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GGGEEENNNMMMIIICCCAAA (Una gua de lectura introductoria al
tema)
La genmica es el campo de la gentica que intenta comprender el
contenido, la
organizacin, la funcin y la evolucin de la informacin gentica
contenidos en el genoma
completo. Su principal objetivo de estudio es la caracterizacin
molecular de los genomas
completos.
La genmica integra las disciplinas tradicionales: citologa,
gentica mendeliana,
cuantitativa, molecular, de poblaciones y nuevas disciplinas
como la bioinformtica.
Para identificar y cartografiar de manera sistemtica todos los
genes del genoma de un
organismo se procedi a:
Identificar mutaciones espontneas o generar colecciones de
mutantes usando agentes
qumicos o fsicos.
Generar mapas genticos mediante anlisis de ligamiento utilizando
las cepas mutantes.
Durante la dcada de 1980 los genetistas comenzaron a utilizar la
tecnologa del ADN
recombinante como una aproximacin al anlisis gentico,
cartografiando secuencias de ADN
clonadas en cromosomas especficos. La mayor parte de estas
secuencias no eran genes, sino
marcadores como polimorfismos de longitud de fragmentos de
restriccin (RFLP), polimorfismo de
un nico nucletido (SNP) y otros. Una vez asignados a un
cromosoma, estos marcadores se
utilizaban en rboles genealgicos para establecer un ligamiento
entre los marcadores y
enfermedades genticas. Este mtodo denominado clonacin posicional
se utiliz para
cartografiar, aislar, clonar y secuenciar los genes de distintas
enfermedades.
1111 2222
3333 4444
5555
Figura 1. Organismos modelo utilizados
para identificar mutaciones y generar
mapas genticos: 1. Maz, 2. Drosophila,
3. E. coli, 4. Ratn y 5. Levadura.
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A mediados de 1980 ya se haban asignado ms de 3.500 genes y
marcadores a
cromosomas humanos. Actualmente se han secuenciado centenares de
genomas de procariotas
y eucariotas, y hay ms de mil proyectos en ejecucin.
La Genmica incluye diversos campos
Genmica Estructural
Genmica Funcional
Genmica Comparativa
La Genmica Estructural incluye la construccin de los datos de la
secuencia del genoma,
el descubrimiento de los genes y su localizacin y la construccin
de mapas genticos.
La Genmica Funcional estudia la funcin biolgica de los genes, su
regulacin y sus
productos.
La Genmica Comparativa compara secuencias de genes y protenas de
diferentes
genomas para elucidar las relaciones funcionales y
evolutivas.
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La Protemica es una extensin de la Genmica y su objetivo es el
estudio de las protenas
presentes en una clula, en un tejido, en un fluido en un momento
dado bajo determinadas
condiciones. Define el conjunto completo de protenas codificadas
por un genoma. Incluye:
Identificacin de todas las protenas expresadas en una clula bajo
determinadas
condiciones.
La naturaleza y el alcance de cualquier modificacin
pos-traduccional de las protenas.
Las interacciones protena-protena.
La localizacin subcelular de las protenas.
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GENMICA ESTRUCTURAL
La Genmica estructural se ocupa de la secuenciacin y la
comprensin del contenido
del genoma. A menudo, uno de los primeros pasos en la
caracterizacin de un genoma es
preparar mapas genticos y fsicos de sus cromosomas. Estos mapas
proporcionan informacin
sobre las localizaciones relativas de genes, los marcadores
moleculares y los segmentos
cromosmicos, que suelen ser esenciales para posicionar los
segmentos cromosmicos y alinear
tramos del ADN secuenciado en una secuencia del genoma
completo.
MAPAS GENTICOS
Los mapas genticos (mapas de ligamiento) proporcionan una
aproximacin a grandes
rasgos de las localizaciones de los genes en relacin con las de
otros genes conocidos.
Estos mapas se basan en la funcin gentica de recombinacin. Para
la construccin de
los mapas se cruzan individuos heterocigotos en dos o ms loci
genticos y se determina la
frecuencia de recombinacin mediante el examen de la progenie. Si
la frecuencia de
recombinacin entre dos loci es del 50%, entonces los loci estn
ubicados en cromosomas
diferentes o estn muy separados en el mismo cromosoma. Si la
frecuencia de recombinacin es
menos del 50%, los loci estn localizados muy prximos en el mismo
cromosoma (pertenecen al
mismo grupo de ligamiento). Para los genes ligados, la
frecuencia de recombinacin es
proporcional a la distancia fsica entre los loci.
Las distancias en los mapas
genticos son medidas en
porcentaje de recombinacin
(centimorgans, cM) o unidades
de mapa (um).
Marcadores de ADN
Distancia en un
mapa gentico
Figura 2. Los mapas
genticos se basan
en la frecuencia de
recombinacin.
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Durante muchos aos, los genes podan detectarse slo observando su
influencia en un
rasgo (fenotipo) y la construccin de mapas genticos estaba
limitada por la disponibilidad de
rasgos de un locus individual que podran examinarse por la
evidencia de la recombinacin. Al
final, esta limitacin se super con el desarrollo de tcnicas
moleculares, como el anlisis de
polimorfismos de la longitud del fragmento de restriccin, la
reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR) y la secuenciacin de ADN, mejorando los mapas
genticos.
Los mapas genticos tienen varias limitaciones, la primera es la
baja resolucin o el detalle.
Segundo, no siempre se corresponden con precisin a las
distancias fsicas entre los genes. Los
mapas genticos se basan en las frecuencias de entrecruzamiento o
recombinacin, que varan
de un cromosoma a otro, de modo que las distancias de un mapa
gentico son slo
aproximaciones de distancias fsicas reales a lo largo de un
cromosoma. A pesar de estas
limitaciones, los mapas genticos han sido fundamentales para el
desarrollo de los mapas fsicos y
la secuenciacin de genomas completos.
MAPAS CITOGENTICOS
Los mapas citogenticos o
cromosmicos constituyen una etapa
intermedia entre los mapas genticos y
los mapas fsicos.
Figura 3. Comparacin del mapa citogentico del
cromosoma 1 del bfalo (BBU1) a la izquierda y la
alineacin con la secuencia de montaje del
cromosoma 1 y 27 del bovino (BTA1 BTA27) a la
derecha. Los marcadores comunes a ambos estn
unidos por una lnea slida de color negro
o una lnea roja slida (circulo). Las lneas rojas
indican los marcadores que se orientan de forma
secuencial pero invertida.
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Con el avance de las tcnicas de bandeo cromosmico, la
citogentica cuenta con una
herramienta de mayor precisin en la individualizacin de los
cromosomas, facilitando su
agrupamiento y clasificacin morfolgica.
El estudio citogentico en animales domsticos se ha desarrollado
rpidamente en los
ltimos aos. Hoy en da es utilizado como elemento de diagnstico
que permiten detectar un
gran nmero de patologas. A su vez el bandeo cromosmico, ha
permitido precisar la
localizacin de genes aportando informacin al mapa gentico. Por
otro lado permiten realizar
estudios evolutivos de especies relacionadas entre s.
La construccin de los mapas citogenticos o cromosmicos se
realizan utilizando tcnicas
que no incluyen la reproduccin sexual (meiosis) y, por lo tanto,
asignan una localizacin segn las
regiones citogenticas (adems, estos mapas presentan la ventaja
de no requerir del uso de
marcadores polimrficos). Esas tcnicas son:
Hibridacin in situ,
Hbridos de clulas somticas
Hbridos de radiacin.
Hibridacin In Situ.
Cuando una secuencia de ADN, en este caso referida como una
sonda de ADN (en
ingls, probe), es marcada con istopos radioactivos o
fluorescencia, podemos hibridarla con su
secuencia complementaria en el ADN genmico de un cromosoma
especfico y observar la
marca directamente sobre el extendido cromosmico con un
microscopio ptico. Las clulas
deben estar fijas y los cromosomas esparcidos en un portaobjetos
y expuestos a una solucin de
pH elevado para romper el apareamiento de bases y permitir el
acceso a las sondas. La
hibridacin in situ fluorescente (FISH) es una tcnica muy
sensible siempre que se cuente con
sondas lo suficientemente grandes (y homlogas) y que se suprima
la fluorescencia de fondo. La
sensibilidad de esta variante de la tcnica de hibridacin in situ
es que permite localizar una
secuencia con una precisin de hasta 30 Mb y de detectar
anormalidades cariotpicas en
cromosomas metafsicos tanto como interfsicos. Los fluorocromos
ms empleados son:
fluorescena (FITC), rodamina (XRITC) y Texas Red.
La hibridacin in situ es la tcnica de eleccin
para la localizacin rpida de los transgenes.
Figura 4. Cromosoma 4 que presenta una duplicacin de
la banda q21 detectado con la tcnica FISH
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Fibroblasto humano Clula tumoral del ratn
Los fibroblastos humanos y las clulas tumorales de ratn se
mezclaron en presencia de polietilenglicol
y dan origen a clulas hbridas denominadas heterocarion
Heterocarion
Clula hbrida con ncleos fusionados
Lneas celulares
Figura 5. La hibridacin de clulas somticas puede utilizarse para
determinar cul es el cromosoma que contiene el gen de inters.
Por ltimo, el pintado de cromosomas (del ingls chromosome
painting) es una variante del
FISH que emplea una mezcla de sondas de ADN derivada de un
cromosoma entero o de una
regin cromosmica de inters. Se utiliza para obtener patrones de
regiones homlogas entre
diferentes especies y es una forma muy directa de evaluar la
cantidad de rearreglos que se
produjeron entre dos especies en el curso de la evolucin.
