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Infektionen mit Salmonellen und anderen Enterobacteriaceae, insbesondere E. coli
(EHEC, EPEC, ETEC, EIEC, EAEC) – Epidemiologie und aktuelle Bewertung
Dr. Angelika Fruth
Robert Koch-Institut
Fachgebiet Bakterielle darmpathogene Erreger und Legionellen
NRZ für Salmonellen und andere bakterielle Enteritiserreger
28.09.2013, 28. Dresdner Kolloquium „Umwelt und Gesundheit“
IfSG, § 2 Aufgabe des Robert Koch-Instituts
• Erkennung, Verhütung und Bekämpfung von übertragbaren
Krankheiten
• epidemiologische Untersuchungen auf dem Gebiet der übertragbaren
Krankheiten einschließlich der Erkennung
• Salmonellose:
1888 erster Ausbruch in Bad Frankenhausen, Kyffhäuser,
notgeschlachtetes Rind
(Herr Prof. A. Gärtner aus Jena)
*Erstbeschreibung:
1880 Karl Joseph Ebert und Robert Koch: Typhus-Erreger (heute S. Typhi)
1885 Daniel Elmer Salmon: „Schweinecholera“ (S. Choleraesuis)
Dr. Angelika Fruth 2
Statistik meldepflichtiger Infektionen des GI-Trakts nach IfSG
(Quelle: Infektionsepidemiologisches Jahrbuch meldepflichtiger Krankheiten für 2011)
Erreger Fälle
Campylobacter 74.194
EHEC (HUS) / andere pathogene E.coli 5.802 (877) / 9.228
Salmonellen 26.116
S. Typhi / S. Paratyphi 62 / 62
Shigellen 707
Yersinien 3.550
Norovirus 116.109
Rotavirus 57.129
Giardia lamblia 4.258
Kryptosporidium 985
Dr. Angelika Fruth 3
Inzidenzen der meldepflichtigen bakteriellen Gastroenteritiserreger (nach SurvStat RKI)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
2008 2009 2010 2011 2012
Salmonella
STEC/EHEC
Campylobacter
Yersinia
Dr. Angelika Fruth 4
Erkr
anku
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ro 1
0.0
00
Ein
wo
hn
er
Jahr
Salmonellose (enterisch)
Art der Übertragung: häufig: Lebensmittelinfektion: Tier Lebensmittel Mensch selten: Mensch Mensch, Tier Mensch
Symptome: Durchfall, Fieber nicht über 39 °C, Stühle Reiswasser-ähnlich („Cholera nostra“), gelegentlich mit Blut (STM DT193 4,5.i:-)
Infektionsdosis: 100 - 100.000 Keime (Subspecies, Patientenfaktoren)
Inkubationszeit: 4 h - 5 Tage (Infektionsdosis, Subspecies)
Ausscheidungsdauer: Kinder < 5 Jahre, 10 Wochen (18 % bis zu 6 Mon., 5 % bis zu 12 Mon.) Erwachsene und Kinder > 5 Jahre 4 Wochen (bis zu 12 Wochen)
Dr. Angelika Fruth 5
Übermittelte Salmonellose-Fälle nach Meldekategorie und Altersgruppe, Deutschland, 2011 (SurvStat)
Dr. Angelika Fruth 6
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
An
zah
l Mel
def
älle
Altersgruppe
Fritz Kauffmann (* 15.01.1899 Stargard; † 27.09.1978 Kopenhagen, Dänemark) arbeitete von 1923 - 1932 am RKI
• Nomenklatur nach klinischen Gesichts-
punkten, später nach Ort der Isolierung
• Seit 2005 (ICSP): Gattung aus 2 Arten und
eine davon mit Unterarten
• Klassifizierung der Erregergruppe anhand
serologischer Merkmale:
• 1926 Philip Bruce White, GB
• Erweiterung und Ergänzungen:
1933-1978 Fritz Kauffmann, DK
Michel Popoff, Leon LeMinor, Patrick
Grimont, François-Xavier Weill, F
Jochen Bockemühl, Rolf Rohde, D
Ordnungsprinzip des Genus Salmonella
Dr. Angelika Fruth 7
White-Kauffmann-LeMinor-Schema 9th Edition 2007
Genus Spezies Subspezies
1531
505
99
336
73
13
Salmonella
S. bongori
S. enterica S. enterica (I)
S. salamae (II)
S. arizonae (IIIa)
S. diarizonae (IIIb)
S. houtenae (IV)
S. indica (VI)
22
nach Grimont and Weill, WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, 2007
Serovar
Dr. Angelika Fruth 8
Salmonella enterica enterica SV. Typhimurium (S. Typhimurium)
Drs. Reissbrodt, Gelderblom; RKI 2005
Dr. Angelika Fruth 9
Häufigkeitsverteilung der Salmonella-Serovare vom Menschen
Deutschland, NRZ-Daten 2011
Serovar Anzahl Anteil
S. Typhimurium 1023 39,3%
S. Enteritidis 373 14,3%
Salmonella subsp. I 138 3,8%
S. Derby 98 3,8%
S. Infantis 76 2,9%
S. Newport 71 2,7%
S. Paratyphi B var. Java 58 2,2%
S. Senftenberg 55 2,1%
S. Goldcoast 45 1,7%
Salmonella subspez. IIIb 43 1,7%
S. Bovismorbificans 38 1,5%
Dr. Angelika Fruth 10
• Serotypie = Bestimmung der O- und H-Antigene und
Ermittlung einer Antigenformel, die den Serovar definiert
• Differenzierung innerhalb der Serovare durch Lysefähigkeit
dieser Erreger mittels spezifischer Bakteriophagen =
Lysotypie
• Etablierte Systeme für: S. Typhi, S. Paratyphi A und B, S.
