb r

. .( ). . ,

�� 56 1

Índice de Hidroxilo Reagentes: Anidrido acético 25 g Piridina Álcool 95º Solução aquosa KOH 0,5 M Solução alcoólica de fenolftaleína a 1%

Preparação da mistura acetilante: Solubilizar 25 g de anidrido acético em piridina q.b.p. 100ml.

Ensaio:

Lançar num balão de acetilação o peso de amostra (fármaco com lípidos) e o volume de mistura acetilante adequados, em função do índice de hidroxilo previsto para a amostra em análise.

Índice previsto Peso de amostra (g) Mistura acetilante (ml) de 10 a 100 2,000 5

de 100 a 150 1,500 5 de 150 a 200 1,000 5 de 200 a 250 0,750 5 de 250 a 300 1,200 10 de 300 a 350 1,000 10

Adaptar um condensador de refluxo e aquecer em banho de água fervente durante 1 hora. Assegurar que o conteúdo do balão fica abaixo da superfície da água do banho. Executar paralelamente um ensaio em branco. Deixar arrefecer e promover a hidrólise do anidrido acético, por adição, através do condensador, 5ml de água. Se se formar turvação adicionar algumas gotas de piridina.

Aquecer de novo o balão em banho de água por mais 10 minutos..

Deixar arrefecer e adicionar através do condensador 5ml de álcool 95º neutralizado a fim de lavar o condensador e o colo do balão.

Retirar o condensador e dosear o ácido acético com uma solução de KOH 0,5 M, em presença de fenolftaleína.

Calcular o Índice de hidroxilo.

I Hv v C

Pb r

. .( ). . ,

�� 56 1

«P» - Peso de amostra tomada para o ensaio.

«vb» - Volume de KOH consumido no ensaio em branco. «vr» - Volume de KOH consumido no ensaio real.

Índices de ácidos insaturados

A importância dos índices de insaturação deve-se ao facto de constituirem indicadores quantitativos dos fármacos com lípidos sobre o teor em ácidos insaturados e respectivos ésteres e eventualmente do tipo de insaturação.

Os métodos de determinação dos índices de ácidos insaturados fundamentam-se na formação de compostos de adição. A adição aos carbonos insaturados das cadeias carbonadas dos ácidos pode realizar-se à custa de diversos reagentes, normalmente seleccionados pela forma particular como adicionam, permitindo enunciar diversos índices de insaturação. Cada um deles exprime situações particularidades de insaturação. Interpretados em conjunto podem revelar aspectos que contribuem para a identificação ou elucidação estrutural da cadeia carbonada de ácidos gordos insaturados, especialmente no que respeita ao grau de insaturação e posição das insaturações.

Índice de Hidrogenação Define-se como a percentagem de hidrogénio expressa em Iodo, adicionada

pelo fármaco com lípidos. A adição de hidrogénio e consequentemente a determinação do índice exige

equipamento especial, hidrogenadores com catalizadores metálicos. É um índice com um interesse limitado a áreas específicas da investigação, quando a adição de ouros reagentes, ou seja, outros índices de insaturação se demonstram ineficazes. (ligações duplas nos carbonos adjacentes ao grupo carboxilo, etc..)

Índice de Sulfocianogénio Define-se como a percentagem de sulfocianogénio expressa em Iodo

adicionada pela amostra. A importância deste índice resulta da forma particular como o reagente,

sulfocianogénio, reage com alguns ácidos gordos insaturados: adiciona apenas uma das duas ligações do ácido linoleico e duas do ácido linolénico.

O seu valor analítico, depende da realização conjunta do Indice de Iodo, permitindo por comparação, avaliar da composição de ácidos poliinsaturados na amostra.

Índice diénico

Define-se como a percentagem de anidrido maleico, calculada em Iodo, que

reage com a amostra. Baseia-se na propriedade dos compostos com duplas ligações conjugadas

poderem cicloadicionar o anidrido maleico de acordo com a reacção de Diels e Alder.

É o único indice de insaturação que revela especificamente ácidos com duplas ligações conjugadas.

