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INSTITUTO AGRONÔMICO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA TROPICAL E SUBTROPICAL
CONSERVAÇÃO DE PÓLEN DE ANONAS COMERCIAIS
JOSÉ EMILIO BETTIOL NETO
Orientadora: Profª Dra. Cecília Alzira Ferreira Pinto-Maglio
Dissertação submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Agricultura Tropical e Subtropical Área de Concentração em Genética, Melhoramento Vegetal e Biotecnologia
Campinas, SP Abril 2008
Ficha elaborada pela bibliotecária do Núcleo de Informação e Documentação do Instituto Agronômico B536c Bettiol Neto, José Emílio Conservação de pólen de anonas comerciais. / José Emílio Bettiol Neto. Campinas, 2008. 78 f. Orientadora: Cecília Alzira Ferreira Pinto-Maglio Dissertação (Mestrado) Concentração em Genética, Melhoramento Vegetal e Biotecnologia - Instituto Agronômico 1. Viabilidade de pólen 2. Criopreservação 3. Coloração com Alexander, 4. Germinação de pólen in vitro. I. Pinto-Maglio, Cecília Alzira Ferreira. II. Título
CDD. 616.9
iii
Aos meus pais Natividade e Luiz (in memoriam). Aos meus irmãos Cristina, Maria Luíza e Luiz, DEDICO
À minha esposa Rosilda, cujo amor e compreensão foram essenciais. Às minhas filhas Isabela e Luíza, pelos olhares reconfortantes e beijos e abraços revigorantes.
OFEREÇO
iv
AGRADECIMENTOS
− À pesquisadora Profª Dra. Cecília Alzira Ferreira Pinto-Maglio, pela paciência e
orientação durante essa etapa da minha vida.
− Ao Centro de Pesquisa & Desenvolvimento de Recursos Genéticos Vegetais do
IAC (Laboratório de Citogenética), pela estrutura disponibilizada.
− Ao Instituto Agronômico, por investir na minha capacitação.
− À Pré-Banca (Prof. Dr. Ricardo Augusto Lombello), pelas oportunas sugestões
no trabalho.
− Aos membros da banca examinadora, Profª Dra. Cecília Alzira Ferreira Pinto-
Maglio, Prof. Dr. Celso Valdevino Pommer e Prof. Dr. Ricardo Augusto
Lombello, pelas valiosas sugestões na tese.
− Ao pesquisador Dr. Ivan José Antunes Ribeiro, pela oportunidade de estágio no
atual Centro Apta de Frutas.
− Aos pesquisadores Dr. Mauro Hideo Sugimori, Dr. Nilberto Bernardo Soares,
Dr. Fernando Antonio Campo Dall´Orto, Dr. Mário Ojima, Dra. Maria Lúcia
Maia, Dr. Mário José Pedro Júnior, pelo incentivo ao ingresso à carreira
científica.
− Aos Engenheiros Agrônomos Clóvis de Toledo Piza Júnior e Ryosuke Kavati,
pela amizade e partilha de conhecimentos.
− Ao Engenheiro Agrônomo Takanoli Tokunaga, por apresentar-me essa
fascinante família botânica.
− Ao pesquisador Dr. Luiz Antonio Junqueira Teixeira, pela amizade e valiosa
contribuição durante a análise estatística dos dados desse trabalho.
− Aos fruticultores Minoru Yassuda, Emília Yassuda, Francisco Rubiño Gomes e
Antonio Rubiño Pontes, pela cessão dos pomares e imprescindível apoio
prestado durante a realização das etapas de campo dos experimentos, sem o qual
seria inexeqüível a proposta do estudo.
v
− Aos parceiros e amigos (Edvan, Marco, Mara, Graciela, Lizz, Rafael, Liamar e
Tânia), pelo estímulo e amparo para prosseguir.
− Aos funcionários do Centro Apta de Frutas que, direta ou indiretamente,
contribuíram para a realização desse estudo.
− A todos meus mestres, sem distinção, que contribuíram para minha formação
profissional e intelectual, impossível enumerá-los, muitíssimo obrigado.
vi
SUMÁRIO
ÍNDICE DE TABELAS ...................................................................................... vii
ÍNDICE DE FIGURAS ...................................................................................... ix
RESUMO ............................................................................................................ xii
ABSTRACT ........................................................................................................ xiii
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 01
2 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................ 03
2.1 Aspectos Econômicos .................................................................................... 03
2.2 Aspectos Botânicos ....................................................................................... 04
2.3 Aspectos Citogenéticos ................................................................................. 07
2.4 Polinização e conservação de pólen .............................................................. 09
3 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................. 14
3.1 Material ......................................................................................................... 14
3.1.1 Plantas ........................................................................................................ 14
3.1.2 Caracterização das áreas experimentais e locais de coleta ......................... 14
3.2 Métodos ......................................................................................................... 15
3.2.1 Microsporogênese - coleta e conservação de botões florais ....................... 15
3.2.2 Microsporogênese - preparações citológicas .............................................. 16
3.2.3 Conservação de pólen - coleta de flores e separação do pólen .................. 16
3.2.4 Conservação de pólen - procedimentos e meios ........................................ 17
3.2.5 Conservação de pólen - teste de colorimetria ............................................. 18
3.2.6 Conservação de pólen - teste de germinação in vitro ................................. 18
3.2.7 Conservação de pólen - testes de polinização ............................................ 19
3.2.8 Análise estatística e delineamento experimental ........................................ 20
4 RESULTADOS ................................................................................................ 22
5 DISCUSSÃO .................................................................................................... 57
6 CONCLUSÕES ................................................................................................ 64
7 REFERÊNCIAS ............................................................................................... 65
8 ANEXOS .......................................................................................................... 71
vii
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1 - Freqüência (%) observada de células com anormalidades meióticas 22 Tabela 2 - Porcentagens médias dos arranjos em amostras de pólen fresco
(PF) e amanhecido (PA) de atemóia coletadas em dois períodos, seco e úmido ...................................................................................... 26
Tabela 3 - Porcentagens médias de grãos de pólen (PF e PA) de atemóia
viáveis (coloridos pelo corante Alexander) em amostras coletadas em dois períodos, seco e úmido ........................................................ 27
Tabela 4 - Porcentagens médias de grãos de pólen de atemóia viáveis
(coloridos pelo corante Alexander), em amostras submetidas a diferentes tratamentos e coletadas em dois períodos ........................ 28
Tabela 5 - Porcentagens médias dos arranjos em amostras de pólen fresco
(PF) e amanhecido (PA) de cherimóia, coletadas em dois períodos, seco e úmido ..................................................................................... 30
Tabela 6 - Porcentagens médias de grãos de pólen (PF e PA) de cherimóia
viáveis (coloridos pelo corante Alexander) em amostras coletadas em dois períodos, seco e úmido ........................................................ 31
Tabela 7 - Porcentagens médias de grão de pólen de cherimóia viáveis
(coloridos pelo corante Alexander), submetidos a diferentes tratamentos e coletados em dois períodos, seco e úmido .................. 31
Tabela 8 - Porcentagens médias dos arranjos em amostras de pólen fresco
(PF) e de pólen amanhecido (PA) de pinha, coletadas em dois períodos ............................................................................................. 33
Tabela 9 - Porcentagens médias de grãos de pólen (PF e PA) de pinha viáveis
(coloridos pelo corante Alexander) em amostras coletadas em dois períodos, seco e úmido ...................................................................... 33
Tabela 10 - Porcentagens médias de grãos de pólen de pinha viáveis (coloridos
pelo corante Alexander), em amostras submetidas a diferentes tratamentos e coletadas em dois períodos, seco e úmido .................. 34
Tabela 11 - Porcentagens médias de germinação in vitro, A- sobre dois meios
de cultura (A e BK), de amostras de grãos de pólen de atemóia B- fresco e amanhecido, coletadas em dois períodos (seco e úmido) 37
Tabela 12 - Porcentagens médias da germinação de grãos de pólen de atemóia
submetidos a diferentes tratamentos de conservação e coletados dois períodos, seco e úmido .............................................................. 37
viii
Tabela 13 - Porcentagens médias de germinação in vitro, A- sobre dois meios de cultura (A e BK), de amostras de grãos de pólen de cherimóia B- fresco e amanhecido, coletadas em dois períodos (seco e úmido) 40
Tabela 14 - Porcentagens médias da germinação de grãos de pólen de
cherimóia submetidos a diferentes tratamentos de conservação e coletados dois períodos, seco e úmido .............................................. 42
Tabela 15 - Porcentagens médias de germinação in vitro, A- sobre dois meios
de cultura (A e BK), de amostras de grãos de pólen de pinha B- fresco e amanhecido, coletadas em dois períodos (seco e úmido) 45
Tabela 16 - Porcentagens médias da germinação de grãos de pólen de pinha
submetidos a diferentes tratamentos de conservação e coletados dois períodos, seco e úmido .............................................................. 46
Tabela 17 - Resultados médios da porcentagem fixação de frutos em flores
polinizadas com grãos de pólen (PF e PA) de atemóia ..................... 48 Tabela 18 - Resultados médios da porcentagem fixação de frutos em flores
polinizadas com grãos de pólen de atemóia, em função dos tratamentos ........................................................................................ 49
Tabela 19 - Resultados médios da porcentagem fixação de frutos em flores
polinizadas com grãos de pólen (PF e PA) de cherimóia .................. 51 Tabela 20 - Resultados médios da porcentagem de fixação de frutos em flores
polinizadas com grãos de pólen de cherimóia, em função dos tratamentos ........................................................................................ 52
Tabela 21 - Resultados médios da porcentagem de fixação de frutos em flores
polinizadas com grãos de pólen (PF e PA) de pinha ......................... 54 Tabela 22 - Resultados médios da porcentagem de fixação de frutos em
polinizações com amostras de grãos de pólen de pinha, em função dos tratamentos .................................................................................. 54
ix
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 - Frutos de cherimóia cv Madeira (A), pinha (B) e atemóia cv Gefner (C) ..................................................................................................... 14
Figura 2 - Annona cherimola Mill. (cherimóia). Botões florais - série de
tamanhos gradativos para estudo da microsporogênese (ref. placa de Petri com 14 cm de diâmetro) ..................................................... 15
Figura 3 - Flores de atemóia: A) fechada; B) pré-fêmea; C) fêmea e D) macho 16
Figura 4 - Annona cherimola Mill. (cherimóia) - microsporogênese. A –
célula mãe de pólen na fase de anáfase I com um cromossomo retardatário (flecha); B – metáfase I sem anomalias; C – telófase I; D telófase II (flechas) e meta/anáfase II (cabeça de flecha); E - tétrade de micrósporos recém formados; F - células somáticas do tecido do tapete da antera com 2n=14 cromossomos ........................ 23
Figura 5 - Annona squamosa L. (pinha) – microsporogênese. A-B – células
mães de pólen na fase de diacinese com n=7 pares de bivalentes, célula A com vários nucléolos; C - metáfase I – polivalentes (flechas); D–E – células em metáfases I com segregação precoce de bivalentes (flechas); F – tétrade de micrósporos recém formados 24
Figura 6 - Tétrades de atemóia cv Gefner. A-B – resultado do teste de
germinação em meio de cultura A; C-D – grãos de pólen (isolado e em tétrade) com tubo polínico. E–H tipos de arranjos; E – tétrade completa com todos os micrósporos viáveis; F- tríade; G- díade; H – tétrade vazia com todos os micrósporos inviáveis ......................... 25
Figura 7 - Porcentagens médias de grãos de pólen de atemóia viáveis
(coloridos pelo corante Alexander) em função do tempo de conservação e período de coleta (Período 1= seco, Período 2 = úmido) ............................................................................................... 28
Figura 8 - Porcentagens médias de grãos de pólen de atemóia viáveis
(coloridos pelo corante Alexander) em função do tempo de conservação e tratamentos ................................................................. 29
Figura 9 - Tétrades de pólen fresco/padrão (PF) de Annona cherimola Mill.
(cherimóia) após teste de colorimetria com corante Alexander. A – tétrades completas coloridas-viáveis e alguns conjuntos vazios-inviáveis (flecha). B – tétrades coloridas e vários conjuntos agrupados vazios inviáveis (flecha). C – detalhes de tétrades coloridas ............................................................................................
30
x
Figura 10 - Porcentagens médias de grãos de pólen de cherimóia viáveis (coloridos pelo corante Alexander) em função do tempo de conservação e período de coleta (Período 1= seco, Período 2 = úmido) ............................................................................................... 32
Figura 11 - Porcentagens médias de grãos de pólen de cherimóia viáveis
(coloridos pelo corante Alexander) em função do tempo de conservação e tratamentos ................................................................. 32
Figura 12 - Porcentagens médias de grãos de pólen de pinha viáveis (coloridos
pelo corante Alexander) em função do tempo de conservação e período de coleta (Período 1= seco, Período 2 = úmido) .................. 35
Figura 13 - Porcentagens médias de grãos de pólen de pinha viáveis (coloridos
pelo corante Alexander) em função do tempo de conservação e tratamentos ........................................................................................ 36
Figura 14 - Germinação in vitro de amostras de pólen de atemóia, em função
do tempo de conservação e do período de coleta (Período 1= seco, Período 2 = úmido) ........................................................................... 38
Figura 15 - Annona cherimola Mill. (cherimóia). Teste de germinação de pólen
fresco (PF) em meio de cultura A. A- tétrades com tubos polínicos após 1 hora da inoculação; B-C – tétrades com tubos polínicos após 3 horas da inoculação; D – tétrades de PF em meio de cultura BK após 1 h de inoculação; E-F– Núcleos resultantes da gametogênese na extremidade do tubo polínico germinado (flechas) ............................................................................................. 39
Figura 16 - Annona cherimola Mill. (cherimóia). Teste de germinação de
pólen amanhecido (PA) em meio de cultura A. A- tétrades com tubos polínicos após 1 hora de inoculação; B–C - tétrades com início de emissão de tubos polínicos após período de 3 e 6 horas da inoculação respectivamente; D – tétrades com tubos polínicos após 12 horas da inoculação ..................................................................... 41
Figura 17 - Annona cherimola Mill. (cherimóia). Teste de germinação de pólen
amanhecido (PA) em meio de cultura BK. A - tétrades após 1 horas de inoculação; B-D - tétrades com tubos polínicos após período de 3 horas, 6 horas e 12 horas da inoculação respectivamente .............. 42
Figura 18 - Germinação in vitro de amostras de pólen de cherimóia, em função
do tempo de conservação e do período de coleta (Período 1= seco, Período 2 = úmido) ........................................................................... 43
Figura 19 - Germinação in vitro de amostras de pólen de cherimóia em função
do tempo de conservação e dos tratamentos .....................................
