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Alumnos: Stephanie Glaves
Valentina Jarur
Melissa Puentes
Luis Silva
Amara Valencia
Asignatura: Procedimientos de
Laboratorio Clínico
Docente : Leonardo Rubio
Fecha: 23 de marzo de 2012
INFORME
“ESPECTROFOTOMETRÍA Y
BUFFER”
23-3-2012
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INTRODUCCIÓN
La espectrofotometría es un método muy usado en investigaciones químicas y biológicas que
sirven para medir la luz. Este equipo mide la absorbancia o transmitancia de la muestra,
según la longitud del espectro de radiación electromagnética.
La absorvbancia se define como la transición desde un nivel de energía bajo a una alta. La
cual vemos la relación que existe entre la concentración de la solución y su capacidad de
absorber radiación o luz.
Por lo tanto, al analizar una muestra haciendo incidir un rayo de luz a través de esta, la
muestra absorberá o “guardara” un resto de luz dependiendo del espectro relativo de esta, por
ende lo que se mide finalmente en el espectrofotómetro es la luz que no es absorbida por la
muestra y que es capaz de atravesarla, esta energía en forma de luz alcanza una placa
registradora que medirá cuanta luz atravesó la muestra, luego la lleva un amperímetro la
cual se va a transformar y expresar en números.
También tenemos el monocromador, que es el filtro que se utilizará para leer los nanómetros
de la longitud de onda requerida para cada técnica. Este tiene que ser de un color opuesto;
obteniéndose ya sea por el prisma; filtro y la difracción de la luz.
Tenemos a los cromóforos, que son aquellos compuestos que poseen dobles enlaces que
absorben la luz en el espectro.
Es importante saber que lo que estamos midiendo es cuantitativo.
Por otra parte, también se demostró para que se usan los amortiguadores o buffer; donde en
este caso se hizo el buffer Sorensen o fosfato, a un pH de 7,0 la cual se explicará más adelante
si se necesito hacer TITULACIÓN.
Objetivos generales:
Aprender a usar el espectrofotómetro
Determinar cuantitativamente la glucosa de nuestro paciente
La importancia de los buffer
Aprender y aplicar el concepto de Titulación
Interpolación en curva de calibración
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SOLUCION BUFFER
Materiales
Agitador magnético
Papel indicador de pH
Peachímetro
Pipetas plásticas
Vaso precipitado
Tubos
Gradillas
Probetas
Agitador magnético
Procedimientos y cálculos
Preparación de solución de buffer fosfato (SORENSEN)
Hicimos una dilución con el cual tendremos un pH neutro final de 7,0.
A= 0,2 M NaH2PO4
B= 0,2 M Na2HPO4
DONDE A = X, y B = Y
La solución madre sería: X ml de A + Y ml de B; diluyéndolo en 200 ml, donde tenemos que
tener X= 39ml e Y= 61 ml
Para preparar la disolución debimos hacer el siguiente cálculo:
A= 0,2 M NaH2PO4
Na=23 H2= 1X2
H2=1X2 O= 15
P=31
04=16X4
----------------------------------------------
P.A= 120 gr + 17 gr = 137 g
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0,2 MOLES-------------X MOLES
1000ml-----------------100ml
X= 0,02 MOLES en 100 ml
1 MOL----------------137gr
0,02--------------------X gr
X= 2,7 gr en 100 ml
Preparación de HCL
0,2 M HCL
Peso atómico del reactivo: 36,5 g/mol
1 MOL ----------------36.5 gr
0,002 MOLES-------X gr
X= 0,073 gr en 10 ml
1L = 1,19 Kg
1000 ml = 1,19 X 1000
1000 ml--------1190 gr
X ml------------0,073 gr
X = 0,06 ml
X= 60 µl
Luego se vació el buffer en un vaso precipitado poniendo a este el agitador magnético.
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Después de que la disolución esté homogénea, introducimos los electrodos del peachímetro en
el vaso precipitado con el buffer Fosfato.
Resultados
Nuestro buffer dio el pH requerido: 7,0 por lo tanto no fue necesario la titulación.
La titulación es un proceso químico cuantitativo, el cual determina la cantidad de cierto
constituyente en la mezcla. En este proceso, la solución titulante se agrega gradualmente al
titulado (analito) para determinar la concentración molar de este en la masa del reactivo. Se
utiliza la molaridad conocida del titulante para determinar la cantidad (masa) de este en la
solución. En nuestro caso, este proceso se había usado para cambiar en pequeñas cantidades
el pH de la solución y así determinar la capacidad amortiguadora de nuestros buffer.
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TÉCNICA DE ESPECTROFOTOMETRÍA
Materiales
Vaso precipitado
Pipeta
Matraz aforado
Espectrofotómetro
Balanza
Vidrio reloj
Espátula
Papel milimetrado
Tubos plásticos
Gradilla
Vaso precipitado
Procedimiento
1. Preparar una solución estándar madre de 1000mg/dl de glucosa en agua destilada
2. Preparar diluciones sucesivas con calibradores de glucosa que contengan las siguientes
concentraciones:
a) 500 mg/dl
b) 250 mg/dl
c) 125 mg/dl
d) 62.g mg/dl
3. Realizar determinación enzimática de glucosa usando los calibradores, solución madre,
calibrador comercial, suero control y muestras de pacientes según el siguiente cuadro:
solución concentración micro litros Reactivo
Solución madre 1000 50 1 ml
Tubo A 500 50 1 ml
Tubo B 250 50 1ml
Tubo C 125 50 1ml
Tubo D 62,5 50 1ml
Suero control 90 50 1ml
Calibrador comercial 100 50 1ml
muestras ¿? 50 1ml
Blanco con agua destilada 0 50 1ml
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a) Incubar 5 minutos a 37 grados Celsius; leer en espectrofotómetro antes de 60 minutos.
b) Pasar a papel milimetrado los resultados de densidad óptica de los tubos madre A, B, C,
y D graficar en Y= absorbancia y X= concentración.
c) Calcular factor según calibrador comercial; realizar absorbancia y cálculo de resultado
de muestra y control según:
Resultado = absorbancia x factor
d) Obtener mismos resultados por interpolación en papel milimetrado.
