Upload
others
View
4
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Investice do rozvoje vzdělávání
Inovace studia molekulární a buněčné biologie
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Investice do rozvoje vzdělávání
Genomika (KBB/GENOM)Genomika (KBB/GENOM)
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Investice do rozvoje vzdělávání
Fyzické mapováníFyzické mapování
F i ké k ti éFyzické kontigové mapy
Ing. Hana Šimková, CSc.
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Investice do rozvoje vzdělávání
Cíl přednášky
- seznámení s konstrukcí fyzických kontigových map a jejich ukotvováním
Klíčová slova
- fyzické mapování, fingerprinting, kontig, ukotvování fyzických map, integrace genetických a fyzických mapg g ý y ý p
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
KONSTRUKCE FYZICKÝCH KONTIGOVÝCH MAPKONSTRUKCE FYZICKÝCH KONTIGOVÝCH MAP
Kontig řetě ec po sobě jdo cích fragmentů DNA t ářejících spojitoKontig – řetězec po sobě jdoucích fragmentů DNA vytvářejících spojitou sekvenciKontigová fyzická mapa se skládá z překrývajících se klonů z knihoven dlouhých inzertů
Konstrukce fyzické kontigové mapy:
sestavování kontigů
ověřování správnosti kontigů pomocí genetických a cytogenetických markerů
integrace genetických a fyzických map
1) Sestavování kontigů1) Sestavování kontigů
- z překrývajících se klonů z knihoven dlouhých inzertů.
Překryvy je možno zjišťovat na základě
- analýzy restrikčních spekter (fingerprintů)ý y ( g )
- vyhledávání společně se vyskytujících markerů
(STS, genetické markery)(STS, genetické markery)
Uspořádání klonů na základě srovnání restrikčních spekter(fingerprinting)(fingerprinting)
Fingerprint = unikátní spektrum restrikčních fragmentů získaných na základě štěpení 1 nebo více restriktázami a frakcionace takto vzniklých fragmentů Klony odvozené znebo více restriktázami a frakcionace takto vzniklých fragmentů. Klony odvozené z jednoho místa genomu sdílejí určitou část restrikčního spektra.
Různé varianty fingerprintingu:a) štěpení 1 restrikční endonukleázou (RE) s 6-bp
restrikčním místem (cca 20-45 proužků na klon)restrikčním místem (cca 20 45 proužků na klon)- elektroforéza na agaróze, barvení ethidium bromidem - vizualizace téměř všech fragmentůg jednoznačnější stanovení přesahů – spolehlivější, je možné zjistit velikost BAC klonu, nejlevnější omezená automatizace, nižší informační hodnota
Alternativní způsob vytváření fingerprintů- optickým mapováním.
Gibson a Muse, 2004
b) štěpení více RE + koncové značení- radioaktivně- fluorescenčně
A lý l k l id é lAnalýza na polyakrylamidovém gelu- vertikální elektroforéza- sekvenátor
Kombinace 2 enzymůKombinace 2 enzymů, radioaktivní značení
Automatizovaný postup fyzického mapování BAC klonů
i l DNA BAC kl ů- izolace DNA z BAC klonů- štěpení 1 až 4 vzácněji štěpícími RE (s 6-bp místem) zanechávajícími kohezní konce- štěpení 1 často štěpící RE (s 4-bp místem) zanechávající tupé konce
T C T A G A
A G A T C T5’ 3’3’ 5’
G G C C
G G C CC C G G
C C G G XbaI+HaeIII
- koncové značení fluorescenčně značenými ddNTP (1 až 4 různé barvičky) – jen u kohezních konců
A G A T C T3 5G G C CC C G G HaeIII
kohezních konců5‘
3‘
3‘
5‘
TCAGATC
CTAGA
CT*
*
Fragmenty 35-600 bp – získáme celkově až stovky fragmentů, viditelných (tj. nesoucích fluorescenční barvičku aspoň na 1 konci) do 50 pro 1 enzym.p ) p yOptimum – 50-250 proužků pro všechny enzymy dohromady.