44
xi
Figura 20 - Annona squamosa L. (pinha). A-D – teste de germinação em meio de cultura A - grãos de pólen amanhecido (PA) isolados e em tétrade em início de germinação ....................................................... 45
Figura 21 - Germinação in vitro de amostras de pólen de pinha, em função do
tempo de conservação e do período de coleta (Período 1= seco, Período 2 = úmido) ........................................................................... 47
Figura 22 - Germinação in vitro de amostras de pólen de pinha em função do
tempo de conservação e dos tratamentos ..........................................
47
Figura 23 - Fixação de frutos em flores polinizadas com amostras de grãos de pólen de atemóia, em função do tempo de conservação e do período de coleta (Período 1= seco, Período 2 = úmido) ..................
50
Figura 24 - Fixação de frutos em flores polinizadas com amostras de grãos de pólen de atemóia, em função do tempo de conservação e dos tratamentos ........................................................................................
50
Figura 25 - Fixação de frutos em flores polinizadas com amostras de grãos de pólen de cherimóia, em função do tempo de conservação e do período de coleta (Período 1= seco, Período 2 = úmido) ..................
52
Figura 26 - Fixação de frutos em flores polinizadas com amostras de grãos de pólen de cherimóia, em função do tempo de conservação e dos tratamentos ........................................................................................
53
Figura 27 - Fixação de frutos em flores polinizadas com amostras de grãos de pólen de pinha, em função do tempo de conservação e do período de coleta (Período 1= seco, Período 2 = úmido) ...............................
55
Figura 28 - Fixação de frutos em flores polinizadas com amostras de grãos de pólen de pinha, em função do tempo de conservação e dos tratamentos ........................................................................................
56
xii
BETTIOL NETO, José Emílio. Conservação de pólen de anonas comerciais. 2008. 78f. Dissertação (Mestrado em Genética, Melhoramento Vegetal e Biotecnologia) – Pós-Graduação – IAC.
RESUMO
Polinizações manuais são necessárias na ausência de agentes polinizadores naturais ou para aumentar a eficiência de cruzamentos. Estudos mostram que o pólen de anonas comerciais, cherimóia (Annona cherimola Mill.), pinha ou ata (Annona squamosa L.) e de seu híbrido atemóia (Annona cherimola X Annona squamosa) têm período de viabilidade reduzido. Este fato, aliado à ocorrência de dicogamia protogínica nessas plantas, demanda metodologias de conservação que promovam maior longevidade ao pólen. Neste trabalho objetivou-se a aplicação de técnicas de conservação de pólen de cherimóia, pinha e atemóia. O pólen destinado à conservação foi coletado de flores em estágio macho - pólen maduro. Os testes de conservação foram realizados em nitrogênio líquido (–196˚C) e em geladeira (4-5˚C). Utilizaram-se para conservação, amostras de pólen submetidas à dessecação e não dessecadas. As amostras foram coletadas em dois períodos do ano: seco e úmido. O pólen recém coletado e não submetido à conservação, denominado pólen fresco (PF), foi usado como padrão. O pólen amanhecido (PA), coletado e utilizado após 12 horas da coleta, é o tipo de pólen habitualmente empregado pelos produtores. Amostras de pólen submetidas à conservação tiveram a viabilidade avaliada após 1, 3, 6, 15 e 30 dias de conservação através de testes de colorimetria, germinação in vitro e polinização a campo. Nos testes de colorimetria usou-se o corante Alexander, que distingue grãos viáveis de inviáveis. Para os testes de germinação utilizaram-se dois meios de cultura, o meio A e o meio BK, ambos com mesma composição, com exceção do tipo de agar. Na germinação a viabilidade foi avaliada pela capacidade dos grãos de pólen emitir tubo polínico. Os testes de polinização a campo foram efetuados mediante a proteção prévia das flores antes da fase feminina - antese floral. O estudo parcial da microsporogênese foi efetuado previamente aos testes de conservação com o intuito de se estabelecer o grau de normalidade do processo meiótico e a qualidade do pólen formado nas três anonas. Foram registrados os tipos de arranjos dos grãos de pólen formados na microsporogênese. A maioria dos arranjos foi do tipo tétrade. A maior porcentagem de anomalias meióticas foi registrada no híbrido atemóia. O PF coletado em período úmido apresentou maior viabilidade em relação ao do período seco. Nos testes de colorimetria, o pólen de cherimóia, não dessecado e conservado em nitrogênio, apresentou maior porcentagem de grãos viáveis. O pólen de atemóia e pinha, dessecado e conservado em nitrogênio, mostrou maior porcentagem de grãos viáveis em relação ao mesmo tipo de pólen conservado em geladeira. Nos testes de germinação in vitro, para as três anonas, registrou-se a emissão de tubos polínicos para as amostras de PF e PA nas primeiras 12 horas após a semeadura e nas demais amostras a emissão decaiu com o tempo de conservação. Nos testes de polinização obteve-se frutificações para as polinizações efetuadas com PF e PA coletados em período úmido e seco, nas três anonas. Não ocorreram frutificações para polinizações com qualquer uma das amostras de pólen conservado além de 3 dias, tanto em nitrogênio como em geladeira. Palavras chave: Criopreservação, coloração com Alexander, germinação de pólen in vitro, viabilidade de pólen.
xiii
BETTIOL NETO, José Emílio. Conservation of pollen from commercial annonas. 2008. 78f. Dissertação (Mestrado em Genética, Melhoramento Vegetal e Biotecnologia) – Pós-Graduação – IAC.
ABSTRACT Hand pollinations are necessary in the absence of natural specific pollinators agents or to increase the efficiency of breeding. Studies have shown that pollen of cherimoya (Annona cherimola Mill.), curstad apple (Annona squamosa L.) and their hybrid atemoya (Annona cherimola X Annona squamosa) have a short viability time. This fact added to the occurrence of protogynous dichogamy in these plants demands for methodologies for pollen conservation that increases the pollen longevity and viability. The objective of this study was to apply pollen storage procedures to cherimoya, curstad apple and atemoya. The pollen for storage was collected from flowers in male stage – mature pollen. The conservation assays were done in liquid nitrogen (–196˚C) and refrigerator (4-5˚C). Some pollen samples were submitted to desiccation and others were not desiccated. Pollen samples were collected in dry and humid periods of the year. The freshly collected pollen that was not submitted to desiccation was denominated fresh pollen (PF) and was used as control. The freshly collected pollen that was used in the assays only 12 hours after collecting was denominated dawned pollen (PA) and it is the kind of pollen used by anona producers. Samples of pollen under conservation had their viability assessment done after 1, 3, 6, 15 and 30 days of conservation by specific staining, in vitro germination and hand pollination assays. The staining assays were done with Alexander’s differential stain that differentiates viable and inviable pollen grains. In the in vitro germination assays were used two culture mediums the A and BK, both with the same composition except for the type of agar. The pollinations trials were made with previous protection of the female flowers – floral overture. Partial studies on microsporogenesis were carried out before the conservation assays to establish the normality of meiotic process and the quality of the formed pollen in the three anonas. The types of final celular arrangements formed on microsporogenesis were registered and the majority of them were tetrads. The main percentage rate of meiotic anomalies was observed in the hybrid atemoya. The fresh pollen collected in humid and dry period presented greater viability then the fresh pollen collected in dry one. By the staining tests the pollen not desiccated of cherimoya that was conserved in nitrogen showed major percentage of viable grains. The atemoya and curstad apple pollen that were desiccated and conserved in nitrogen showed more viable grains then this same pollen conserved in refrigerator. In the in vitro germination tests the emitted pollen tubes were observed for samples of PF and PA in the first 12 hours. After this time the rate of emitted tubes decreased as time of conservation raised. The pollinations made with PF and PA pollen samples that were collected in the humid and dry period resulted in fruit settings for three anonas. There was no fruiting for pollinations with any other pollen sample that was conserved in nitrogen or refrigerator for more than three days longer. Key words: Cryopreservation, Alexander staining, in vitro pollen germination, pollen viability.
1
1 INTRODUÇÃO
O Brasil é um dos maiores produtores mundiais de frutas. Devido à sua extensão
e distribuição territorial ao longo do continente, o país possui uma grande diversidade
edafoclimática o que possibilita o cultivo de vasta e diversificada gama de espécies
frutíferas.
Com o crescente intercâmbio comercial brasileiro com outros países produtores
de frutas e a diversificação dos pomares nacionais, o consumidor brasileiro tem à sua
disposição inúmeras alternativas de produtos e sabores oriundos das frutíferas. Dentre
as novas opções de frutas presentes nas gôndolas dos supermercados brasileiros,
algumas espécies de anonáceas tais como a cherimóia (Annona cherimola Mill.), a
pinha, ata ou fruta-do-conde (Annona squamosa L.), a graviola (Annona muricata L.), a
atemóia (híbrido interespecífico entre a A. cherimola e a A. squamosa) e a condessa
(Annona reticulata L.) estão ganhando cada vez mais espaço, o que vem demandando
áreas crescentes de cultivo, contribuindo não só para o aumento da renda dos
produtores, mas também firmando as culturas dessas fruteiras como alternativa bastante
viável ao produtor.
As anonáceas mencionadas são consumidas principalmente in natura ou são
utilizadas na culinária para produção de geléias, sucos, sorvetes, glacês, musses, bolos,
drinques, entre outros. Além destas, também há outras que possuem enorme potencial
de uso pelas indústrias de cosméticos, farmacêuticas e químicas. Contêm substâncias
naturais bioativas com potencial de utilização na indústria química e farmacológica.
Apesar do crescente interesse dos agentes do agronegócio de frutas, dos esforços
em pesquisa por parte de alguns órgãos públicos e organização de entidades
associativas, as anonas pertencem a um grupo de frutas que ainda enfrenta inúmeros
gargalos para que se torne uma importante fonte de divisas para o país.
Especificamente para o Estado de São Paulo, onde a cultura atinge perto de
1.500 hectares plantados, tem-se a necessidade de cultivares que sejam mais adequados
para suportar as pressões impostas pelo ambiente. Dentre estas estão a resistência à
antracnose e adaptação a diferentes condições edafoclimáticas. Para muitos desses
casos a solução é a criação de novos híbridos e de novas cultivares que apresentem
características favoráveis aos diferentes aspectos acima mencionados. Para a criação de
híbridos e determinação da compatibilidade visando o aumento na produção de frutos
2
em anonas, é utilizada primariamente a polinização cruzada. No entanto, verifica-se em
diversos trabalhos que cruzamentos interespecíficos em geral têm tido pouco sucesso.
Em parte, estes problemas podem ser atribuídos ao pouco conhecimento disponíveis
sobre vários aspectos ligados a biologia da reprodução, que incluem estudos sobre a
microsporogênese, processo que resulta na produção de pólen, desenvolvimento de
gametófitos, até alguns aspectos da fecundação, como também as relações genéticas
interespecíficas entre as anonas comerciais, fator este que torna seu cultivo e
principalmente seu melhoramento, um desafio para os fruticultores e para os
pesquisadores, respectivamente.
Para aumento efetivo da frutificação e conseqüentemente da produção de frutos,
há a necessidade de tornar a polinização artificial em plantações comerciais uma
metodologia acessível e mais eficiente do que a natural. Assim, estudos sobre técnicas e
condições de armazenamento que levem ao estabelecimento de metodologia de
conservação, que prolongue o tempo de viabilidade do pólen de atemóia, cherimóia e
pinha, seja ele, no mínimo, de 24 horas, viria facilitar e otimizar o trabalho de
polinização dentro dos campos de produção comercial destes frutos, implicaria em
economia para os produtores e também facilitaria a realização de cruzamentos visando o
melhoramento genético, o que permitiria a obtenção de novas cultivares e/ou híbridos
entre espécies que florescem em diferentes meses do ano.
Neste sentido, objetivou-se no presente trabalho estudar técnicas de conservação
de grãos de pólen de anonas comerciais, a saber, cherimóia (Annona cherimola Mill.),
pinha ou ata (Annona squamosa L.) e seu híbrido atemóia (A. cherimola x A.
squamosa).
3
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Aspectos Econômicos
O comércio internacional de frutas (frescas e processadas) está entre os de maior
dinamismo e perspectiva futura, com boas possibilidades dos agricultores familiares se
integrarem aos mercados de frutas frescas, polpa e sucos. O consumo de frutas tropicais
nos estratos superiores de renda chega a ser quase o dobro daquele observado nos
estratos inferiores, o que permite concluir que existe grande potencial de crescimento do
mercado doméstico de frutas, principalmente em conjunturas econômicas mais
favoráveis em termos de trabalho e renda (MALUF, 2000).