Índice de Iodo O índice de Iodo é número de gramas de halogénio, expressa em Iodo

fixados por adição, por 100 gramas de amostra. Para a sua determinação faz-se reagir um halogénio com um peso rigoroso

de amostra, doseando-se posteriormente o excesso do halogénio, salvaguardando-se que os compostos halogenados formados sejam apenas compostos de adição.

A primeira regra a observar para que se formem apenas compostos de adição e não de substituição, é conduzir a reacção de halogenação na ausência de luz. Apesar deste cuidado, a escolha do halogénio reagente é também crítica, já que alguns não manifestam reactividade suficiente para que a reacção seja quantitativa. Em contrapartida outros halogénios reagem tão violentamente, que não só se formam compostos de adição, como também compostos de substituição.

Assim para a determinação do índice de Iodo preconiza-se o monobrometo de Iodo, (BrI), cuja reactividade é adequada aos fins propostos.

Os ácidos insaturados não reagem todos na mesma extensão: os ácidos da série oleica, monoinsaturados, reagem rapidamente e quantitativamente (2 átomos de Iodo). Da mesma forma reagem os ácidos di-insaturados com ligações não conjugadas. A existências de duas ligações conjugadas, implica uma menor reactividade, daquela que estiver mais afastada do grupo carboxilo. Em ácidos com três ligações duplas conjugadas, a intermédia dificilmente adiciona halogénio, fixando-se apenas 2/3 da quantidade de halogénio prevista. As ligações triplas adicionam apenas metade dos átomos de halogénio previstos.

Índice de Iodo

Ensaio real

R R´ + BrI R R´

Br

I

Reacção de adição abrigo da luz com excesso de BrI

BrI + KI > KBr + I2

O BrI não consumido é convertido em Iodo por reacção com iodeto de Potássio

I2 + Na2S2O3 > 2 NaI + Na2S4O6

O Iodo formado é doseado pelo tiossulfato

Ensaio branco

Cálculo

Seja: «C» a concentração do tiossulfato titulante; «vr» o volume de titulante consumido no ensaio real; «vb» o volume de titulante consumido no ensaio branco; «P» o peso de amostra tomado para o ensaio. então, 1000ml de Na2S2O3 N <> 126,9 g de Iodo (equivalente grama do Iodo na

reacção) 1000ml de Na2S2O3 C <> C x 126,9 g de Iodo 1ml de Na2S2O3 C <> C x 0,1269 g de Iodo (vb-vr) ml de Na2S2O3 C <> (vb-vr) x C x 0,1269 g de Iodo ou seja, (vb-vr) x C x 0,1269 <> P I.I. <> 100g e o índice de Iodo dado por;

I Iv v C

Pb r

. .( ). , .

�� 12 69

Índice de Iodo Reagentes: Bromo Iodo Sol. de Iodeto de Potássio a 10%. Clorofórmio Solução de tiossulfato de Sódio 0,1 M Solução de amido a 0,2%. Preparação da solução de monobrometo de Iodo:

Misturar 6,1g de Iodo e 3,9g de Bromo e promover a sua dissolução em 500ml de ácido acético glacial.

Ensaio:

Pesar para um balão cónico de rolha esmerilada de 200 a 300ml (balão de Indice de Iodo) a quantidade de amostra (fármaco com lípidos) adequada ao Indice de Iodo previsto.

Peso de amostra (g) Índice de Iodo previsto

1,00 < 20 0,50 a 0,25 20 a 60 0,25 a 0,15 60 a 100 0,15 a 1,00 > 100

Solubilizar a amostra em 15ml de Clorofórmio e adicionar 25ml de solução de BrI, rigorosamente medidos. (O reagente é volátil e tóxico).

Rolhar e guardar ao abrigo da luz, para evitar a formação de compostos de substituição, durante uma hora, agitando de vez em quando.

Adicionar 10ml de solução de Iodeto de Potássio a 10%, isenta de Iodo livre, e 100ml de água, lavando com ela a rolha e o interior do colo do balão.

Titular o Iodo libertado com tiossulfato de Sódio 0,1 M, de início directamente até o titulado apresentar uma côr amarela pálida, depois em presença de cerca de 2ml de água de amido a 0,2%, até desaparecimento da coloração azul.

