Informe Seminario Gflv Cortado

GENES QUE INTERVIENEN EN LA RESISTENCIA A XIPHINEMA NDEX EN VITIS

JUAN CAMILO NAVARRO HERRERA, COD: 716663 JUAN PABLO BONET TORO, COD: 71

ANDRS FELIPE OSORIO JARAMILLO, COD: 71

GENTICA GENERAL

TERESA BENAVIDES

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE AGRONOMA SEDE BOGOT

BOGOT, OCTUBRE DE 2011

Gentica general: Genes que intervienen en la resistencia a Xiphinema ndex en Vitis

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TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIN. ........................................................................................................................ 2

2. OBJETIVO GENERAL ................................................................................................................... 2

2.1. OBJETIVOS ESPECFICOS .................................................................................................... 2

3. MARCO TERICO. ...................................................................................................................... 3

3.1. GRAPEVINE FANLEAF VIRUS GFLV. ................................................................................. 3

3.2. XIPHINEMA (NEMATODOS DAGA). ................................................................................... 3

3.3. ADQUISICIN, RETENCIN Y TRANSMISIN DEL GFLV. ................................................... 4

4. ARREGLO EXPERIMENTAL (HWANG C. FENG, 2010) ................................................................ 5

4.1. MATERIALES VEGETALES Y LA DETECCIN DE RESISTENCIA A X. NDEX ......................... 6

4.2. BIBLIOTECAS DE BAC ......................................................................................................... 6

4.3. SECUENCIACIN DE LOS BAC Y EL DESARROLLO DE MARCADORES ................................ 7

4.4. RT-PCR ................................................................................................................................ 8

4.5. ANOTACIN DE BAC Y ANLISIS DE LA SECUENCIA ......................................................... 8

5. RESULTADOS Y ANLISIS ........................................................................................................... 8

5.1. Desarrollo de marcadores y cartografa de alta resolucin. ............................................ 8

5.2. Seleccin de recombinantes informativos y evaluacin de la resistencia de X. index. .. 9

6. DISCUSIN ............................................................................................................................... 10

7. CONCLUSIONES ........................................................................................................................ 10

8. BIBLIOGRAFIA .......................................................................................................................... 11

Tabla de Ilustraciones Figura 1. Xiphinema (Weiland A. C.,2001). ............................................................................ 3

Figura 2. Anatoma de un Nematodo diformismo sexual (Rubio G. C. et al., 2007). ............ 4


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1. INTRODUCCIN. Por medio de este trabajo realizamos la presentacin escrita, lgica y rigurosa de argumentos e informacin con miras a sustentar una idea propia sobre la clonacin y caracterizacin del gen responsable de la resistencia a los nematodos Xiphinema ndex en vitis , el cual es el mayor responsable de la transmisin del virus de la hoja en abanico de la vid (GFLV) a nivel mundial; Dando a conocer la importancia de encontrar nuevas formas de enfrentar el virus (GFLV),el cual afecta al rendimiento y a la longevidad de las cepas, dependiendo la variante del virus en la planta.

En primer lugar se realiza una recopilacin sobre los estudios en virosis del viedo, centrndose en aquellos que hacen referencia al GFLV; de la misma manera se revisan los trabajos existentes sobre los nematodos fitoparsitos de la vid, con especial hincapi en las especies transmisoras de este virus. Para el estudio pertinente y el desarrollo de los objetivos de trabajo, nos hemos basado en el artculo Cloning and characterization of XiR1, a locus responsable for dagger nematode resistance in grape de Hwang C. F. et al, (2010), con el fin de abarcar el tema de resistencia a la infeccin viral desde el punto de vista gentico.

La enfermedad del abanicamiento de las hojas de la vid, puede ser tan compleja que alcanza a reducir la produccin del cultiva hasta en un 80%, convirtindola en el mayor problema global de la viticultura (Andret-Link et al 2004). En un principio se manej el GFLV, usando fumigaciones en contra de X. index, pero observaron que no es muy recomendable debido a la alta penetrabilidad en el suelo, su alto costo y por los perjuicios relacionados con el medio ambiente (Goheen, 1988).

