Introducción

El dominio Bacteria alberga a numerosos microorganismos que son capaces de subsistir en gran variedad de hábitats y bajo diversas condiciones ambientales, haciendo posible su existencia en casi cualquier lugar imaginable.Las bacterias presentan una amplia gama de morfologías y características metabólicas que permiten su diferenciación y clasificación mediante análisis de laboratorio. Para ello, es necesario cultivar las cepas en medios propicios para su crecimiento y proliferación, sean estos líquidos (Ej.: caldo nutriente), semisólidos (Ej.: agar TSI) o sólidos (Ej: agar corriente). La identificación bacteriana se basa principalmente en la observación macroscópica y microscópica de los cultivos y los resultados de distintas pruebas realizadas a ellos.

El análisis macroscópico consiste en observar a simple vista cambios cualitativos en las muestras, como variación en el color u opacidad del medio de cultivo, textura de la superficie, agrupación macroscópica, bordes de la colonia, elevación de esta, y tipo de hemólisis, en el caso de los cultivos en agar sangre, y movilidad, en el caso del agar MIO.La observación microscópica busca esclarecer características que no es posible visualizar sin el instrumental adecuado. Para ello, se utiliza el microscopio y ciertas tinciones (Ej.: tinción de Gram) para obtener apreciaciones más certeras de la colonia, como forma de la bacteria, agrupación (racimos, cadenas, etc), y gram positividad/negatividad.

También existen pruebas bioquímicas como la Fisiotaxonomía bacteriana, que de acuerdo a variables selectivas y diferenciales como utilización de fuentes de carbono, presencia de enzimas, sensibilidad a compuestos químicos y formación de productos metabólicos, permite un reconocimiento más preciso de los organismos en cuestión. Del mismo modo, la prueba API 10s conduce a una identificación rápida de enterobacterias y bacilos gram-negativos mediante la comparación de los resultados obtenidos con otros preexistentes. Este test consiste en 11 pruebas bioquímicas estandarizadas que utilizan sustratos deshidratados.

Los análisis anteriormente descritos son útiles para la identificación de bacterias con las que convivimos en nuestro cotidiano, así como también de potenciales patógenos que ponen en riesgo la salud humana.

Este trabajo práctico tiene los siguientes objetivos:

Identificar material empleado en la práctica bacteriológica Adquirir destreza para manipular materiales y cultivos,

cuidando la esterilidad Conocer los diferentes medios de cultivo Conocer la utilidad de los medios de cultivo más usados Conocer el concepto de siembra y aislamiento de bacterias Practicar diferentes tipos de siembra y aislamiento bacteriano Comparar colonias bacterianas desarrolladas en placas de agar Describir colonias de acuerdo a criterios macroscópicos Practicar tinciones diferenciales de frotis bacterianos: tinción

de Gram, tinción de cápsula y esporas. Dada una serie de preparaciones microscópicas, identificar

diferentes formas y agrupaciones de microorganismos teñidos con la tinción de Gram

Reconocer géneros y especies bacterianas de acuerdo a sus características macro y microscópicas.

Practicar algunas pruebas bioquímicas rápidas para la identificación de cocáceas Gram+

Reconocer alteraciones producidas en los medios de cultivo, por la presencia de productos intermediarios, debido a la acción bacteriana

Identificar macroscópica y microscópicamente bacterias de nuestra flora normal en las placas sembradas en la sesión anterior.

Identificar bacterias que están presentes en el ambiente Identificar una cepa bacteriana Gram(-) a través de su

comportamiento en diferentes medios de cultivo y analizar macroscópica y microscópicamente.

Materiales y Métodos

Los materiales utilizados en los pasos prácticos son los siguientes:

Mechero Asas de siembra Pipetas Pasteur Suero fisiológico Placas de agar Corriente Placas de agar McConkey Placas de agar Sangre Tubos de agar Corriente Tubos de agar semitendido Cultivos Bacterianos en medio sólido

Cultivos Bacterianos en medio tendido Batería de tubos con diversos medios de cultivo Batería de tubos de pruebas fisiotaxonómicas Batería API S10 Batería de preparaciones fijadas Microscopio Portaobjetos Reactivos para tinción de Gram

Resultados

Parte I:

El análisis macroscópico de los cultivos de las bacterias Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Bacillus cereus arrojó las siguientes características para cada colonia, respectivamente:

