TEMA 19- ESTRATEGIAS DE CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMTICA II. Introduccin regulacin por Cambios Conformacionales.

2. Interaccin protena-ligando. 2.1. Funcin de Scatchard. 2.1.1. Linearizacin de la ecuacin de Scatchard. 2.2. Ecuacin de Hill. 2.2.1. Linearizacin de la ecuacin de Hill. 2.2.2. Razn de saturacin Rs.

3.Modelo Protenas alostricas. 3.1.Modelo concertado de Monod, Wyman y Changeux (MWC) 3.1.1. Enzimas alostricas tipo K 3.1.2. Enzimas alostricas tipo V 3.1.3. Modelo alostrico mixto 3.2. Modelo secuencial (KNF).

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i) Observaciones experimentales que condujeron al desarrollo de la idea sobre los cambios conformacionales y su papel en la regulacin de la actividad enzimtica.

ii) Modelos tericos empleados para la descripcin de este sistema de control.

iii) Significado biolgico/bioqumico de este tipo de control.- Observaciones experimentales- Modelo de Monod-Wyman-Changeux- Modelo de Koshland-Nemethy-FilmerRegulacin por Cambios Conformacionales

I) Observaciones experimentales * Muchas de las ideas sobre el control conformacional de la actividad enzimtica se desarrollaron como consecuencia del trabajo sobre las vas biosintticas de los aminocidos en microorganismos, especialmente en E. coli.* A mediados de la dcada de los aos 50 se descubri que la Treonina-dehidratasa, primera enzima de la va biosinttica de la Ile, en E. coli, se inhiba fuertemente por Ile, producto final de la va, que tiene muy pocas analogas estructurales con el sustrato de la enzima, la Thr.- Slo la primera enzima de la va, la treonina-dehidratasa, muestra este tipo de inhibicin.

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* Un ejemplo, semejante, se encontr en el caso de la enzima Carbamoiltransferasa o Aspartato Transcarbamilasa (ATCasa), enzima que cataliza la primera reaccin de la va biosinttica de las bases pirimidnicas, en E. coli, la cual se inhibe tambin por el producto final de la va, especialmente por CTP.

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CCC+Active relaxed formInactive tense formATCaseRRRRRRCCCCatalytic subunitsCatalytic subunitsRegulatory subunitsAspartateCarbamoylphosphateCarbamoyl aspartateQuaternary structure

* En este caso, tambin se observ que el ATP poda actuar activando a la enzima, la ATCasa; proporcionando as un mecanismo para conseguir el balance entre la produccin de nucletidos purnicos y pirimidnicos, necesarios para la biosntesis de cidos nucleicos.* A principios de los aos 60, ya se haban descrito varios sistemas que presentaban este tipo de regulacin, en los que nicamente la primera enzima de la va era inhibida por retroalimentacin o feed-back.* El primer intento serio de unificar todas estas observaciones fue realizado por Monod, Changeux y Jacob, y constituye uno de los trabajos clsico de la Enzimologa.- Monod, Changeux and Jacob (1963). J. Mol. Biol. 6, 306

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- En este trabajo se resaltan los siguientes puntos o caractersticas comunes a este tipo de sistemas:a) El ligando implicado en la regulacin de la actividad enzimtica (molcula reguladora o efector), generalmente, es estructuralmente diferente del sustrato o el producto de la reaccin que cataliza la enzima retroinhibida.b) La mayor parte de las enzimas cuya actividad se controla/regula por este tipo de regulacin, no muestran cinticas hiperblicas clsicas cuando se representa v [S], sino que muestran una cintica de tipo sigmoidal.

c) Es relativamente fcil distinguir entre la unin del efector a la enzima y la unin del sustrato. Varios tratamientos qumicos y fsicos nos permiten desensitizar la enzima, es decir, hacerle perder su respuesta ante las molculas reguladoras o efectores sin que ello lleve parejo la perdida de la actividad cataltica. As en el caso de la ACTasa un tratamiento trmico, suave, da lugar a una enzima activa no inhibible por CTP. La enzima desensitizada muestra una cintica hiperblica semejante a la que presentan las enzimas michaelianas.d) Generalmente las enzimas que se regulan por este mecanismo son oligmeros, es decir, protenas formadas por varias subunidades iguales o distintas, unidas entre si por fuerzas dbiles.

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* Monod, Changeux y Jacob propusieron que la molcula reguladora o efector se une a un sitio de la enzima diferente del centro activo, de manera que la interaccin entre la molcula reguladora y el sustrato tiene lugar de manera indirecta o alostrica, (del griego otra estructura).* La unin de la molcula reguladora al sitio de regulacin induce un cambio conformacional reversible en la enzima que causa una alteracin de la estructura del centro activo y los consiguientes cambios en sus propiedades cinticas.