Hbridos de Clulas Somticas
Para esta tcnica se utilizan
clulas hbridas (viables) derivadas
de la fusin in vitro de clulas
somticas de especies diferentes
de mamferos. Aunque se
desconoce la razn, se observa
que los cromosomas que se van
perdiendo en las clulas hbridas
pertenecen exclusivamente a uno
de los conjuntos parentales. Por
ejemplo, los hbridos
humano/roedor tienden a perder
(a travs de los sucesivos cultivos y
en forma preferencial) los
cromosomas humanos y quedarse
con una mayora de cromosomas
de roedor. Debido a esto, es
posible derivar un panel de clulas
hbridas que representen cada cromosoma humano en forma nica,
sobre un conjunto de
cromosomas de roedor. Por lo tanto, todos los genes de origen
roedor son retenidos (y se expresan
normalmente), mientras que slo los genes presentes en el nico
cromosoma humano que qued
retenido en ese hbrido podrn ser localizados por medio del uso
de sondas moleculares o el
anlisis de expresin. De esta manera, detectando patrones de
presencia o ausencia de
marcadores (o expresin de genes) y correlacionando con los
cromosomas presentes en el
hbrido, se puede asignar un gen humano a un cromosoma en
particular. Los hbridos de clulas
somticas humano/ratn, con un complemento limitado de cromosomas
humanos (intactos), han
sido muy usados para localizar genes humanos en los ltimos 20
aos, a pesar de ser muy
inestables.
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Hbridos de Radiacin (HR)
Otra tcnica desarrollada para obtener mapas de alta resolucin
son los paneles de
hbridos de radiacin (Radiation Hybrid RH), enfoque descripto por
Goss y Harris en 1975. Las dos
grandes ventajas de este sistema son que pueden mapearse
marcadores o genes no polimrficos
(se evala slo la presencia o ausencia de un marcador) y que se
logra una resolucin mayor que
con los mapas de ligamiento, constituyendo un puente entre stos
y los mapas fsicos. Estos
paneles de clulas hbridas se construyen a partir de clulas
donantes (de la especie a ser
mapeada) que han sido irradiadas letalmente (ya sea con rayos g
o X) para causar la
fragmentacin de sus cromosomas (por roturas de doble cadena).
Las clulas as irradiadas son
fusionadas con lneas celulares receptoras deficientes para un
marcador de seleccin, como ser
la timidina quinasa (TK) o la hipoxantina fosforibosil
transferasa (HPRT). Usando condiciones de
seleccin con medios apropiados, sobrevivirn slo aquellas clulas
que contengan, por lo menos,
algn fragmento cromosmico proveniente de las clulas dadoras.
El concepto terico es que aquellos loci que se encuentran muy
prximos unos de otros
sern retenidos en el mismo fragmento cromosmico despus de la
radiacin. Esta caracterstica
es similar al principio de ligamiento gentico que hemos visto en
los mapas meiticos. Como en los
paneles de ADN obtenidos con cruzas de animales, la informacin
de los paneles HR es
acumulativa y puede proveer datos para el ordenamiento (de alta
resolucin) de regiones no
polimrficas o no separables por los mapas de ligamiento.
Figura 6. Hbridos de radiacin. Construccin de clones de hbridos
de radiacin (HR) a partir de clulas
donantes con un nico cromosoma humano (hbrido mono-cromosmico) y
clulas receptoras de hmster.
Cada clon (abajo) presenta una coleccin diferente (al azar) de
fragmentos del cromosoma humano
original. Los 6 loci hipotticos (A a F) se marcan como +
(presencia) o - (ausencia), dando una idea del
ordenamiento en el cromosoma original
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Cuando se evala un marcador (por Southern blot, FISH o PCR), el
patrn de presencia (+)
o ausencia () a travs del panel, define el emplazamiento del
mismo: aquellos marcadores con el
mismo patrn de + y estarn localizados en el mismo bin o posicin.
Estos estudios se conocen
como patrones de retencin de marcadores y nos ayudan a
determinar la ubicacin de un gen
o marcador. En estos casos, la unidad para medir la distancia en
el mapa es el Ray o el centiRay
(cR).
MAPAS FSICOS
Los mapas fsicos estn basados en el anlisis directo del ADN y
ponen los genes respecto
a distancias medidas en el nmero de pares de bases, kilobases o
megabases. Un tipo comn de
mapa fsico es el que conecta piezas aisladas de ADN genmico que
fue clonado en bacterias o
levaduras. Una de las ventajas es que, por lo general, los mapas
fsicos tienen resolucin mayor y
son ms exactos que los mapas genticos.
Hay varias tcnicas para crear mapas fsicos, entre las que se
incluyen el mapeo de
restriccin, que determina las posiciones de sitios de restriccin
en el ADN; el mapeo del sitio de
secuencia especfica (sequence-tagged site, STS), que localiza
las posiciones de secuencias
cortas nicas de ADN en un cromosoma; la hibridacin in situ
fluorescente (fluorescent in situ
hybridization, FISH), por el cual pueden mapearse los marcadores
visualmente en sus
localizaciones cromosmicas y la secuenciacin de ADN.
Mapa gentico Secuencia de
ADN
Mapa fsico Cromosoma
Clones de ADN alineados
Figura 7. Los
mapas fsicos a
menudo se utilizan
para ordenar los
fragmentos de
ADN clonados.
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VISUALIZACION DE LOS FRAGMENTOS DE ADN
Para la visualizacin de fragmentos de ADN se encuentran
disponibles numerosas tcnicas, entre
las que se pueden mencionar:
1. La electroforesis es una tcnica bioqumica estndar para la
separacin de molculas sobre la
base del tamao y la carga elctrica. Hay varios tipos. Se prepara
un gel poroso de agarosa que
se funde en una solucin buffer. Al enfriarse se solidifica. En
uno de los extremos del gel se realizan
indentaciones (pocillos) para contener las soluciones con
fragmentos de ADN y se somete a una
corriente elctrica que pasa a travs del gel. Dado que el grupo
fosfato del ADN tiene carga
negativa, los fragmentos de ADN migran hacia el extremo positivo
del gel. La distancia que
recorre cada fragmento depende de su tamao. Luego se produce la
tincin del gel con un
colorante especfico como bromuro de etidio.
La electroforesis es muy utilizada en la tecnologa de ADN
recombinante.
2. Otra tcnica es la Southern blot, sirve para transferir los
fragmentos desnaturalizados
monocatenarios provenientes de un gel a un medio slido delgado.
Estos fragmentos son cortados
por una o ms enzimas de restriccin. Se puede identificar que
clones de una biblioteca
contienen una determinada secuencia de ADN y para caracterizar
el tamao de los fragmentos.
Tambin se puede utilizar para determinar si un clon contiene
todo un gen o solo parte de el.
Los fragmentos se separan por electroforesis en gel, lo que
produce una serie de bandas.
Se tie el ADN en el gel con bromuro de etidio y se fotografa o
escanea para determinar el
nmero y peso molecular de los fragmentos. El ADN se debe
desnaturalizar en fragmentos de
cadena sencilla con un tratamiento alcalino. Se cubre el gel con
una membrana de nitrocelulosa.
Los fragmentos de ADN del gel se transfieren a la membrana
colocando la membrana y el gel
sobre un pabilo (esponja) sumergida parcialmente en una solucin
tampn. Se colocan varias
capas de papel de celulosa secante. La accin capilar arrastra el
tampn por el gel y de esta
manera se transfieren los fragmentos de ADN del gel al filtro de
nitrocelulosa. Despus de la
transferencia al gel se coloca en una solucin de hibridacin de
una sonda marcada en forma
radiactiva o qumica. La sonda se unir a todos los fragmentos de
ADN en la membrana que
posee secuencias complementarias. Luego se lava la membrana para
sacar la sonda no unida y
la sonda unida se detecta por autorradiografa u otro mtodo para
sondas marcadas.
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3. El Nothern blot es la transferencia de ARN tambin de un gel a
un soporte slido mediante un
proceso denominado. La hibridacin puede revelar el tamao de una
molcula de ARN
mensajero particular, su abundancia o los tejidos en los que se
transcribe.
4. El Western blot es la transferencia de la protena de un gel a
una membrana. La sonda puede
ser un anticuerpo, utilizado para determinar el tamao de una
protena y el patrn de expresin.
5. Hibridacin in situ (explicada anteriormente)
6. Footprinting del ADN
Muchas secuencias del ADN actan como sitios de fijacin para
protenas por ej. las
secuencias consenso en promotores que son los sitios a menudo
sitios de fijacin para los factores
de transcripcin. Esta tcnica se utiliza para determinar las
secuencias de ADN fijadas a estas
protenas.
7. Mutagnesis
Una manera muy eficaz para estudiar los genes es provocar
mutagnesis y estudiar los efectos
en el organismo.
Figura 8. Tcnica de Southern blot
para transferir los fragmentos
desnaturalizados monocatenarios
provenientes de un gel a un
medio slido delgado.
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8. Animales transgnicos
En ratones y otros mamferos el ovocito es lo
suficientemente grande como para inyectar el ADN
de manera directa. En el estado de dos proncleos
antes de la fecundacin. Antes de la fecundacin se
puede inyectar el ADN en uno de ellos y as unas
copias de ADN son inyectadas y se integran al azar
mediante un proceso denominado recombinacin
no homloga. Los embriones se implantan luego en
una hembra seudopreada, madre sustituta.
Figura 9. Animales transgnicos. Los animales alterados son
transgnicos y el ADN aportado extrao se denomina
transgen.
9. Ratones con desactivacin gnica Knock-out
Es una variante que consiste en producir ratones en los
que se les desactiva un gen normal. Sus fenotipos ratones
con desactivacin permiten determinar la funcin de un
gen. La manera habitual es insertar un gen neo que
confiere resistencia al antibitico G418. La insercin
rompe el gen blanco y proporciona un marcador
conveniente para hallar copias del gen desactivado.
Despus de transferir el gen desactivado a las clulas
embrionarias se seleccionan mediante el agregado del
antibitico G418. Solo sobrevivirn las clulas con el gen
desactivado.
Figura 10. Knock-out. Dentro del ratn la copia normal del
gen
puede intercambiarse con la desactivada a travs de la
recombinacin.
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Reaccin en Cadena de la Polimerasa para amplificar el ADN
(PCR)
Permite amplificar los fragmentos de ADN miles a millones de
veces en el transcurso de
unas pocas horas. Puede utilizarse con cantidades pequeas de ADN
original incluso una sola
molcula. La PCR ha revolucionado la biologa molecular y es hoy
una de las tcnicas
moleculares ms utilizadas.