Segundo o MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, 2008),
o Brasil é o terceiro maior produtor mundial de frutas, com produção superando 38
milhões de toneladas anuais, cultivadas em 3,4 milhões de hectares.
Em 2007, as exportações brasileiras de frutas frescas atingiram cerca de 920 mil
toneladas, com valor de US$ 643 milhões (preço FOB), aproximadamente. Os maiores
volumes exportados foram de melões, bananas, mangas, maçãs e uvas. No mesmo ano,
foram importadas 280 mil toneladas de frutas frescas, principalmente pêras com
aproximadamente 49% do volume total importado (IBRAF – Instituto Brasileiro de
Frutas, 2008).
As espécies anonáceas de maior importância cultivadas nas regiões tropicais são
a pinha ou ata (Annona squamosa L.) e a graviola (Annona muricata L.), seguidas pela
cherimóia (Annona cherimola Mill.) e a atemóia (híbrido entre pinha e cherimóia),
sendo as de menor expressão a condessa (Annona reticulata L.) e o beribá (Rollinia
mucosa Baill.) (SÃO JOSÉ et al., 1997).
As anonáceas acima mencionadas são consumidas principalmente in natura ou
utilizadas na culinária para produção de geléias, sucos, sorvetes, glacês, musses, bolos,
drinques, entre outros. Além destas, também há outras que possuem enorme potencial
de uso pelas indústrias de cosméticos, farmacêuticas e químicas. Contêm substâncias
naturais bioativas com potencial de utilização na indústria química e farmacológica,
conhecidas como "acetogeninas de anonáceas" que apresentam uma gama de
importantes atividades biológicas tais como: citotóxica, antitumoral, pesticida,
vermicida, abortiva, antimicrobiana, imunossupressora, antiemética, inibidora do apetite
e antimalárica (NASCIMENTO et al., 2003).
4
No Brasil, a regionalização dos pomares de anonáceas, além da adaptabilidade
climática das espécies, envolve os hábitos alimentares regionais. Sendo assim, a pinha e
a graviola possuem destaque na região Norte e Nordeste. O Sudeste brasileiro, além da
pinha, apresenta melhores condições para o desenvolvimento de atemóias e cherimóias
(NOGUEIRA et al., 2005).
Apesar da deficiência de dados estatísticos quanto às áreas cultivadas com
espécies frutíferas, estima-se que no Estado de São Paulo, as anonáceas ocupem o
equivalente a 1.400 hectares, distribuídos pelos diversos microclimas, em função das
diferentes exigências edafoclimáticas das diferentes espécies (KAVATI, 2004),
absorvendo a mão-de-obra de 1,5 a 2,0 pessoas por hectare durante todo o ano (SÃO
JOSÉ et al., 2004).
Enfatizando a importância de apenas uma única espécie de anonácea, nos
últimos dez anos na Espanha, maior produtor mundial de cherimóias, obteve-se
aumento na produção, passando de 200 a 300 toneladas/ano para 4.000 toneladas/ano de
frutos destinados principalmente para exportação (GUIRADO et al., 2004). Esse dado
sobre o aumento de produção é relevante, quando comparativamente observa-se a
potencialidade existente para o território brasileiro, tanto em tonelagem quanto em
espécies dessa família botânica.
2.2 Aspectos Botânicos
Segundo MANICA (2003), as anonáceas pertencem ao sub-reino Embriophyta,
divisão Spermatophyta, subdivisão Angiospermae, classe Dicotyledoneae, ordem
Ranales, subordem Magnoliales, família Annonaceae, subfamília Annonoideae e gênero
Annona.
A família Annonaceae compreende, segundo JESSUP (1988), aproximadamente
132 gêneros e mais de 2.300 espécies. Dentre elas, aproximadamente 50 espécies
possuem frutos comestíveis (GARDIAZABAL & ROSEMBERG, 1993) e estão
distribuídas, basicamente, entre os gêneros Annona L., Rollinia A.St.-Hil., Uvaria L. e
Asimina Adans, sendo os dois primeiros os de maior expressão comercial (ZAYAS,
1966).
A maioria das espécies de anonáceas é de origem tropical e somente um gênero
(Asimina) de regiões temperadas. As espécies domesticadas são originárias das
5
Américas e, provavelmente, apenas uma espécie africana (Annona senegalensis) esteja
passando por um processo de domesticação (PINTO et al., 2005).
Estudo de ERKENS (2005), desenvolvido com 47 taxa do gênero Guatteria,
através de seqüências de DNA, indicaram que esse gênero é muito bem estruturado em
um grupo filogênico e que sua origem centro-americana pode ser mais provável que a
sul americana.
Segundo DONADIO et al. (1998; 2004), as anonáceas, em geral, são plantas
com porte médio e porte grande, nativas das Américas, sendo que algumas espécies
ocorrem espontaneamente em território nacional.
A pinha (Annona squamosa L.), originária da América Central, provavelmente
da região das Antilhas, encontra-se distribuída em diversas regiões tropicais e
subtropicais do mundo. No Brasil, foi introduzida no Estado da Bahia, e vem se
destacando como cultura de importância em vários estados da região do Nordeste, entre
eles Alagoas, Bahia, Ceará, Paraíba e Pernambuco e, no Sudeste, em São Paulo
(DONADIO, 1997; ARAÚJO et al., 1999).
Annona squamosa L. tem porte arbóreo, com 4 a 6 metros de altura, bastante
engalhada, com folhas caducas e de coloração verde clara brilhante na face superior e
verde azulado na inferior, de forma elíptica-oblonga medindo de 5 a 17 cm de
comprimento por 2 a 7 cm de largura e com pecíolos de 0,7 a 1,5 cm de comprimento
(OCHSE et al., 1974; PINTO et al., 2005).
Segundo MANICA (2003), o florescimento ocorre nas brotações novas e é
concentrado no mês de outubro, mas é comum encontrar flores durante o ano inteiro. As
flores de Annona squamosa são hermafroditas, axilares, com cálice e corola carnosos,
formando uma câmara floral que funciona como abrigo, fonte alimentar e/ou local de
acasalamento para os visitantes florais. As flores apresentam características da síndrome
de cantarofilia, tais como pétalas carnosas, de coloração clara e emissão de odores fortes
e desagradáveis. A antese é crepuscular, iniciando por volta das 17 horas e a duração
das flores é de aproximadamente dois dias. As flores apresentam-se na fase feminina
nas primeiras 20 horas e na fase masculina nas 20 horas seguintes, caracterizando a
dicogamia protogínica. Carpophilus hemipterus, Carpophilus sp e Haptoncus
ochraceus (Nitidulidae) são os principais visitantes, sendo considerados como agentes
polinizadores desta anonácea. A espécie é autocompatível, contudo, os testes de
germinação indicam que as sementes obtidas por polinização cruzada apresentam maior
viabilidade do que as resultantes de geitonogamia (KILL & COSTA, 2003).
6
O fruto é um sincarpo arredondado, oval ou cônico, constituindo massa sólida e
de cor verde-escura. Apresenta de 5 a 10 cm de diâmetro e de 6 a 10 cm de
comprimento, pesando entre 120 a 330 gramas. Em seu interior existem sementes pretas
em número de 35 a 60, com 1,5 a 2,0 cm de comprimento por 0,6 a 0,8 cm de diâmetro
(DONADIO et al., 1998; PINTO et al., 2005). A maturação dos frutos concentra-se nos
meses de fevereiro a março (MANICA, 2003)
A cherimóia (Annona cherimola Mill.) é originária dos vales interandinos do
Equador e do Peru, em áreas com 1500 a 2200 metros de altitude. De crescimento lento,
pode atingir 7 a 8 metros de altura. O tronco cilíndrico de casca grossa possui um
sistema radicular pouco profundo e muito ramificado. É planta considerada
semidecídua, visto que nunca fica sem folhas porque a queda das folhas do ano anterior
se dá ao mesmo tempo em que surgem novas brotações e florações. As folhas são
simples, alternadas e com formas ovaladas ou ovaladas-lanceoladas. As gemas são
compostas e podem originar brotações mistas (vegetativas e floríferas). As flores são
hermafroditas, pouco chamativas, muito aromáticas, solitárias ou em grupo de duas ou
três, sobre um pedúnculo curto e inclinado, inserido nas axilas das folhas. O cálice é
constituído de três sépalas de cor verde escuro e de forma triangular. A corola é formada
por seis pétalas, disposta em dois vértices; as três pétalas exteriores são carnosas e bem
desenvolvidas, medindo de 2,5 a 4 cm; as três pétalas internas são rudimentares, em
forma de escamas, ovaladas ou triangulares. A parte masculina da flor possui
numerosos estames (150-200), dispostos helicoidalmente e muito juntos sobre um
receptáculo, formando massa compacta e branca. A parte feminina possui grande
número de carpelos (100-200), com apenas um óvulo, dispostos em espiral, formando
um cone compacto em cujos extremos encontram-se os estilos e estigmas (GARCIA et
al., 2006). Em função de podas, variedades e condições climáticas, a floração pode
ocorrer de setembro a fevereiro, todavia, verifica-se a presença de flores esporádicas em
outros meses do ano (BONAVENTURE, 1999).
O fruto é composto, do tipo sincarpo, de pele fina e delicada, apresentando
marcas em forma de “U” que correspondem à zona de união dos carpelos, podendo ser
lisa ou com pequenas protuberâncias. O peso do fruto varia entre 200 e 800 gramas, de
cor verde claro ao verde escuro. A polpa, de sabor sub-ácido e delicado, é branca,
cremosa e moderadamente sucosa, com sementes de coloração entre o marrom escuro à
preta (GARCIA et al., 2006). Segundo BONAVANTURE (1999), a colheita pode se
estender por um período de até dez meses, dependendo de fatores como época de
7
polinização, variedade cultivada e temperatura predominante durante o
desenvolvimento dos frutos.
Segundo TOKUNAGA (2000), o primeiro cruzamento artificial entre as
espécies A. cherimola e A. squamosa ocorreu na Flórida, em 1908, originando o híbrido
interespecífico conhecido por atemóia, que foi introduzido no Brasil no ano de 1950,
através do Instituto Agronômico de Campinas (IAC). Segundo o mesmo autor, os
cultivares mais plantados são: Thompson, Gefner, African Pride e Pink’s Mammoth que
apresentam algumas diferenças morfológicas, porém têm em comum o teor de sólidos
solúveis, em torno de 25 °Brix. A principal vantagem desses híbridos é a de possuírem
maior amplitude de adaptabilidade térmica, podendo ser cultivados em áreas mais
amplas que seus parentais.
As flores são hermafroditas, compostas de três pétalas longas, de cor creme,
solitárias ou agrupadas e dicogâmicas. O florescimento ocorre entre os meses de
outubro a fevereiro, sendo que a colheita dos frutos de atemóia é realizada da segunda
quinzena de maio até o mês de julho, em pomares implantados em condições de climas
mais amenos (TOKUNAGA, 2000).
2.3 Aspectos Citogenéticos
Segundo PAGLIARINI (2001) a citogenética é o ramo da ciência que sobrepõe
os conhecimentos da citologia e da genética, estudando os cromossomos nos mais
diferentes aspectos. Em programas de melhoramento genético, a citogenética
proporciona técnicas e informações de natureza geral ou específica que permitem a
manipulação do genótipo ou do sistema de transmissão da informação genética.
Especificamente, o estudo do comportamento meiótico das plantas fornece
informações importantes quanto à normalidade na formação dos grãos de pólen.
Segundo HANNIA (2000), a observação de cromossomos de anonáceas através
da microscopia de luz é método rápido e muito informativo como um todo. A
dificuldade reside no fato da tendência desses cromossomos formarem aglomerados ou
bastonetes. Dentre os métodos utilizados pela autora acima para visualização de
cromossomos de Annona cherimola (cherimóia) e Annona muricata (graviola), a
coloração com o fluorocromo DAPI mostrou-se o melhor, tendo sido registrado 2n = 16
para cherimóia e 2n = 14 para graviola. O estudo acima também compila dados de
outros autores que relatam para Annona cherimola 2n = 14 (KUMAR & RANADIVE,
8
1941), 2n = 16 (BOWDEN, 1948; DARLINGTON & WYLIE, 1956). Para Annona
muricata, 2n = 16 (BOWDEN, 1948, trabalhando com sementes colombianas), n = 7
(KUMAR & RANADIVE, 1941) e 2n = 14 (SIMMONDS, 1954; DARLINGTON &
WYLIE, 1956).
MORAWETZ (1988), comparando a evolução de sistemas de cariótipos de
anonáceas australianas com outras famílias (Eupomatiaceae, Himantandraceae e
Austrobaileyaceae), informa que doze gêneros e vinte espécies de anonas australianas
são todos diplóides, com 2n = 16 ou 18. Detalhes da estrutura da interfase nuclear,
modo de condensação dos cromossomos, bandeamento com fluorocromos e
Giemsa/banda C mostram, nesse trabalho, a complementariedade entre os cariótipos
dessas famílias.
Segundo TECHIO (2002), a análise do comportamento cromossômico meiótico
em híbridos pressupõe um entendimento das características genéticas dos parentais, pois
diferentes combinações genéticas podem refletir graus variáveis de irregularidades nos
descendentes. Tais irregularidades podem refletir diretamente na viabilidade do pólen,
uma vez que pode existir correlação entre as irregularidades e a instabilidade meiótica
fornecida pelo índice meiótico.
Segundo LOVE (1949), o índice meiótico que representa a porcentagem de
tétrades normais em relação às totais é indicador da instabilidade reprodutiva dos grãos
de pólen, considerando plantas de trigo que apresentam índice abaixo de 90% instáveis.
Para BATTISTIN et al. (2006), índices meióticos acima de 85% confirmam a
regularidade meiótica na microsporogênese, em espécies de plantas medicinais do
gênero Sesbania.