Sitio reguladorCentro activo

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2. INTERACCIN PROTENA-LIGANDOUna protena une ms de una molcula de un mismo ligando

P

P

P

P

PLLLLLLLLLLLK1 K2 K3 K4K1 < K2< K3< K4 Cooperatividad positivaK1> K2> K3> K4 Cooperatividad negativaK1 = K2 = K3 = K4 No cooperatividadTratamiento de Scatchard permite calcular el nmero de sitios de unin por molcula de protena, la constante de unin protena-ligando y el tipo de cooperatividad

La funcin de Scatchard, , se define como la razn entre la concentracin de ligando-unido y la concentracin total de protena [Ligandounido} = ------------------------ [Protena]- Esta funcin es diferente de la funcin de saturacin, que representa el nmero de sitios ocupados partido por el nmero total de sitios de unin que tiene la macromolcula. N Sitiosocupados Y = ------------------------ N totalsitios2.1. FUNCION DE SCATCHARD

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N sitios = (concentracin de protena) x (numero de sitios por mol de protena)No total sitios = [P] n = Y nEn esta ec. --> funcin de ScatchardY --> funcin de saturacinn --> n sitios por mol de protena Para deducir la ecuacin de Scatchard consideraremos una protena P, con dos sitios de unin para el mismo ligando, L, que se unen independientemente y con la misma afinidad a ambos sitios.Se deduce la relacin funcin de Scatchard y SaturacinLLP

En el sistema no existe cooperatividad, K1 = K2 = K3 = K4=K [Ligandounido} = ------------------------ [Protena]

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La funcin de Scatchard para dos lugares equivalentes viene definida por: K[L] = n ----------------- 1 + K[L] Deduccin Enzimologa. Pgina 224 Nuez de Castro 2001 K[L] = 2 ----------------- 1 + K[L] Para un nmero n de lugares equivalentes de uninn nmero de ligandos que pueden unirse por molcula de protenaK es la constante de equilibrio de unin del ligando a cada centro (es la misma para todos los lugares de unin n que tenga la protena[L] es la concentracin de ligando libre

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2.1.1. Linearizacin de la ecuacin de SCATCHARD K[L] = n ----------------- 1 + K[L] Dividendo por [L] y despejando

Representacin de Scatchard para una protena que tiene 4 lugares de unin equivalentesK es la constante de equilibrio de cada uno de los sitios de uninPERMITE CALCULAR NMERO DE LIGANDOS QUE SE UNEN POR MOLCULA DE PROTENA

[L] mM-1 1 2 3 4 5 6nLinearizacin de la ecuacin de SCATCHARDCooperatividad positiva

Cooperatividad negativa

Cuando las grficas se desvan de la linealidad Protenas presentan cooperatividadClculo: EQUILIBRIO DE DILISIS, CENTRIFUGACIN

2.2. TRATAMIENTO DE HILLEnzimas presentaban cinticas de saturacin respecto al substrato se desviaba del comportamiento hiperblico michaelianoCintica sigmoidal Curva de saturacin de la hemoglobina K [Po2]nhY = ------------------ 1 + K [Po2]nhY es saturacinPo2 presin parcial de oxigenoK constante de formacin del complejo oxihemoglobina [Po2]nhY = ------------------ K` + [Po2]nhK` = [Po2]nh0.5 [Po2]0.5 Presin da una saturacin de 0,5nh ndice de Hill valor experimental (hemoglobina 2,8)Semejanza

Tratamiento de Hill SnhY = ------------- Snh0,5 + SnhAplicada a las enzimas con cintica sigmoidal

vY = ------------ VmaxSaturacin de la enzima [Po2]nhY = --------------- K` + [Po2]nhS0,5 Concentracin substrato la saturacin es igual Vmaxnh igual a 1 es una saturacin hiperblica michaelianaS0,5 = Km SY = ----------- = S0,5 + S v------------ Vmax S = ----------- Km + Snh>1 Cooperatividad positivanh

nh>1nh

2.2.1-Linearizacin de la ecuacin de HillReaccin enzimtica la fraccin de saturacin

Representando la ecuacin lineal

La ecuacin de una recta pendiente es el ndice de HillS0,5 Concentracin substrato para la cual la saturacin es igual a de la velocidad mximaObtencin valor experimental del ndice de HillDeducir la existencia de cooperatividadValor de S0,5