Praticar paralelamente um ensaio branco. Calcular o Índice de Iodo,

I Iv v C

Pb r

. .( ). , .

�� 12 69

«vb» - volume de tiossulfato consumido no ensaio branco. «vr» - volume de tiossulfato consumido no ensaio real.

«C» - concentração da solução de tiossulfato. «P» - Peso de amostra tomada para o ensaio.

Índices químicos para avaliação de alterações dos fármacos com lípidos

Alterações oxidativas

Designa-se por ranço a alteração oxidativa dos fármacos com lípidos, que

origina a formação de compostos carbonílicos de baixo peso molecular, voláteis, que impressionam os sentidos do olfacto e do paladar de forma particular.

É usual, por motivos meramente didáticos, distinguir dois tipos de ranço com base, quer na causa do processo oxidativo, quer no tipo de compostos resultantes. Surgem então as designações de ranço cetónico e de ranço aldeídico.

Caracteriza-se o ranço cetónico pela formação, durante o processo oxidativo, de metilcetonas e relaciona-se com a acção oxidativa de certos microorganismos.

O ranço aldeídico, caracterizado pela formação de aldeídos de baixo peso molecular, em especial com 7, 8 e 9 carbonos, relaciona-se com a acção oxidante do oxigénio do ar, e com a intervenção da luz.

A formação de ranço aldeídico implica a oxidação pelo oxigénio do ar dos ácidos gordos, em especial o oleico e os da sua série, com formação de peróxidos, insípidos e inodoros, e a consequente degradação destes, por mecanismos de radicais livres, com formação dos compostos carbonílicos. É usual dividir-se o processo de formação de ranço aldeídico em duas etapas: a primeira a que se dá o nome de Fase de Indução de Ranço ou Periodo Incipiente de Ranço, que coincide com a formação dos peróxidos; a segunda a que se dá o nome de Fase de decomposição dos peróxidos e que corresponde à degradação destes com formação dos compostos carbonílicos.

Ensaios para pesquisa de Ranço Aldeídico Pesquisa dos caracteres organolépticos.

Entende-se por caracteres organolépticos o conjunto de propriedades directamente apreciáveis pelos orgãos dos sentidos.

Para a pesquisa de ranço têm especial valor o odor e o gosto do fármaco em análise. Os compostos carbonílicos formados durante a fase de decomposição dos peróxidos, são voláteis e capazes de impressionar os sentidos do olfacto e do paladar de forma particular. Por outro lado, estes sentidos mostram elevada sensibilidade a tais estímulos, reconhecendo o odor e o sabor particular desses compostos, mesmo quando existentes em quantidades vestigiárias. Por estes motivos, e também porque outros testes concebidos para a pesquisa de ranço podem indicar falsos resultados, o teste torna-se de grande utilidade, sobrepondo-se a sua indicação, quando positiva, a qualquer indicação contrária de outro teste de pesquisa da alteração.

Teste de Fellenberg.

Este teste tem por base a pesquisa de compostos com grupo funcional aldeídico, que como já referido atrás, se formam na decomposição dos peróxidos. Fundamenta-se no facto de estes compostos restituirem a côr violeta-avermelhada ao reagente de Schiff, fucsina descorada pelo metabissulfito.

Refira-se que este método apresenta frequentemente falsos resultados, pelo que a interpretação dos seus resultados deve ser cautelosa e acompanhada pelos resultados de outros testes.

Teste de Kreiss.

Este teste tem por base a pesquisa de um composto particular que se forma no processo de oxidação dos fármcos com lípidos. Trata-se do aldeído epihidrínico que ocorre na amostra sob a forma de dietilacetal.

O aldeído epihidrínico reage com o floroglucinol em solução etérea, formando um composto de coloração avermelhada. Note-se que para que a reacção ocorra é necessário hidrolizar o dietilacetal do aldeído epihidrínico à custa de um ácido mineral forte. Tal como o anterior, este teste apresenta frequentemente falsos resultados negativos. A elevada volatilidade, quer do dietilacetal, quer do próprio aldeído, e a libertação de calor da reacção de hidrólise, fortemente exotérmica, contribuem para a perda do composto. Por outro lado falsos resultados positivos, podem também ser encontrados em amostras não oxidadas mas sujeitas a exposição luminosa e/ou envelhecidas.