Staphylococcus aureusTipo de Agar Corriente Sangre McConckey

Medio de cultivo

L S L S L S

Crecimiento Bajo Moderado No crece

Cara

cte

ríst

icas

morf

oló

gic

as

Colonia Puntiforme Puntiforme -Borde Ondulado Ondulado -

Superficie

Rugosa Rugosa -

Elevación

Plana Elevada -

C. Físicas

CéreaBrillante

Color amarillo

CéreaBrillante

Color amarillo

-

Hemolisis

- β -

Tabla 1: Características morfológicas para la colonia de Staphylococcus aureus

Escherichia coliTipo de Agar Corriente Sangre McConckey

Medio de cultivo

S S S S L S

Crecimiento Moderado Alto Alto

Cara

cte

ríst

icas

morf

oló

gic

as

Colonia Puntiforme Irregular PuntiformeBorde Liso Liso Liso

Superficie

Lisa Lisa Lisa

Elevación

Elevada Elevada Convexa

C. Físicas

TransparenteBrillanteSin color

CéreaBrillante

Color blanco

CéreaBrillante

Color fucsiaHemoli

sis- β -

Tabla 2: Características morfológicas para la colonia de Escherichia coli.

Bacillus cereusTipo de Agar Corrien

teCorriente Sangre McConcke

yMedio de cultivo

L S S S S S L S

Crecimiento Bajo Moderado Alto Alto

Cara

cte

ríst

icas

morf

oló

gic

as Colonia Puntifor

meRizoide Irregula

rPuntiforme

Borde Liso Lobulado Ondulado

Liso

Superficie

Lisa Rugosa Rugosa Lisa

Elevación

Elevada Elevada Elevada Elevada

C. Físicas

Transparente

Brillante

Sin color

CéreaOpacaColor

Amarillo

CéreaOpacaColor gris

CéreaBrillante

Color rosado

Hemolisis

- α -

Tabla 3: Características morfológicas para la colonia de Bacillus cereus

El análisis microscópico realizado posterior al uso de la tinción de Gram, mostró los resultados siguientes:

Análisis MicroscópicoBacteria Staphyloco

ccus aureusEscherichia coli

Bacillus cereus

Bacillus cereus

Muestra Colonia

Agar Sangre Agar MacConckey

Agar Sangre

Agar MacConkey

Afinidad tintórea

Gram + Gram - Gram + Gram -

Forma Cocacea Bacilo Bacilo BaciloAgrupación

Racimo Racimo Cadena Racimo

Tabla 4: Morfología microscópica de las cepas bacterianas sembradas y sometidas a la tinción de Gram.

La observación microscópica de la batería de muestras fijadas indicó los resultados expuestos en la Tabla 5.

Tinción

Nº Muestra Afinidad T.

Forma Agrupación

Gram

101 Gram + Gram + Bacilo Cadena102 Gram - Gram - Bacilo Cadena

y racimo103 Mezcla

Gram + y Gram -

Gram + Cocacea DiploGram - Bacilo Diplo

105 Estafilococos

Gram + Cocacea Racimo

106 Levadura Gram + Cocacea Racimo107 Estreptococ

osGram + Cocacea Racimo

Verde de

Malaquita

109 Esporas - Bacilo Cadena

Tinta China

110 Capsula - Cocacea Diplo

Tabla 5: Morfología de colonias fijadas.

Parte II

Las muestras nasofaríngeas recolectadas en el laboratorio (Fig. ) fueron analizadas macroscópica, microscópica y bioquímicamente, entregando los resultados expuestos en las tablas.

Muestra N°1 Muestra N° 2 Muestra N°3

Fig. * : Muestras nasofaríngeas en agar sangre, pertenecientes a tres estudiantes distintos

Muestras nasofaríngeaNº muestra 01 02 03

Tipo de Agar Sangre Sangre SangreCrecimiento Alto

(1)Moderado

(2)Moderado Bajo Moderado Bajo

Cara

cter

ísti

cas

mor

foló

gica

s

Colonia Puntiforme Rizoide Puntiforme Irregular Puntiforme PuntiformeBorde Liso Lobulado Liso Liso Liso Liso

Superficie Liso Rugosa Lisa Lisa Lisa LisaElevación Convexa Elevada Convexa Elevada Convexa ConvexaC. Físicas Transparente