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2.2.2. Razn de saturacin Rs. Significado biolgico de la cooperatividad positiva y negativa.Rs, la razn de las concentraciones de substrato que dan como resultado el 10% y 90% de saturacin S 0,9Rs = ----------- S 0,1 Snh 0,1Y = 0,1= ------------------ Snh 0,5 + Snh 0,10,1 Snh 0,5 = 0,9 Snh 0,1 Snh 0,9Y = 0,9= ------------------ Snh 0,5 + Snh 0,90,9 Snh 0,5 = 0,1 Snh 0,9

0,1 Snh 0,90,9 Snh 0,1 9 = S 0,9Rs = ---------- = S 0,1Enzima michaelianas es constante e independiente de Km y Vmax

nh = 1,0 valor de Rs es igual a 81 No cooperatividadnh = 2,0 el valor de Rs es igual a 9,0 Cooperatividad positivanh = 0,5 el valor de Rs es igual a 6531 Cooperatividad negativaEnzimas con cooperatividad positiva, un cambio en la concentracin de sustrato de 9 veces hace que la enzima pase de una saturacin del 10% al 90% Interruptores metablicosEnzimas con cintica hiperblica, ndice de Hill 1 se necesita aumentar 81 vecesEnzimas con cooperatividad negativa, para que la enzima pase de una saturacin del 10% al 90% se necesita aumentar 6561 veces. Amortiguadores de las variaciones de la [S].Ej fosfatasa alcalina de E.coli suministra fosfato inorgnico.

3.MODELOS PROTENAS ALOSTRICAS.Efecto alostrico: Cambios conformacionales en una enzima dan lugar a aumento o inhibicin de la actividadProtena alostricas actividad esta regulada por la unin no covalente y reversible de moduladores: Se unen a sitios distintos al sustratoHill no era posible determinar con exactitud las constantes de disociacin y las constantes alostricasTransicin alostrica hace referencia a transduccin de una seal a un lugar diferente ocupado por esa seal en la protena.Transicin alostrica homotrpica cuando induce cambios en la unin del mismo tipo de ligandoTransicin alostrica heterotrpica cuando induce cambios en la unin del otro tipo de ligando

3.1. Modelo concertado de Monod, Wyman y Changeaux2. Las subunidades (protomeros) ocupan posiciones equivalentes, de manera que dentro del oligmero, existe al menos un eje de simetria. 3. Cada protomero posee un sitio de unin (solo uno) para cada uno de los diferentes ligandos: Activadores o inhibidores3. El oligmero puede existir en dos estados conformacionales, que designaremos por R (relajada, alta afinidad) y T (tensa, baja afinidad) y que presentan afinidad diferente por un ligando dado.1. Las protenas alostricas son protenas oligomricas R

TTensa, baja afinidadRelajada, alta afinidad

4. La conformacin de la protena cambia de de la forma R a la forma T (o viceversa) se conserva la simetra del oligmero.* Si representamos la conformacin de las subunidades en forma T y R por un circulo y un cuadrado respectivamente, existe el siguiente equilibrio:Los cambios R T son concertados, no hay formas hbridas, compuestas por subunidades (R-T)

5. No existirn especies hbridas (TR) ya que en tal caso se perdera la simetra del oligmero.*En otras palabras, todas las subunidades cambian de conformacin de una manera concertada, lo que le ha dado tambin nombre al modelo: Modelo concertado.6. Las formas R y T pueden poseer diferente capacidad cataltica (siendo kcR y kcT las constantes catalticas de las formas R y T, respectivamente) o diferentes afinidades por los ligandos sustratos, activadores o inhibidores.KR y KT constantes de disociacin intrnsecas de cada uno de los protmeros de las formas R y T y el Substrato. * En la siguiente figura, se representa el modelo concertado ms sencillo de una protena dimrica que tiene un activador A, y un inhibidor I:

R

TSSIILAAL cte de equilibrio entre las dos formas R y T.

S

SS

KTKT

[T] L = ------------ [R]Saturacin por ligando0.0

0.5

1.0 S

S S

KRKR

SSIIAAClculo de YEnzimologa. Nuez de CastroPg 237kcRkcTPP

Y La funcin de saturacin, la hemos definido anteriormente como la razn entre el nmero de sitios ocupados partido por el nmero total de sitios. Y= v/VmaxParmetros describen el estado de un sistema alostrico L c (1+ c )n-1 + (1 + )n-1Y = L (1+ c )n + (1 + )n-1

L cte de equilibrio entre las dos formas R y T en ausencia de ligando. [T] L = ------------ [R]n nmero de sitios de uninc constante ratio de las dos constantes de disociacin KR c = ------------ KT Concentracin de ligando libre [S] = ------------ KR