- frakcionace – sekvenátor – použití vnitřního standardu v každé kapiláře- vyhodnocení – program FPC (FingerPrintedContigs)
- porovná fingerprinty- poskládá klony do kontigů- navrhne nejkratší cestu pro sekvenování (minimum tiling path - MTP)
Štěpení restrikčními endonukleázamia barevné značenía barevné značení
T C T A G A5’ 3’ XbaIA G A T C T3’ 5’
XbaI
BamHIG G A T C C
C C T A G G
5’ 3’
3’ 5’
G A A T T C 5’ 3’EcoRIC T T A A G3’ 5’
XhoIC T C G A G
G A G C T C
5’ 3’
3’ 5’Luo et al. (2003)
G A G C T C3 5
Využití kitu SNaPshot pro barevné značení
EcoRIBamHI EcoRI HaeIII HaeIII
Výstup ze sekvenátoru
(adapted from Luo et al., Genomics, 2003)
Čtyřbarevné značení – oddělení barevLuo et al. 2003
BamHIBamHI
EcoRI
XbaI
XhoI
Velikostní standard (Liz)
HICF (high information content fingerprinting)fingerprinting s vysokým informačním obsahem
Izolace DNAz BAC klonů
fingerprinting s vysokým informačním obsahem
z BAC klonů
Institut National de la Recherche Agronomique
Štěpení 5 restrikčními endonukleázami
Sestavování kontigů (Genoprofiler, FPC)
K ilá í l kt f é
( p , )Fluorescenční značení
(SNaPshot kit)Kapilární elektroforéza
(ABI3730)(Luo et al, 2003, Genomics)
Konstrukce fyzické mapy
Výběr metody pro daný genom tak, aby byl dosažen
a) optimální počet analyzovaných proužkůa) optimální počet analyzovaných proužků- méně proužků – nižší informační hodnota, větší relativní chyba- příliš mnoho proužků – více falešněpříliš mnoho proužků více falešně pozitivních překryvů
b) dostatečná vzdálenost mezi proužky
Sulston cutoff score (Sulstonova prahové hodnota) vyjadřuje pravděpodobnost, že proužky společné pro 2 fingerprintované p y p p g pklony jsou výsledkem náhody. Pokud je hodnota nižší než tento uživatelem nastavený práh, klony jsou prohlášeny za překrývající se. Udává se jako e-n.
Větší genomy vyžadují mnohem nižší M t l 2004hodnotu Sulstonova skóre (vyšší n). Meyers et al. 2004
Závislost mezi Sulston cutoff scorea rozsahem překryvu BAC klonůa rozsahem překryvu BAC klonů
křivka pro BAC klon o velikosti cca 125 kb
1e- 45
1e-75
70 80%50 60% 70-80%
% překryvu klonů
50- 60%
% překryvu klonů
Sestavení fyzické mapy chromozómu 3B pšenices použitím programu FPCp p g
[e-65]
[e-70]
[e-60]
[e-55][e-75]
gů
[e-45]
[e-50]
Poče
t kon
tig
Následné automatické
P
[e-25]
Manuálníupravování sestavy
(merging, splitting, killing…)
Počáteční sestavení (automaticky s vysokou
přísností)
sestavení s klesající přísností
(merging, DQing…)
E. Paux (2008)
Vyhledávání překryvů na základě společných markerů
Obvykle slouží k doplnění fingerprintingu, propojení dosud nespojených kontigů. Lze použít i samostatně, ale velmi pracné, vyžaduje vysokou hustotu markerů.
STS markery (sequence-tagged site – místo se sekvenční adresou) – krátká sekvence, kterou lze amplifikovat pomocí PCR a kterou lze lokalizovat na jediném místě v genomua) odvozeny z náhodných sekvencí (nemusí být polymorfní)b) d ti ký h k ů ( ř ISBP ik t litů RFLP)b) odvozeny z genetických markerů (např. ISBP, mikrosatelitů, RFLP)c) odvozeny z ESTů (expressed sequence tag – místo s expresní adresou)
2) Ověřování správnosti kontigů
- integrací genetických a fyzických map – markery ve vazbě by měly k l k li t dl hý h k ti í hkolokalizovat na dlouhých kontizích
- sekvence z obou konců dlouhých kontigů použít k odvození genetických markerů – ty by měly kosegregovat
Tyto koncové sekvence (BAC end sequences = BES) také mohou posloužit ke spojení dvou kontigů:
odvození sondy z konce kontigu- odvození sondy z konce kontigu- skríning knihovny- vytipování BACu – získání jeho koncové sekvence – může být na dalším
kontigukontigu
Ukotvování kontigů pomocí FISH
- pro kontigy, které nelze ukotvit- pro kontrolu orientace kontigů Dvoubarevná FISH - pro zjištění velikosti mezer mezi kontigy
VIRTUÁLNÍ SPOJENÍ DVOU KONTIGŮ
172A10 + 173K08 140C18 + 173K08
Na základě dvoubarevné FISH jsou oba kontigy v těsné blízkosti nebo se překrývajíkontigy v těsné blízkosti nebo se překrývají
Ř
FISH
PŘEKRYV ?