Typhimurium, S. Enteritidis, S. Virchow, S. Hadar, S.
Bovismorbificans, S. Derby, S. Infantis, S. Agona, S.
Oranienburg, S. Heidelberg
• z.B. kann man bei S. Paratyphi B mehr als
86, bei S.Typhimurium über 300 Lysotypen unterscheiden
Feintypisierung phänotypisch mit Serotypie und Lysotypie
Dr. Angelika Fruth 11
Lysotypie oder Phage typing seit 1950er Jahren
extended Anderson phage
typing plate DT 36 extended Anderson phage
typing plate DT4 (original sequenced LT2)
Felix/Callow and Lilleengen phage typing plate (Blue plate)
1bvar.2/2 (original sequenced LT2)
Dr. Angelika Fruth 12
Dominanz verschiedener S. Typhimurium-Lysotypen bei Patienten-Isolaten aus Deutschland von 1966 – 2012 (Daten NRZ)
Dr. Angelika Fruth 13
0
10
20
30
40
50
60
DT9 DT204 DT104 monophasic 4,(5)12:i:-DT193
Year
% o
f S
Tm
Feintypisierung und Molekulare Epidemiologie
Virulenzgen-basierte Pathovar-Charakterisierung
(z.B. bei S. Paratyphi B: EPV und SPV)
Genoserotypie, z.B. fliC und fljB RFLP
Ausbruchsuntersuchungen (PFGE, MLVA, MLST, Virulenzplasmid-Analysen)
Bestimmung von Antibiotikaresistenzen als epidemiologischer Marker
PFGE
Adhärenz und Invasion
fliC RFLP
Dr. Angelika Fruth 14
PFGE-Analyse verschiedener S. Pomona-Isolate (Xba I, PulseNet Protokoll)
Spur
1 Standard (S. Braenderup)
2 Humanes Isolat
3 Humanes Isolat
4 Fall (1. Isolat)
5 Standard (S. Braenderup)
6 Fall (2. Isolat)
7 Kot Bartagame
1 2 3 4 5 6 7
Quelle: Dr. Prager, RKI 2006
(kbp)
1135,0
668,9
452,7
310,1 244,4
173,4/167,1
104,5
33,3
Dr. Angelika Fruth 15
PFGE-Muster von S. Newport-Ausbruchsstämmen 2011/12
Dr. Angelika Fruth 16
Ausbruchsklon 1 (Mungbohne)
SNWPXB.0050
Ausbruchsklon 2 (Wassermelone)
SNWPXB.0060
PFGE-XbaI
50
.00
10
0.0
0
15
0.0
0
20
0.0
0
30
0.0
0
40
0.0
0
50
0.0
0
80
0.0
0
15
00
kbp
Key
.
.
.
.
.
.
strain
.
.
.
.
.
.
LabID
11-08477
11-08672
11-08784
11-09048
12-00031
12-00065
SourceCountry
.
.
.
.
.
.
ReceivedDate
09/11/2011
22/11/2011
29/11/2011
13/12/2011
03/01/2012
04/01/2012
PlasmidProfileSeroType
SNWP
SNWP
SNWP
SNWP
SNWP
SNWP
Aufklärung von 2 zeitgleich verlaufenden Ausbrüchen mit unterschiedlichen Infektionsquellen
Molekulare Typisierung / Molekulare Epidemiologie
PFGE- Typ
SNWPXB.
Isolate 2011 Zeitraum (Anzahl)
MLVA
11-VNTR
Allel-Muster
Sequenztyp 3-VNTR Allel-Muster
Sequenztyp 7-house-keeping Gene MLST
Allel-Muster
Sequenztyp
3 Virulenz Gene
sopA-B-D
Allel-Muster
0050 Okt.-Dez. (43) 448 a ST31 20 - 17 - 40
0060 Dez (18) 456 i ST118 54 - 3 - 1
0002 Dez (1) 457 j ST157 20 - 17 - 13
0058 Okt (2) 450 H ST166 52 - 41 - 1
0048 Okt (1) 450 C ST166 52 - 41 - 1
0047 Okt (1) 449 b ST1635 51 - 3 - 1
0051 Aug (1) 451 d ST157 20 - 17 - 13
0052 Aug (1) 452 e ST166 52 - 41 - 1
0021 Jun/Jul (2) 455 c ST166 52 - 41 - 1
0053 Mai (1) 453 f ST118 53 - 3 - 1
Dr. Angelika Fruth 17
Salmonellose des Menschen Vielfalt der Infektionsquellen
Eier und Schweine- Rind- andere Geflügelfleisch fleisch fleisch Infektionsquellen
35 - 45 % 25 - 35% 10 - 20 % 1 - 5 %
Gewürze, Eisbergsalat, Paprika Chips, Alfalfa Sprossen, Sesam Halva, Tomaten, Schokolade, Räucherfisch, Anistee
Spieltiere, z. B. Leguan, Gecko, Schildkröten, Agamen und Schlangen
Tendenz steigend
Dr. Angelika Fruth 18
Datum der
Meldung
meldender
Staat
Beschreibung der
Warnung
Produkt-
kategorie
Lebensmittel /
Produkt
Gefahrenquelle Ursprungslan
d
Vertrieb Untersuchungs-
ergebnisse
30.07.2010 Deutsch-
land
Salmonella Dublin in
Käse aus roher
Kuhmilch aus
Deutschland