Indice de peróxido.

Todos os ensaios atrás referidos para pesquisa de ranço nos fármacos com lípidos, estão orientados no sentido de pesquisar propriedades ou compostos característicos do ranço, mas note-se que quer os compostos carbonílicos, quer o dietilacetal do aldeído epihidrínico são produtos da decomposição dos peróxidos. Note-se também que o cheiro e sabor característicos do ranço são devidos aos compostos carbonílicos formados nessa fase, já que os peróxidos se revelam insípidos e inodoros. Pode então concluir-se que quer os caracteres organolépticos da amostra, quer os resultados dos testes de Fellenberg e de Kreiss são indicadores de ranço se o processo oxidativo tiver atingido a fase de decomposição dos peróxidos.

Na verdade, a alteração ranço inicia-se antes de qualquer daqueles indicadores possa acusar a sua existência. Os peróxidos formados na primeira fase de ranço são já produtos da oxidação dos lípidos.

Para que a pesquisa da alteração ranço seja completa será necessária a pesquisa, ou mesmo a quantificação, dos peróxidos existentes.

O índice de peróxido relaciona-se quantitativamente com os peróxidos existentes. A Farmacopeia Portuguesa VI, define-o como o número de miliequivalentes de oxigénio activo por 1000g de fármaco.

A determinação baseia-se na oxidação do iodeto, em meio acético, pelos

peróxidos com doseamento posterior do Iodo formado com tiossulfato. A execução simultânea de um ensaio branco elimina a interferência de Iodo contaminante da solução de Iodeto.

Indice de Peróxido O índice de peróxido, representa o número de miliequivalentes de Oxigénio

activo por quilograma de amostra. O2 + 4H+ + 4e- --------- 2H2O I2 +2 e- ---------------------------- 2 I-

2 I- --------------------------- I2 +2 e- 2S2O32- ---------------------S4O6

2- + 2 e-

___________________________ ________________________________

O2 + 4H+ + 4 I- ---------- H2O + 2I2 2 S2O32- + I2--------- 2 I- + S4O62-

O2 + 4H+ + 4 I- ---------- 2H2O + 2I2

4 S2O32- + 2I2 --------- 4 I- + 2S4O62-

_____________________________________

O2 + 4H+ + 4 S2O32- -------- 2H2O + 2S4O62-

1 eq (O2) --- 1 eq (S2O32-) 1000 ml Na2S2O3 0,01 N ---------- 0,01 eq Oxigénio activo

1 ml Na2S2O3 0,01 N -------------- 0,01 meq Oxigénio activo (n1 - n2) ml Na2S2O3 0,01 N ------------------ (n1 - n2) x 0,01 meq Oxigénio

activo

(n1 - n2) x 0,01 meq Oxigénio activo ---------- m IP -------------------------------------1000 g

IP = ( - ) x 101 2n n

�

Pesquisa de alterações oxidativas nos fármacos com lípidos

Índice de Peróxido (F.P. VI)

Reagentes: Ácido acético Clorofórmio Solução saturada de KI Tiossulfato de Sódio 0,01 M Ensaio:

Num matraz de 250ml, com rolha, introduzir 5,00g da amostra (m g). Juntar 30ml de uma mistura de 3 volumes de ácido acético glacial e 2 volumes de clorofórmio. Agitar até dissolução da amostra e adicionar 0,5ml de solução saturada de iodeto de potássio. Agitar exactamente durante 1 min e adicionar 30ml de água. Titular com tiossulfato de sódio 0,01 M, adicionado lentamente, sem cessar a agitação, até que a coloração amarela quase tenha desaparecido. Adicionar 0,5ml de solução de amido. Continuar a titulação, com agitação enérgica, até desaparecimento da coloração (n1 ml). Executar um ensaio em branco nas mesmas condições (n2 ml). O ensaio em branco não deve consumir

mais de 0,1ml de tiossulfato de sódio 0,01 N.