La base de la PCR es la replicacin catalizada por una ADN
polimerasa, que tiene dos
requisitos esenciales: un molde de ADN monocatenario a partir
del cual puede copiarse una
nueva cadena de ADN y un cebador al que pueden agregarse los
nuevos nucletidos. Debido a
que una molcula de ADN consta de 2 cadenas de nucletidos cada
una puede servir como
molde para producir una nueva molcula de ADN, la cantidad de ADN
se duplica con cada
replicacin. El punto de partida de la sntesis de ADN en el molde
es determinado por la eleccin
de los cebadores. Los cebadores utilizados en la PCR son los
fragmentos cortos de ADN, de
manera tpica de 17 a 25 nucletidos de longitud, que son
complementarios a las secuencias
conocidas en el molde. Para cada cadena se utiliza un cebador
diferente.
Para llevar a cabo la PCR se comienza con:
una solucin que incluye el ADN blanco (ADN por ser
amplificado),
la ADN polimerasa,
los cuatro desoxirribonuclesidos trifosfatos
los cebadores que son complementarios a las secuencias cortas en
cada cadena
de ADN blanco
los iones magnesio y otras sustancias que son necesarias para
que se produzca la
reaccin.
Una reaccin en cadena de la polimerasa incluye 3 pasos:
Paso 1: una solucin de ADN se calienta entre 90C y 100C para
romper los puentes de
hidrgeno entre las dos cadenas de nucletidos y producir as los
moldes monocatenarios
necesarios. La mezcla de la reaccin se mantiene a esta
temperatura durante slo uno o
dos minutos.
Paso 2: la solucin de ADN se enfra con rapidez a una temperatura
entre 30C y 65C y se
mantiene as durante un minuto o menos. Los cebadores se adhieren
a sus secuencias
complementarias en las cadenas molde.
Paso 3: la solucin se calienta entre 60C y 70C, temperatura a la
cual la ADN polimerasa
puede sintetizar cadenas nuevas de ADN mediante el agregado de
nucletidos a los
cebadores. En el transcurso de unos pocos minutos se producen
dos molculas nuevas de
ADN bicatenario por cada molcula original de ADN.
Luego se repite cada ciclo completo. Con cada ciclo, la cantidad
de ADN se duplica; de
modo que ste aumenta en forma geomtrica. Una molcula de ADN
aumenta a ms de 10.000
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molculas en 10 ciclos de PCR, a ms de un milln de molculas en 20
ciclos y a ms de mil
millones de molculas en 30 ciclos. Cada ciclo se completa en el
trmino de unos pocos minutos;
por tanto, en unas pocas horas se obtiene una amplificacin
grande de ADN.
Figura 11. Pasos de la PCR
Dos innovaciones importantes facilitaron el uso de la PCR:
El descubrimiento de la ADN polimerasa que es estable a las
temperaturas elevadas
(polimerasa Taq).
El desarrollo de cicladores trmicos automatizados, es decir,
mquinas que provocan los
cambios de temperaturas rpidos requeridos para los diferentes
pasos de la PCR.
En la actualidad la PCR se utiliza con frecuencia en lugar de la
clonacin gnica, pero
tiene varias limitaciones. El uso de PCR requiere el
conocimiento previo de parte de la secuencia
del ADN para permitir la construccin de cebadores. Otra
limitacin es que el tamao de los
fragmentos que pueden amplificarse por la polimerasa Taq estndar
suele ser menor de 2000 pb.
A pesar de sus limitaciones la PCR se utiliza habitualmente en
una amplia gama de aplicaciones
moleculares.
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SECUENCIACION
SECUENCIACIN DEL ADN
En cierto sentido, un ADN clonado o no, no est
completamente caracterizado hasta que se conoce su
secuencia nucleotdica. La capacidad de secuenciar ADN ha
permitido grandes avances en el
conocimiento de la organizacin del genoma y de los genes,
incluyendo su estructura, funcin y
mecanismos de regulacin.
Los primeros mtodos para la secuenciacin rpida de ADN se
desarrollaron entre 1975 y
1977. Frederick Sanger y col. crearon el mtodo de secuenciacin
dideoxi basado en la
elongacin del ADN; Allan Maxam y Walter Gilbert desarrollaron
un
segundo mtodo basado en la degradacin qumica del ADN. El
mtodo de Sanger se convirti con rapidez en el procedimiento
estndar para la secuenciacin de cualquier fragmento
purificado
de ADN.
Mtodo qumico de Maxam y Gilbert
Un fragmento de ADN se marca radioactivamente en sus extremos
con gamma 32P
gamma 32S dATP por accin de la polinucletido quinasa. La tcnica
consiste en romper estas
molculas marcadas con reacciones qumicas especficas para cada
una de las cuatro bases.
Cuatro alcuotas de la misma muestra se tratan bajo condiciones
distintas, posteriormente el
tratamiento con piperidina rompe la molcula de ADN a nivel de la
base modificada.
Los productos de estas cuatro reacciones se resuelven en funcin
de su tamao en geles
de poliacrilamida donde la secuencia puede leerse en base al
patrn de bandas radioactivas
obtenidas. Esta tcnica permite la lectura de unas 100 bases de
secuencia.
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Base nitrogenada
Figura 12. Mtodo qumico de
Maxam y Gilbert.
Mtodo enzimtico de Sanger
En este mtodo se utilizan pocos reactivos txicos y cantidades
menores de radioactividad
que en el mtodo de Maxam-Gilbert, y su caracterstica particular
es el uso de
didesoxinucletidos trifosfato (ddNTPs) como
terminadores de la cadena de ADN. Los ddNTPs
son desoxinucletidos de los 4 nucletidos
diferentes (dATP,dTTP, dCTP y dGTP) que carecen
de uno de los grupos hidroxilo, de manera que
cuando uno de estos nucletidos se incorpora a
una cadena de ADN en crecimiento, esta
cadena no puede continuar elongndose ya que la enzima ADN
polimerasa necesita un extremo
3 OH para aadir el siguiente nucletido, y el ddNTP, marcado en
forma radioactiva o qumica,
incorporado carece de este grupo hidroxilo. Al terminar la
elongacin de la cadena, se producen
varios fragmentos de ADN de longitud variable, los cuales son
desnaturalizados por calor y
separados por tamao (con una resolucin de un solo nucletido)
mediante electroforesis en gel
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de poliacrilamida - urea. Cada una de las cuatro reacciones de
sntesis se corre en calles
individuales (A, T, G y C) y se visualizan las bandas de ADN
mediante autorradiografa o luz
ultravioleta. Las bandas obtenidas en el gel corresponden a los
fragmentos de ADN de diferentes
longitudes
Una banda en una calle indica un fragmento de ADN que es el
resultado de una
terminacin de la cadena tras la incorporacin de un
didesoxinucletido (ddATP, ddGTP, ddCTP o
ddTTP). El nucletido terminal puede ser identificado de acuerdo
al didesoxinucletido que se
aadi en la reaccin que dio lugar a esa banda. Las posiciones
relativas entre las cuatro calles
se utilizan entonces para leer la secuencia de ADN.
ADN monocatenario que
debe ser secuenciado
Los cuatro ddNTP
Secuencia de la cadena
obtenida complementaria
Secuencia de la cadena
molde original
Autorradiograma de la electroforesis en gel
Figura 13. El mtodo de
didesoxi de secuenciacin
de ADN se basa en la
terminacin de la sntesis de
ADN.
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Secuenciacin automtica de Sanger
Durante muchos aos, la secuenciacin del ADN se realiz sobre todo
en forma manual y
era una tcnica laboriosa y costosa. En la actualidad, la
secuenciacin se lleva a cabo mediante
aparatos automatizados que utilizan colorantes fluorescente y
escneres de lser para los miles de
secuencias de pares de bases en unas pocas horas.
Figura 14. Esquema de la secuenciacin por el mtodo automtico de
electroforesis capilar con la secuencia
obtenida.
Los ddNTP utilizados en la reaccin automatizada se marcan cada
uno con un colorante
fluorescente distinto. Las cuatro reacciones pueden tener lugar
en el mismo tubo de ensayo y
pueden colocarse en el mismo pocillo durante la electroforesis,
dado que cada dNTP se marca en
forma distintiva. Los aparatos de secuenciacin recin
desarrollados llevan a cabo la electroforesis
en tubos capilares que contienen gel. Los fragmentos de
diferentes tamaos producidos por la
reaccin de secuenciacin se separan dentro de un tubo y al migrar
pasan por delante de un haz
de lser y un detector.
Cuando los fragmentos pasan por el lser, sus colorantes
fluorescentes se activan y la
fluorescencia resultante se detecta por un escner ptico. Cada
colorante emite fluorescencia de
una longitud de onda caracterstica que se lee en el escner
ptico. Para la interpretacin, la
informacin ingresa en una computadora y los resultados se
imprimen como un conjunto de picos
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en un grfico (Fig. 14). Los aparatos de secuenciacin
automatizados pueden contener 96 tubos
capilares o ms, lo que permite leer secuencias de 50.000 a
60.000 pb en unas pocas horas.
Secuenciacin automtica en geles desnaturalizantes de
acrilamida/bisacrilamida
La secuenciacin automtica mediante geles desnaturalizantes, se
realiza polimerizando
un gel de acrilamida/bisacrilamida entre dos cristales montados
adecuadamente sobre el
cassette que sirve de soporte para los mismos y que
posteriormente se acoplar en el
secuenciador automtico para proceder a la carga de la
muestras.
El nmero de muestras que podemos cargar en cada gel, viene
determinado por el
nmero de pocillos que posee el peine (de dientes de tiburn) que
utilicemos. Hay peines de
cuatro tamaos distintos: de 36, 48, 64 y 96 pocillos.
La electroforesis se desarrolla durante 7 horas, y se puede
realizar una lectura de unos
700pb aproximadamente, dependiendo siempre de la calidad del
ADN, de la correcta
cuantificacin del mismo, de la utilizacin del primer adecuado, y
de la polimerizacin correcta
del gel de acrilamida/bis principalmente.