A formação de pontes cromossômicas é indicativo da ocorrência de
translocações ou inversões paracêntricas (CAO et al., 2003), e podem conduzir à
esterilidade dos grãos de pólen, como sugerido por ZADOO (1984).
Cromossomos retardatários são indicativos do não pareamento cromossômico
levando a formação de gametas não balanceados, aborto de óvulos fecundados,
formação de sementes inviáveis e plantas adultas semi-estéreis (RAMSEY &
SCHEMSKE, 2002).
O fato de ter havido relato anterior de inviabilidade em grãos de pólen de anonas
(PINTO-MAGLIO, 2003) tornou quase imprescindível que, paralelamente aos estudos
de metodologias de conservação, realizados neste trabalho, fosse analisado também o
processo de formação do pólen, através da análise do comportamento meiótico das
9
plantas de modo a não somente explicar as causas da inviabilidade observada nos grãos
de pólen fresco, mas principalmente dar suporte aos testes de viabilidade dos grãos de
pólen provenientes das amostras submetidas às diferentes metodologias de conservação.
2.4 Polinização e conservação de pólen
Na maioria das Angiospermas o pólen é uma estrutura celular livre (mônade),
porém, em algumas famílias, eles formam grupos de grãos denominados tétrades que
podem ter de zero a quatro grãos férteis (FLORES, 2002). Segundo SILVEIRA (2008),
o tapete é o tecido responsável pela nutrição do tecido esporogênico e produção de
esporopolenina, molécula responsável pela proteção do gametófito contra a dessecação.
Além dos gametas, a estrutura do pólen é formada, por substâncias sintetizadas no
tapete que conferem adesividade, disposição e coloração ao pólen, atratividade e
adesibilidade deste ao corpo de insetos, proteção contra a ação de raios ultra-violeta,
contribuindo para sua dispersão (FLORES, 2002).
Em sua revisão, COPENHAVER (2005), informa que em aproximadamente 52
famílias botânicas, compreendendo 581 espécies mono ou dicotiledôneas, aquáticas ou
terrestres e distribuídas em seis dos sete continentes do globo, formam tétrades. Dentre
as anonáceas, 23 gêneros englobando 83 espécies pertencem a esse grupo. Apenas
quatro espécies de um único gênero formam mônades, ou seja, Annona bicolor, A.
dumetorum, A. globiflora e A. rosei. TSOU & FU (2007) observaram octades na
formação de grãos de pólen em Annona (Annonaceae) do gênero Cymbopetalum.
Segundo MCCORMICK (2004), as células mãe de pólen de Arabidopsis
thaliana sofrem meiose I e II para formar tétrades, envoltas pela parede da calose. As
células das anteras se diferenciam na pré-meiose inicial ou nas células mãe de pólen.
Nas espécies que formam mônades essas células se separam, naquelas que formam as
tétrades não há separação. É provável que esse mecanismo de separação seja mediado
por processos enzimáticos. Na formação das tétrades de Annona glabra e Annona
montana, há digestão parcial do envelope de calose, da transformação da estrutura
calose-celulose no sistema de formação das tétrades e da rotação dos micrósporos em
anonas que não é comum nas Angiospermas (TSOU & FU, 2002).
A polinização das anonáceas pode ser realizada por diferentes insetos, porém na
maioria delas, incluindo as anonas comerciais, como a cherimóia, ata e atemóia, a
polinização é feita por restrito grupo de insetos, quase que exclusivamente pelos
10
besouros nutidulídeos, numa síndrome de polinização denominada cantarofilia
(PAULINO NETO & OLIVEIRA, 2006). Segundo GUIRADO et al. (2004), a via de
polinização anemófila é improvável pois o pólen de cherimóia é pegajoso e pesado,
além disso, as flores são pendentes e a abertura das pétalas no estágio fêmea é pequena.
Associada a este tipo de polinização, as anonas comerciais apresentam
dicogamia protogínica, mecanismo natural para impedir a autofecundação, o qual
apresenta flores onde o gineceu torna-se receptivo antes da maturação do androceu
quando há liberação do pólen (FFTC – Food & Fertilizer Tecnology Center, 2006). Isto
sugere que a autofecundação não é regra para essa família, sendo um fenômeno raro que
ocorre em condições ambientais muito peculiares (BONAVENTURE, 1999;
GUIRADO et al., 2001; GUIRADO et al., 2004). Sendo assim, número, forma, tamanho
e simetria dos frutos, estão intimamente relacionados com a população de insetos
polinizadores pois, dentre outros fatores, esses estão relacionados ao número de óvulos
fecundados (PINTO et al., 2005). Quando a polinização é inadequada, ou seja, quando
são fecundados somente alguns óvulos e, portanto, de maneira irregular, os frutos
resultantes são assimétricos e disformes (GARCIA et al., 2006).
Devido a este problema, na Califórnia, SCHROEDER (1943), propôs a
polinização artificial, ou manual, e demonstrou as vantagens da técnica, a qual consiste
na coleta, e transferência manual, de pólen das anteras para os estigmas das flores,
através da observação de fertilização dos óvulos mais regular e conseqüentemente maior
produção de frutos, maiores e de formas mais homogêneas.
Também no Brasil a polinização natural em anonas comerciais não tem se
mostrado eficiente, pois não existe um agente polinizador específico, ou seja, o mesmo
que é encontrado no local de origem da cherimóia, por exemplo, o que gera poucos
frutos e muitos deles defeituosos. Isso tem dificultado a produção de frutos nessas
anonas, portanto, em termos comerciais, a polinização natural não é eficiente (MELO et
al., 2002 b).
Já a polinização artificial é recurso de extrema importância para o produtor que
destina sua produção ao comércio in natura, pois em função da eficiência da
polinização, obtém-se, segundo GUIRADO et al. (2001), frutos de maior tamanho e
melhor conformação com melhores remunerações para o produto. A falta de qualidade
do pólen pode frustrar as expectativas de resultados dessas polinizações artificiais tanto
para produtores como para pesquisadores que buscam novos híbridos (GUIRADO et al.,
2004).
11
Nesse sentido, investigações quanto à conservação de pólen tornam-se
imprescindíveis dentro de um programa de melhoramento visando à oferta de materiais
mais produtivos e adaptados às diferentes regiões brasileiras. Segundo TIGHE (2004), a
conservação de pólen possibilita sincronia artificial entre a dispersão de pólen com a
receptividade floral, além de complementar a ação de agentes polinizadores pouco
eficientes ou mesmo inexistentes.
Pesquisas com a conservação de pólen têm sua importância para a preservação e
intercâmbio de germoplasma, para estudos sobre o desenvolvimento do pólen em si, e
melhoria da eficiência dos programas de melhoramento (HANNA, 1994).
Para tanto, o conhecimento de fatores como a temperatura e umidade do
ambiente de armazenamento, e o grau de umidade do pólen é imprescindível para o
sucesso dessa ação (LINSKENS, 1964; DEAN, 1965; KHAN et al., 1971).
BOYDEN & COUSINS (2003), estudando pólen de uva, obtiveram sucesso na
conservação e manutenção da viabilidade deste, por um prazo superior a um ano,
quando mantidos em nitrogênio líquido ou armazenados a -80 ºC.
SCHROEDER (1942) demonstrou que pólen de abacate conservado a
temperatura de aproximadamente 14 °C mantinha sua viabilidade por até 150 horas,
podendo ser utilizados em cruzamentos.
HONDA et al. (2002) não obtiveram diferenças significativas entre pólen
criopreservado e pólen fresco de Delfinium, quanto à quantidade de frutos e sementes,
mostrando a viabilidade da criopreservação de pólen.
GOMES et al. (2003) mostraram ser viável, por até dois anos, pólen de cebola
criopreservado em nitrogênio líquido (-196 °C), o qual manteve-se viável por até dez
dias em refrigeração, mesmo após a permanência de um ano em criopreservação.
Em anonas comerciais, além do fato de a polinização natural ser ineficiente,
como foi mencionado acima, o que justificaria por si só estudos de conservação de
pólen, ainda há outro problema que afeta a hibridação e a obtenção de novos híbridos
em anonas, que é a curta viabilidade do pólen depois de retirado da planta
(BONAVENTURE, 1999 e PINTO-MAGLIO, 2003). Este fator dificulta a efetivação
de cruzamentos entre espécies e/ou cultivares que floresçam em épocas diferentes do
ano, como é o caso da própria atemóia e as suas espécies parentais.
Testes feitos em laboratório por PINTO-MAGLIO (2003) demonstraram que
grãos de pólen, colhidos à tarde e guardados em refrigerador, para serem utilizados em
polinizações na madrugada do dia seguinte, ou seja, armazenados durante 6 a 12 horas,
12
mesmo com todos os cuidados, perdem cerca de 70 a 80% de viabilidade e apresentam
rápida contaminação por fungos e bactérias.
Observações feitas por GUIRADO et al. (2004), comparando o comportamento
de pólen de flores em estágio macho e em estágio fêmea, registraram o seguinte: o pólen
imaturo das flores em estágio fêmea comportava-se melhor do que o pólen de flores em
estágio macho, quanto ao volume de produção em cherimóias, mesmo quando era
coletado e deixado à temperatura ambiente. Já o pólen maduro retirado de flores macho,
melhorava a sua performance quando conservado em temperaturas entre 3 e 7 ºC do que
quando mantido à temperatura ambiente, no caso específico do local, de 20°C,
recomendando inclusive o uso de pólen de flores fêmeas para a polinização. No entanto,
estas recomendações parecem se aplicar especificamente para o local, região de
Granada, Espanha, sendo um dado que pode ser experimentado, mas insuficiente
dependendo do objetivo da utilização do pólen.
Em alguns locais de cultivo destas fruteiras no Estado de São Paulo, a falta de
agente natural polinizador que substitua o agente do local de origem destas plantas, pois
como foi mencionado acima, o mesmo não é nativo do Brasil, obriga os produtores a
contratarem mão-de-obra, para que a polinização seja feita manualmente visando efetiva
produção de frutos. Este procedimento é um dos fatores que tem onerado
demasiadamente o custo de produção dessa fruta.
Neste caso, os problemas relacionados à falta de polinizador e a curta viabilidade
do pólen, são agravados ainda pelo fato de estas anonas apresentarem protoginia, o que
faz com que as flores fiquem na fase feminina ao entardecer e, portanto, receptivas
apenas a partir das 16:30 h, mais ou menos. A partir desta hora a polinização manual
deve ser feita rapidamente, pois a viabilidade do pólen é muito curta. O pólen deve ser
retirado das flores em fase masculina (que são as mesmas flores que estavam no estágio
feminino no dia anterior) e colocado imediatamente nas flores em fase feminina,
receptiva, exigindo assim que, um trabalho intenso de polinização no campo, inicie-se
por volta das 16:30 hs e prossiga intensivamente até o início da noite entre 19:00 até as
20:00 h ou mais tarde.
Assim, estudos sobre técnicas e condições de armazenamento de pólen que
levem ao estabelecimento de uma metodologia de conservação viriam facilitar e
otimizar o trabalho de polinização e melhoramento da produção de frutos. Outros
benefícios da conversação do pólen dessas fruteiras seria a redução de custos de
produção para os fruticultores além de aumentar o período de cruzamentos. O
13
desenvolvimento de protocolos adequados de conservação também permitiria a
obtenção de novos cultivares e/ou híbridos entre espécies de anonas que florescem em
diferentes meses do ano. Estas técnicas são ferramentas fundamentais em programas de
melhoramento genético.
Dessa forma, objetivou-se no presente trabalho estudar técnicas de conservação
de grãos de pólen de anonas comerciais, a saber, cherimóia (Annona cherimola Mill.),
pinha, ata ou fruta-do-conde (Annona squamosa L.) e seu híbrido atemóia (A. cherimola
x A. squamosa).
14
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 MATERIAL
3.1.1 Plantas
Os estudos de conservação de pólen de anonas comerciais foram realizados em
Annona cherimola Mill. (cherimóia) cv Madeira, Annona squamosa L. (pinha) e no
híbrido atemóia cv Gefner, resultante do cruzamento/hibridação de A. cherimola x A.
squamosa (Figura 1).
Figura 1 - Frutos de cherimóia cv Madeira (A), pinha (B) e atemóia cv Gefner (C).
3.1.2 Caracterização das áreas experimentais e locais de coleta
Os experimentos foram executados em pomares comerciais cujas condições
edafoclimáticas, descritas abaixo, são apropriadas para o cultivo de cada uma dessas
fruteiras. Para cherimóia, mais adaptada a climas mais amenos, foram selecionados
pomares localizados no município de Pedra Bela-SP, no sítio Monjolo e, para pinha e
atemóia, que se adaptam a climas mais subtropicais, plantações localizadas no
município de Lins-SP, especificamente do sitio Yassuda.
O município de Pedra Bela está situado na altitude de 1030 m, latitude 22º 47' S
e longitude 46º 47' W, com temperaturas médias anuais, máxima e mínima, de 24,7º e
12,5ºC, respectivamente. O mês mais frio é julho, quando a média das temperaturas
mínimas é de 8,1ºC (PEDRO JÚNIOR et al., 1991). A precipitação anual está em torno
dos 1555 mm, sendo que, aproximadamente 76% desse volume estão concentrados
15
entre os meses de outubro a março e apenas 8% entre junho e agosto (SIGRH – Sistema
Integrado de Gerenciamento de Recursos Hídricos, 2008).