3.1.1.Enzimas alostricas modelo tipo KMisma constante cataltica kcR = kcTR mayor afinidad por el sustrato KR

L= 0L= 10L = 100L =1000L = 0 No hay equilibrio de transconformacin (Todo esta como R)la ecuacin queda reducida a Ec. M-MY La presencia del ligando afecta la afinidad del enzima por el sustratoModifica la Km Cambia la concentracin de substrato para la cual la saturacin es semimximaInhibidor desplaza el equilibrio hacia la forma T (KR

Enzimas alostricas modelo tipo V3.1.2. Enzimas alostricas modelo tipo VDiferente constante cataltica kcR = kcTIgual afinidad por el sustrato KR = KT L c (1+ c )n-1 + (1 + )n-1Y = L (1+ c )n + (1 + )n KR c = ------------ KTC 1

Y = 1 + Saturacin hiperblicaAccin de los moduladores (activadores e inhibidores) sobre la Vmax

Vmax = kcR R + kcT TFosforilasa b activada por AMP Aspartato quinasa (EC 2.7.2.4) de E.coli inhibe por lisina

voS

AIKmVmaxVmax IVmaxASuma de la contribucin a la velocidad de la forma transconformada R y de la forma transconformada T

Resumen modelo MWC- SencilloModelo da cuenta del comportamiento de protenas que muestran cintica sigmoide y que son oligomericas. Se adecua a la accin de activadores e inhibidores alostricos

LimitacinNo explica el compartamiento cintico de aquellas protenas que tienen cooperatividad negativa.3.1.3.Enzimas alostricas modelo tipo K mixtoTanto la constante cataltica como la afinidad (Km) cambianNOTA: Cintica sigmoide no es sinnimo de alosterismo. Hay protenas con cintica sigmoide no alestericas y enzimas alostericas con cintica hiperblica (enzimas alostricas tipo V puro)

3.2.Modelo secuencial de Koshland, Nemethy y FilmerLigando unido a uno de los protomeros induce un cambio conformacional Entrada de un segundo ligandoCooperatividad positivaCooperatividad negativa+-Permite la presencia de formas hbridas, (prohibido en el modelo concertado)

2. Explica tanto la cooperatividad positiva como negativa3. Modelo concertado , sera un caso particular del modelo secuencial, en el que se explica nicamente la cooperatividad positiva.Ajuste inducido de Kosland

TRATAMIENTO DE SCATCHARDEl tratamiento de Scatchard permite el estudio de la unin de una protena con varios ligandos.La representacin linealizada de la ecuacin permite obtener el nmero de ligando que se unen por mol de protena, as como la afinidad de los lugares de unin.El signo de la cooperatividad se puede obtener de la representacin linealizadaECUACIN DE HILLDerivada del estudio de la saturacin de la hemoglobina es til para explicar la saturacin no hiperblica que se da en enzimas que se desvan del comportamiento Michaeliano, monstrando curvas sigmoidales, con cooperatividad positiva, o hiprbolas no equilteras (curvas de cooperatividad negativa).El ndice de Hill (nh) es un parmetro experimental y no tiene que ser un nmero entero.RESUMENRAZON DE SATURACIN La razn de saturacin (Rs) entre concentraciones de substrato para dar una saturacin del 90% a una concentracin de substrato para la obtencin de una saturacin del 10% es 81, en el caso de las protenas con cinticas michaelianas; es mucho menor para protenas con cooperatividad positiva, y muchsimo mayor para protenas con cooperatividad negativa.Enzimas con cooperatividad positiva puede comportarse como un interruptor metablico; por otra parte, una protena con cooperatividad negativa puede servir para mantener el mismo flujo a pesar de las posibles variaciones en la concentracin de substratos.

MODELO ALOSTRICO CONCERTADO

Modelo propuesto por Monod, Wyman y Changuex. Explica de forma clara y elegante la mayor tipo de procesos alostricos de regulacin.Esquema mecnico simple, protenas oligomricas, con ejes de simetria

Clasifica en tres tipos de enzimas alostricas.Tipo K, son protenas oligomricas que presentan cooperatividad positiva, asi como la accin de inhibidores y activadores.Tipo V explica igualmente la accin de activadores e inhibidores sobre la velocidad mxima sin cambiar la constante de afinidad por el substrato.Tipo mixto, una mezcla de ambos modelos.

MODELO ALOSTRICO CONCERTADO

Modelo ms potente , tiene mayor complejidad , no es muy utilizado en Enzimologa .

Prctica el instrumento ms utilizado es el ndice de Hill

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