Cuando las muestras a secuenciar tienen una longitud no superior
a 400pb, podemos
disminuir el tiempo de la electroforesis a 3.5 horas, aumentando
la velocidad de barrido del laser, y
el resultado es igualmente optimo.
Figura 15. Esquema de los geles desnaturalizantes.
Secuenciadores automticos capilares
Existen instrumentos de electroforesis capilar que proporcionan
una alternativa al sistema
basado en geles de acrilamida/bisacrilamida donde el soporte ha
sido sustituido por un polmero
que se inyecta de forma automtica en un capilar antes de cargar
la muestra a secuenciar; las
muestras se van analizando una a una. Este tipo de
secuenciadores se utiliza para lecturas no
superiores a unos 450pb.
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20
El equipo funciona de forma completamente automtica inyectando
las muestras (que se
preparan exactamente igual que durante la secuenciacin en geles
y se colocan en una placa
de 96 pocillos), en un capilar previamente cargado con un cierto
polmero que funciona como lo
hace la matriz de acrilamida-bisacrilamida-urea de los geles de
secuencia, permitiendo resolver
fragmentos de ADN de cadena sencilla que se diferencian en una
nica base.
A una altura determinada el laser detecta la fluorescencia
emitida por cada cadena
sencilla de ADN fluorescente y traduce esta emisin de
fluorescencia en la secuencia
correspondiente. Una vez desarrollada la electroforesis de la
primera muestra, el capilar se vaca
rellenndose nuevamente con polmero fresco. Se inyecta a
continuacin una segunda muestra,
se procede a desarrollar nuevamente la electroforesis y as
sucesivamente.
Figura 16. Secuenciador ABI Prism 310
LAS PRINCIPALES VENTAJAS DE ESTOS NUEVOS EQUIPOS SON:
Automatizacin completa de todo el proceso, no siendo necesaria
siquiera la presencia
de un tcnico que cargue las muestras en los diferentes capilares
del equipo.
Rapidez en el anlisis de cada muestra: dado el pequeo dimetro de
los capilares, se
pueden aplicar voltajes mayores que en los geles de
acrilamida:bisacrilamida:urea, por lo
que pueden leerse del orden de 450 nucletidos en el plazo de una
hora mientras que esta
misma longitud de secuencia necesita unas 2-4 horas en un
secuenciador en gel.
El tiempo necesario del proceso es, para la polimerizacin del
mismo, unas dos horas y
para la preelectroforesis, una hora aproximadamente.
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21
Corte de ADN con enzima de
restriccin
Introduccin del plsmido
recombinante a la bacteria
SECUENCIACIN DE TODOS LOS GENES DEL GENOMA
El genoma o secuencia completa de ADN de un organismo constituye
la informacin
gentica heredable de un organismo.
Secuenciar es determinar el orden en que se enlazan las bases de
dicha secuencia. Ese
trozo de ADN puede corresponder a un gen, un genoma, o a una
parte de ellos. Los avances de
las tcnicas de secuenciacin del ADN permiten hoy en da leer el
ADN a gran velocidad lo que
ha llevado a abordar proyectos a gran escala como el Proyecto
Genoma Humano. Adems se
dispone ya de la secuencia completa de ADN de muchos genomas de
animales, plantas y
microorganismos.
Se usan dos mtodos diferentes para secuenciar genomas:
A- Mtodo clon a clon
B- Mtodo Hierarchical Shotgun Sequencing (secuenciacin de la
perdigonada jerrquica) y
Shotgun Sequencing (secuenciacin de la perdigonada).
A- Mtodo clon a clon:
Se realiza la construccin de una biblioteca con fragmentos
clonados que incluyen el ADN de
todo el genoma de un organismo, que luego se ensamblan en mapas
genticos y fsicos.
Figura 17. Estrategia general para clonar un gen.
Un trozo de ADN es manipulado con enzimas de
restriccin e introducido en un plsmido el cual a
su vez es introducido en una bacteria. Al cultivar la
bacteria se obtienen mltiples copias del ADN de
inters.
El clonado se realiza con distintos tipos
de enzimas de restriccin y vectores: Las
enzimas de restriccin son protenas aisladas
de bacterias cuya funcin es cortar ADN.
Cada enzima reconoce un sitio particular del
ADN, es decir que reconoce una secuencia
particular de nucletidos. Esa secuencia
especfica se denomina sitio de restriccin.
Una vez que la enzima reconoce estos sitios,
se posiciona sobre la molcula de ADN y
corta dentro o en torno de esa secuencia.
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22
Cortes con extremos romos Cortes con extremos cohesivos
Figura 18. Las enzimas segn el
corte se clasifican en: Enzimas que
generan extremos romos y
Enzimas que generan extremos
cohesivos.
Los vectores son molculas transportadoras que transfieren y
replican fragmentos
de ADN que llevan insertados. Para que sirva de vector, una
molcula debe ser capaz de
replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta. Tambin
tiene que tener secuencias de
reconocimiento que permitan la insercin del fragmento de ADN a
clonar.
Para insertar un fragmento de ADN al vector, se utiliza una
enzima de restriccin, y se
mezcla con fragmentos de ADN producidos con la misma enzima.
Los vectores que transportan un fragmento insertado se denominan
vectores
recombinantes.
Hay muchos vectores de clonacin, que es una molcula de ADN
replicante y estable a la
cual puede adherirse un fragmento de ADN extrao para la
introduccin en una clula. Difieren
en la especificidad de la clula husped, el tamao de los insertos
que pueden transportar y en el
nmero de copias que producen y el nmero y tipo de genes
marcadores que contienen.
Tipos de Vectores:
Vectores procariotas:
1. Plsmidos: (ADN epismico). Para secuencias cortas de 10.000
bases (10 Kb). Son circulares y
existen naturalmente en las bacterias. Contienen orgenes de
replicacin y pueden por eso
replicarse independientemente del cromosoma bacteriano.
Figura 19. pUC19 vector plsmido tpico de clonacin.
El mtodo de insercin ms sencillo es a
travs de las enzimas de restriccin.
Un segundo mtodo para insertar ADN en un
plsmido es mediante una cola homopolimrica o
tailing donde se crean extremos cohesivos
complementarios sobre las piezas del ADN con
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23
extremos romos. Primero, se corta el plsmido y el ADN extrao con
una enzima de restriccin. Si la
enzima de restriccin produce extremos cohesivos, estos se
eliminan por una enzima que digiere el
ADN monocatenario. De manera alternativa el plsmido y el ADN
extrao pueden cortarse por
una enzima de restriccin que produce extremos romos. Una vez que
el plsmido y el ADN extrao
tienen extremos romos, los extremos cohesivos monocatenarios son
agregados por una enzima
transferasa terminal.
Un tercer mtodo de insercin de fragmentos consiste en utilizar
la enzima ligasa T4, capaz
de conectar dos piezas cualquiera de extremos romos de ADN y se
denomina clonacin
mediante el uso de conectores.
Una vez insertado el plsmido debe introducirse en las clulas
bacterianas. Esta tarea suele
cumplirse mediante la transformacin y que es la capacidad de las
bacterias de captar el ADN
del ambiente externo. Muchas veces la transformacin es un
proceso natural, y otros deben
tratarse en forma qumica o fsica previamente. Los plsmidos
dentro de la clula se replican y
multiplican.
2. Bacterifagos: (gran capacidad para invadir bacterias, se
utiliza para ADN complementario y
genmico). Ofrecen ciertas ventajas y el ms comn es el
bacterifago que infecta E. Coli. Una
de sus ventajas es la elevada eficiencia para transferir el ADN
a las bacterias. Una segunda
ventaja es que cerca de la tercera parte del genoma no es
esencial para la infeccin ni para la
reproduccin. Estos genes no esenciales que comprenden alrededor
de 15 Kb pueden ser
reemplazados por hasta 23 Kb de ADN extrao. El ADN extrao
cortado con EcoRI tendr
extremos cohesivos que son complementarios con los de los
extremos de los genes esenciales, a
los cuales puede conectarse mediante la ligasa. El cromosoma
posee extremos monocatenarios
cortos denominados sitios cos, necesarios para empaquetar en ADN
dentro de la cabeza de un
fago. Los cromosomas del fago recombinante pueden entonces
empaquetarse en la cubierta
proteica y agregarse a E. coli. Los fagos inyectan su ADN
recombinante dentro de la clula,
donde se replicar. Slo los fragmentos de ADN de tamao adecuado y
que contienen genes
esenciales se empaquetarn en las cubiertas del fago.
3. Csmidos: Los csmicos combinan las propiedades de los vectores
plsmidos y los fagos. Los
fragmentos de ADN grandes de 44 Kb pueden clonarse en
csmicos.
Los csmicos son plsmidos pequeos que contienen los sitios cos
del fago ; pueden
empaquetarse con las cubiertas virales y transferirse a las
bacterias por infeccin viral. Dado que
se pierden todos los sitios virales menos los sitios cos, un
csmico puede tener ms del doble del
ADN extrao que puede transportar el fago vector.
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24
El ADN extrao es insertado en los csmicos del mismo modo que se
introduce en los plsmidos.
Figura 20. Vector csmido.
4. Vectores de expresin: Muchas veces es interesante no solo
replicar el gen si no tambin
producir la protena que codifica. Uno de los primeros productos
comerciales elaborados por
tecnologa recombinante fue la protena insulina. La expresin
exitosa es un tema difcil sobre todo
las secuencias que regulan la trascripcin y la traduccin son
diferentes en las bacterias y en los
eucariontes. Para solucionar este problema suele insertarse un
gen extrao en un vector de
expresin que, adems del origen de replicacin, los marcadores
seleccionables y los sitios de
restriccin, contienen secuencias requeridas para los procesos
mencionados.
Vectores eucariotas:
Figura 21. Puede insertarse
un gen extrao en un vector
de expresin; en este
ejemplo un vector de
expresin E. coli.
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25
1. YACs: (cromosoma artificial de levadura). Es un material
bastante inestable. Para secuencias
de hasta 1 Mb (1000 Kb o 1 milln de bases). Son molculas de ADN
con un origen de replicacin
de levadura, que permite que se replique, un par de telmeros que
garantizan estabilidad dentro
de la clula y un centrmero.