O município de Lins está situado em latitude 21º 40' S e longitude 49º 46' W e
altitude próxima a 400 metros. Apresenta temperaturas anuais médias de máximas e
mínimas, respectivamente 30,1 e 16,7 ºC, cujo mês mais frio (julho) apresenta médias
mínimas de 12,3 ºC (PEDRO JÚNIOR et al., 1991). O regime pluviométrico anual é de
aproximadamente 1219 mm, concentrados (77%) entre outubro e março, sendo os
meses mais secos, de junho a agosto (SIGRH - Sistema Integrado de Gerenciamento de
Recursos Hídricos, 2008).
3.2 MÉTODOS
3.2.1 Microsporogênese - coleta e conservação de botões florais
Para o estudo da microsporogênese, foram coletados botões florais em diferentes
estágios de desenvolvimento (Figura 2) visando observar as várias fases da divisão
meiótica. Imediatamente após a coleta, os botões florais foram acondicionados em
frascos contendo fixador Carnoy (álcool absoluto 3: 1 ácido acético glacial, v/v).
Para melhor penetração do fixador no material, os frascos foram mantidos em
câmara de vácuo por 3 minutos e estocados em freezer, a -20°C até a preparação das
lâminas.
Figura 2 - Annona cherimola Mill. (cherimóia). Botões florais - série de tamanhos gradativos para estudo da microsporogênese (ref. placa de Petri com 14 cm de diâmetro).
16
3.2.2 Microsporogênese - preparações citológicas
Para o preparo das lâminas, foi utilizada a metodologia de MEDINA &
CONAGIN (1964), adaptada para o material de anona. Os botões florais selecionados
foram retirados do fixador e lavados, por 15 minutos, em água destilada e,
posteriormente, pelo mesmo período, em solução tampão de ácido cítrico (pH 4,5).
Após a lavagem dos botões foi realizada a hidrólise do material em um mix de
enzimas (pectinase e celulase a 2%), em “banho maria”, durante duas horas, a 37 ºC.
Com o auxílio de um bastão de vidro, as anteras foram maceradas, no corante carmin
acético (1,2%), sendo o excesso de tecido retirado das lâminas de forma a deixar apenas
células mãe de pólen. Em seguida, procedeu-se o esmagamento do material sob as
lamínulas. As lâminas foram vedadas com cera e analisadas no microscópio óptico
Zeiss, modelo Jenaval, com objetiva com aumento 100 X.
3.2.3 Conservação de pólen - coleta de flores e separação do pólen
Flores de anonas apresentam protoginia, assim para o estudo do pólen, as flores
de cherimóia, atemóia e pinha foram coletadas ao atingirem o estágio macho, ou seja, o
estágio em que as flores estavam com pólen maduro (Figura 3D). Esse estágio é
caracterizado pela coloração marrom dos estigmas, abertura total e separação das
pétalas (GUIRADO, 2004).
Figura 3 – Flores de atemóia: A) fechada; B) pré-fêmea; C) fêmea e D) macho.
17
Dentre as várias amostras coletadas para serem submetidas aos testes de
conservação, denominou-se de pólen fresco (PF) o pólen que foi considerado como
testemunha em todas as avaliações deste trabalho.
Para a obtenção de todas as amostras, as flores foram coletadas aleatoriamente
nos pomares e depositadas em bandejas plásticas. Em seguida, foram peneiradas de
forma a separar as anteras e pólen das demais estruturas que compõe as flores.
Foram coletadas flores de cherimóia e pinha no estágio de fêmea que
permaneceram dentro de bandejas plásticas por um período de aproximadamente 12
horas para que atingissem o estágio macho. No caso da atemóia, o tempo de espera foi
de seis horas. Esse pólen foi classificado como pólen amanhecido (PA) uma vez que a
maturação do pólen ocorreu fora da planta.
O pólen amanhecido (PA), obtido da forma descrita anteriormente é o tipo de
pólen utilizado correntemente pelos produtores para polinizações. O pólen fresco, recém
coletado (PF), também foi utilizado.
As amostras de pólen foram coletadas em duas condições climáticas: a primeira
caracterizada por um período relativamente mais seco (outubro) e a segunda por um
período relativamente mais úmido (novembro), em ambas as áreas experimentais (Pedra
Bela e Lins). As temperaturas (°C) e Umidades Relativas (%), durante a coleta das
flores, foram obtidas in loco por meio do psicrômetro de Assman (Anexo 1).
3.2.4 Conservação de pólen – procedimentos e meios
Para os testes padrão, o pólen recém coletado (PF) foi usado imediatamente após
a coleta em experimentos de polinização a campo, em testes de colorimetria e
germinação in vitro. O pólen amanhecido (PA) foi utilizado em experimentos de
polinização, colorimetria e germinação in vitro, após 12 horas da coleta das flores em
estágio fêmea, no caso da cherimóia e pinha, e após seis horas para atemóia.
Para os testes de conservação, amostras do pólen recém coletado foram
transferidas para uma placa de Petri e colocadas para serem dessecadas, por um período
de 90 minutos, conforme protocolo de LORA et al. (2006). Após esse procedimento,
esse pólen dessecado foi acondicionado em microtubos, do tipo Ependorff, e
armazenado em nitrogênio líquido (-196 °C) e em geladeira (4 a 5 °C). Na geladeira, os
microtubos permaneceram fechados em um dessecador contendo sílica. Parte das
18
amostras do pólen recém coletado foi conservada no nitrogênio líquido e parte delas em
geladeira sem serem submetidas ao dessecamento.
Dessa forma, para os testes de conservação, foram consideradas amostras com os
seguintes tratamentos: 1) pólen não dessecado e conservado em nitrogênio (PndN), 2)
pólen não dessecado e conservado em geladeira (PndG), 3) pólen dessecado e
conservado em nitrogênio (PdN) e 4) pólen dessecado e conservado em geladeira
(PdG).
Os períodos de conservação estabelecidos para as amostras permanecerem em
nitrogênio e geladeira foram de um, três, seis, 15 e 30 dias.
O monitoramento da viabilidade do pólen, realizado imediatamente após a
conclusão dos períodos de conservação estabelecidos, foi feito através de testes de
colorimetria, germinação in vitro e de polinização a campo.
3.2.5 Conservação de pólen – teste de colorimetria
Para os testes de colorimetria foi utilizado o corante Alexander n° 2
(ALEXANDER, 1969). Através desta técnica, são considerados viáveis os grãos que
apresentam conteúdo citoplasmático colorido pelo corante Alexander e inviáveis os que
se apresentam com aspecto vazio e sem coloração.
Lâminas contendo porções de pólen foram coloridas e, após um leve
aquecimento, foram vedadas com cera e conservadas em geladeira até o momento da
análise microscópica.
As análises foram feitas no microscópio óptico Zeiss, modelo Jenaval, em
objetiva de aumento 25X, considerando-se a contagem de grãos de pólen em dez
campos aleatórios por lâmina. Cada campo foi limitado à área total de foco da objetiva.
3.2.6 Conservação de pólen – teste de germinação in vitro
Nos testes de viabilidade através da germinação em meio de cultura (in vitro)
são considerados viáveis os grãos que emitem tubo polínico com o comprimento igual
ou superior ao diâmetro do grão de pólen (ROSELL et al., 2006).
Para o monitoramento da viabilidade do pólen através de testes de germinação in
vitro, foram testados dois meios de cultura denominados A e BK. Os meios possuem a
mesma composição diferindo apenas no tipo de agar utilizado. Ambos são compostos
19
por 5 g de sacarose, 0,87 g de agar, 0,01 g de ácido bórico, 0,03 g de nitrato de cálcio,
0,02 g de sulfato de magnésio e 0,01 g de nitrato de potássio, dissolvidos em 100 ml de
água destilada.
No meio A utilizou-se o agar próprio para cultura de tecidos vegetais, mais
especificamente o agar tipo E (Sigma). Para o preparo do meio BK, foi usado o bacto-
agar Mikrobiolie (Merck).
Os meios foram homogeneizados em forno microondas (potência média por três
minutos). Após o resfriamento, os meios de cultura foram vertidos sobre lâminas de
vidro para microscopia, formando uma fina película sobre as mesmas. Em seguida,
amostras de pólen foram depositadas sobre as lâminas com auxílio de um pincel. As
lâminas foram colocadas em placas de Petri com papel de filtro umedecido, formando
uma câmara úmida, e mantidas em temperatura ambiente.
Para a contagem do número de grãos de pólen germinados foi utilizado o mesmo
microscópio e número de campos de observação descritos no item 3.2.2.
3.2.7 Conservação de pólen – testes de polinização
Para estimar a viabilidade do pólen foram também efetuadas polinizações a
campo nos meses de outubro e dezembro de 2007. A temperatura (°C) e Umidade
Relativa (%), durante as polinizações, foram obtidas in loco por meio do psicrômetro de
Assman (Anexo 1).
Nos testes de polinização, foram consideradas viáveis as amostras de pólen que
resultaram em frutificações. A fim de evitar possível contaminação com pólen estranho,
as flores que estavam no estágio de pré-fêmea (Figura 3B) foram previamente
protegidas com saquinhos de tecido não tecido (TNT). Com auxílio de um pincel, foram
efetuadas polinizações manuais em flores no estágio fêmea (Figura 3C), utilizando-se
pólen dos quatro tratamentos (PndN, PndG, PdN e PdG), além do pólen testemunha
(PF) e do PA. Para os tratamentos de conservação (PndN, PndG, PdN e PdG), as
polinizações foram realizadas com amostras armazenadas durante 1, 3, 6, quinze e trinta
dias. Após as polinizações, as flores foram devidamente identificadas quanto ao pólen
utilizado e novamente protegidas com saquinhos de TNT, os quais foram mantidos nas
flores durante trinta e seis horas após o recebimento do pólen.
Quinze dias após as polinizações foram realizadas as análises para se verificar a
ocorrência de frutificações. Para as amostras de PF e PA, foram polinizadas onze flores
20
em cada um dos quatro blocos, em ambos os períodos (seco e úmido), totalizando 88
flores polinizadas (11 polinizações x 4 blocos x 2 períodos), em cada uma das três
fruteiras. Para os tratamentos (PndN, PndG, PdN e PdG), foi polinizado o mesmo
número de flores, em cada um dos quatro blocos, em ambos os períodos e em cada um
dos tempos de conservação estudado (1, 3, 6, quinze e trinta dias), totalizando 440
polinizações para cada um dos tratamentos aplicados às amostras (11 polinizações x 4
blocos x 2 períodos x 5 tempos de armazenamento). Dessa forma, nos dois períodos
estudados, foi considerada a fixação de frutos em 1936 flores para cada uma das
espécies e também para o híbrido.
3.2.8 Análise estatística e delineamento experimental
Análises estatísticas foram realizadas para avaliar os efeitos dos diferentes
fatores envolvidos nos experimentos. Os fatores considerados nessas análises foram:
período de coleta (seco e úmido), meio de cultura (A e BK), pólen padrão (PF), pólen
sem conservação (PA) e pólen conservado (PndN, PndG, PdN e PdG), tempo de
germinação in vitro (uma, três, seis e 12 horas), frutificação resultante da polinização a
campo, pré-tratamento (pólen dessecado e não dessecado), condições de conservação
(geladeira e nitrogênio líquido) e tempo de conservação (um, três, seis, 15 e 30 dias).
Na primeira análise estatística, foi utilizado o delineamento completamente
casualizado com tratamentos em arranjo fatorial 2 x 2 x 2 x 4, considerando os
seguintes fatores: período de coleta de pólen (seco e úmido), meio de germinação (A e
BK), pólen (PF e PA) e tempo de leitura (1, 3, 6 e doze horas), respectivamente. Os
dados obtidos foram submetidos à análise de variância, sendo as médias comparadas por
meio do teste de Tukey, ao nível de 5%. Para o fator quantitativo (tempo de leitura),
ajustaram-se equações de regressão. Os resultados dessa análise determinaram qual o
meio de cultura, estágio fenológico de coleta de flores e tempo de leitura das lâminas
mais adequados para observação da germinação in vitro do pólen das anonas estudadas.
Na segunda análise estatística, utilizou-se o delineamento completamente
casualizado com tratamentos em arranjo fatorial 2 x 2 , sendo o primeiro fator o período
de coleta de pólen (seco e úmido) e o segundo o pólen (PF e PA). Os dados foram
submetidos à análise de variância, sendo as médias comparadas pelo teste de Tukey, ao
nível de 5%. Os resultados aqui obtidos ratificaram as melhores condições ambientais,
21
mais especificamente, em função da umidade relativa (UR%), e condições fenológicas
para coleta de pólen.
E, na terceira análise, também foi utilizado o delineamento experimental
completamente casualizado com tratamentos em arranjo fatorial 2 x 4 x 6, sendo o
primeiro fator o período de coleta de pólen (seco e úmido), o segundo os tratamentos
(PndN, PndG, PdN e PdG), o terceiro o tempo de armazenamento (1, 3, 6 quinze e trinta
dias), considerando o tempo zero como o inicial. Os dados obtidos foram submetidos à
análise de variância, sendo as médias dos tratamentos qualitativos comparadas pelo teste
de Tukey, ao nível de 5%. Os efeitos do fator quantitativo (tempo de armazenamento)
foram estudados por meio de regressão. Essa análise objetivou estudar os efeitos da
condição climática de coleta, da dessecação das amostras e das temperaturas de
conservação do pólen das três fruteiras.
22
4 RESULTADOS
4.1 Microsporogênese
Para a análise da microsporogênese foram selecionados botões florais de forma a
se obter as fases meióticas de anáfase I (Figura 4A), metáfase I (Figura 4B), telófase I
(Figura 4C), telófase II (Figura 4D, flecha), meta/anáfase II (Figura 4D, cabeça de
flecha) e diacinese (Figuras 5A e 5B).