La resistencia a X. ndex y GFLV ha sido el objetivo clave de los estudios de la uva en programas de patrn de reproduccin. Un estudio anterior hall que la resistencia a la X. ndex derivado de Vitis arizonica es en gran parte controlado por un rasgo de QTL de XiR1 (X. index resistencia 1), localizado en el cromosoma 19. (Hwang C. F. et al, 2010).

2. OBJETIVO GENERAL

Aprender a desarrollar un seminario cientfico, mediante la revisin de diferentes fuentes cientficas confiables, para poder sustentar ideas propias sobre un caso de la vida real que sea de nuestro inters, para este caso: genes que intervienen en la resistencia a Xiphinema index (vector de GFLV) en Vitis.

2.1. OBJETIVOS ESPECFICOS

2.1.1. A. Conocer los procedimientos necesarios para realizar un mapa gentico de alta resolucin y saber interpretarlo.

2.1.2. B. Identificar la importancia de las libreras de BAC en la creacin de clones que permiten la identificacin de regiones especficas en el genoma.


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3. MARCO TERICO. 3.1. GRAPEVINE FANLEAF VIRUS GFLV.

Repartido en el mundo entero, se le considera como el virus ms importante dentro de los que afectan a la vid. Infecta a portainjertos de especies americanas, a variedades vinferas as como a los hbridos. Su diseminacin a grandes distancias se debe al transporte de plantas enraizadas, de injertos o de portainjertos provenientes de plantas sin control sanitario (BOVEY et al., 1980a; PEREZ-CAMACHO, 1981). El GFLV es un virus ARN cuyo genoma de 11.116 kb contiene dos molculas de ARN monocatenario de sentido positivo, ARN1 de 2,4 x 106 Da y 7.342 kb (RITZENHALER et al., 1991) y ARN2 de 1,4 x 106 Da y 3.774 kb (SERGHINI et al. 1990), que encapsidan en partculas diferentes. Est formado por partculas isomtricas de unos 30 nm de dimetro con un contorno angular y poca resolucin de superficie de estructura. En preparaciones purificadas en las que se realiza centrifugacin diferencial en gradiente de sacarosa, aparecen tres bandas (T, M y B) correspondientes a tres tipos de partculas, con coeficiente de sedimentacin 53 S, 93 S y 123 S. Estas bandas estn compuestas por 0,30 y 42 % de cido nucleico y por 100, 70 y 58 % de protena respectivamente (QUACQUARELLI et al., 1976; MARGIS et al., 1991).

3.2. XIPHINEMA (NEMATODOS DAGA).

Segn MARTELLI (1978), varias especies de este gnero estn repartidas en todas las reas principales de viedos del mundo. La mayora de las infectaciones de estos nematodos producen un lento y gradual decaimiento, pero raras veces matan a las vides en su totalidad. Se alimentan por medio de un largo estilete que utilizan para penetrar en el sistema vascular de las races. La mayor parte de su alimentacin tiene lugar en los pices de las races y el crecimiento de las mismas se para inmediatamente despus de que comienzan a alimentarse, dando lugar a un sistema radicular con aspecto de escoba de bruja (PEARSON y GOHEEN, 1996).

Figura 1. Xiphinema (Weiland A. C.,2001).


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Los nematodos del gnero Xiphinema se caracterizan por ser de tamao medio grande (2-12 mm) y forma cilndrica, alargada y atenuada en ambos extremos. Tienen un anfidio en forma de cliz, anillo gua doble situado en el tercio posterior del odontostilo, la unin entre odontostilo y odontforo es dentada y el odontforo se ensancha hacia su parte final y acaba en dos rebordes prominentes (Figura 1). (Weiland A. Carlos M., 2001). Su ciclo biolgico comienza en un huevo del que salen como primera fase larvaria y mudan 4 veces para convertirse en adultos con sexos separados. Cada fase debe alimentarse antes de poder mudar y continuar el crecimiento. La reproduccin en algunas especies es principalmente partenogentica y los machos son raros, aunque en otras, los machos estn presentes en casi el mismo nmero que las hembras (COHN, 1970).