BrillanteSin color

CéreaBrillante

Color Amarillo

Transparente

BrillanteSin color

CéreaBrillante

Color Amarillo

TransparenteBrillanteSin color

CéreaOpaca Color

AmarilloHemolisis α α α α β β

Tabla 6

Tinción de Gram Nº Muestra 01 02 03

Muestra Colonia

Agar Sangre Agar Sangre Agar Sangre

Afinidad tintórea

Gram + Gram - Gram + Gram - Gram + Gram -

Forma Cocaceas Cocaceas Cocaceas Cocaceas Cocaceas CocaceasAgrupación Racimos Cadena Racimos Racimos Racimos Cadena

Tabla 7: Análisis microscópico de las muestras, posterior a la tinción de Gram.

Posteriormente, se realizaron las pruebas de coagulasa y catalasa a dos cepas bacterianas encontradas en la muestra N° 1, lo que se grafica en la Tabla 8.

Prueba bioquímica para cocacea Gram +Bacteria Nº1 Nº2Catalasa (-) (+)

Coagulasa No se realizo Control negativo

Control positivo

(-) (+)Tabla 8: Pruebas bioquímicas para las bacterias halladas en la muestra N°1.

Las muestras extraídas del ambiente (Fig. *) fueron sometidas a análisis macroscópico, obteniendo los resultados observados en la Tabla 9.

a. b. c.

d. e.Fig. * : Muestras ambientales y corporales correspondientes a: a. cara, b. muñeca, c. cuero cabelludo, d. suelo del laboratorio, e. oreja.

Muestras ambientales y del cuerpoMuestra Cara Muñeca Cuero

cabelludoSuelo

LaboratorioOreja

Tipo de Agar Corriente Corriente McConckey McConckey CorrienteCrecimiento Bajo Moderado - - Bajo

Cara

cter

ísti

cas

mor

foló

gica

s

Colonia Puntiforme Circular - - CircularBorde Liso Liso - - Liso

Superficie Lisa Lisa - - LisaElevación Pulvinada Umbonada - - UmbonadaC. Físicas Cérea

OpacaColor blanco

TransparenteBrillante

Color Amarillo

- - CéreaOpacaColor

Amarillo

Tabla 9: Análisis macroscópico de las colonias halladas en muestras ambientales y corporales.

Las pruebas de la batería bioquímica para la bacteria asignada indicaron lo expuesto en la Tabla 10.

Batería BioquímicaAgar o Caldo

Forma Color al Inicio Color después de agregar la bacteria

Resultado

Corriente Tendido Amarillo claro Blanco Pigmentación (+)Manitol Tendido Rojo

transparenteRosado Alcalinidad (-)

Citrato Tendido Verde musgo fuerte

Azul Utilización de citrato (-)Medio alcalino

Producción de amoniacoTSI Semitendido Naranjo

transparenteSuperficie negraProfundidad roja

No hay fermentación (K/K)Presencia de enzimas proteolíticas

Presencia de H2SLIA Semitendido Lila Morado intenso No desamina la Descarboxila la

lisina lisinaMIO - Café oscuro Morado No hay motilidad

Corriente Líquido Amarillo fuerte

Amarillo opaco Ausencia de indol (-)

Urea Líquido Lila claro Lila claro No posee ureasa (-)Sorbitol Líquido Rojo fuerte Rojo anaranjado +- Variable (V)

Glucosado Líquido Amarillo transparente

Amarillo transparente sin presencia de gas

Acidez (A)

Voges-Proskauer

Líquido Amarillo - marrón

Rosado oscuro

Rojo Presencia de Acetilmetilcabinol

(+)

pH 4,5 o más bajo(+)

Tabla 10: Resultados de las pruebas bioquímicas fisiotaxonómicas para la cepa asignada.

Posteriormente, el análisis API 10S para la bacteria (Fig. *) mostró lo indicado en las Tabla 11 y Tabla 12.

a.

b.

c.

Fig. *: a. API 10S con la bacteria sembrada, b. API 10S luego de 3 semanas, c. API 10S luego de 3 semanas más algunos reactivos.

Pruebas en contraBacteria ONPG URE ARA TDA LDC OX

Salmonella choleraesuis ssp

arizonae

- 0% - 0% - 0%

Proteus mirabilis

1% - 1% - 1% -