Infektionsepidemiologie und Typing
Modellstudiengang WS 07 / 08
• Welche sind es?• Form• Biochemie• DNA/RNA• Antigene• usw
• Wo kommen sie her?• Vom Patienten nebenan• Aus dem Urlaub• usw
• Was fördert ihre Verbreitung?• Ein erfolgreicher Klon• Multiklonal• Antibiotikaresistenzen
Bakterielle Erreger
• Antonie van Leeuwenhoek
• 1632-1723, Niederlande
• Mikroskopie
• 1675: Protozoen, Bakterien
• Bacillen, Kokken, Spirillen
Mikroskopie
Bakterien Formen
• Hans Christian Joachim Gram
• 1853-1938, Dänemark
• 1883-1885, Friedrichshain, Berlin: Gramfärbung
• Gram+:BlauGram-: Rot (Gegenfärbung Safranin)
Gram Färbung
Gram-positiv
Gram-negativ
Bakterielle Zellwand
Bakterielle Erreger
DNA - Desoxyribonukleinsäure
• 1928/1944: Griffith/Avery: Transforming principle (S.pneumoniae)
• 1953:James Watson, Francis Crick: Doppelhelix
• 1978: Daniel Nathans, Hamilton Smith: Restriktionsendonukleasen
• 1983: Kary Mullis: Polymerase Chain Reaction (PCR)
RNA Polymerase
DNA Polymerase
Ribosomen
Ribosomen
16S rRNA phylogenetic Tree
Intermezzo - Größenverhältnisse
Intermezzo - Nomenklatur
Griechisch für Mikrobiologen
streptos: einfach zu biegen, wie eine Kettestaphyle: Traubecoccos: Körnchen
Streptococcus pneumoniae
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Pseudomonas aeruginosa
Kettenkörnchen der Lungenentzündung
Goldene Traubenkörnchen
Darmbakterien von Theodor Escherich
Edwin Klebs, Lungenentzündung
Falsche Einheit, alt und faltig
Oberflächenantigene
Streptococcus pneumoniae Kapseltypen
• Polysaccharid Kapsel
• 91 verschiedene Kapselstrukturen
• Neufeld'sche Quellungsreaktion
• Manche Serotypen gehäuft bei invasiven Krankheiten
• Manche Serotypen sind häufiger als andere
Serotyp-Verteilung invasiver Pneumokokken Erkrankungenbei Kindern, Deutschland (1997-2006)
14
19F
6B
23F118C
7F
6A
9V
4
others 14
19F
6B
23F
1
18C
7F
6A
9V
4
others
7-valenter Pneumokokken Impfstoff
Serotype coverage of PCV7 (V), vaccine-related (VR) and non-vaccine (NV) serotypes in all IPD in children <5 years
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006
NV (%)
VR (%)
V (%)
IPD < 5 years
Streptococcus pyogenes (GAS) M-Protein (emm-Gen)
• M-Protein
• Antigen
• Unterteilung in Serovare
• Sequenzierung der Gene der M-Proteine (emm-Gene)
• Zur Zeit sind mehr als 150 verschiedene emm-Typen bekannt
• Das M-Protein hat eine antiphagozytäre Wirkung
emm-Typisierung von 203 invasiven S.pyogenes Isolaten aus Deutschland 2003-2004
0
10
20
30
40
50
60
70
80
1 28 3 12 89 4 6 75 77 118 26 29 5 9 2 11 13 30 49 50 58 64 81 83 87 94 102
103
833
6735
27G
St
4986
nu
mb
er
of
iso
late
s
emm-type
emm-type n= %1 67 33,0
28 41 20,23 22 10,8
12 11 5,489 9 4,4
others 53 26,1
203 100,0
Klonale VerwandtschaftPulsed Field Gel Electroporesis (PFGE)
Chromosomale DNA Extraktion
Verdau mit Restriktionsendonuklease
Auftrennung nach Größe auf Agarose-Gel
Pulsed Field Gel Electroporesis (PFGE)
Pulsed Field Gel Electroporesis (PFGE)
Klonale VerwandtschaftMultilocus Sequence Typing (MLST)
• DNA Sequenzierung interner Fragmente von 7 'house-keeping genes'
• essentielle Gene: nur wenige Mutationen werden toleriert
• Silent Mutations: bleiben erhalten, weil sie nicht stören
• Für Streptococcus pneumoniae
• aroE (shikimate dehydrogenase)
• gdh (glucose-6-phosphate dehydrogenase)
• gki (glucose kinase)
• recP (transketolase)
• spi (signal peptidase I)
• xpt (xanthine phosphoribosyltransferase)
• ddl (D-alanine-D-alanine ligase)
Multilocus Sequence Typing (MLST)
• PCR von 7 Genfragmenten
• Jede neue Sequenz erhält eine Nummer,
• gleiche Sequenzen erhalten gleiche Nummern
• Für jedes Allel eine Bibliothek von
verschiedenen Varianten (Nummern)
• Nummern der 7 Allelen in fester Reihenfolge
ergeben einen Code
• Jeder Code ist ein Sequence Type (eigene ST
Nummer)
• Stämme mit gleichem Sequence Type sind
klonal.
Allel
Multilocus Sequence Typing (MLST)Beispiele
ST aroE gdh gki recP spi xpt ddl
124 7 5 1 8 14 11 14
81 4 4 2 4 4 1 1
15 1 5 4 5 5 3 8
SLV15 1 4 4 5 5 3 8
DLV 1 4 4 23 5 3 8
Multilocus Sequence Typing (MLST)eBURST, Clonal Complex ST124
124
Klonale VerwandtschaftAnwendungen
• Zwei Patienten mit gleicher Infektion. Verdacht auf gleiches Isolat.
• → PFGE
• Gleiches Isolat ergibt haargenau gleiches PFGE Muster
• Es ist kaum Zeit da gewesen für Punktmutationen
• Klonale Verwandtschaft aller Makrolid-resistenten Pneumokokken
Isolate in Deutschland, und Vergleich mit internationalen Isolaten
• → MLST
• Zeigt Verwandtschaft von zeitlich auseinanderliegenden Isolaten
• MLST ist 'portable', PFGE nicht
Schlussworte
• Typisierung von Bakterien ist enorm vielfältig
• Einige Beispiele wurden gezeigt
• in der Epidemiologie ist Typisierung sehr wichtig
• Manchmal Korrelation zwischen Typisierung und Krankheitsverlauf
• Rolle der Molekularbiologie ist groß