3.3. ADQUISICIN, RETENCIN Y TRANSMISIN DEL GFLV.

Gracias a su largo estilete puncionan las races y se alimentan aspirando el jugo de las clulas profundas de los tejidos. Este estilete es el que permite el trnsito del GFLV e incluso su acumulacin. Segn ALFARO y GOHEEN (1974), es suficiente que X. index se alimente durante 5 minutos para adquirir el virus. Las partculas vricas se retienen de forma selectiva en zonas determinadas al pasar al aparato digestivo. En Xiphinema la retencin del virus se produce en la capa cuticular que tapiza el lumen del esfago, extendindose la zona de retencin desde el odontostilo hasta el bulbo basal (Figura 2) (PONZ et al., 1990).

Figura 2. Anatoma de un Nematodo diformismo sexual (Rubio G. C. et al., 2007).


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4. ARREGLO EXPERIMENTAL (HWANG C. FENG, 2010)

El estudio presentado aqu se desarrolla en mapas de alta resolucin genticos y fsicos en un eVort para identificar el gen XiR1 (s). El mapeo se llev a cabo con 1.375 genotipos en tres poblaciones derivadas de D8909-15, una seleccin resistente de un cruce de V. rupestris A. de Serres (susceptible) V. arizonica B42-26 (resistente).

La resistencia a X. ndex se evalu en 99 recombinantes informativos que fueron identificados mediante el cribado de las tres poblaciones con dos marcadores que flanquean el locus XiR1. El mapeo fsico de XiR1 se logr mediante la proyeccin de tres cromosomas artificiales bacterianos (BAC) de bibliotecas construidas de D8909-15, V. vinfera Cabernet Sauvignon y V. arizonica B42-26. Un total de 32 clones BAC fueron identificados y el lugar XiR1 se deline en una regin de 115 kb. El anlisis de la secuencia de los tres clones de BAC identificaron nucletidos putativos para genes (NB-LRR - Inmune receptors in plant virus defense).

Tres Poblaciones F1 3 Bibliotecas ARN

1.375 genotipos Aislado de cDNA Se Identificaron

Marcadores Cebadores 2 L 99 Recombinantes XiR1 Se deline Se tomaron Secuenciacin y Amplificacin 2 L

Evaluados para Secuencias Identificaron

Materiales

Vegetales Bibliotecas de BAC

Desarrollo de

marcadores RT - PCR

9621 0023 05384

M4F3F VMCN

4 plantas c/u + padres + control

100 Nematodos 4-8 semanas

EXPERIMENTO

V. Arizonica

D8909-15 V. Vinifera.

32 clones

115 kb

Genes (NB-LRR)

Los marcadores fueron

desarrollados de la

informacin combinada

de las secuencias finales

de los:

BAC Polimorfismos

Extremos BAC

S29J16

VA31P21

M10J21

XiR1.1 y XiR1.2

5gr Hoja 10 gr Raz

D8909-15

Primer ciclo PCR

Plantillas PCR animada

1.2% Agarosa Bromuro etilio

CEBADORES


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4.1. MATERIALES VEGETALES Y LA DETECCIN DE RESISTENCIA A X. NDEX

La primera poblacin, 9621, se deriv de un cruce de D8909-15 F8909-17, en el que se identific el lugar XiR1 inicialmente por (Xu et al. 2008). La poblacin 9621 se ampli a 943 individuos F1 para este estudio. La segunda fue la poblacin 0023 que consta de 178 individuos F1 de un cruce de D8909-15 V. vinifera B90-116. La tercera poblacin, 05384, consisti en 253 individuos F1 y derivada de un cruce de D8909-15 V. vinifera Airen. El padre comn materno de la familia D8909-15 fue la fuente de resistencia a X. ndice, mientras que los tres progenitores masculinos F8909-17, V. vinifera B90-116 y V. vinifera Airen eran susceptibles. D8909-15 es una seleccin derivada de un cruce de V. rupestris A. de V. Serres arizonica B42-26. El abuelo materno V. rupestris A. de Serres es susceptible de ndice X, mientras que el abuelo paterno V. arizonica B42-26 es muy resistente. Para distinguir los dos genomas haploides, as como el origen del genoma de un determinado cromosoma homlogo de D8909-15, los genomas y los cromosomas homlogos de individuos de B42-26 de origen y los de A. de origen Serres fueron designados D8909-15-R y D8909 -15-S del genoma / cromosoma, o simplemente "R" y "S" del genoma / cromosoma, respectivamente. Las tres poblaciones se analizaron con dos marcadores previamente identificados (M4F3F y VMCNg3a10) (Xu et al. 2008), que flanquean el locus XiR1 para que los genotipos recombinantes informativos pudieron ser identificados. Cuatro plantas de cada uno de los 99 recombinantes resultantes, junto con los padres y el control altamente susceptible de V. rupestris San Jorge, fueron propagados a partir de dos cortes de brotes herbceos. Las plantas enraizadas fueron evaluados para la resistencia a X. ndice basados en el nmero de agallas formadas en 4-8 semanas despus de la inoculacin con 100 nematodos, como se describi previamente por (Xu et al. 2008).

4.2. BIBLIOTECAS DE BAC

Tres bibliotecas de BAC se utilizaron para identificar BAC contiguos que abarcan el lugar XiR1.

La primera biblioteca de BAC fue construida por Yimin Jin (MA Walker, datos no publicados) a partir de D8909-15 utilizando una combinacin de vectores / enzima de pECSBAC4 / EcoRI. La biblioteca de BAC D8909-15 tiene 33.792 clones con un tamao de insercin promedio de aproximadamente 50 kb. La cobertura de esta biblioteca se estima en 3,4 libras equivalentes de genoma. Un total de 88 piscinas de ADN con una para cada una de las placas 384, basados en la PCR que permite la deteccin de clones de inters.

La segunda biblioteca de BAC fue construida a partir de V. vinifera Cabernet Sauvignon por el E & J Gallo Company (Modesto, CA, EE.UU.), utilizando dos combinaciones de vectores / enzima: pECBAC1/BamH I y pECBAC1/EcoR y ya est disponible en el


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laboratorio de MA Walker en la Universidad de California, Davis. Esta biblioteca de BAC se compone de 56.448 clones con una cobertura combinada de 13,9 libras equivalentes de genoma. El nmero de clones, tamao de insercin promedio y equivalentes de genoma son 27.648, 151 kb y 7.5 libras de la sub-biblioteca BamHI y 28.800, 125 kb y 6.4 libras de la sub-biblioteca EcoRI, respectivamente.

La tercera biblioteca de BAC fue construida a partir de V. arizonica B42-26 mediante una combinacin de vectores / enzima de pCC1/HindIII (amplicn Express, Pullman, WA, EE.UU.). El arizonica V. B42-26 de la biblioteca se compone de 36.864 clones con una cobertura del genoma de 6.1x equivalente a un tamao de insercin promedio de 140 kb. El Cabernet Sauvignon de la biblioteca y la arizonica V. B42-26 de la biblioteca se cuadriculada en un conjunto de tres y dos 22.5 22,5 cm2 Hybond N + Wlters, respectivamente.

Estos filtros fueron seleccionados por la hibridacin con el sistema de deteccin y etiquetado directo de cidos nucleicos ECL (Amersham, GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido).

4.3. SECUENCIACIN DE LOS BAC Y EL DESARROLLO DE MARCADORES

Los marcadores fueron desarrollados sobre la base de informacin combinada de las secuencias finales de los BAC y los polimorfismos identificados entre los dos cromosomas homlogos de D8909-15, as como entre los padres de las tres poblaciones. El ADN de BAC fue preparado a partir de 500 ml de LB nocturna utilizando un Kit Qiagen (Valencia, CA, EE.UU.) y las secuencias finales de BAC fueron obtenidas por secuenciacin directa utilizando BigDye Terminator V3.1 qumica (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU. ).