Milch und
Milchprodukte
Käse Salmonella
Dublin
Deutschland,
Niederlande
30.07.2010 Vereinigtes
Königreich
Salmonella Hvitting-
foss in schwarzem
Pfeffer aus Thailand
Kräuter und
Gewürze
Pfeffer Salmonella
Hvittingfoss
Thailand Nachweis von
Salmonella
Hvittingfoss
28.07.2010 Brasilien Salmonella
Minnesota in
gefrorenen,
gepökelten
Hähnchen aus
Brasilien, via die
Niederlande
Geflügelfleisch
und Geflügel-
fleischprodukte
Hähnchen Salmonella Minnesota Brasilien
27.07.2010 Brasilien Salmonella Heidel-
berg in gefrorenem
Truthahn (Meleagris
gallapavo) aus
Brasilien
Geflügelfleisch
und Geflügel-
fleischprodukte
Truthahn Salmonella Heidelberg Brasilien
13.07.2010 Italien Salmonella spp. in
gefrorenen
Surimiprodukten aus
Vietnam
Fisch und
Fischerei-
produkte (außer
Weich- und
Krustentiere)
Surimi-
produkte
Salmonella spp. Italien Krebsfleisch-
imitat
Schnellwarnungen RASFF: Lebensmittelsicherheit / Ausschnitt aus den Meldungen 2010
Dr. Angelika Fruth 19
Vielfalt der Infektionsquellen
Beatrix von Wissmann et al. (2012) 2012;17(6):pii=20076;available
S. Enteritidis
• Juli 2010: Hochzeitsfeier in Ansbach
• Warmes Buffet (Standzeit von 14:00 bis 20:00). Die warmen Gerichte wurden in
Wärmebehältern geheizt (ohne Temperaturkontrollen). Salate und andere kalte
Speisen waren während dieser Zeit ungekühlt (Raumtemperatur).
• Fotographien des Buffets zeigten, dass ein Teil der Salate und kalten Speisen mit
Blumen verziert waren, welche direkt in die Speisen gesteckt waren.
• Am NRZ wurden für 8 der 26 Salmonella-Isolate von Teilnehmern der
Hochzeitsfeier, für 2 der 8 Salmonella-Isolate des Catering Personals sowie für die
2 Isolate aus Lebensmittelproben Serovar, Lysotyp und Ribotyp bestimmt.
• alle 12 Isolate: S. Enteritidis Lysotyp 4/6, Ribotyp 3
Dr. Angelika Fruth 20
Dr. Angelika Fruth 21
Beispiele aus der Arbeit des NRZ, 2012/2013
International: • multinationaler Ausbruch(Deutschland, Ungarn, Tschechische Republik, Österreich, UK)
von Nalidixinsäure-resistenten S. Stanley mit dem PFGE-Muster SSTAXB.0017 • S. Thompson-Geschehen in den Niederlanden 2012 mit 9 Fällen auch in Deutschland,
ein Reiserückkehrer aus den Niederlanden National: • S. Panama-Geschehen in Thüringen, humanen Isolaten mit dem PFGE-Muster
SPANXB0006 und mittels PFGE nicht unterscheidbare Isolate von Mett- und Rohwurst (PFGE-Muster wurde bereits bei früheren S. Panama-Ausbrüchen 2008 und 2009 in Thüringen festgestellt)
• ein Döner-assoziierter S. Braenderup-Ausbruch in Sachsen mit über 20 Fällen, darunter auch Bistro-Mitarbeiter. (PFGE-Muster SBRPXB.0008)
• S. Braenderup-Ausbruch in einem Klinikum in Bayern; vier Patienten-Isolate mit PFGE-Muster SBRPXB.0015
• Döner-assoziierter Ausbruch durch mehrfachresistenten S. Kentucky-Stamm in Thüringen; 12 humane und zwei Dönerfleisch-Isolate mit PFGE-Muster SKENTXB.0006c
• S. Agona PT56 in Sachsen ebenfalls Döner-assoziierter Ausbruch • derzeit S. Infantis PT29 im südlichen Niedersachsen und Eichsfeld (PFGE SINFXB.0027)
über 100 Fälle
Dr. Angelika Fruth 22
Anteil der Infektionen mit Salmonellen mit einer möglichen Reptilien-Assoziation an gemeldeten Salmonellosen bei Kindern unter 2 Jahren
(Quelle:http://www3.rki.de/SurvStat/)
0
5
10
15
20
25
30
35
2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011
An
teil
in %
Jahr
Dr. Angelika Fruth 23
Jahr Alter des Patienten
Salmonella (S.) Subspecies (subsp.), Serovar, Antigenformel
Reptilienkontakt u.ä.