As observações realizadas em meiose nas células mãe de pólen (CMP) de
atemóia, cherimóia e pinha evidenciaram a presença das anomalias que estão
apresentadas na tabela 1.
Foram observados cromossomos retardatários (Figura 4A), núcleos com vários
nucléolos (Figura 5A), polivalentes (Figura 5C, flecha), bivalente fora da placa
metafásica (Figura 5D), segregação precoce de bivalentes (Figura 5E) e pontes (Figura
5C, cabeça de flecha).
Como resultado dessas anomalias meióticas foi observada, no final da meiose, a
formação de tríades e tétrades com micronúcleos (Figuras 6A e 6B, flechas).
Como resultado final da microsporogênese foram observadas tétrades normais
(Figuras 4E, 5F e 6E), mônades, díades e tríades (Figuras 6B, 6D, 6F e 6G), além de
tétrades completamente vazias (Figura 6H).
Tabela 1 - Freqüência (%) observada de células com anormalidades meióticas.
Fase Anormalidade Atemóia Cherimóia Pinha
Meiose I
Segregação precoce de cromossomos1 2,6 0,5 0,4 Presença de nucléolos4 1,1 0,1 0,2 Polivalentes1 2,1 0,1 0,1 Pontes2 5,6 0,4 0,4 Bivalente fora da placa1 2,2 0,3 0,4 Cromossomos retardatários3 1,2 0,1 0,1
Meiose II Segregação precoce de cromossomos1 2,0 0,0 0,1 Pontes2 3,7 0,3 0,3 Cromossomos retardatários3 0,6 0,2 0,1
Produtos meióticos
Tríades 3,2 0,0 0,6 Tétrade com micronúcleo 0,8 0,1 0,1
1em metáfases; 2em anáfases; 3em telófases; 4em diacinese.
23
Figura 4 – Annona cherimola Mill. (cherimóia) - microsporogênese. A – célula mãe de pólen na fase de anáfase I com um cromossomo retardatário (flecha); B – metáfase I sem anomalias; C – telófase I; D telófase II (flechas) e meta/anáfase II (cabeça de flecha); E - tétrade de micrósporos recém formados; F - células somáticas do tecido do tapete da antera com 2n=14 cromossomos.
20 µm
E F
10 µm
BA
10 µm
10 µm
C
20 µm
D
10 µm
24
Figura 5 – Annona squamosa L. (pinha) – microsporogênese. A-B – células mães de pólen na fase de diacinese com n=7 pares de bivalentes, célula A com vários nucléolos; C - metáfase I – polivalentes (flechas); D–E – células em metáfases I com segregação precoce de bivalentes (flechas); F – tétrade de micrósporos recém formados.
10 µm
A B
10 µm
10 µm
F
10 µm
C D
10 µm
E
10 µm
25
50 µm
C
50 µm
A
50 µm
B
25 µm
E
25 µm
D
25 µm
F
25 µm
G
25 µm
H
Figura 6 – Tétrades de atemóia cv Gefner. A-B – resultado do teste de germinação em meio de cultura A; C-D – grãos de pólen (isolado e em tétrade) com tubo polínico. E–H tipos de arranjos; E – tétrade completa com todos os micrósporos viáveis; F- tríade; G- díade; H – tétrade vazia com todos os micrósporos inviáveis. Presença de micronúcleos nas figuras A e B (flechas).
26
Os resultados das análises evidenciaram a presença de menor porcentagem de
anomalias em cherimóia (2,1%) e pinha (2,8%), em relação a atemóia (25,1%). Nos três
materiais a anomalia observada com maior freqüência foi a formação de pontes, nas
fases de anáfases I e II (Tabela 1).
Para atemóia, cherimóia e pinha, o índice meiótico, que representa a
porcentagem de tétrades normais resultantes das divisões meióticas, foi de 73,7 ± 3,26,
97,8 ± 2,05 e de 94,8 ± 3,29, respectivamente (Anexo 2).
A análise da meiose demonstrou que os três materiais possuem sete
cromossomos bivalentes (n = 7) (Figuras 5A e 5B). Foram observados também, em
células somáticas do tecido do tapete da antera, 2n = 14 cromossomos (Figura 4F).
4.2 Colorimetria
4.2.1 Atemóia
Através da colorimetria com o corante Alexander, foram identificados grãos de
pólen de atemóia em diferentes arranjos. A contagem de grãos viáveis (coloridos) e
inviáveis (não coloridos) foi feita independentemente do arranjo apresentado pelos
grãos de pólen (Figura 6B a 6H). Em média, observou-se freqüência aproximada de
68% de tétrades, 15% de tríades, 12% de díades, 2% de mônades, 1,1% de grãos
isolados e 2,1% de grãos vazios, em lâminas contendo amostras de PF. Lâminas
preparadas com PA continham, em média, 60% de tétrades, 19% de tríades, 13% de
díades, 3,7% de mônades, 1,3% de grãos isolados e 2% de grãos vazios,
aproximadamente (Tabela 2).
Tabela 2 – Porcentagens médias dos arranjos em amostras de pólen fresco (PF) e amanhecido (PA) de atemóia coletadas em dois períodos, seco e úmido.
Pólen fresco (PF) Pólen amanhecido (PA) Período de coleta Arranjos Seco úmido média seco úmido médiaTétrades 62,2 73,6 67,9 56,4 63,4 59,9 Tríades 17,1 12,9 15,0 21,3 17,6 19,4 Díades 13,9 9,8 11,8 14,5 12,3 13,4 Mônades 2,2 1,5 1,8 3,3 4,2 3,7 Grãos isolados 1,2 1,1 1,1 1,3 1,3 1,3 Grãos vazios 3,2 1,1 2,1 3,1 1,1 2,1
27
A maior porcentagem (86%) de grãos de pólen, identificados como viáveis pelo
teste de colorimetria, foi verificada em lâminas contendo amostras de PF. Quanto ao
período de coleta, verificou-se maior porcentagem (85,8%) de núcleos coloridos em
amostragem realizada no período úmido (Tabela 3). Também foi observada a existência
de grãos pólen de diferentes tamanhos (Figura 6A).
Tabela 3 – Porcentagens médias de grãos de pólen (PF e PA) de atemóia viáveis (coloridos pelo corante Alexander), em amostras coletadas em dois períodos, seco e úmido.
Período Pólen Seco Úmido Média Amanhecido 80,78 Bb 82,41 Ba 81,60 B Fresco 82,80 Ab 89,19 Aa 86,00 A Média 81,79 b 85,80 a
Médias seguidas de letras maiúsculas iguais na coluna e letras minúsculas iguais na linha não diferem significativamente pelo teste Tukey a 5%. DMS pólen e período = 0,75; DMS interação = 1,85.
Para a atemóia, a porcentagem média de grãos de pólen coloridos em amostras
não dessecadas não diferiu significativamente quando conservadas em geladeira (PndG)
e em nitrogênio líquido (PndN). Amostras de pólen dessecadas e conservadas em
nitrogênio líquido (PdN) apresentaram maior porcentagem de grãos de pólen coloridos
em relação às mantidas em geladeira (PdG) (Tabela 4).
Durante o tempo em que o pólen foi conservado (30 dias), a amostra coletada no
período seco apresentou, em média, redução diária de 0,7% de grãos coloridos, e nas
coletadas no período úmido a redução foi de 0,9%, aproximadamente (Figura 7).
Quanto aos tratamentos, nas duas temperaturas de armazenamento das amostras
(nitrogênio líquido ou geladeira), a redução de grãos de pólen coloridos no mesmo
período de 30 dias foi de 0,5% para amostras de pólen dessecadas e 1% para as não
dessecadas, aproximadamente (Figura 8).
28
Tabela 4 – Porcentagens médias de grãos de pólen de atemóia viáveis (coloridos pelo corante Alexander), em amostras submetidas a diferentes tratamentos e coletadas em dois períodos.
Período Tratamento Seco Úmido Média PndG 73,54 Bb 78,90 Ba 76,22 C PdG 73,58 Bb 81,40 Aa 77,49 B PndN 72,01 Cb 79,56 Ba 75,78 C PdN 75,17 Ab 81,94 Aa 78,55 A Média 73,57 b 80,45 a
Médias seguidas de letras maiúsculas iguais na coluna e letras minúsculas iguais na linha não diferem significativamente pelo teste Tukey a 5%. DMS período = 0,51; DMS tratamento = 0,95; DMS interação = 1,33.
0 5 10 15 20 25 30Tempo (dias)
50
60
70
80
90
100
Grã
os c
olor
idos
(%)
Período 1 Y= 79,66 - 0,664 X r2= 0,74 (n=24)Período 2 Y= 88,89 - 0,921 X r2= 0,89 (n=24)
Figura 7– Porcentagens médias de grãos de pólen de atemóia viáveis (coloridos pelo corante Alexander) em função do tempo de conservação e período de coleta (Período 1= seco, Período 2 = úmido).
29
0 5 10 15 20 25 30Tempo (dias)
50
60
70
80
90
100
Grã
os c
olor
idos
(%)
PndG Y= 86,46 - 1,117 X r2= 0,91 (n=12)PdG Y= 83,74 - 0,681 X r2= 0,72 (n=12)PndN Y= 84,40 - 0,940 X r2= 0,80 (n=12)PdN Y= 82,50 - 0,431 X r2= 0,51 (n=12)
Figura 8– Porcentagens médias de grãos de pólen de atemóia viáveis (coloridos pelo corante Alexander) em função do tempo de conservação e tratamentos.
4.2.2 Cherimóia
Diferentemente do que foi observado em atemóia, o pólen de cherimóia
apresentou tamanho mais homogêneo (Figura 9A).
O PF apresentou freqüências próximas a 98% de tétrades, 1,5% de tríades e 0,3%
de díades, 0,05% de mônades, 0,1% de grãos isolados e 0,2 de grãos vazios (Figuras 9A
a 9C). No PA foram observadas as freqüências de 96% de tétrades, 2% de tríades, 0,2%
de díades, 0,2% de mônades e 1% de grãos vazios, aproximadamente (Figura 9 e Tabela
5).
A maior porcentagem de grãos de pólen coloridos foi observada em lâminas
contendo amostras de PF (Tabela 6).
O pólen coletado no período úmido apresentou maior porcentagem de grãos
coloridos em relação ao coletado no período seco (Tabela 6).
Amostras de pólen não dessecadas e conservadas em geladeira (PndG) e
amostras dessecadas e conservadas em nitrogênio líquido (PdN) não diferiram quanto a
30
25 µm
C
100 µm
A
100 µm
B
Figura 9 – Tétrades de pólen fresco/padrão (PF) de Annona cherimola Mill. (cherimóia) após teste de colorimetria com corante Alexander. A – tétrades completas coloridas-viáveis e alguns conjuntos vazios-inviáveis (flecha). B – tétrades coloridas e vários conjuntos agrupados vazios inviáveis (flecha). C – detalhes de tétrades coloridas.
Tabela 5 - Porcentagens médias dos arranjos em amostras de pólen fresco (PF) e amanhecido (PA) de cherimóia coletadas em dois períodos, seco e úmido.
Pólen fresco (PF) Pólen amanhecido (PA) Período de coleta
Arranjos seco úmido média seco úmido média Tétrades 97,2 98,2 97,7 95,3 97,3 96,0 Tríades 2,1 1,2 1,6 3,1 1,5 2,3 Díades 0,2 0,4 0,3 0,0 0,5 0,2
Mônades 0,1 0,0 0,05 0,5 0,0 0,2 Grãos isolados 0,2 0,1 0,1 0,0 0,0 0,0 Grãos vazios 0,3 0,1 0,2 1,2 0,7 0,9
porcentagem média de grãos coloridos. Na mesma temperatura de conservação, as
amostras não dessecadas apresentaram maior porcentagem de grãos coloridos em
relação às amostras dessecadas. A maior porcentagem de grãos coloridos foi observada
em amostras de pólen não dessecadas conservadas em nitrogênio líquido (Tabela 7).
31
Tabela 6 – Porcentagens médias de grãos de pólen (PF e PA) de cherimóia viáveis (coloridos pelo corante Alexander), em amostras coletadas em dois períodos, seco e úmido.
Período Pólen Seco Úmido Média Amanhecido 96,00 Bb 98,53 Ba 97,27 B Fresco 98,98 Aa 99,48 Aa 99,23 A Média 97,49 b 99,01 a
Médias seguidas de letras maiúsculas iguais na coluna e letras minúsculas iguais na linha não diferem significativamente pelo teste Tukey a 5%. DMS pólen e período = 0,74; DMS interação = 1,42.
Tabela 7 - Porcentagens médias de grão de pólen de cherimóia viáveis (coloridos pelo corante Alexander), submetidos a diferentes tratamentos e coletados em dois períodos, seco e úmido.
Período Tratamento Seco Úmido Média PndG 98,03 Aa 98,33 Aa 98,18 B PdG 98,24 Aa 96,90 Bb 97,57 C PndN 98,27 Ab 98,91 Aa 98,59 A PdN 97,74 Bb 98,33 Aa 98,03 B Média 98,07 a 98,11 a
Médias seguidas de letras maiúsculas iguais na coluna e letras minúsculas iguais na linha não diferem significativamente pelo teste Tukey a 5%. DMS período = 0,17; DMS tratamento = 0,16; DMS interação = 0,44.
Durante a conservação, em ambos os períodos de coleta (Figura 10) e nos
tratamentos (Figura 11) aplicados às amostras de pólen (PndG, PndN e PdN) observou-
se redução diária de aproximadamente 0,1% na porcentagem de grãos de pólen
coloridos. No tratamento PdG a redução diária foi de 0,2% (Figura 11).