Se disearon los cebadores para cada extremo secuenciado de los BAC, utilizando el programa Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), y luego se utiliz para:

(1) usar directamente en la pantalla de la biblioteca de BAC D8909-15.

(2) aislar a los extremos correspondientes de alcoholemia para la deteccin de hibridacin basados en la biblioteca de BAC Cabernet Sauvignon.

(3) para amplificar, clonar y secuenciar los fragmentos genmicos correspondientes a todos los padres para la identificacin de polimorfismos de marcadores entre los genomas parentales.

Para estimar el tamao de los insertos, El ADN de los BAC fue digerido con la enzima de restriccin Not I (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE.UU.) y se analizaron con una prueba de gel DRIII (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.), para una duracin de 16 h a 14 C con 6 V / cm y el pulso de 50-40 s. Los BAC S29J16 y M10J21 fueron secuenciados utilizando una estrategia de escopeta por Macrogen (Sel, Corea) y amplificacin Express (Pullman, WA, EE.UU.), respectivamente. VA31P21 fue secuenciado por Macrogen (Sel, Corea), utilizando la tecnologa 454. El ADN y las secuencias de la


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protena putativa de XiR1.1 XiR1.2 ya estn disponibles con los nmeros respectivos de acceso GU471231 y GU471232 en el banco de germoplasma.

4.4. RT-PCR

El ARN total fue aislado a partir de 5 g de hojas de D8909-15 y 10 g de tejido de la raz con un bromuro (CTAB) basados en el protocolo de extraccin de RNA como se describi anteriormente por (Iandolino et al. 2004), con modificaciones menores. La Poli (A) + RNA fue aislado utilizando el ARNm kit Dynabeads de purificacin (Dynal AS, Oslo, Noruega). La sntesis de la primera cadena de cDNA se realiz utilizando superndice III transcriptasa (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.)

Se realiz segn lo descrito en el manual, Primer captulo. 2 L de alcuota de hojas y races de cDNA, se utiliz para las reacciones de la primera ronda de PCR, y 2 L de los productos de la primera ronda de PCR fueron utilizados como plantillas para la reaccin de PCR anidada. La amplificacin de las dos reacciones de PCR se realiz durante 30 ciclos (1 min a 94 C, 2 min a 55 C, 3 min a 72 C) seguido de 7 min a 72 C. Los productos de PCR fueron separados en 1,2% de geles de agarosa y visualizados con bromuro de etidio.

4.5. ANOTACIN DE BAC Y ANLISIS DE LA SECUENCIA

La edicin y compilacin de datos de secuencias de ADN, as como las comparaciones y

los anlisis de ADN y secuencias deducidas de aminocidos se realizaron con el programa

Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Las secuencias de ADN y las protenas de

genes predichos fueron analizados por NCBI Blast bases de datos y GeneMark.hmm, este

ltimo utilizando la configuracin de Arabidopsis thaliana y Medicago truncatula.

5. RESULTADOS Y ANLISIS

5.1. Desarrollo de marcadores y cartografa de alta resolucin.

Encontraron que el marcador SSR (Microsatlites); son secuencias de nucletidos repetidos en tndem, y dispersas en el genoma. Los partidores son diseados para complementar las secuencias vecinas al microsatlite de manera de amplificar dicha secuencia. Son marcadores co-dominantes y pueden reconocer homocigocidad y heterocigocidad en organismos diploides (Fendri, 2008). VMC5a10, est altamente vinculado con el locus XiR1 en el cromosoma 19. As mismo para identificar otros locus ligados a la regin XiR1, se proyect por PCR con VMC5a10 la librera BAC de D8909-15. Debido a que la uva es un cultivo altamente heterocigoto, y las dos libreras BAC se construyeron a partir de dos tipos diferentes de ADN genmico, se puede esperar que los clones obtengan el genoma resistente R o susceptible S.


