Cell-Cycle Inhibition by Helicobacter pylori

L-Asparaginase

Claudia Scotti, et al

DANIEL VANEGAS ISAZATATIANA ZAPATA CORREA

INTRODUCTION

HELICOBACTER

• Gram-negative bacteria.

• Helix shape.

• Microaerobic conditions at 37°C.

• Doesn´t need hydrogen.

INTRODUCTION

HELICOBACTER PYLORI

• Lives on the gastric epithelium.

• Damage the mucus layer gastric acid.

• Ulceration and possibly gastric cancer.

• L- asparaginase.

INTRODUCTION

L-ASPARAGINASE

• Destroys asparagine outside the cells.

• Only intacellular reserve.

• Proliferation increases the asparagine demand.

INTRODUCTION

L-ASPARAGINASE – CELL CYCLE

• Relation l-asparaginase/ asparagine synthetase.

• Inhibition of cell cycle.

• Fibroblastic and gastric cell.

GENERAL OBJETIVE

Demonstrate that H. pylori L-asparaginase plays an important role in cell-cycle inhibition induced by BCF on cultured cells, and show that this inhibition is more pronounced in cells with low expression levels of the enzyme asparagine synthetase

MATERIALES Y METODOS

ETICA

Tomar muestra de sangre en el centro de Analisi Monza.

Estudios avalados por Comunidad Europea

86/609/EEC

Ministerio de salud y la protección animal.

MATERIALES Y METODOS

CULTIVO

Fuentes de carbono y sales,

Agar.

Peptones, fluidos corporales , sistemas

amortiguadores.

Cepas de H. pylori CCUG

17874, 60.190, G21, G27

y suero fetal bovino

Indicadores PH, agentes

reductores.

MATERIALES Y MÉTODOS

PREPARACIÓN MUTANTE

1. Sembrar y cultivar bacterias de una cepa salvaje virulenta sobre un medio que contiene una cantidad de antibiótico.

2. Cultivar por resiembra de las colonias de bacterias resistentes establecidas en 1.

PREPARACION MUTANTE

3. La siembra y el cultivo de las bacterias dependientes derivadas de 2. sobre un medio libre de antibiótico hasta la aparición de colonias inversas así escogidas.

MATERIALES Y METODOS

MATERIALES Y METODOS

LINEAS CELULARES

• Un cultivo primario común.

• Proliferación celular in vitro.

• Formación de una monocapa.

• Origen a mas cultivos.

MATERIALES Y METODOS

BRDU

BrdU es incorporado en el ADN en la fase S.

Se detecta utilizando un anticuerpo monoclonal anti-BrdU.

Una ELISAUn Fluorocromo

Citometríade Flujo

MATERIALES Y METODOS

CROMATOGRAFIA

• Separación de mezclas complejas de proteínas.

• Identificar cantidades y componentes.

• Tiene dos fases: Móvil Estacionaria

MATERIALES Y METODOS

CROMATOGRAFIA LIQUIDADE ESPECTOMETRIA DEMASA

• Separación de proteínas.

• Alta selectividad y sensibilidad.

• Amplios de rangos.

MATERIALES Y METODOS

ENSAYO ENZIMATICO

• Sustrato enzima producto.

• Mide la cantidad de producto por unidad de tiempo.

• Actividad catalítica.

MATERIALES Y METODOS

ANTICUERPOS MONOCLONALES

• Producción de anticuerpos homogéneos.

• Un solo tipo de célula.

• Afinidad especifica por un antígeno.

MATERIALES Y METODOS

WESTERN BLOT

• Variación del southern blot.

• Proteínas separadas por electroforesis en gel según tamaño.

• Transfieren a un filtro incuban con anticuerpos detectan la unión Ag-Ac.

MATERIALES Y METODOS

LISIS CELULAR

• Destrucción de la membrana celular.

• Liberar proteínas y otros componentes intracelular.

• Lisis usando: Glucosa Detergentes Sln orgánicas

MATERIALES Y METODOS

• ELISA

• EIA heterogéneo.

• Fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano.

• Tres tipos: sándwich

competitivo

indirecto

RESULTADOS

FIGURA 1B

RESULTADOS

FIGURA 4 A

RESULTADOS

FIGURA 5 A

1. Pre-lytic fraction2. Periplasmic fraction3 y 4. Soluble and insoluble spheroplast fractions

DISCUSSION

AUTHOR WHAT HE SAID YES OR NOT

Sommi P, et al.

Following exposure to H. pylori BCF, HDF, MKN7 and MKN28 cells showed a significant increase in the number of cells in G1 phase, and, concomitantly, a decrease in those in the S phase.

Yes

Ding Y, et al.

In fact, the cell-cycle block of cell clones, especially leukemic, exposed to this enzyme class hasbeen previously described to depend on the expression level ofasparagine synthetase

Yes

DISCUSSION

AUTHOR WHAT HE SAID YES OR NOT

Fiocca R, et al.

The observation that the protein has a predicted signal peptide, suggests that protein transit into the external environment might occur through secretion or through release of outer membrane vesicles

Yes

Keating MJ, et al.The activity of the recombinant enzyme steadily increases along the pH gradient observed throughout the gastric mucus layer

Yes

CONCLUSIONS

• Helicobacter pylori affects 50% of world people, for this reason its important to know about it and identify some diagnostic method that helps in a early detection.

• This study is important because, it provides information on the behavior of H. pylori and that information can be used to studies to identify possible treatments.

CONCLUSIONS

• L-asparaginase is the responsible factor for cell-cycle inhibition of gastric cell lines for this reason it could be used on the diagnostic of H. pylori-related diseases.

• The L-asparaginase’s role as a potential pathogenic factor could be thoroughly analysed by studying its internalisation in cells of infected patients.

Thank you!