32
0 5 10 15 20 25 30Tempo (dias)
50
60
70
80
90
100
Grã
os c
olor
idos
(%)
Período 1 Y= 99,06 - 0,108 X r2= 0,75 (n=24)Período 2 Y= 99,52 - 0,153 X r2= 0,49 (n=24)
Figura 10 - Porcentagens médias de grãos de pólen de cherimóia viáveis (coloridos pelo corante Alexander) em função do tempo de conservação e período de coleta (Período 1= seco, Período 2 = úmido).
0 5 10 15 20 25 30Tempo (dias)
50
60
70
80
90
100
Grã
os c
olor
idos
(%)
PndG Y= 99,01 - 0,090 X r2= 0,88 (n=12)PdG Y= 99,54 - 0,215 X r2= 0,58 (n=12)PndN Y= 99,16 - 0,062 X r2= 0,69 (n=12)PdN Y= 99,44 - 0,153 X r2= 0,87 (n=12)
Figura 11– Porcentagens médias de grãos de pólen de cherimóia viáveis (coloridos pelo corante Alexander) em função do tempo de conservação e tratamentos.
33
4.2.3 Pinha
A freqüência aproximada dos arranjos observados no PF de pinha foi de 93% de
tétrades, 2% de tríades, 3% de díades, 0,5% de mônades, 0,2% de grãos isolados e 0,4%
de grãos vazios, aproximadamente. Em lâminas preparadas com amostras de PA as
freqüências dos arranjos observadas foram de 86% de tétrades, 7% de tríades, 4%
díades, 0,4% de mônades, 0,4% de grãos isolados e 2% de grãos vazios (Tabela 8).
Tabela 8 - Porcentagens médias dos arranjos em amostras de pólen fresco (PA) e de pólen amanhecido (PA) de pinha, coletadas em dois períodos.
Pólen fresco (PF) Pólen amanhecido (PA) Período de coleta Arranjos seco úmido média seco úmido média Tétrades 89,2 97,4 93,3 79,7 92,7 86,2 Tríades 2,9 1,7 2,3 12,2 2,5 7,3 Díades 6,0 0,0 3,0 5,5 2,0 3,7 Mônades 0,8 0,0 0,4 0,6 0,2 0,4 Grãos isolados 0,3 0,2 0,2 0,4 0,5 0,4 Grãos vazios 0,1 0,7 0,4 2,2 2,1 2,1
O teste de colorimetria evidenciou também boa regularidade no tamanho dos
grãos de pólen de pinha.
Amostras de PF apresentaram maior porcentagem (6%) de grãos coloridos em
relação ao PA (Tabela 9). Amostras de pólen coletadas no período úmido alcançaram
maior percentual de grãos coloridos em relação às coletadas no período seco (Tabela 9).
Tabela 9 – Porcentagens médias de grãos de pólen (PF e PA) de pinha viáveis (coloridos pelo corante Alexander), em amostras coletadas em dois períodos, seco e úmido.
Período Pólen Seco Úmido Média Amanhecido 88,94 89,08 89,01 B Fresco 93,79 94,85 94,32 A Média 91,37 b 91,97 a
Médias seguidas de letras maiúsculas iguais na coluna e letras minúsculas iguais na linha não diferem significativamente pelo teste Tukey a 5%. DMS pólen e período = 0,56.
34
Amostras de pólen não dessecadas e conservadas em geladeira (PndG)
apresentaram maior percentual médio de grãos coloridos em relação às dessecadas
(PdG). Quanto às amostras conservadas em nitrogênio, as dessecadas (PdN) registraram
maior proporção de grãos de pólen coloridos que as não dessecadas (PndN), como
apresentado na tabela 10.
Tabela 10 – Porcentagens médias de grãos de pólen de pinha viáveis (coloridos pelo corante Alexander), em amostras submetidas a diferentes tratamentos e coletadas em dois períodos, seco e úmido.
Período Tratamento Seco Úmido Média PndG 80,12 Cb 85,35 Ca 82,74 C PdG 81,36 Bb 88,55 Ba 84,96 B PndN 82,38 Ab 88,35 Ba 85,36 B PdN 82,82 Ab 90,42 Aa 86,62 A Média 81,67 b 88,16 a
Médias seguidas de letras maiúsculas iguais na coluna e letras minúsculas iguais na linha não diferem significativamente pelo teste Tukey a 5%. DMS período = 0,39; DMS tratamento = 0,73; DMS interação = 1,02.
Em função do tempo de conservação, a redução diária de grãos de pólen
coloridos foi de aproximadamente 0,6% nas amostras coletadas em ambos os períodos
(Figura 12).
Amostras de pólen dessecadas e conservadas em nitrogênio líquido apresentaram
redução diária 0,4% de grãos de pólen coloridos. Nos demais tratamentos o percentual
de redução foi de 0,7%, aproximadamente (Figura 13).
Em todos os materiais estudados, observou-se que, com o aumento do tempo de
conservação, houve aumento do rompimento da parede do grão de pólen, para as duas
condições de conservação e para amostras submetidas ou não à desidratação prévia.
Os anexos 3 e 4 apresentam resumo da análise de variância dos resultados da
colorimetria das amostras de pólen das três fruteiras.
35
0 5 10 15 20 25 30Tempo (dias)
50
60
70
80
90
100
Grã
os c
olor
idos
(%)
Período 1 Y= 86,84 - 0,563 X r2= 0,66 (n=24)Período 2 Y= 94,68 - 0,710 X r2= 0,82 (n=24)
Figura 12 – Porcentagens médias de grãos de pólen de pinha viáveis (coloridos pelo corante Alexander) em função do tempo de conservação e período de coleta (Período 1= seco, Período 2 = úmido).
0 5 10 15 20 25 30Tempo (dias)
50
60
70
80
90
100
Grã
os c
olor
idos
(%)
PndG Y= 89,30 - 0,716 X r2= 0,64 (n=12)PdG Y= 90,97 - 0,656 X r2= 0,70 (n=12)PndN Y= 91,99 - 0,722 X r2= 0,78 (n=12)PdN Y= 90,77 - 0,453 X r2= 0,50 (n=12)
Figura 13 – Porcentagens médias de grãos de pólen de pinha viáveis (coloridos pelo corante Alexander) em função do tempo de conservação e tratamentos.
36
4.3 Germinação in vitro
4.3.1 Atemóia
As análises das lâminas preparadas para germinação in vitro evidenciaram que a
germinação das amostras de PF foi maior em relação às de PA. O meio de cultura
preparado com o bacto-agar (meio BK) apresentou 97% a mais de grãos de pólen
germinados que o meio A (Tabela 11A; Figuras 6A; 6D; detalhes nas Figuras 6C e 6D),
independente do pólen utilizado. Amostras de pólen coletadas no período úmido
emitiram maior porcentagem (5%) de tubos polínicos em relação às coletadas no
período seco (Tabela 11).
Tanto para as amostras de PF quanto para as amostras de PA observaram-se
grãos de pólen em início de germinação, mesmo após doze horas da inoculação sobre os
meios. Foi observada a emissão de tubos polínicos em todos os arranjos considerados
(detalhes nas Figuras 6C e 6D).
Conforme pode ser observado na tabela 11, amostras do pólen coletadas no
período úmido germinaram 28% mais que as amostras coletadas no período seco.
Tabela 11 – Porcentagens médias de germinação in vitro, A- sobre dois meios de cultura (A e BK), de amostras de grãos de pólen de atemóia B- fresco e amanhecido, coletadas em dois períodos (seco e úmido).
A Período B Período Meio Seco Úmido Média Pólen Seco Úmido Média
A 6,81 Bb 16,83 Ba 11,82 B PA 12,53 Bb 18,35 Ba 15,44 BBK 21,22 Ab 25,43 Aa 23,32 A PF 15,50 Ab 23,91 Aa 19,70 A
Média 14,01 b 21,13 a Média 14,01 b 21,13 a
Médias seguidas de letras maiúsculas iguais na coluna e letras minúsculas iguais na linha não diferem significativamente pelo teste Tukey a 5%. DMS meio e pólen = 1,08; DMS interação = 3,01.
Não foi observada diferença significativa na germinação in vitro entre o pólen
dessecado e o não dessecado conservado em geladeira e entre o pólen dessecado e não
dessecado conservado em nitrogênio. Porém, observou-se uma diferença média de 34%
maior na germinação em amostras de grãos de pólen dessecadas e não dessecadas,
conservadas em geladeira, em relação às amostras de grãos dessecadas e não
dessecadas, conservadas em nitrogênio líquido (Tabela 12).
37
Tabela 12 – Porcentagens médias da germinação de grãos de pólen de atemóia submetidos a diferentes tratamentos de conservação e coletados dois períodos, seco e úmido.
Período Tratamento Seco Úmido Média PndG 6,29 8,1 7,20 A PdG 6,15 7,94 7,05 A PndN 4,62 5,95 5,28 B PdN 4,60 5,78 5,19 B Média 5,41 b 6,94 a
Médias seguidas de letras maiúsculas iguais na coluna e letras minúsculas na linha não diferem significativamente pelo teste Tukey a 5%. DMS período =0,33; DMS tratamento = 0,61; PndG = pólen fresco não dessecado conservado em geladeira; PdG = pólen fresco dessecado conservado em geladeira; PndN = pólen fresco não dessecado conservado em nitrogênio líquido; PdN = pólen fresco dessecado conservado em nitrogênio líquido.
Após um dia de conservação, amostras de pólen coletadas no período seco e em
período úmido apresentaram queda na porcentagem de germinação in vitro de 42 e 80%,
respectivamente. No terceiro dia, as amostras coletadas no período seco apresentaram
redução de 99%. Amostras do pólen coletado no período úmido apresentaram 97% de
queda na taxa germinação no sexto dia de conservação (Figura 14).
38
0 5 10 15 20 25 30Tempo (dias)
0
10
20
30
40
50
Ger
min
ação
(%)
Período 1 Y= 26,50 x Exp(-1,606X) r2= 0,97 (n=24)Período 2 Y= 28,14 x Exp(-0,931X) r2= 0,96 (n=24)
Figura 14 - Germinação in vitro de amostras de pólen de atemóia, em função do tempo de conservação e do período de coleta (Período 1= seco, Período 2 = úmido).
4.3.2 Cherimóia
A maior germinação in vitro foi observada quando se inocularam amostras de
polen fresco, independentemente do meio utilizado (Figuras 15A a 15C). Amostras de
pólen fresco inoculadas em meio A emitiram tubos polínicos que alcançaram tamanho
considerável após 1 hora de inoculação (Figura 15A). O PF inoculado sobre meio A
apresentou menor vigor que o mesmo pólen inoculado em meio BK. No meio A,
somente três horas após a inoculação, o PF atingiu comprimento semelhante ao
registrado na primeira hora para o meio BK (Figuras 15B, 15C e 15D).
Esse pólen mostrou-se bastante vigoroso, verificado pelo crescimento contínuo
dos tubos polínicos até 12 horas após a inoculação. Nas figuras 15B e 15C, pode-se
verificar o comprimento relativo desses tubos após três horas da inoculação. A condição
de maior potencial de viabilidade desse pólen pôde ser verificada inclusive pela
presença de núcleos resultantes da gametogênese (Figuras 15E e 15F).
A maior porcentagem de germinação foi observada em amostras coletadas no
período úmido (Tabela 13).
39
10 µm
F
10 µm
E
D
100 µm 100 µm
C
A
100 µm 100 µm
B
Figura 15 - Annona cherimola Mill. (cherimóia). Teste de germinação de pólen fresco (PF) em meio de cultura A. A- tétrades com tubos polínicos após 1 hora da inoculação; B-C – tétrades com tubos polínicos após 3 horas da inoculação; D – tétrades de PF em meio de cultura BK após 1 h de inoculação; E-F– Núcleos resultantes da gametogênese na extremidade do tubo polínico germinado (flechas).
40
Tabela 13 – Porcentagens médias de germinação in vitro, A- sobre dois meios de cultura (A e BK), de amostras de grãos de pólen de cherimóia B- fresco e amanhecido, coletadas em dois períodos (seco e úmido).
A Período B Período Meio Seco Úmido Média Pólen Seco Úmido Média A 26,08 29,44 27,76 B PA 19,93 22,53 21,23 BBK 30,26 33,85 32,05 A PF 36,41 40,73 38,59 AMédia 28,17 b 31,65 a Média 28,17 b 31,65 a
Médias seguidas de letras maiúsculas iguais na coluna e letras minúsculas iguais na linha não diferem significativamente pelo teste Tukey a 5%. DMS meio e pólen = 1,61.
Após doze horas da inoculação, tanto no PF quanto no PA (Figuras 16A e 16D),
observaram-se grãos de pólen em início de germinação, também foi observado emissão
de tubos polínicos em todos os arranjos considerados.
Amostras de pólen de cherimóia, inoculadas sobre o meio A, emitiram menor
porcentagem de tubos polínicos que as semeadas no meio BK (Figuras 17A a 17D e
Tabela 13).
A germinação in vitro das amostras de pólen de cherimóia coletadas no período
úmido foi 52% maior que as coletadas no período seco (Anexo 5).
Quando comparou-se a média da porcentagem de grãos de pólen conservados
em condições de geladeira, não foram observadas diferenças significativas na
germinação in vitro entre amostras de pólen dessecadas e não dessecadas. Resultado
semelhante foi observado para as amostras conservadas em nitrogênio líquido (Tabela
14).
Por outro lado, as amostras conservadas em geladeira germinaram, em média,
22% mais que aquelas conservadas em nitrogênio líquido, estando ou não as amostras
dessecadas (Tabela 14).