2008 2 Monate S. enterica subsp. IIIb, 53:z10:- Schlange
2008 3 Monate S. enterica subsp. II, 58:lz13,z28:z6 Bartagame
2008 7 Monate S. Poona, 13,22:z:1,6 Schlange
2008 11 Monate S. Gaminara, 16:d:1,7 Bartagame
2008 3,9 Jahre S. Jangwani, 17:a:1,5 Reptil
2008 8 Monate S. enterica subsp. IV, 18:z36z38:- Leguan
2008 17 Monate S. Pomona 28:y:1,7 Schildkröte
2008 5 Wochen S. enterica subsp. II, 35:g,m,s,t:- Bartagame o. Chamäleon
2008 1 Woche S. Johannisburg, 40:b:e,n,x div. Schlangen
2008 2 Wochen S. enterica subsp. II, 58:c:z6 Leguan, Wasseragame
2008 9 Wochen S. enterica subsp. IV, 48:g,z51:- Wasseragame
2009 9 Monate S. Eastbourne, 9,12:e,h:1,5 Bartagame
2009 3 Monate S. Herston, 6,8:d:e,n, z15 Leguan
2009 6 Jahre S. Thompson, 6,7:k:1,5 Wasserschildkröte
2010 5 Tage S. enterica subsp. II, 21:z10:z6 Waran
Infektionen von Kindern durch Kontakt zu exotischen Haustieren
(Beispiele aus den Daten des NRZ)
Dr. Angelika Fruth 24
1135,0
452,7
173,4/167,1
104,5
33,3
(kbp)
668,9
310,1
244,4
1 2 3 4 5 6
Spur
1 Standard S. Braenderup
2 Fall 2008 (Säugling, 4 Monate)
3 Kater
4 Bartagame 1
5 Bartagame 2
6 Standard S. Braenderup
PFGE-Analyse von S. Eastbourne-Isolaten aus einem Haushalt (Xba I, PulseNet Protokoll)
Quelle: Dr. Prager, RKI 2006
Dr. Angelika Fruth 25
Wer war es? Bartagame oder Katze
Dr. Angelika Fruth 26
Reptilien-assoziierte Lebensmittelvergiftung Lowther, S.A. et al. Zoonoses Public Health. 58 (2011) 560–566
• Dezember 2009, Minnesota, USA
• 3 Patientenisolate S. subsp. IV gleiche PFGE-Muster
• keiner der Patienten hatte Reptilienkontakt
• alle 3 Personen waren beim „potluck dinner“ (jeder Gast bringt Essen selbst mit)
• Gastgeber 66 Gäste
• Insgesamt 19 Gäste erkrankt mit mittlerer Inkubationszeit 19 h (3 - 26 h) Dauer der Erkrankung 5 Tage (1 - 11 Tage)
• Infektionsquelle: Bratensoße, hergestellt durch Bartagamen-Besitzer (asymptomatischer Ausscheider)
• Abstriche im Haushalt : Türöffner, Abfluss-Badezimmer, Ausguss-Küche Staubsaugerbeutelinhalt und Tier
– Bartagame: S. subsp. IV 6,7:z4z23:- und S. Labadi
Dr. Angelika Fruth 27
Dr. Angelika Fruth 28
Escherichia coli
Reissbrodt, Gelderblom; RKI 2005
Dr. Angelika Fruth 29
Humanmedizin
E. coli Asymptoma-tische Colonisation
Diarrhoe Extra-intestinale Manifestation
Commensale +++ - +
IPEC - +++ -
ExPEC +++ + +++
Escherichia coli
apathogen pathogen intestinal (IPEC) extraintestinal (ExPEC) EHEC/STEC UPEC EPEC SEPEC EAEC, DAEC NMEC EIEC ETEC
Dr. Angelika Fruth 30
Erreger Klinik Wirkort
EPEC wässrige Durchfälle (besonders bei Säuglingen)
Dünndarm
EIEC Dysenterie mit Tenesmen Dickdarm
ETEC Reisediarrhoe, choleraähnliche Durchfälle Dünndarm
EAEC wässrige Durchfälle, chronische Darmstö-rungen, Reisediarrhoe
Dünndarm
EHEC wässrige, blutige Durchfälle bis zur hämorrhagischen Kolitis – Komplikation HUS (Hämolyse, Nierenversagen, Thrombopenie)
Dickdarm
Erkrankungen durch darmpathogene E. coli (IPEC)
Dr. Angelika Fruth 31
Leitmerkmale zur Diagnostik von E. coli
Pathovar Virulenzfaktor Zielgen
EHEC / EHEC-LST Shigatoxin
Intimin
Enterohämolysin
stx1 und stx2
eaeA
ehxA
EPEC / aEPEC Intimin
Virulenzplasmid
eaeA
EAF, bfp
EIEC Invasin/Membranprotein Virulenzplasmid
ipaH
ial
ETEC / aETEC Enterotoxine
Kolonisationsfaktoren
lth, sth
cfa
EAEC-I / aEAEC Virulenzregulator
Virulenzplasmid
aggR
EAEC-probe, aatA
EAEC-II Virulenzregulator
Virulenzplasmid
P-Fimbrien
Aerobactin
Yersiniabactin
aggR
EAEC-probe, aatA
pap
iucC
irp2
Dr. Angelika Fruth 32
EHEC / STEC / VTEC
= Enterohämorragische /Shigatoxin bildende/Verotoxin bildende Escherichia coli
• 1977 Erstbeschreibung duch Konowalchuk