Figura 22. Vector YAC
2. BAC: Cromosoma artificial de bacterias. Se utilizan para
clonar segmentos grandes desde 100
a 500 Kb (100.000 bases a 500.000 bases).
Figura 23. Vector BAC. Cromosoma artificial de
bacteria con distintos sitios de corte de enzimas
de restriccin.
El ADN clonado en los BACs es por lo general ms pequeo que los
YACs. Sin embargo, los
BACs ofrecen ventajas importantes como por ejemplo, son ms
manipulables para ciertos tipos de
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26
Una biblioteca genmica es un
conjunto de clones, cada uno de los
cuales contiene un fragmento de un
genoma de un organismo dado.
Las bibliotecas genmicas se
consiguen clonando los fragmentos
en vectores.
estudios en el laboratorio. Los BACs se usan a gran escala para
construir mapas fsicos de alta
resolucin de los cromosomas, con el fin de establecer la
secuencia completa del genoma.
PAPEL DE LA CLONACIN GNICA
La manipulacin y el anlisis de los genes con tecnologa de ADN
recombinante requiere
copias mltiples de las secuencias de ADN utilizadas. La clonacin
fue un requisito previo para
muchos mtodos moleculares, En la actualidad los mtodos de
amplificacin del ADN han
obviado la necesidad de la clonacin, aunque sigue siendo muy
utilizada para crear secuencias
de genes novedosos y para otras manipulaciones.
Como encontrar la secuencia de ADN para ser clonada?
Dado que en una clula puede haber millones de pares de bases de
ADN es necesario
clonar para encontrar un gen. Este enfoque clonar primero y
buscar despus, se denomina
clonacin de fragmentos escogidos al azar (Shotgun). Primero se
clona un nmero grande de
fragmentos en conocimiento de que uno o ms tienen el ADN de
inters y entonces se busca el
fragmento entre los clones. La coleccin de clones que
contiene todos los fragmentos de ADN provenientes de
una fuente se denomina genoteca o biblioteca
genmica.
Para crear una genoteca genmica se recolectan
las clulas y se rompen. As se produce la liberacin de
ADN. Este se puede aislar por diferentes mtodos. Uno de
ellos utiliza fenol. Una vez extrado el ADN se corta el ADN
con enzimas de restriccin y debido a que los sitios de corte son
al azar las molculas de ADN se
cortan en lugares diferentes y se producirn fragmentos
superpuestos. Estos se unen a vectores
que pueden transferirse a las bacterias. Esta tcnica produce un
conjunto de clulas bacterianas
o bacterifagos que contienen los fragmentos genmicos
superpuestos. Una genoteca puede
contener un nmero importante de clones para garantizar que todas
las secuencias de ADN estn
representadas.
B- Mtodo Hierarchical Shotgun Sequencing (secuenciacin de la
perdigonada
jerrquica) y Shotgun Sequencing (secuenciacin de la
perdigonada)
El mtodo de Hierarchical Shotgun Sequencing fue propuesto por
James Watson y Francis
Collins, entre otros, contando con la mayor parte de la
financiacin pblica.
Esta metodologa resulta la ms compleja, con un conocimiento ms
exhaustivo del
genoma. Bsicamente consiste en secuenciar el genoma completo,
cromosoma a cromosoma de
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27
1 2
un extremo al otro. Se hacen 2 o 3 fragmentos del ADN
(fragmentos cortos de 2 Kb, fragmentos de
15-20 Kb y tambin se pueden hacer fragmentos de 200-300 Kb).
Luego se construye una biblioteca genmica con cada preparacin
con la utilizacin de
vectores BAC. Se seleccionan y secuencian clones al azar de
estas bibliotecas. Luego se utiliza un
programa para ensamblar y superponer largos tramos de secuencia
a partir de los fragmentos
cortos, usando las secuencias de los clones ms largos como marco
de referencia.
Figura 24. Representacin esquemtica de la estrategia de
secuenciacin utilizado por 1. El Proyecto
Genoma Humano financiado con fondos pblicos y 2. Por Celera
genomics.
El mtodo de Shotgun Sequencing desarrollado por Craig Venter
bajo la financiacin de
Celera Genomics y otras compaas biotecnolgicas privadas,
emplearan una segunda
tcnica, ms prctica. Consistira en la secuenciacin de genes
expresados en las clulas
diferenciadas en las que se encuentran activos, partiendo de los
ARNm resultantes de su
traduccin.
El mtodo Shotgun Sequencing es ms rpido y menos costoso, pero es
ms propenso a los
errores debidos a un montaje incorrecto de la secuencia
final.
Hasta el momento se han secuenciado 180 eucariotas (17 mamferos,
3 especies
de aves, 2 anfibios, 4 especies de peces, 24 especies de
insectos, plantas, etc.) y
17 estn en proyecto borrador. Tambin se han secuenciado 2149
bacterias.
(Informacin Marzo 2013)
Fuente http://www.genome.jp/kegg/catalog/org_list.html.
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28
Tabla 1. Ejemplos de genomas completos o de borradores de
secuencias publicadas.
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29
NUEVOS MTODOS DE SECUENCIACIN
SECUENCIACIN DE ALTO RENDIMIENTO
La elevada demanda de secuenciacin de bajo costo ha dado lugar a
las distintas
tecnologas de secuenciacin de alto rendimiento. Estos esfuerzos
han sido financiados por
instituciones pblicas y privadas as como desarrolladas y
comercializadas dentro de la empresa
privada por las compaas de biotecnologa. Se pretende que las
tecnologas de secuenciacin
de alto rendimiento disminuyan los costos de secuenciacin de las
bibliotecas de ADN ms all de
lo que se puede hacer con el mtodo corriente del terminador
marcado basado en la separacin
del ADN por electroforesis capilar. Muchos de los nuevos mtodos
de alto rendimiento usan
mtodos que paralelizan el proceso de secuenciacin, produciendo
miles o millones de
secuencias a la vez.
Figura 25. Evolucin de las tecnologas de alto rendimiento.
ABI-3730 de Applied Biosystems, posiblemente el
ms utilizado en la secuenciacin del genoma Humano, con una
capacidad de 1 Mb por da (Un milln de
bases). El AB-SOLID actual, en menos de 10 aos ha multiplicado
por 1000 la capacidad de secuenciacin.
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30
Amplificacin clonal in vitro
Ya que los mtodos de deteccin molecular frecuentemente no son lo
suficientemente
sensibles para la secuenciacin de una sola molcula, la mayora de
los mtodos utilizan un paso
con clonacin in vitro para generar muchas copias de cada molcula
individual. Uno de los
mtodos es la PCR de emulsin, en la que se aslan las molculas
individuales de ADN junto con
microesferas recubiertas con cebadores en burbujas acuosas
dentro de una fase oleosa.
Posteriormente una PCR recubre cada microesfera con copias
clonales de la biblioteca de
molculas aisladas y seguidamente se inmovilizan para ser ms
tarde secuenciadas. La PCR de
emulsin (Fig. 26) se usa en los mtodos publicados por Margulis y
colaboradores (comercializado
por 454 Life Sciences, adquirido por Roche), Shendure y Porreca
et al. (conocido como
"secuenciacin polony ", trmino formado por polimerasa "pol" y
colonia "colony"), y la
secuenciacin SOLiD (desarrollada por Agencourt y adquirida por
Applied Biosystems). Otro
mtodo para la amplificacin clonal in vitro es la "PCR de
puente", en la que los fragmentos se
amplifican a partir de los cebadores unidos a una superficie
slida, desarrollados y usados por
Solexa (de la que ahora es propietaria la empresa Illumina)
(Fig. 27). Estos mtodos producen
ambos muchas localizaciones fsicamente aisladas que contienen
cada una muchas copias de un
solo fragmento. El mtodo con una nica molcula desarrollado por
el laboratorio de Stephen
Quake (y ms tarde comercializado por Helicos) se salta este paso
de amplificacin, fijando
directamente las molculas de ADN a una superficie.
Figura 26. Emulsin de PCR. Una molcula de ADN por perla. La
amplificacin clonal de miles de copias se
produce en microrreactores en una emulsin.
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31
1 2
Figura 27. Amplificacin en fase slida. Una molcula de ADN por
Cluster.
Secuenciacin paralelizada
Una vez que las secuencias clonales de ADN se localizan
fsicamente en posiciones
separadas de la superficie, se pueden utilizar varios mtodos de
secuenciacin para determinar
las secuencias de ADN de todas las localizaciones en
paralelo.
Figura 28.Terminacin reversible. 1. Illumina/Solexa; 2. Helicos
BioSciences.
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32
La "secuenciacin por sntesis", como en la popular secuenciacin
electrofortica con
terminador marcado con colorante, usa el proceso de sntesis de
ADN por ADN polimerasa para
identificar las bases presentes en la molcula complementaria de
ADN. Los mtodos de
terminador reversible (usados por Illumina y Helicos) utilizan
versiones reversibles de terminadores
marcados con colorante, aadiendo un nucletido cada vez, y
detectando la fluorescencia
correspondiente a esa posicin y removiendo posteriormente el
grupo de bloqueo para permitir la
polimerizacin de otro nucletido.
La Pirosecuenciacin (utilizada por
Roche/454) tambin usa la polimerizacin
del ADN para aadir nucletidos,
aadiendo cada vez un tipo diferente y
despus detectando y cuantificando el
nmero de nucletidos aadidos a una
determinada localizacin a travs de la luz
emitida por la liberacin de los pirofosfatos
unidos a ellos.
Figura 29. Roche/454. Pirosecuenciacin.
La "secuenciacin por ligacin" es otro mtodo enzimtico de
secuenciacin que emplea
una ADN ligasa en lugar de una polimerasa para identificar la
secuencia objetivo. Se usa en el
mtodo polony y en la tecnologa SOLiD que ofrece Applied
Biosystems. Este mtodo utiliza un
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33
reservorio de todos los oligonucletidos posibles de una longitud
dada, marcados de acuerdo con
la posicin secuenciada. Los oligonucletidos se templan y ligan;
el ligamiento preferente de las
ADN ligasas por su secuencia especfica produce una seal
correspondiente a la secuencia
complementaria en esa posicin concreta. Shendure et al., usaron
este mtodo para secuenciar
el genoma de E. coli MG1655.