Resultados en espectrofotómetro
Soluciones Absorbanci
a
Concentración
(mg/dl)
Factor
Muestra 1 1 119 119
Muestra 2 1,102 131,1 119
Muestra 3 1,940 230,9 119
Muestra 4 1,356 161,4 119
Muestra 5 0,905 107,7 119
Solución madre 1,847 219,8 119
Tubo A 1,829 217,7 119
Tubo B 1,952 232,3 119
Tubo C 1,456 173,3 119
Tubo D 0,769 91,5 119
Suero control 0,099 11,78 119
Blanco 0,000 0 119
Calibrador comercial 0,843 100
Con C = f *A.
Siendo:
F= factor
A= Absorbancia
C= concentración (mg/dl)
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Gráfico
Gráfico e interpolación para cálculo de concentración de las muestras (1, 2, 3, 4 y 5) a
partir de la gráfica:
MUESTRA Concentración obtenida
por interpolación
Concentración real
M1 ~135 mg/dL 93 mg/dl
M2 ~160 mg/dL 92 mg/dl
M3 ~370 mg/dL 541 mg/dl
M4 ~185 mg/dL 133 mg/dl
M5 ~120 mg/dL 87 mg/dl
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CONCLUSIÓN
Las soluciones buffer son sin duda un componente esencial en el organismo, es por esto que se
encuentran estrechamente ligados a los mecanismos de mantención del equilibrio químico y la
homeostasis sistémica.
En este laboratorio pudimos comprobar el efecto amortiguador de una solución buffer
preparada por nosotros y las variaciones del pH e integridad sanguínea en ausencia de este.
El buffer que elaboramos fuel buffer fosfato, el cual tiene un pH de 7,0, al exponerlo al
peachímetro nos dimos cuenta de que la elaboración fue correcta y nos calzo el pH medido con
lo esperado, sin embargo si no lo hubiéramos conseguido habríamos tenido que utilizar la
técnica de titulación que consiste básicamente en agregar más acido en caso de que el pH
fuera muy básico, o viceversa si el p H hubiera resultado muy acido habríamos tenido que
agregar más sal, que actúa como el componente básico en este caso.
Hicimos un pool de 6 tubos, cada uno con 1 ml de sangre y a cada uno de ellos lo expusimos a
distintas soluciones, y estos fueron los resultados:
pH T1 T2 T3 T4 T5 T6 Hemólisis
Sangre 7,0 1
gota
1
gota
1
gota
1
gota
1
gota
1
gota
Buffer fosfato 7,0 3
ml
-
Buffer acetato 4,8 3
ml
+
Buffer barbital 8,0 3
ml
+
Agua destilada 7,0 3
ml
+
Suero fisiológico 7,0 3
ml
-
Se puede notar que no ocurrió hemólisis cuando se expuso la sangre al buffer fosfato, esto se
debe a que el pH al que trabaja este buffer es muy cercano al pH fisiológico de la sangre, es
por esto que no se altero el equilibrio químico de su medio normal y esto llevo a que no
hubiera hemolisis. Con los otros buffer si se presento hemólisis ya que mantenían el pH a
niveles muy distintos a la normalidad sanguíneas. Sin embargo se presentó hemólisis en el
agua destilada a pesar de que en esta existe un pH 7,0, esto se debió a la variación osmótica
de los medios, ya que se expuso a los glóbulos rojos a un medio hipotónico con respecto al
plasma, es por esto que ellos experimentaron una lisis.
Con respecto a la espectrofotometría cabe destacar que es una de las técnicas más usadas en
laboratorio clínico, esencial para medir densidades y concentraciones que el ojo humano no es
capaz de distinguir.
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En el laboratorio de espectrofotometría preparamos una solución madre de glucosa, desde la
cual practicamos diluciones sucesivas para llegar a cuatro tubos con concentraciones
conocidas diferentes, esto con el propósito de exponerlas luego al espectrofotómetro y medir
sus absorbancias junto con otras muestras proporcionadas por el profesor y controles.
Los resultados de esta técnica si bien, no fueron lo exactos que esperábamos, nos sirvieron
mucho para experimentar y dimensionar de lo que se trata la espectrofotometría, como
funciona y en qué consiste. Sin embargo a juzgar por la variación de los resultados pudimos
inferir que el error estuvo básicamente en haber calibrado el blanco con una cubeta que, lo
más probable, fue que haya estado rayada por el exceso de uso. Como también podría deberse
a un mal pipeteo, un error de rotulación, mala agitación de las muestras o soluciones y como
factor principal, el mal estado en que se encontraba el reactivo utilizado, lo cual fue advertido
desde un principio por el docente a cargo.
Es por esto que coincidimos en que lo más importante en esta técnica es escoger
correctamente la longitud de onda a la cual se va a exponer la muestra según el inserto de la
técnica, y por lo tanto ser muy cuidadosos con los instrumentos y materiales que se utilizan,
ya que a la menor variación los resultados pueden ser distintos en un porcentaje muy
importante juzgando que se trata con la vida del paciente.
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BIBLIOGRAFÍA
Principios de química: los caminos del descubrimiento. Escrito por Peter William
Atkins, Loretta Jones.
Química y reactividad química. Escrito por John C. Kotz, Paul M. Treichel, Gabriela C.
Weave.