• 1980er O´Brian (Shiga-like Toxin) und Karmali (Verotoxin)
• USA: „Hamburger disease“
• Haupttyp: O157:H7 (Serovar: LPS-O-Antigen aus Zellwand und Flagellen-H-Antigen)
• Vielfalt von Serovaren und weiteren Virulenzfaktoren
Dr. Angelika Fruth 33
Shigatoxin
rRNA-N-Glycosidase (AB5 – Struktur) A = Aktivität; B = Bindung Bindung an Oberflächenrezeptoren (Gb3 und Gb4) zytotoxisch: Hemmung Proteinbiosynthese der eukaryotischen Zellen Induktion Apoptose
im Genom funktioneller oder kryptischer Prophagen kodiert Expression an Phagenvermehrungszyklus gekoppelt Stx1- und Stx2- Familien (Stx1a,c,d und Stx2a,b,c,d,e,f,g)
Dr. Angelika Fruth 34
-Gb3 -Gb4 Niere Darm
-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7
Erkrankungsverlauf bei Infektion mit EHEC
Infektion wässrige Diarrhoe, kolikartige Bauchschmerzen
blutige Diarrhoe (30%)
spontane Ausheilung
(85-90%)
HUS (5-10%), davon lethal 3-5%
Adhäsion (Intimin) Bildung von Komplementkomplexen und Hemmung der glomerulären Filtration
Dr. Angelika Fruth 35
Altersverteilung bei Infektion mit EHEC (Daten NRZ 2006)
0
50
100
150
200
250
Anzahl n
männlich weiblich
männlich 226 21 11 5 0 3 5 4 5 2 7
weiblich 178 19 8 3 3 6 10 6 3 2 17
0 – 5 6 – 9 10 – 14 15 – 19 20 – 24 25 – 29 30 – 34 35 – 39 40 – 49 50 – 59 > 60
Dr. Angelika Fruth 36
Monatliche EHEC-Meldezahlen in Deutschland, 2001-2009
Anzahl EHEC-Meldungen
Meldejahre
0
50
100
150
200
03
06
09
12
03
06
09
12
03
06
09
12
03
06
09
12
03
06
09
12
03
06
09
12
03
06
09
12
03
06
09
12
03
06
09
12
2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009
gleitender Mittelwert über 3 Monate
Dr. Angelika Fruth 37
O111 (2%)
Andere (5%)
O145 (3%)
O91 (0%)
O26 (9%)
O103 (1%)
O157 (80%)
Andere (33%)
O111 (3%)
O145 (5%)
O91 (8%) O26 (14%)
O157 (20%)
O103 (17%)
Serogruppenverteilung von gemeldeten EHEC- und HUS-Fällen (2001-2008)
EHEC HUS
Dr. Angelika Fruth 38
EHEC bei Patienten und Isolate aus Lebensmitteln
0
5
10
15
20
25
O1
57
O1
03
O2
6
O9
1
O1
45
O1
11
O1
28
O1
77
O1
46
O7
6
O8
O1
74
O5
O1
13
O1
56
O1
15
Oro
ug
h
On
t
* P
F2
8
† P
29
‡ F
20
STEC serogroups
Pro
po
rtio
n (
%)
patient isolates food isolates
Werber, Beutin, Pichner, Stark, Fruth: STEC Serogroups in Food and Patients, Germany. Emerg Infect Dis 2008; 14(11): 1803-6
Dr. Angelika Fruth 39
Große EHEC-Ausbrüche nach KARCH (1999)
Land/ Region
Monat/ Jahr
STEC-Serovar
Anzahl Fälle
Anzahl Kran-kenhausbe-handlungen
Anzahl HUS-Fälle
Anzahl Todes-fälle
Ursache
Japan/Sakai City Juli 1996 O157:H7 8576 606 106 3 Rettichsprossen als Teil der Schulspeisung
USA/Washington, Idaho, Nevada, Cal-ifornia
Dezember, 1992 bis Februar 1993
O157 :H7 732 195 55 4 Hamburger aus einer einzelnen Fast-Food-Kette
Kanada/ Nordwestbereich
Sommer 1991
O157:H7 521 nicht verfügbar
22 2 Hackfleisch und da-durch kontaminierte Lebensmittel
Großbritannien/ Zentral-Schottland
November bis Dezem-ber 1996
O157:H7 501 151 27 20 gekochtes Fleisch von einem Fleischer
USA/Cabool, Missouri
Dezember 1989 bis Ja-nuar 1990
O157:H7 243 32 2 4 unchloriertes Trink-wasser
Australien/Adelaide Januar bis Februar 1995
O111:H- > 200 nicht verfügbar
22 0 nicht gekochte Wurst
Großbritannien/ Lothian, Schottland
Mai 1994 O157:H7 > 100 1/3 der Fälle 9 1 pasteurisierte Milch
Schweden Sommer 1995
O157:H7 110 nicht verfügbar
29 0 nicht bestimmt
Dr. Angelika Fruth 40
Seropathovare von EHEC nach KARMALI 2003 und GYLES 2007
Sero-
pathovar
Relative
Inzidenz
Assoziation
mit
Ausbrüchen
Assoziation
mit HUS
und HC
Serovare
A hoch häufig ja O157
B mittel mäßig ja O26, O103, O111,
O121, O145
C niedrig selten ja O91, O104, O113,
O165 u.a.