Figura 30. Life/APG. Secuenciacin por Ligacin.
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34
Real Time (Secuenciacin en Tiempo Real)
Es un nuevo mtodo de tecnologa que est llevando adenlante
Pacific Biosciences. En
esta tcnica, los nucletidos no detienen el procesos de sntesis
de ADN. La secuenciacin en
tiempo real implica una imagen continua de la incorporacin de
los nucletidos marcados
durante la sntesis de ADN.
En la plataforma de Pacific Biosciences molculas individuales de
ADN polimerasa estn
unidos a la parte inferior de detectores individuales (ZMW
detectors) obteniendo informacin
mientras los nucletidos son fosforilados mientras el cebador va
traduciendo.
Otros enfoques han propuesto mejorar la relacin de mediciones
seal-ruido en la
secuenciacin en tiempo real con esquemas de deteccin ms
convencionales.
Por ejemplo, Life/Visiten ha diseado ADN polimerasas que se
adjunta con un colorante
fluorescente para producir una seal mejorada por la energa de
resonancia de fluorescencia
Figura 31. Pacific BioSciences. Secuenciacin en Tiempo Real.
Genoma de enriquecimiento
A pesar de las reducciones de costes sustanciales asociados con
tecnologas NGS (Next
Generation Sequencing) en comparacin con el mtodo automatizado
de Sanger, la
secuenciacin del genoma completo es todava un esfuerzo costoso.
Una solucin provisional a
este problema puede ser el uso de plataformas de NGS para
apuntar a regiones de inters
especficas. Esta estrategia se puede utilizar para examinar
todos los exones en el genoma, genes
especficos de las familias que constituyen dianas farmacolgicas
conocidas o las regiones que
estn implicados en enfermedades o en efectos
farmacogenticos.
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35
El concepto de focalizacin de regiones especficas del genoma est
bien establecido,
con la PCR es el ms ampliamente utilizado, aunque en una escala
pequea. PCR acoplado con
secuenciacin de Sanger est adecuadamente emparejado para
analizar unos cuantos
candidatos genes, pero el acoplamiento de la PCR con las
plataformas NGS de alto rendimiento
no es prctico porque la preparacin de la muestra requerira el
manejo de decenas de miles de
cebadores de forma individual o en grupos multiplex.
Un artculo de Frazer y sus colegas en colaboracin con RainDance
Technologies (2009)
informaron la amplificacin simultnea de 3.976 productos que
utilizan tecnologas de microgotas
PCR.
La produccin de grandes cantidades a bajo costo hace que las
plataformas de NGS
descritas anteriormente sean tiles para muchas aplicaciones.
Estos incluyen el descubrimiento de
la variante por resecuenciacin de regiones especficas de inters
o genomas en su totalidad, el
asamblado de novo de bacterias y de genomas eucariotas menores,
la catalogacin de los
transcriptomas de clulas, tejidos y organismos (ARN-seq), los
perfiles en todo el genoma de las
marcas epigenticas y la estructura de la cromatina usando mtodos
basados en la seq (CHIP-
seq, metil-seq y ADNsa-seq) y la clasificacion de especies y el
descubrimiento de genes pora
estudios de la metagenmica.
Por ejemplo, las plataformas Illumina/Solexa y LIfe/APG son
variantes muy adecuadas para
el descubrimiento de resecuenciacin de genomas humanos, porque
se producen por ciclo
volmenes gigantescos de bases de alta calidad.
Adems, la plataforma, Helicos BioSciences es muy adecuado para
aplicaciones que
exigen informacin cuantitativa de ARN o ARN seq.
El rpido ritmo de los avances tecnolgicos en el campo podra
cambiar esta informacin
en un futuro prximo.
Genomas individuales
Los estudios del genoma humano tienen por objeto un catlogo de
SNVS (variante de un
simple nucletido) y la SVS (variantes estructurales) y su
asociacin a diferencias fenotpica, con el
objetivo final de personalizar la genmica con fines mdicos. En
2004, el Consorcio Internacional
de Secuenciacin del Genoma Humano public la primera, y todava
nica, referencia terminada
del genoma humano (actualmente Centro Nacional de Biotecnologa
de la Informacin: NCBI). Su
costo fue estimado en US $300 millones.
La genmica individual tambin est siendo aplicada al estudio de
la enfermedad. Por
ejemplo, Mardis et al., reportaron la secuencia de dos genomas
del cncer de leucemia mieloide
agudo mediante la plataforma Illumina/Solexa, y ambos estudios,
identificaron mutaciones
somticas que pueden ser asociada con la enfermedad. Gibbs et
al., describieron recientemente
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36
la elucidacin de las dos variantes allicas en una familia con
una forma recesiva de la
enfermedad de Charcot-Marie-Tooth utilizando la plataforma
Life/APG.
Varios proyectos destinados a la secuenciacin de ms individuos,
incluyendo el Atlas del
genoma del cncer y El proyecto de 1000 Genomas, tambin estn
utilizando las plataformas
Illumina/Solexa y Life/454 para secuenciar genomas enteros.
En comparacin con la secuenciacin automatizada de Sanger, las
plataformas de NGS
han aumentado dramticamente el rendimiento y redujo
sustancialmente los gastos, con varios
grupos presentando informes de costos de reactivos por debajo de
$100.000. Sin embargo, existe
una gran variabilidad entre y dentro de plataformas NGS en
trminos de tamao del molde y
construccin, largo de lectura, rendimiento y la base y la
cobertura del genoma, y dicha
variabilidad hace que sea difcil evaluar la calidad (es decir,
la precisin de la cobertura del
genoma y continuidad del genoma) de los genomas basado en
consideraciones de costo.
En junio de 2009, Illumina anunci la secuenciacin del genoma
individual por el precio de
US$ 48.000. Complete Genomics ofrece un servicio similar a un
precio de US$ 5.000. Sin embargo, el
logro del ahorro de los costos tambin puede venir con una
disminucin de la calidad de la
informacin.
Las tecnologas de NGS tienen una impresionante gama de
aplicaciones, y actualmente se
estn desarrollando an ms. Adems de las aplicaciones descritas
anteriormente, las tecnologas
de NGS estn siendo utilizadas para caracterizar las relaciones
evolutivas de genomas antiguos y
para dilucidar el papel de secuencias no codificantes en la
salud y enfermedades. En un futuro no
muy lejano, es previsible que las tecnologas de NGS pudieran ser
utilizadas para obtener datos de
alta calidad a partir de la secuencia un genoma aislado de una
sola clula, lo que sera un
avance importante, sobre todo para la genmica del cncer. Para
que esto ocurra, sern
necesarios avances en las tcnicas, para aislar eficazmente
largas molculas de ADN intactas, y
en los mtodos, para la lectura precisa de la secuencia. El campo
del desarrollo de NGS y las
aplicaciones es un rea de rpido movimiento de la investigacin,
que hace de este un momento
emocionante para los estudios genmicos.
Anlisis de las secuencias de ADN
Adems de la clonacin y amplificacin las tcnicas moleculares se
utilizan para analizar
las molculas de ADN mediante la secuenciacin.
Secuenciacin del ADN: una tcnica poderosa que surge de la
tecnologa del ADN recombinante
es la capacidad de secuenciar con rapidez las molculas de ADN.
La secuenciacin consiste en
determinar la secuencia de bases, permite leer la informacin
brindando informacin acerca de
la estructura y funcin de los genes.
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37
Aplicaciones de la tecnologa del ADN recombinante
Adems de proporcionar informacin valiosa sobre los genes la
Tecnologa del ADN
recombnate tiene numerosas aplicaciones como la elaboracin de
productos farmacuticos
(insulina), y otras sustancias, bacterias especializadas (como
produccin de etanol a partir de
plantas), plantas y animales de granja diseados por ingeniera
gentica y para corregir defectos
genticos humanos. Algunos frmacos oligonucletidos (secuencias
cortas de ADN sinttico o de
ARN pueden utilizarse para tratar enfermedades (terapia gnica).
Los oligonucletidos antisentido
son complementarios a los ARN no deseados, como el ARN viral.
Cuando se agrega a una clula,
estos ADN antisentido se unen al ARNm viral e inhiben su
traduccin. Varios frmacos han sido
probados para diferentes tratamientos para el cncer.
Tambin ha permitido el desarrollo de sondas para detectar
mutaciones causantes de
enfermedades. Se dispone de la comprobacin prenatal para varios
centenares de
enfermedades genticas. Para muchas enfermedades genticas las
nicas pruebas diagnsticas
disponibles son las que identifican una mutacin predisponerte en
el ADN, pero muchas
enfermedades genticas son provocadas por varias mutaciones
diferentes y derivar en resultados
pueden ser falsos Salvo la completa secuenciacin del gen que es
costosa no hay manera de
identificar a todos los individuos predispuestos.
En la terapia gnica deban primero localizarse los genes
causantes de enfermedades y
desarrollarse vectores. Un mtodo de terapia consiste extraer
clulas del cuerpo agregar los virus
con los genes recombinantes e reintroducir las clulas en el
cuerpo del paciente. En este caso los
vectores se introducen directamente.
Figura 32. Evolucin de proyectos y publicaciones
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38
Generalidades del anlisis genmico
Los proyectos genoma generan grandes cantidades de informacin
sobre la secuencia
del ADN. Estos datos son tiles slo cuando son analizados. Para
identificar y caracterizar las
regiones codificantes de los genes de las secuencias annimas de
ADN se necesitan diversos tipos
de anlisis mediante la utilizacin de programas y bases de datos,
como por ejemplo:
Asegurar que la secuencia est completa y es precisa.
Identificar los genes encontrando las pautas de lectura abiertas
(ORF: Open Reading
Frames). Empiezan con una secuencia de iniciacin: ATG y terminan
con una secuencia
de terminacin: TAA, TAG o TGA.
Encontrar los sitios promotores de inicio de transcripcin y de
traduccin.
Encontrar los sitios de empalme, los intrones y los exones.