172A10 140C18 173K08172A10(5 kb)
140C18(8 kb)
173K08(3 kb)
Podle FISH jsou oba kontigy lokalizovány na distálním konci 3B
Zjištění vzájemné pozice dvou BAC klonů pomocí FISH t ž ý h h ó hna natažených chromozómech
mitotickéchromozómy natažené chromozómy
mezera cca 30 kb
3) Integrace genetických a fyzických map
Xb d907Xcfa2191
Xcfa2226 Xcfd143 Xgwm493
Genetická mapaXgwm493 Xbarc87 Xbarc147
Xcfa2191 Xcfa2226 X fd143
Deleční mapa Fyzická mapa
Xbcd907
Xcdo460
Xtam61
Xgwm493 Xbarc147 Xbarc133 Xbarc75 Xbarc102 Xgwm389 Xgwm533-1
Xgwm533-2XksuH7
Xgwm389 Xgwm533 Xbarc68 Xbarc156
Xbarc147 Xbarc102 Xbarc75
Xcfd143 Xbarc133
Xwmc43Xk H7
3BS-8
3BS-9 Xbarc73
Xabg471
Xbcd1418
Xgwm566Xgwm72 Xcfd4 Xgwm285 Xgwm77
Xgwm533 2 Xwmc43 Xgwm264
Xcnl3 Xgwm131
XksuH7Xpsr689
Xcfd79 Xgwm566 Xgwm72 Xgwm285 Xgwm77
Xcfd4
XksuH7 Xpsr689
3BS-1
Xbarc73 Xgwm264 Xgwm144
Xfbb378
Xbcd131
gXgpw1146 Xgwm376 Xgwm284
gXgwm108 Xgwm112 Xbarc164 Xgpw1146
Xgwm376 Xgwm131 Xgwm108 Xbarc77 Xbarc1077
Xgwm77 Xbarc139
Xgwm284 Xbarc164 Xcnl3
C
3BL-2
Xfba360
Xbg131
Xcfa2170
Xgwm114
Xgwm299 Xbarc77 Xbarc84
Xbarc1077 Xgwm112 Xgwm114
Xpsp3081
3BL-2
3BL-10
Xbarc203 Xbarc1044
Xbg131
Xtam63
Xmwg11
gXpsp2151 Xgwm547
Xgwm247Xgwm181 Xgwm340 Xcfa2170
Xgwm547
Xgwm299 Xpsp2151 Xgwm247
Xpsr170 XksuG62
3BL-7Xbarc164
??g
Xgwm181 Xbarc84
Xgwm247 Xgwm340 Xfwm4
XksuG62
A) Přímé ukotvování (forward contig anchoring)
Přímé ukotvování:- z genetických map do kontigů pomocí geneticky
zamapovaných markerů(SSR EST RFLP DA T SNP )(SSR, EST, RFLP, DArT, SNP…)
Provádí se skríning knihovny g ygenetickými markery - je možné i s větším počtem sond –poolovací strategie (strategie směsných vzorků):
a) PCR skríning – pooly z knihovny – miskové+řádkové+sloupcové (=3D), ale i 5D, 6D pooly.
b) k í i h b idi íb) skríning hybridizací – na membránách o vysoké hustotě
E. Paux (Science, 2008)
a) Vytváření třídimenzionálních směsných vzorků (poolů)
48 PCR reakcí umožní proskrínovat 8 misek po 384 jamkách tedy najít 1misek po 384 jamkách, tedy najít 1 pozitivní klon mezi 3072.
CNRGV Toulouse
b) Hybridizace na membránách o vysoké hustotěNanášecí schéma 5x5,
každý klon 2x Nylonová membránas nanesenými klonyý y
CNRGV Toulouse
Detail
Po hybridizaci s radioaktivně značnou sondou
Skríning hybridizací – na membránách o vysoké hustotě- sonda z 1 markeru (např. EST)- směsné sondy z několika typů markerůsměsné sondy z několika typů markerů - sondy z překrývajících se oligonukleotidů (overgos)
odvozeny z kusu známé unikátní sekvence – 2 částečně se překrývající oligonukleotidyp ý j g y
8 bp
22-24 bp konce doplněny radioaktivně značenými oligonukleotidy
8 bp22-24 bp
ká ifi it h b idi ( d j d k i ý h vysoká specificita hybridizace (odvozeno z jednokopiových sekvencí), silné signály, lze snadno odmýt – hybridizační membránu je možno použít víckrát poměrně vysoké náklady na syntézu overgos poměrně vysoké náklady na syntézu overgos
B) Reverzní ukotvování (reverse contig anchoring)
Reverzní ukotvování (chromosome landing):- ukotvování kontigů BAC klonů na genetickou mapu (přes genetický marker obsažený v kontigu) – využívá markerů odvozených ze sekvencí BAC kl ů b k ů BAC kl ů (BES) SSR ISBP SNP kt éBAC klonů nebo konců BAC klonů (BES) – SSR, ISBP, SNP, …, které se geneticky zamapují za použití mapovací populace
E. Paux (Science, 2008)