D niedrig selten nein verschiedene
E* nicht
human
nicht bekannt nein verschiedene
Dr. Angelika Fruth 41
Kombination verschiedener Pathovar-bestimmender Virulenzmerkmale
Daten NRZ Salmonellen
Pathovar Virulenzmerkmal Serovar
EHEC/EAEC stx1, stx2, eaeA, ehxA, astA O157:H-, O26:H11
STEC/EAEC stx1, astA O115:H10
STEC/EAEC stx2, astA O146:H28, O43:H2
STEC/EAEC stx1, stx2, ehxA, astA O91:H-, O113:H4
EPEC/EAEC eaeA, astA O99:H33
ETEC/EAEC sth, astA O25:H-
Dr. Angelika Fruth 42
0
50
100
150
200
250
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2122232425262728293031 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21222324252627282930 1 2 3 4
M ai Juni Juli
Erkrankungsbeginn, Datum 2011 (Durchfall)
An
za
hl E
rkra
nk
un
ge
n
EHEC
HUS
Der Ausbruch durch EHEC O104:H4 in Deutschland, Frühjahr 2011
Dr. Angelika Fruth 43
Stamm-Charakteristik
„typischer“ E. coli: Lactose positiv, Sorbitol-fermentierend,
ß-Glucuronidase positiv, Indole positiv, H2S negativ, kein Wachstum auf Simmons
Citrate Agar
> EHEC
• Shiga toxin 1 / stx1-Gen: negativ
• Shiga toxin 2 / stx2-Gen (vtx 2a variant): positiv
• Intimin (eaeA-Gen): negativ
• Enterohemolysin / ehxA-Gen: negativ
oder EAEC ?
• EAggEC Virulenzplasmid:
aatA (ABC-transporter gene) positiv
aagR (master regulator of vir-plasmid genes) positiv
aap (secreted protein dispersin gene) positiv
aggA (AAF/I-fimbrial subunit gene) positiv
aggC (AAF/I-fimbrial operon gene) positiv
Dr. Angelika Fruth 44
Weitere Virulenzmarker (Bielaszewska, M. et al.: Lancet, 2011)
• STEC:
iha (IrgA homologue adhesin)
lpfAO26 (structural subunit of long polar fimbriae)
lpfAO113 (structural subunit of long polar fimbriae)
ter cluster (tellurite resistence)
irp2 (component of iron uptake system on HPI)
fyuA (component of iron uptake system on HPI)
• EAEC:
set1 (Shigella enterotoxin 1)
pic (protein involved in intestinal colonisation)
• MLST sequence type: ST 678 (adk 6, fumC 6, gyrB 5, icd 136, mdh 9, purA 7, recA 7) H. Karch, KL HUS, Universität Münster
• Phylotype: B1
• ESBL-Resistenz: CTX-M15 + ß-TEM-1 ….. oder ExPEC ?
Dr. Angelika Fruth 45
Makrorestriktionsmuster (XbaI) von E. coli O104:H4
Isolaten des Ausbruchs
1 2 3 4 5
1135
668,9
452,7398,4
336,5310,1
244,4216,9
138,9
104,5
54,733,328,820,5
kb
Spur 1, 5: MW Standard Salmonella Braenderup H9812 Spur 2: RKI 11-02027 (HUS), Spur 3: RKI 11-02034 (Diarrhoe) Spur 4: RKI 11-02060 (blutige Diarrhoe)
PFGE nach Prager et al. (2011) IJMM 301:181-191
kbp
Dr. Angelika Fruth 46
„Attack-Rate“ nach Scheutz, 2011
Serovar Shigatoxin % HUS-Fälle
O157 (eaeA+) 1a+2a, 2a+2c, 2a, 2c 13
Non-O157 (eaeA+) 1a+1c, 2a, 2a+2c 8
Non-O157 (eaeA-)
2d act 0,5
O104:H4 (eaeA-)
2a 22
Dr. Angelika Fruth 47
Hintergrundsgeschehen von EHEC und weiteren E. coli- Pathovaren im Ausbruch mit EHEC O104:H4
• Neben dem Ausbruchsstamm O104:H4 wurden 87 EPEC und
702 EHEC im Ausbruchszeitraum aus den Einsendungen an das NRZ detektiert
• 311 der EHEC- und 53 der EPEC-Isolate konnten 42 verschiedenen Serovaren zugeordnet werden
• wachsende Zahl stx2-positiver Isolate der Serovare O26,
O91 und O146 • 2 Cluster O157-Fälle und 1 Cluster O26-Fälle (mit HUS)
Dr. Angelika Fruth 48
PFGE-Analyse der O157:Hnm – Cluster aus 2011 Quelle: NRZ-Bericht 2012, PulseNet Protocol
PFGE-XbaI
20
.00
50
.00
10
0.0
0
20
0.0
0
30
0.0
0
40
0.0
0
60
0.0
0
10
00
kbp
Key
.
.
.
.
.
.
strain
11-02106
11-05383
11-03890
11-02539
11-04132
11-05273
Serovar
O157:H-
O157:H-
O157:H-
O157:H-
O157:H-
O157:H-
Plasmid
.
Stx1
+
+
+
+
+
+
Stx2
+
+
+
+
+
+
eaeA
+
+
+
+
+
+
O157XB.0124
O157XB.0132
20.0
0
50.0
0
100.
00
200.
00
300.
00
400.
00
600.