Traducir la secuencia de ADN en una secuencia proteica y
compararla con otras protenas
conocidas.
Figura 33. Sitios de empalme,
intrones y exones.
Para asegurar que la secuencia nucleotdica de un genoma est
completa y no contiene
errores, el genoma se secuencia ms de una vez. Este proceso se
denomina compilacin.
Una vez secuenciado, compilado y comprobado la exactitud de un
genoma, se realiza
una bsqueda de todos los genes que codifican productos (protenas
y ARN) formados por una
pauta de lectura abierta, tripletes nucleotdicos que se pueden
traducir en la secuencia
aminoacdica de una protena. Este es el primer paso de la
anotacin, el proceso que identifica
los genes, sus secuencias reguladoras y su funcin o funciones.
La anotacin tambin identifica los
genes que no codifican protenas y encuentra y caracteriza los
elementos genticos mviles y las
familias de secuencias repetitivas.
El objetivo final del anlisis de la secuencia es obtener una
descripcin funcional completa
de todos los genes del genoma de un organismo.
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39
GENMICA FUNCIONAL
La Genmica Funcional clasifica los genes de las secuencias
dilucidadas por la Genmica
Estructural e identifica sus funciones.
Algunos genes pueden tener funciones previamente asignadas
mediante los mtodos
clsicos de mutagnesis y de cartografa de ligamiento; pero muchos
genes no tienen an una
funcin asignada.
La genmica funcional es el estudio simultneo de todos los genes
involucrados en un
estado fisiolgico determinado o en un tejido en particular.
Permite comprender la organizacin y los mecanismos genticos que
en conjunto hacen a
la fisiologa de un organismo.
La secuencia de nucletidos de un gen puede utilizarse para
predecir la secuencia de
aminocidos de la protena que codifica. Entonces, la protena
puede sintetizarse o aislarse y
estudiarse sus propiedades para determinar su funcin. Sin
embargo, este enfoque bioqumico
para la comprensin de la funcin gnica insume tiempo y es
costoso. Un objetivo fundamental
de la genmica funcional fue desarrollar mtodos informticos que
permitan identificar la funcin
gnica a partir de la secuencia de ADN sola, evitando el proceso
laborioso de aislar y caracterizar
las protenas individuales.
Despus de obtener una secuencia genmica, la siguiente tarea es
asignar funciones a los
genes de la secuencia. Algunos genes pueden tener funciones
previamente asignadas mediante
los mtodos clsicos de mutagnesis y de cartografa de ligamiento;
pero muchos genes no
tienen una funcin bien dirigida asignada.
Una aproximacin para asignar funciones a estos genes es la
utilizacin de bsqueda de
homologa. Este anlisis tiene diversos componentes: bsqueda en
bases de datos como GenBank
para encontrar genes parecidos aislados en otros organismos,
comparar la secuencia de un ORF
con la de un gen bien caracterizado de otro organismo, rastrear
el ORF en busca de motivos
funcionales, regiones del ADN que codifican dominios proteicos
como canales de iones, regiones
de unin a ADN o seales de secrecin/exportacin.
Aplicaciones de la genmica funcional
Caracterizar transcriptomas especfico de tejidos.
Determinar patrones de expresin gnica asociados a procesos
celulares tales como
diferenciacin, proliferacin y muerte celular.
Estudiar las alteraciones en los perfiles de expresin asociados
a procesos patolgicos
(infecciones; carcinognesis, etc.)
Efectuar inferencias funcionales de genes escasamente
caracterizados.
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40
Predecir redes sociales de genes estrechamente relacionadas con
procesos biolgicos
especficos.
Desde el advenimiento de la genmica moderna, se han desarrollado
diversas tecnologas
de gran cantidad de datos que permiten a los investigadores
analizar las interacciones genticas
de miles de genes simultneamente. Estas tecnologas incluyen de
ADN y de expresin proteica,
mtodos automatizados para el aislamiento y la diseccin de
grandes complejos proteicos y
bsquedas de alcance genmico de sitios de interaccin protena-DNA.
Dado que estas tcnicas
se basan en la abundancia de datos proporcionados por la
terminacin de los proyectos de
secuenciacin del genoma, a menudo se denominan tcnicas de
genmica funcional.
Mtodos de anlisis de la Genmica Funcional o Transcriptmica
Northern Blot
PCR cuantitativa
Hibridacin substractiva
Differential display
Microarrays (Microarreglos de ADN)
SAGE
XX-seq: RNA-Seq, Chl-Seq, CVN-Seq.
Northern Blot
Es una tcnica para
transferir fragmentos de ARN
desnaturalizados provenientes
de un gel a un medio slido. El
ARN es separado en un gel de
agarosa, y posteriormente
transferido a una membrana
de nylon. Despus de la
transferencia, se agrega una
sustancia marcada para
permitir la visualizacin de los
genes.
Figura 34. Tcnica de Northern Blot.
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41
PCR cuantitativa o PCR en tiempo real
Al igual que la PCR convencional, se utiliza un molde de ADN,
cebadores especficos, dNTP
y una ADN polimerasa; a esto se le adiciona una sustancia
marcada con fluorforo.
La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad
de hacer incidir sobre
cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y
de detectar la fluorescencia
emitida por el fluorforo excitado.
Tabla 2. Diferencias entre PCR convencional y PRC en tiempo
real.
PCR en Tiempo Real PCR Sensibilidad Alta Baja Especificidad Alta
Baja Resultados Cuantitativos Si Fluorescentes especficos No
Mtodo de deteccin Fluorescencia Electroforesis en gel de
agarosa Rango de deteccin Amplio rango Pequeo rango Tiempo de
reaccin 1 hs 3-5 hs
Pasos Post-PCR No Electroforesis en gel de
agarosa Contaminacin No Si
Hibridacin Substractiva y Differential Display
Tanto la hibridacin substractiva como el Differential Display
son tcnicas comparativas
que no requieren conocimiento previo de los genes involucrados
pero es necesario el clonado y
secuenciacin para la identificacin de los genes expresados
diferencialmente.
Figura 35. PCR en Tiempo
Real. A diferencia de la
PCR convencional, los
ciclos se observan desde
el inicio.
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42
Microarrays, Microarreglos o microordenaciones de ADN (chips de
ADN)
Se utilizan para examinar la expresin de miles de genes
simultneamente. Los
microarreglos de ADN son simplemente trozos de vidrio (chips)
sobre los que se aplican nuestras de
ADN siguiendo un patrn ordenado, es decir, una ordenacin. A
menudo estas
microordenaciones son producidas por mquinas automticas que
ponen gotas microscpicas
de muestras especficas de ADN en posiciones especficas del chip.
Las muestras de ADN que se
pueden aplicar pueden ser cualquier tipo de ADN clonado, pero a
menudo son oligonucletidos
cortos sintetizados in vitro.
En un microarreglo de ADN se pueden aplicar ms de 30.000
muestras diferentes, lo que
representa miles de genes distintos. Tericamente, todos los
genes del genoma de un organismo
pueden estar presentes en un microarreglo, lo que permite el
anlisis de la expresin gentica de
todo el genoma.
Los microarreglos de ADN se pueden usar para comparar los
patrones de expresin
gentica en dos o ms tejidos diferentes, en un mismo tejido en
dos momentos diferentes del
desarrollo, o en clulas normales respecto de enfermas.
1 2
Figura 36. Expresin diferencial de genes.
1-Hibridacin substractiva.
2. Differential Display. Se expresan y comparan
como porcentaje muestras de mRNA en el rumen (1)
y abomaso (4) a las 3 y 13 semanas de edad y
adultos (18 - a 20 meses de edad) en ganado
Holstein.
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43
Anlisis en Serie de la Expresin Gnica (SAGE)
Permite conocer y cuantificar la expresin de genes en la clula o
tejido mediante la
medicin de los ARNm que estn presentes en un momento
determinado. Esto permite crear
perfiles de expresin de cada clula o tejido en determinadas
situaciones. De esta manera se
pueden comparar estos perfiles y determinar que genes estn
siendo apagados o activados y as
determinar cual puede ser la causa.
La base de esta tcnica esta en el uso de tags de ADNc que son
pequeos fragmentos
de ARNm que han sido transformadas a ADNc. Se parte de una
muestra de ARNm y
Figura 37. Microarrays.
3. Transcribe el ARNm en ADN complementario ms estable y aade
etiquetas fluorescentes verde a ADNc derivado de las clulas no
tratadas, y de color rojo a los clulas tratadas. 4. Se aplica la
etiqueta de ADNc al chip, la unin ocurre cuando se encuentra con
una secuencia complementaria de bases del chip.
5. Se pone el chip en un escner y con clculos computacionales se
estiman las tasas de rojo a verde.
6. Se determina si algn gen respondi fuertemente a la droga para
promover o reflejar los daos.
1. Se construye o compra un microarray o chip, que contiene el
ADN de cadena simple que representa miles de genes diferentes. 2.
Se obtienen dos muestras de clulas, luego de aplicar la droga a una
muestra y se recogen las molculas de ARNm.
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44
aprovechando la caracterstica del ARNm de tener una cola de
adeninas en el extremo 3 (poli
A), se utiliza un soporte con colas de timinas para provocar la
unin de los ARNm al soporte. Estas
timinas cumplen la funcin de primers para poder sintetizar ADNc
a partir del ARNm por medio de
una transcriptasa inversa. Se corta el ADNc a una distancia
determinada a partir del soporte de
timinas por medio de una enzima de restriccin, dejando extremos
adhesivos en el sitio de corte.
En el extremo adhesivo se une una molcula llamada linker que
posee una enzima de
restriccin tipo II que corta nuevamente el ADNc, esta vez
dejando un extremo romo. Aqu se
obtiene por primera vez un tag de ADN (ARNm), unido a las
secuencias que han permitido
hibridaciones. Dos tag para formar un ditag, es decir, dos tags
junto a dos molculas linkers.
Posteriormente se procede a amplificar por PCR para obtener
mayor cantidad de ditags y
favorecer la secuenciacin.
