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InmunofluorescenciaTécnica que se utiliza para la detección de estructuras
subcelulares que nos permiten estudiarlas con la utilización de anticuerpos acoplados a fluoróforos.
¿Conocen alguna otra técnica para marcar de manera fluorescente una proteína?
Lic. Micaela Daiana Garcia
Función de una proteína
Migración celular
Endocitosis y señalización
Interacciones
Escalas temporales
Localización subcelular
¿Por qué estudiar la localización subcelular de una proteína?
Sin estímulo
Con estímulo
La expresión de proteínas de una célula es dinámica. Esto depende de los estímulosque reciban, los requerimientos energéticos y como ésta interprete los mismosmanifestará cambios en la expresión y distribución de las proteínas de su repertoriogenético.
Ejemplo:
La inmunofluorescencia es un conjunto de técnicas en donde se empleananticuerpos para detectar y localizar, antígenos específicos en células y/otejidos.
No confundir inmunodetección con Transfección ! Proceso por el cual un gen de interés es introducido dentro de la célula eucariota por métodos químicos
ó físicos.
Fibroblastos de ratón. Inmunodeteccióncon anti beta tubulina (citoesqueleto), y con anti paxilina (adhesiones focales). El
núcleo se tiñó con DAPI un intercalante del ADN.
Tubulina Núcleo PaxilinaInmunodetección
Células BHK‐21 fueron transfectadas con el plásmido DsRed‐Mitocondria. Luego la detección de actina se hizo con faloidina
acoplada a Alexa Fluor 488 (citoesqueleto).
Mitocondrias Núcleo ActinaTransfección
Fijación
Permeabilización
Bloqueo
Inmunodetección:‐ Inmunofluorescencia directa‐ Inmunofluorescencia indirecta
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Pasos claves de una inmunofluorescencia
1Fijación: Preservar la localización, composición y estructura del material biológico aanalizar manteniendo lo más fielmente posible a la situación que existe invivo.Existen distintos métodos de fijación de material biológico. Esto dependerá dedistintos factores como: el tipo de microscopia a utilizar, la estructurasubcelular que se quiera detectar, entre otras.
Glutaraldehído Paraformaldehído Metanol/Acetona
Modo de acción
Por puentes entre grupos aminos de las proteínas
Por puentes entre grupos aminos de las proteínas
Por precipitación de proteínas y carbohidratos
Uso más frecuente
Microscopía electrónica yalgunos estudios de fluorescencia
Estudios de fluorescencia e inmunocitoquímicos
Gran variedad de estudios
Ventajas / Desvantajas
‐ Provee la mayor preservación de estructura fina.‐ Es el más severo de los fijadores.‐ Altera los epitopes.Provoca fluorescencia inespecífica.
‐ Produce menos autofluorescencia que el glutaraldehído.‐ Genera menor cantidad de puentes que el glutaraldehído.‐ Penetra más rápidamente dentro de la célula.
‐ La fijación es más rápida que con los aldehídos.‐ Puede alterar el patrón de localización de los antígenos.‐ Fija y permeabiliza al mismo tiempo.‐ Puede generar contracción en la muestra.
2 Permeabilización:Existen distintos métodos de permeabilización que son mas “suaves” o mas “fuertes”. Esto dependerá de la naturaleza del compuesto permeabilizante a utilizar. Produce poros en las membranas celulares. Lo que permite el ingreso de los anticuerpos a la célula si queremos detectar estructuras internas de la célula.
Célula fijada Permeabilización
Inmunodetección
Célula positiva
Célula negativa
Anticuerpo específico
Isotipo
Se utilizan generalmente detergentes no iónicos que solubilizan los lípidos de la membrana produciendo de manera irreversible o reversible poros en la membrana (por ejemplo Tritón X‐
100, NP40).
3 Bloqueo
• Su función es impedir interacciones inespecíficas de los anticuerpos con elmaterial biológico a analizar y así reducir la marcación inespecífica.
• En general se utilizan soluciones protéicas concentradas (GeneralmenteAlbúmina bovina sérica o gelatina de pescado).
• El anticuerpo primario debe competir con la proteína bloqueante para unirsea su epitope y así detectar la estructura de interés.
• Se reduce la unión inespecífica del anticuerpo por epitopes no específicos.
4 Inmunodetección:
• Los anticuerpos son proteínas que tienen la capacidad reconocerespecíficamente y unirse con alta afinidad a otras moléculas(antígenos).
• La molécula que es reconocida por los anticuerpos se denominaantígeno. Cada antígeno tiene al menos un epitope o regiónreconocida por un anticuerpo.
Anticuerpos
Se trata de moléculas sintetizadas por linfocitos B y capaces de reconocer y
unirse con alta afinidad a otras moléculas
Lic. Eliana Fernandez
¿Cómo están compuestos?Las inmunoglobulinas se encuentran formadas por 4 cadenas polipeptídicas: 2 cadenas pesadas (H, en verde) (55 000 dalton) y 2 cadenas livianas (L, en amarillo) (25 000 dalton)
Cada cadena posee regiones variables que permiten el reconocimiento específico de antígenos y otra región Constante.
El antígeno es reconocido por la región variable del anticuerpo.La parte del antígeno reconocida se denomina epitope.
Paratope
Epitope
Epítopes antigénicos
Cada antígeno suele presentar varios determinantes antigénicos o epitopes.
Anticuerpos policlonales
Anticuerpos producidos por diferentes clones de linfocitos
Mezcla heterogénea de anticuerpos que reconocen distintos epitopes de un mismo antígeno
Anticuerpos monoclonales
Anticuerpos producidos por un único clon de linfocitos
Población de anticuerpos homogéneos que reconocen el mismo epitope de un antígeno
¿Cómo se obtienen los anticuerpos policlonales?
¿Cómo se obtienen los anticuerpos monoclonales?
Se obtienen inmortalizando linfocitos B, por fusión con células de mieloma de ratón.
Las células fusionadas (hibridomas) producirán
inmunoglobulinas idénticas a las que producía el linfocito B normal parental y son inmortales como el
mieloma que le dio origen.
César MilsteinPremio Nobel de Química 1984
¿Cómo debe ser el anticuerpo secundario?
¿Cómo se obtienen los anticuerpos secundarios?
IgG purificadas de conejo
IgG anti‐IgG de conejo hecha en ratón
Gracias!