00
1000
Dr. Angelika Fruth 49
Identifizierung von EHEC-Erkrankungen durch mikrobiologische Laboratorien in Deutschland
Stufendiagnostik 1. Primärdiagnostik
• Shigatoxin-Produktion oder Nachweis der stx-Gene in einer coliformen bakteriellen Flora (einer Stuhlprobe) aus Anreicherungskultur (mittels Elisa, PCR)
• Nutzung von Indikator-/Selektiv-medien für E. coli z.B. O157:H7 (sorbitol non-fermenting)
• Üblicherweise keine Isolierung (Reinkultur) der Stämme, aber nach Diagnosestellung
Meldung an die Gesundheitsämter
• … danach: Weiterleitung der Proben (insbesondere Isolate) !
2. Weiterführende bzw. Spezialdiagnostik
• Spezialisierte Labore (NRZ, KL HUS, LUA´s) verarbeiten die Proben (Mischkulturen) aus den Laboren der Primärdiagnostik
• daraus Stammisolierung als Grundvoraussetzung für epidemiologisches Subtypisieren
• Testung von Virulenzgen-Profilen / Genotypisierung (PCR, Sequenzierung)
• Serotypisierung, MLST zur Sequenztypbestimmung (Macro-Evolution)
• PFGE (PT, MLVA) für Klärung epidemiologischer Zusammenhänge (Micro- Evolution)
Dr. Angelika Fruth 50
(Keine) Korrelation mit Qualität der Meldung Daten SurvStat
Falldefinition nach IfSG erfüllt
Angaben in SurvStat (%) 95%KI
Toxin(gen)-nachweis 25 15% - 35%
Erregerisolierung 32 20% - 44%
Keine Methode 20 06% - 46%
Dr. Angelika Fruth 51
Weshalb ist die weiterführende Analyse der Erreger von besonderer Bedeutung?
• Zeitnahe Ausbruchsentdeckung und – kontrolle
• Vermeidung von Sekundärübertragungen
- Häufig (5-15%); bei O157:H-/H7 publiziert
- Übertragung früh in der Erkrankungsphase
- Betrifft vor allem (jüngere) Geschwisterkinder
- Hohes HUS-Risiko
• Risikobewertung wird ermöglicht
z.B. im Zusammenhang mit Therapieempfehlungen, Empfehlungen für Hygienemaßnahmen, Umgang mit Langzeitausscheidern, Wiederzulassung zu Gemeinschaftseinrichtungen etc.
• Erfassung des Erregerwechsels und –wandels (Sammlung von Stamminformationen)
• Ableitung von Maßnahmen zur Prophylaxe (Impfprävention, Intervention in der Lebensmittelproduktion, Erweiterung des Diagnostik-Panels)
Dr. Angelika Fruth 52
Dank
RKI, Abteilung Infektionskrankheiten Universität Leipzig Prof. Dr. Martin Mielke Prof. Dr. Peggy Braun Prof. Dr. Antje Flieger PD Dr. Michael Pees Dr. Rita Prager Dr. Erhard Tietze ÖGD, Landesuntersuchungs- und Dr. Wolfgang Rabsch Gesundheitsämter RKI, Abteilung Infektionsepidemiologie Dr. Christina Frank Dr. Dirk Werber Prof. Dr. Klaus Stark Dr. Hermann Claus … das Ausbruchsteam des RKI Institut für Hygiene, KL HUS, Universität Münster Prof. Dr. Helge Karch PD Dr. Martina Bielaszewska PD Dr. Alexander Mellmann
Dr. Angelika Fruth 53
… Ihnen für Ihre Aufmerksamkeit!
Dr. Angelika Fruth 54
Resümee
• Die Anwendung molekularer Verfahren in der mikrobiologischen Routine-Diagnostik ist weit vorangeschritten.
• Die Konsequenz ist ein Mangel an Patientenisolaten (besonders bei EHEC).
• Kopplung der Isolatgewinnung und -versendung an die Meldung der Erreger nach IfSG
• Für den Aufbau einer umfassenden molekularen Surveillance lebensmittelbedingter Erreger (EHEC) müssen neue Bearbeitungsstrategien in allen Ebenen des ÖGD diskutiert werden.
Dr. Angelika Fruth 55
Zukunft Toxin-basierter EHEC Surveillance
• Testverfahren, die gleichzeitig Shigatoxin, Serogruppe, und weitere Virulenzfaktoren (eaeA) detektieren
– Phänotypisch und/oder genotypisch
– Liefert Basisinformationen zu allen STEC
• Information über (dominierende) non-O157
– Problematisch für den Infektionsschutz
• Diagnostik unvollständig und nicht zeitnah
– Modernere Testverfahren müssen etabliert und in Routinediagnostik angewendet werden
• aktive HUS-Surveillance
Dr. Angelika Fruth 56
Zusammenfassung
• Pathovare von E.coli müssen aus klinischer und epidemiologischer Sicht molekularbiologisch definiert werden
• Diagnostik sollte nicht auf intestinale Pathovare beschränkt sein
• Risikobewertung wird ermöglicht, z.B. im Zusammenhang mit Therapieempfehlungen
• Vielzahl von Verfahren wurde publiziert und in der Praxis erprobt (DNA-Hybridiserungs-, Microarray-, PCR-, RT-PCR-, PCR-ELISA-Verfahren)
• Zeit- und Kostenökonomie im Einklang mit verbesserter Diagnosestellung
Dr. Angelika Fruth 57
Diagnostik 2001: Einführung des IfSG
• Serotypie (Agglutinationsteste) für Einordnung in E.coli- Pathovare:
z.B. Zuordnung nach bekannten Serovaren wie
O25, O55, O127 für EPEC
O44 für EAEC
O78, O86 für ETEC
O124, O143, O144 für EIEC
• Stufenplan für EHEC ( primär keine O157-Diagnostik!)