Los ditags se cortan con la primer enzima de restriccin para
eliminar los linkers y dejar a los
ditags puros y con un extremo adhesivo, permitiendo la unin de
estos a una gran hebra de ADNc
(ditags) o concatenado de ADNc. ste concatenado se pasa luego a
un vector de clonamiento
para obtener mltiples copias. Por ltimo se procede a secuenciar
este concatenado de ditags,
identificando cuantos tags hay en total de cada ARNm, y se
procede a identificar qu protena
codifican, mediante el uso de una base de datos.
Figura 38. SAGE. Luego de la obtencin de los ditaq se realiza
clonado, secuenciacin y anlisis
bioinformtico.
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45
Figura 39. Comparacin de las secuencias de los Tag con bases de
datos especficas como SAGE Genie
donde ya se encuentran mapeados los tags con sus respectivos
genes y permite la identificacin y
caracterizacin de los transcriptos
ARN-Seq
Figura 40. ARN-Seq. Secuenciacin de ltima generacin aplicada al
anlisis de transcriptomas.
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46
El ARN-Seq se refiere al uso de la secuenciacin de ltima
generacin aplicada al anlisis
de transcriptomas. Puede realizarse utilizando distintas
plataformas: Ilumina, Roche, Solid.
Independientemente de la plataforma utilizada la informacin
obtenida es la misma. Permite
obtener informacin, por ejemplo, como lo diferentes alelos de un
gen se expresan, detectar
mutaciones post-trascriptacional o identificar las funciones de
genes. ARN-Seq proporciona una
medicin mucho mas precisa de los niveles de transcriptos y sus
isoformas que otros mtodos.
La secuenciacin a gran escala llevada a cabo en los proyectos
genoma constituye la
base de partida de la genmica funcional, que tiene como objetivo
la caracterizacin del
proteoma, esto es el conjunto completo de genes que determinan
protenas en un genoma, y la
caracterizacin de los patrones de expresin gnica. En la
actualidad se dispone de numerosas
estrategias para identificar el conjunto de genes funcionalmente
activos como los microarreglos
de ADN, SAGE y mas recientemente la secuenciacin de alto
rendimiento.
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47
GENMICA COMPARATIVA
La Genmica Comparativa, un nuevo campo de la biologa que se
desarrolla con rapidez,
compara directamente la informacin gentica de un organismo con
la de otro. Es un campo con
muchas aplicaciones tanto en ciencia bsica como aplicada,
incluyendo el descubrimiento de
genes, el desarrollo de organismos modelo para enfermedades
humanas y animales, la
elucidacin de la historia evolutiva entre los genes, genomas y
especies, y la relacin entre los
organismos y su ambiente.
La Genmica Comparativa usa una amplia gama de tcnicas y
recursos, incluyendo la
construccin y utilizacin de bases de datos que contengan
secuencias nucleotdicas y
aminoacdicas, tcnicas citogenticas de cartografa gnica como
hibridacin in situ fluorescente
(FISH), y mtodos experimentales, como mutagnesis. La genmica
comparativa utiliza estos
recursos para identificar las semejanzas y las diferencias
genticas entre organismos, para
determinar como estas diferencias contribuyen a las diferencias
fenotpicas, de ciclo vital, y para
verificar la historia evolutiva de estas diferencias
genticas.
El anlisis de un nmero cada vez mayor de secuencias genmicas
confirma que todos los
seres vivos estn relacionados y descienden de un ancestro en
comn. Todos los organismos
utilizan grupos gnicos parecidos para realizar las funciones
celulares bsicas, como la replicacin
del ADN, la transcripcin y la traduccin. A partir de los
organismos modelo se pueden comparar
estas funciones bsicas para estudiar enfermedades hereditarias y
analizar la interaccin entre los
genes.
Para estudiar las homologas entre genomas de especies diferentes
se usa el pintado
cromosmico comparativo que utiliza sondas marcadas con
fluorescencia de una especie e
hibridando sobre los cromosomas de otra especie.
Figura 41. Los genes ortlogos son aquellos
que descienden de un gen ancestral comn
que tienen la misma funcin en diferentes
especies. Las protenas que surgen a partir de
la duplicacin de un nico gen se
denominan parlogas.
Definir el nmero mnimo de
genes para la vida es una tarea que
implica mtodos comparativos y
experimentales. La aproximacin
comparativa se basa en la premisa que
es probable que los genes compartidos
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48
por organismos alejados sean esenciales para la vida. Comparando
los conjuntos de genes
compartidos por organismos diferentes sera posible catalogar los
compartidos y desarrollar una
lista de genes que se consideraran indispensables para la
vida.
Los genes ortlogos son aquellos que descienden de un gen
ancestral comn que tienen la
misma funcin en diferentes especies. As por ejemplo Mycoplasma
genitalium comparte 240
genes ortlogos con Haemophilus influenzae adems se identificaron
16 genes cuyas secuencias
son diferentes pero realizan la misma funcin. Mycoplasma
genitalium tiene un genoma con 480
genes que codifican protena, lo que representa el genoma
bacteriano mas pequeo de entre los
casi 150 genomas secuenciados hasta la fecha.
Los genes que pertenecen a familias multignicas comparten
secuencias de ADN similares
pero no idnticas como resultado de una mutacin en linaje con un
nico gen ancestral. Sus
productos a menudo son diferentes con funciones parecidas pero
sus genes no siempre se
encuentran en una misma localizacin del cromosoma.
Las familias multignicas permiten aportan conocimientos sobre la
evolucin del genoma.
Las protenas que surgen a partir de la duplicacin de un nico gen
se denominan parlogas. La
familia de la globina es un ejemplo de familia multignica
parloga que surgi por duplicacin y
dispersin a diferentes sitios cromosmicos.
Las familias multignicas estn presentes en muchos genomas. Adems
de las amplias y
grandes mutaciones de los genes pequeos bloques de genes pueden
duplicarse mediante
diversos mecanismos. La filogenia molecular ha trazado el linaje
y las relaciones entre los miembros
de las familias gnicas. Uno de los ejemplos mejor estudiados de
divergencia es la superfamilia
gnica de las globinas. En esta familia hace 800 aos se produjo
la duplicacin de un gen
ancestral que codificaba a una protena de transporte de oxgeno.
De los dos genes generados,
uno evolucion hasta la mioglobina actual y el otro en el gen de
la globina ancestral el que se
duplic y form los prototipos de las subfamilias gnicas de la y
globina. Otros patrones se
observan en otras familias gnicas las que son intensamente
estudiadas en el genoma humano.
Como se observa en la figura 42, en la regin media del cromosoma
6 bovino (BTA6) se
han mapeado diferentes QTL asociados a rasgos fenotpicos como
produccin de leche,
conformacin y rasgos funcionales en animales de tambo y
composicin corporal y crecimiento
en animales de cra. En BTA6, la proporcin de los genes de la
especie bovina que se han
asignado es relativamente pequea y se distribuye de manera
desigual. Estudios comparativos del
mapeo cromosmico de alta resolucin combinados con la informacin
de las secuencias
nucleotdicas pueden ser utilizado para detectar la posicin y
funcin, dentro de regiones del
cromosoma, de genes candidatos polimrficos que afectan variables
fenotpicas de importancia
econmica y fisiolgica en bovinos. La alineacin comparativa de
las secuencias de los
cromosomas ortlogos humanos, de ratn, de gallina y de perro con
la secuencia bovina permiti
enriquecer mapas previos del cromosoma BTA6 determinando loci
nuevos. Utilizando el anlisis de
RH, incluyeron un total de 63 nuevos genes y EST con precisin en
relacin con la posicin de los
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49
loci conocidos, por lo tanto, aumentaron la densidad de los
genes y ESTs integrados en el mapa
de BTA6.
Figura 42. Mapeo comparativo entre cromosomas de pollo, bovino,
humano, ratn y perro.
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50
LA PROTEMICA
Esta rama se ocupa de Identificar y analizar las protenas de una
clula. El Proteoma define
el conjunto completo de protenas codificadas por un genoma.
En la mayora de los genomas secuenciados se desconoce la funcin
de muchos de los
genes recin descubiertos. Muchas veces se le asigna una funcin
por su homologa con genes
conocidos. En E coli y S cerevisiae se desconoce la mayor parte
de la funcin de los genes
codificados al igual que en humanos.
A medida que se dispone de ms datos de las secuencias de los
eucariotas se hace
evidente que su complejidad no esta necesariamente
correlacionada con la cantidad de genes.
Por ejemplo Drosophila tiene menos genes que C. elegans pero no
es menos complejo que el
nemtodo. La relacin entre gen y producto gnico es compleja. Los
genes pueden tener sitios
mltiples de inicio de la transcripcin que produce varios
transcriptos distintos. El corte y empalme
alternativo y la edicin de las molculas generan docenas de
protenas diferentes a partir de un
nico gen. En humanos se estima que el 40 60% producen ms de una
protena por ese motivo.
El anlisis de la funcin proteica se ve dificultado por el hecho
de que muchas protenas trabajan
va interacciones protena protena o como parte integrante de un
gran complejo molecular.
La protemica se utiliza para reconciliar las diferencias entre
el nmero de genes de un
genoma y el nmero de protenas (producto final) observadas en la
clula. Proporciona
informacin sobre la funcin de las protenas, su estructura, las
modificaciones post-
traduccionales, las interacciones protenicas sus variantes y las
relaciones con otras protenas del
genoma.
La protemica utiliza tcnicas para separar e identificar las
protenas aisladas. La
combinacin de tcnicas implica un gel de electroforesis
bidimensional (2DGE) y espectrometra
de masas. En la primera las protenas extradas de una clula se
cargan en un gel de
poliacrilamida y se separa segn su carga elctrica. El gel se
rota 90 y las protenas se separan
segn su peso molecular. Las modernas tcnicas de espectrometra de
masas permiten
determinar con precisin la masa de molculas. Uno de estos mtodos
se denomina ionizacin
por lser asistida por matriz (MALDI). Se pueden identificar
cientos de protenas por da y los
bancos de espectrmetros pueden procesar cientos de muestras en
un solo da. Nuevos
instrumentos se estn desarrollando para el procesado de muestras
con ms rapidez, sensibilidad
y precisin.