IP = ( - ) x 101 2n n

�

Alterações hidrolíticas dos fármacos gordos

A alteração hidrólise deve-se à actividade hidrolítica de lipases contidas nas próprias oleaginosas de onde são extraídos os fármacos com lípidos. Na presença de água e quando a temperatura é favorável hidrolisam os estéres com libertação dos ácidos gordos.

A hidrólise dos ésteres tem como consequência imediata o aumento da acidez.

Ensaios para avaliação da extensão da hidrólise Os ensaios propostos para avaliação da extensão da hidrólise baseiam-se

na determinação da acidez expressa em peso de base tiulante ou em peso de um ácido gordo específico.

Índice de Ácido.

O índice de ácido define-se como o número de miligramas de Hidróxido de Potássio necessários para neutralizar os ácidos livres de 1 grama de amostra.

Determina-se, titulando com uma solução da base referida, os ácidos livres de um peso «P» de amostra solubilizada num solvente apropriado e previamente neutralizado.

Grau de Acidez.

O Grau de Acidez é um indicador frequentemente usado para avaliação da hidrólise de corpos gordos alimentares, em especial, do azeite.

Define-se em termos de percentagem de ácidos gordos livres, expressa no ácido predominante. Dada a sua utilidade na análise do azeite, simplifica-se muitas vezes a definição, tomando como ácido predominante, o ácido oleico.

Alterações hidrolíticas dos fármacos com lípidos Hidrólise

CH2-OOC-R

CH -OOC-R´

CH2-OOC-R´´

lipases

água / temperatura

CH2 - OH R-COOH

CH - OH + R´-COOH

CH2 - OH R´´-COOH

Índice de Acido. (mg KOH neut. ac. 1g F.G.) Índice de Ester. (mg KOH sap. esteres 1g C.G.)

Grau de Acidez. (% ác. livres expressa em ác. oleico)

Indice de ácido

R COOH + KOH R COOK

P - peso de amostra em ensaio.

v - vol. de titulante em ml. C - Concentração do titulante.

1000 ml KOH N --------------- 56,1g KOH 1000 ml KOH C N --------- C.56,1g KOH 1 ml KOH C N ----------- C.56,1mg KOH

v ml KOH C N -----------v.C.56,1 mg KOH

v.C.56,1 ---------- P I.A. ----------------- 1g

I Av C

P. .

. . ,�

56 1

Grau de Acidez

1000 ml KOH N ---------------- 282g ac. oleico 1000 ml KOH C N ----------- C.282g ac. oleico 1 ml KOH C N ----------- C.0,282g ac. oleico

v ml KOH C N ----------- v.C.0,282g ac. oleico

v C 0,282 ----------- P G.A. ---------------- 100g

G Av C

P. .

. . ,�

28 2

Proporcionalidade entre o índice de ácido e o grau de acidez.

GA k IAv C

Pk

v CP

� � �.. . , . . ,28 2 56 1

k

v CP

v CP

k k� � � � �

. . ,

. . ,,,

,

28 2

56 128 256 1

0 502

Índice de Ácido

Reagentes: Solução de KOH 0,1 N

Álcool Éter dietílico.

Solução alcoólica de fenolftaleína a 1% Sulfato de sódio anidro.

Preparação do solvente:

Misturar em partes iguais álcool e éter dietílico. Neutralizar a solução com KOH 0,1 N em presença de fenolftaleína.

Ensaio:

Homogenizar a amostra e desidratá-la por agitação com sulfato de sódio anidro. Filtrar.

Pesar, com rigor, cerca de 5 gramas de amostra e promover a sua dissolução em 15ml de solvente.

Neutralizar os ácidos livres com a solução de KOH 0,1 N em presença de fenolftaleína, até obtenção de uma coloração persistente.

Calcular o Índice de Ácido, I Av C

P. .

. . ,�

56 1

e o

Grau de Acidez, G Av C

P. .

. . ,�

28 2

«v» volume de titulante gasto no ensaio. «C» é a concentração do KOH titulante.

«P» o peso de amostra