Infektionsepidemiologie und Typing

Modellstudiengang WS 07 / 08

• Welche sind es?• Form• Biochemie• DNA/RNA• Antigene• usw

• Wo kommen sie her?• Vom Patienten nebenan• Aus dem Urlaub• usw

• Was fördert ihre Verbreitung?• Ein erfolgreicher Klon• Multiklonal• Antibiotikaresistenzen

Bakterielle Erreger

• Antonie van Leeuwenhoek

• 1632-1723, Niederlande

• Mikroskopie

• 1675: Protozoen, Bakterien

• Bacillen, Kokken, Spirillen

Mikroskopie

Bakterien Formen

• Hans Christian Joachim Gram

• 1853-1938, Dänemark

• 1883-1885, Friedrichshain, Berlin: Gramfärbung

• Gram+:BlauGram-: Rot (Gegenfärbung Safranin)

Gram Färbung

Gram-positiv

Gram-negativ

Bakterielle Zellwand

Bakterielle Erreger

DNA - Desoxyribonukleinsäure

• 1928/1944: Griffith/Avery: Transforming principle (S.pneumoniae)

• 1953:James Watson, Francis Crick: Doppelhelix

• 1978: Daniel Nathans, Hamilton Smith: Restriktionsendonukleasen

• 1983: Kary Mullis: Polymerase Chain Reaction (PCR)

RNA Polymerase

DNA Polymerase

Ribosomen

Ribosomen

16S rRNA phylogenetic Tree

Intermezzo - Größenverhältnisse

Intermezzo - Nomenklatur

Griechisch für Mikrobiologen

streptos: einfach zu biegen, wie eine Kettestaphyle: Traubecoccos: Körnchen

Streptococcus pneumoniae

Staphylococcus aureus

Escherichia coli

Klebsiella pneumoniae

Pseudomonas aeruginosa

Kettenkörnchen der Lungenentzündung

Goldene Traubenkörnchen

Darmbakterien von Theodor Escherich

Edwin Klebs, Lungenentzündung

Falsche Einheit, alt und faltig

Oberflächenantigene

Streptococcus pneumoniae Kapseltypen

• Polysaccharid Kapsel

• 91 verschiedene Kapselstrukturen

• Neufeld'sche Quellungsreaktion

• Manche Serotypen gehäuft bei invasiven Krankheiten

• Manche Serotypen sind häufiger als andere

Serotyp-Verteilung invasiver Pneumokokken Erkrankungenbei Kindern, Deutschland (1997-2006)

14

19F

6B

23F118C

7F

6A

9V

4

others 14

19F

6B

23F

1

18C

7F

6A

9V

4

others

7-valenter Pneumokokken Impfstoff

Serotype coverage of PCV7 (V), vaccine-related (VR) and non-vaccine (NV) serotypes in all IPD in children <5 years

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006

NV (%)

VR (%)

V (%)

IPD < 5 years

Streptococcus pyogenes (GAS) M-Protein (emm-Gen)

• M-Protein

• Antigen

• Unterteilung in Serovare

• Sequenzierung der Gene der M-Proteine (emm-Gene)

• Zur Zeit sind mehr als 150 verschiedene emm-Typen bekannt

• Das M-Protein hat eine antiphagozytäre Wirkung

emm-Typisierung von 203 invasiven S.pyogenes Isolaten aus Deutschland 2003-2004

0

10

20

30

40

50

60

70

80

1 28 3 12 89 4 6 75 77 118 26 29 5 9 2 11 13 30 49 50 58 64 81 83 87 94 102

103

833

6735

27G

St

4986

nu

mb

er

of

iso

late

s

emm-type

emm-type n= %1 67 33,0

28 41 20,23 22 10,8

12 11 5,489 9 4,4

others 53 26,1

203 100,0

Klonale VerwandtschaftPulsed Field Gel Electroporesis (PFGE)

Chromosomale DNA Extraktion

Verdau mit Restriktionsendonuklease

Auftrennung nach Größe auf Agarose-Gel

Pulsed Field Gel Electroporesis (PFGE)

Pulsed Field Gel Electroporesis (PFGE)

Klonale VerwandtschaftMultilocus Sequence Typing (MLST)

• DNA Sequenzierung interner Fragmente von 7 'house-keeping genes'

• essentielle Gene: nur wenige Mutationen werden toleriert

• Silent Mutations: bleiben erhalten, weil sie nicht stören

• Für Streptococcus pneumoniae

• aroE (shikimate dehydrogenase)

• gdh (glucose-6-phosphate dehydrogenase)

• gki (glucose kinase)

• recP (transketolase)

• spi (signal peptidase I)

• xpt (xanthine phosphoribosyltransferase)

• ddl (D-alanine-D-alanine ligase)

Multilocus Sequence Typing (MLST)

• PCR von 7 Genfragmenten

• Jede neue Sequenz erhält eine Nummer,

• gleiche Sequenzen erhalten gleiche Nummern

• Für jedes Allel eine Bibliothek von

verschiedenen Varianten (Nummern)

• Nummern der 7 Allelen in fester Reihenfolge

ergeben einen Code

• Jeder Code ist ein Sequence Type (eigene ST

Nummer)

• Stämme mit gleichem Sequence Type sind

klonal.

Allel

Multilocus Sequence Typing (MLST)Beispiele

ST aroE gdh gki recP spi xpt ddl

124 7 5 1 8 14 11 14

81 4 4 2 4 4 1 1

15 1 5 4 5 5 3 8

SLV15 1 4 4 5 5 3 8

DLV 1 4 4 23 5 3 8

Multilocus Sequence Typing (MLST)eBURST, Clonal Complex ST124

124

Klonale VerwandtschaftAnwendungen

• Zwei Patienten mit gleicher Infektion. Verdacht auf gleiches Isolat.

• → PFGE

• Gleiches Isolat ergibt haargenau gleiches PFGE Muster

• Es ist kaum Zeit da gewesen für Punktmutationen

• Klonale Verwandtschaft aller Makrolid-resistenten Pneumokokken

Isolate in Deutschland, und Vergleich mit internationalen Isolaten

• → MLST

• Zeigt Verwandtschaft von zeitlich auseinanderliegenden Isolaten

• MLST ist 'portable', PFGE nicht

Schlussworte

• Typisierung von Bakterien ist enorm vielfältig

• Einige Beispiele wurden gezeigt

• in der Epidemiologie ist Typisierung sehr wichtig

• Manchmal Korrelation zwischen Typisierung und Krankheitsverlauf

• Rolle der Molekularbiologie ist groß