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Como resultado, se obtuvieron en total 7 marcadores, desarrollados de los fines de la secuencia de 21 clones de BAC, identificado de 2 libreras BAC (Menos de la librera V.vinifera Cabernet Sauvignon), esos 7 BAC, cubren 500kb con 3 gaps en la regin XiR1 de la regin R del genoma. De los 9 clones BAC de la librera de Cabernet Sauvignon resultaron todos con el genoma S.

(Hwang, et al. 2010.)

5.2. Seleccin de recombinantes informativos y evaluacin de la resistencia de X. index.

XiR1 fue mapeado con intervalos de 5,6 cM entre los 2 marcadores, VMCNg3a10 y M4F3F, en el cromosoma 19, usados para encontrar recombinantes informativos en las tres poblaciones (Xu et al 2008). Los datos genotpicos segregados normalmente con una relacin 1:1 (X2= 1.34, P= 0.10-0.25 para VNG3a10, y X2= 0.16, P= 0.50 0.75 para M4F3F) en las 3 poblaciones combinadas. El porcentaje global de gametos recombinados en las tres poblaciones fue de 7.2%, con un rango de variacin entre 5.6 a 7.9%. Los resultados sugieren que los parentales masculinos tienen efectos significativos en la relacin de los dos tipos recombinantes F1 , dado que las tres poblaciones de D8909-15 tienen el mismo parental femenino. Adems, todas las 99 plantas recombinantes, fue estudiada la resistencia X.index segn el nmero de agallas observadas en el sistema radical, dando como resultado 61 genotipos


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R y 38 S. En adiccin se seleccionaron con marcadores genticos derivados de los clones BAC y permiti que se identificaran los diez principales recombinantes. Estos datos permiten el posicionamiento del locus XiR1 en un intervalo de 0.51Cm entre los dos marcadores que flanquean en el genoma D-8901-R 1N2R3b y M4F3R. 6. DISCUSIN

La habilidad de producir nuevos cultivares de uva con procesos de mejoramiento convencionales es frecuentemente obstaculizada por su alto grado de heterocigocidad, la herencia de caractersticas polignicas deseadas, fue la razn de ser del desarrollo del mapa gentico de alta resolucin de la regin XiR1.

Los datos condujeron adems del aislamiento del locus XiR1, el descubrimiento dentro de el mismo, miembros de genes de NB-LRR (nucletide-binding leucine-rich-repeat), conocidas como protenas que juegan un papel importante en la inmunidad innata de plantas y animales. En plantas, esas protenas de resistencia reconocen patgenos especficos derivados de las protenas efectoras, el reconocimiento posterior desencadena una respuesta de defensa rpida y eficaz, a menudo tambin se les asocia con la respuesta de hipersensibilidad y otros procesos pocos conocidos que suprimen el patgeno (Tameling, 2007).

La frecuencia de recombinacin entre las tres poblaciones tiene un rango de 5.6 a 7.9%, confirmando el lmite de variacin esperado, aunque el nmero y la frecuencia de recombinacin en la regin XiR1 sugiere que existen grandes diferencias entre las tres poblaciones. La posible causa de que el parental masculino tenga mayor impacto en la frecuencia de recombinantes en la regin XiR1 es an desconocida, aunque los datos sugieren que el progenitor F8909-17 de la poblacin 9621 fue genticamente superior para la produccin de recombinantes informativos en la regin XiR1.

En este estudio, XiR1 fue fsicamente localizado dentro de 115kb entre los marcadores 1N2R3b y M4F3R, los cuales estn dentro de un LOD (lmite de deteccin) desde el pico del QTL, confirmando que la posicin de XiR1 fue bastante precisa. La regin XiR1 ofrece una oportunidad nica para examinar los impactos evolutivos en la microestructura de una determinada regin especfica para cada uno de los genomas.

7. CONCLUSIONES


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8. BIBLIOGRAFIA

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