• keine weitere Analyse von E.coli aus anderen Reservoiren, insbesondere ExPEC (UPEC, NMEC, SEPEC)
Dr. Angelika Fruth 58
Stufenplan zur EHEC-Diagnostik (Fruth,A. et.al. BGBl. 2000, 43:310-317)
• 1. Schritt: Screening auf EHEC/STEC in Stuhlproben nach Anreicherung mittels Shigatoxin-ELISA gemäß Herstellervorschrift
• 2. Schritt: Bestätigung eines positiven Befunds mittels zweitem Nachweisverfahren (z.B. PCR) ggf. in Speziallaboratorien
• 3. Schritt:Typisierung des EHEC/STEC-Isolats mittels Serotypie, Genotypie u.a. für epidemiologische Untersuchungen (IfSG)
Dr. Angelika Fruth 59
Untersuchungsverfahren auf dem Weg von der Probe…
Erregeranzucht und-isolierung
SMac, Ehly-Agar
EIA
Serotypie (klassisch oder molekular)
Nachweis von Virulenzgenen:
Inhouse-PCR-Verfahren
RT-PCR
WGS/Metagenomics
Anreicherungskultur
mTSB; EHECdirekt
MALDI-TOF
LAMP
PCR-ELOSA
LUMINEX
… zur Anwendung molekularer Verfahren für schnelle und effiziente Diagnosen
Dr. Angelika Fruth 60
Molekulare Surveillance von EHEC
Untersuchung auf EHEC gemäß Indikationsliste:
Versand des Isolats an Speziallabore mit eindeutigem Identifikator / Minimum an Epi-Info
(LUA‘s, KL, NRZ)
Zusammenführung aller Daten und Analyse zur Ausbruchserkennung
(zentrale Datenbank am NRZ und Stammsammlung)
Kinder mit Diarrhoe unter 6 J., Patienten mit blutigen Durchfällen ohne Altersbeschränkung, Vorliegen eines HUS, Häufung von Diarrhoe-Fällen in
Gemeinschaftseinrichtungen etc. (MiQ)
mittels zertifizierter Verfahren (EIA, PCR)
bei positivem Nachweis des Shigatoxins / Shigatoxingene
Isolierung des Erregers Meldung an GA
Netzwerk der Primärdiagnostik-
Labore
NRZ / KL RKI, Abt. 3 (SurvNet)
Typisierung des Erregers (NRZ, KL): mit Phänotypie: Serotypie, biochem. Differenzierung, Resistenztestung
und molekularen Methoden: Virulenzgenprofil, PFGE, MLST, SLST
Lagerung des Probenmaterials für
weitere Untersuchungen (mind. 14 Tage)
Übermittlung relevanter Informationen nach IfSG an Landesstellen und ECDC / TESSy
Ergänzung der Meldedaten
Netzwerk der LUA‘s +
Dr. Angelika Fruth 61
Zusammenfassung
• Pathovare von E.coli müssen aus klinischer und epidemiologischer Sicht molekularbiologisch definiert werden
• Diagnostik sollte nicht auf intestinale Pathovare beschränkt sein
• Risikobewertung wird ermöglicht, z.B. im Zusammenhang mit Therapieempfehlungen
• Vielzahl von Verfahren wurde publiziert und in der Praxis erprobt (DNA-Hybridiserungs-, Microarray-, PCR-, RT-PCR-, PCR-ELISA-Verfahren)
• Zeit- und Kostenökonomie im Einklang mit verbesserter Diagnosestellung
Dr. Angelika Fruth 62
PulseNet USA
• entwickelt nach E.coli O157-Ausbruch 1993 verursacht durch „Hamburger“ mit 726 Erkrankten und 4 toten Kindern
• seit 1996 am CDC in Atlanta betrieben
• finanziert durch Regierung
• Bereitstellung von Geräten und Know-how für alle US-Bundesstaaten und Datenauswertungs-Support
• Standardisiertes molekulares Fingerprinting auf der Basis der PFGE
unter Einbeziehung weiterer Feintypisierungsergebnisse (Serovar, Lysotyp, AMR, MLST, MLVA, SNP-VNTR)
• Kumulative Datenbank
• Nationales Netzwerk des öffentlichen Gesundheitswesens und der Lebensmittelbehörden (public health and food regulatory agency laboratories) zur Aufklärung lebensmittelbedingter Ausbrüche
• Zwischen 7 und 17 Tagen bis zum Analysenbericht
Dr. Angelika Fruth 63
Vergleich der Plasmidprofile von E. coli O104:H4 und
HUSEC041 (Quelle: NRZ für Salmonellen, RKI)
147
63
36
kbp
1 2 3 4
(Plasmidprofilanalyse nach Kado & Liu; J. Bact. Vol. 145, 3; 1365-1373)
Spur 1: HUSEC041 95kbp plasmid: blaTEM-1 75kbp EAEC virulence plasmid: aatA, aggR, aaf/III Spur 2, 3: Isolate des Ausbruchs 90kbp plasmid: blaTEM-1, blaCTX-M-15 83kbp EAEC virulence plasmid: aatA, aggR, aaf/I Spur 4: MW Standard E. coli 39R861
Dr. Angelika Fruth 77