41
50 µm
A
50 µm
B
100 µm
D
50 µm
C
Figura 16 - Annona cherimola Mill. (cherimóia). Teste de germinação de pólen amanhecido (PA) em meio de cultura A. A- tétrades com tubos polínicos após 1 hora de inoculação; B–C - tétrades com início de emissão de tubos polínicos após período de 3 e 6 horas da inoculação respectivamente; D – tétrades com tubos polínicos após 12 horas da inoculação.
42
100 µm
B
100 µm
C
100 µm
D
100 µm
A
Figura 17 - Annona cherimola Mill. (cherimóia). Teste de germinação de pólen amanhecido (PA) em meio de cultura BK. A - tétrades após 1 hora de inoculação; B-D - tétrades com tubos polínicos após período de 3 horas, 6 horas e 12 horas da inoculação respectivamente. Tabela 14 - Porcentagens médias da germinação de grãos de pólen de cherimóia submetidos a diferentes tratamentos de conservação e coletados dois períodos, seco e úmido.
Período Tratamento Seco Úmido Média PndG 10,94 12,18 11,56 A PdG 10,31 11,91 11,11 A PndN 9,02 9,67 9,34 B PdN 9,00 9,50 9,25 B Média 9,82 b 10,81 a
Médias seguidas de letras maiúsculas iguais na coluna e letras minúsculas na linha não diferem significativamente pelo teste Tukey a 5%. DMS período =0,89; DMS tratamento = 1,66; PndG = pólen fresco não dessecado conservado em geladeira; PdG = pólen fresco dessecado conservado em geladeira; PndN = pólen fresco não dessecado conservado em nitrogênio líquido; PdN = pólen fresco dessecado conservado em nitrogênio líquido.
43
Independentemente do período de coleta das amostras (Figura 18) e dos
tratamentos a que foram submetidas as amostras de cherimóia (Figura 19), após o sexto
dia de conservação não foi observada emissão de tubos polínicos em cherimóia.
0 5 10 15 20 25 30Tempo (dias)
0
10
20
30
40
50
Ger
min
ação
(%)
Período 1 Y= 45,02 x Exp(-1,341X) r2= 0,99 (n=24)Período 2 Y= 47,74 x Exp(-1,203X) r2= 0,98 (n=24)
Figura 18 - Germinação in vitro de amostras de pólen de cherimóia, em função do tempo de conservação e do período de coleta (Período 1= seco, Período 2 = úmido).
44
0 5 10 15 20 25 30Tempo (dias)
0
10
20
30
40
50
Ger
min
ação
(%)
PndG Y= 46,08 x Exp(-0,920X) r2= 0,99 (n=12)PdG Y= 46,19 x Exp(-1,049X) r2= 0,98 (n=12)PndN Y= 46,47 x Exp(-1,582X) r2= 0,99 (n=12)PdN Y= 46,47 x Exp(-1,641X) r2= 0,99 (n=12)
Figura 19 - Germinação in vitro de amostras de pólen de cherimóia em função do tempo de conservação e dos tratamentos.
4.3.3 Pinha
Após doze horas da inoculação sobre o meio A (Figuras 20A a 20D) e meio BK,
observou-se grãos de pólen em início de germinação tanto em amostras de PF quanto de
PA. Foi observada emissão de tubos polínicos em todos os arranjos considerados.
As maiores porcentagens de germinação foram obtidas em amostras de PF
inoculadas sobre o meio BK.
Quanto aos períodos de coleta, as amostras coletadas no período úmido
continham grãos pólen com maior potencial germinativo, em relação às coletadas no
período seco (Tabela 15).
A porcentagem média de germinação das amostras do PF, em relação ao PA, foi
18% superior (Tabela 15A). Para as amostras coletadas no período úmido, foi observada
geminação 47% superior, em relação às coletadas no período seco (Tabela 15B).
45
25 µm
C
25 µm
D
25 µm
A B
25 µm
Figura 20 - Annona squamosa L. (pinha). A-D – teste de germinação em meio de cultura A - grãos de pólen amanhecido (PA) isolados e em tétrade em início de germinação.
Tabela 15 – Porcentagens médias de germinação in vitro, A- sobre dois meios de cultura (A e BK), de amostras de grãos de pólen de pinha B- fresco e amanhecido, coletadas em dois períodos (seco e úmido).
Médias seguidas de letras maiúsculas iguais na coluna e letras minúsculas iguais na linha não diferem significativamente pelo teste Tukey a 5%. DMS pólen e período = 1,19; DMS interação = 2,23.
As amostras de pólen coletadas no período úmido germinaram 52% mais que as
coletadas no período seco. Em relação às amostras conservadas em geladeira, não foi
observada diferença significativa na germinação in vitro dos grãos de pólen, estando as
amostras dessecadas ou não. Para amostras conservadas em nitrogênio líquido, o mesmo
A Período Meio Seco Úmido Média A 13,99Bb 18,24Ba 16,12 B BK 25,00Ab 37,60Aa 31,30 A Média 19,40 b 27,92 a
B Período Pólen Seco Úmido Média PA 17,81Bb 24,54Ba 21,17 B PF 21,18Ab 31,30Aa 26,24 A Média 19,40 b 27,92 a
46
foi observado. Amostras conservadas em geladeira germinaram 22% mais que as
amostras conservadas em nitrogênio líquido, submetidas ou não à dessecação prévia
(Tabela 16).
Após um dia de armazenamento foi observada queda de germinação de 70% e
56% para as amostras de pólen coletadas no período seco e úmido, respectivamente. No
terceiro dia, a redução na porcentagem de tubos polínicos emitidos foi de 97% e 96%,
nas amostras coletadas nos períodos seco e úmido, respectivamente (Figura 21).
Tabela 16 – Porcentagens médias da germinação de grãos de pólen de pinha submetidos a diferentes tratamentos de conservação e coletados dois períodos, seco e úmido.
Período Tratamento Seco Úmido Média PndG 7,32 11,18 9,25 A PdG 7,11 10,97 9,04 A PndN 6,14 9,10 7,62 B PdN 5,70 8,92 7,31 B Média 6,59 b 10,04 a
Médias seguidas de letras maiúsculas iguais na coluna e letras minúsculas na linha não diferem significativamente pelo teste Tukey a 5%. DMS período =0,51; DMS tratamento = 0,94; PndG = pólen fresco não dessecado conservado em geladeira; PdG = pólen fresco dessecado conservado em geladeira; PndN = pólen fresco não dessecado conservado em nitrogênio líquido; PdN = pólen fresco dessecado conservado em nitrogênio líquido.
No sexto dia de armazenamento não foram observadas germinações de pólen de pinha
em amostras coletadas tanto no período seco quanto no úmido (Figura 21).
A redução na emissão de tubos polínicos observada em pinha foi de 61% nas
amostras conservadas em geladeira e de 76% nas amostras que permaneceram em
nitrogênio líquido. Ao terceiro dia essas reduções eram de 95% nas duas condições de
conservação. Ao sexto dia, não foram observadas germinações, em nenhum dos
tratamentos aplicados às amostras (Figura 22).
47
0 5 10 15 20 25 30Tempo (dias)
0
10
20
30
40
50G
erm
inaç
ão (%
)Período 1 Y= 29,95 x Exp(-1,217X) r2= 0,98 (n=24)Período 2 Y= 44,67 x Exp(-1,249X) r2= 0,98 (n=24)
Figura 21 - Germinação in vitro de amostras de pólen de pinha, em função do tempo de conservação e do período de coleta (Período 1= seco, Período 2 = úmido).
0 5 10 15 20 25 30Tempo (dias)
0
10
20
30
40
50
Ger
min
ação
(%)
PndG Y= 36,49 x Exp(-0,916X) r2= 0,92 (n=12)PdG Y= 36,55 x Exp(-0,999X) r2= 0,92 (n=12)PndD Y= 36,91 x Exp(-1,440X) r2= 0,94 (n=12)PdN Y= 36,90 x Exp(-1,667X) r2= 0,94 (n=12)
Figura 22 - Germinação in vitro de amostras de pólen de pinha em função do tempo de conservação e dos tratamentos.
48
No anexo 6 é apresentado o resumo do quadro da análise de variância dos
resultados da porcentagem média de germinação in vitro de amostras de grãos de pólen
(PF e PA), coletados em períodos distintos (seco e úmido), germinando sobre dois
meios de cultura (A e BK) e com leituras feitas em uma, três, seis e 12 horas após a
inoculação dos grãos de pólen sobre os meios.
O resumo do quadro da análise de variância da porcentagem de germinação in
vitro em função do período de coleta, tratamentos e tempo de conservação, é
apresentado nos anexos 7 e 8.
4.4 Polinização
4.4.1 Atemóia
A fixação de frutos em flores de atemóia polinizadas com amostras de PF foi,
em média, 12% superior àquela em flores polinizadas com o PA. Quanto ao período de
coleta das amostras de PF e PA, foi verificado um percentual 23% maior de fixação de
frutos em flores polinizadas com amostras de pólen coletadas no período úmido (Tabela
17).
Tabela 17 – Resultados médios da porcentagem fixação de frutos em flores polinizadas com grãos de pólen (PF e PA) de atemóia.
Período Pólen Seco Úmido Média Amanhecido 59,08 74,99 67,04 B Fresco 65,90 84,08 74,99 A Média 64,49 b 79,54 a
Médias seguidas de letras maiúsculas iguais na coluna e letras minúsculas iguais na linha não diferem significativamente pelo teste Tukey a 5%. DMS pólen e período = 6,55.
Quando se usaram amostras de pólen conservadas em geladeira e nitrogênio
líquido, as flores polinizadas com amostras de pólen coletadas no período úmido
frutificaram 44% mais que as coletadas no período seco. Não foram observadas
diferenças significativas na fixação de frutos em flores polinizadas com amostras de
pólen dessecadas e não dessecadas, armazenadas em geladeira. O mesmo foi observado
49
entre as amostras conservadas em nitrogênio líquido. Submetidas ou não ao
dessecamento das amostras, flores polinizadas com amostras conservadas em geladeira
frutificaram em média 23% mais que as amostras conservadas em nitrogênio líquido
(Tabela 18).
Flores polinizadas com amostras de pólen coletadas no período seco e úmido,
após um dia de conservação, apresentaram redução de 91 e 76% na frutificação. Após o
terceiro dia de conservação, as amostras de todos os tratamentos praticamente não
fixaram frutos (Figuras 23, 24 e Anexo 9).
Tabela 18 - Resultados médios da porcentagem fixação de frutos em flores polinizadas com grãos de pólen de atemóia, em função dos tratamentos.
Tratamento Período Média Seco Úmido PndG 12,88 Ab 20,84 Aa 16,86 A PdG 12,88 Ab 17,80 Ba 15,34 A PndN 10,98 Ab 15,15 Ca 13,07 B PdN 10,98 Ab 15,15 Ca 13,07 B Média 11,93 b 17,24 a
Médias seguidas de letras maiúsculas iguais na coluna e letras minúsculas na linha não diferem significativamente pelo teste Tukey a 5%. DMS período =1,00; DMS tratamento = 1,86; DMS do desdobramento = 2,60. PndG = pólen fresco não dessecado conservado em geladeira; PdG = pólen fresco dessecado conservado em geladeira; PndN = pólen fresco não dessecado conservado em nitrogênio líquido; PnD = pólen fresco dessecado conservado em nitrogênio líquido.
50
0 5 10 15 20 25 30Tempo (dias)
0
20
40
60
80
100
Frut
os fi
xado
s (%
)
Período 1 Y= 65,90 x Exp(-2,450X) r2= 0,99 (n=24)Período 2 Y= 84,04 x Exp(-1,677X) r2= 0,98 (n=24)
Figura 23 – Fixação de frutos em flores polinizadas com amostras de grãos de pólen de atemóia, em função do tempo de conservação e do período de coleta (Período 1= seco, Período 2 = úmido).
0 5 10 15 20 25 30Tempo (dias)
0
20
40
60
80
100
Frut
os fi
xado
s (%
)
PndG Y= 74,86 x Exp(-1,211X) r2= 0,95 (n=12)PdG Y= 74,95 x Exp(-1,681X) r2= 0,98 (n=12)PndN Y= 74,99 x Exp(-3,090X) r2= 0,98 (n=12)PdN Y= 74,99 x Exp(-3,090X) r2= 0,98 (n=12)
Figura 24 – Fixação de frutos em flores polinizadas com amostras de grãos de pólen de atemóia, em função do tempo de conservação e dos tratamentos.
51
4.4.2 Cherimóia
A polinização de flores com amostras de PF resultou, em média, na fixação de
90,90% de frutos. Em polinizações com amostras de PA a fixação de frutos foi de
77,26%, ou seja, foram observados 18% mais frutos fixados em flores polinizadas com
amostras de PF (Tabela 19).
Quanto ao período de coleta das amostras de PF e PA, flores polinizadas com
amostras de pólen coletadas no período úmido fixaram 14% mais frutos que as
polinizadas com amostras coletadas no período seco (Tabela 19).
A fixação de frutos com amostras de pólen coletadas no período úmido foi, em
média, 44% maior que nas polinizações realizadas com amostras coletadas no período
seco. Não foi observada diferença significativa na fixação de frutos entre flores
polinizadas com amostras de pólen dessecadas e não dessecadas, quando conservados
em nitrogênio líquido. Porém, quando as amostras foram conservadas em geladeira,
observou-se que as polinizações efetuadas com amostras de pólen não dessecadas
fixaram aproximadamente 21% mais frutos que quando realizadas com amostras de
pólen dessecadas. Polinizações com amostras conservadas em geladeira resultaram em
aproximadamente 61% mais fixação de frutos, em relação às amostras conservadas em
nitrogênio, sendo elas dessecadas ou não (Tabela 20).
Tabela 19 - Resultados médios da porcentagem fixação de frutos em flores polinizadas com grãos de pólen (PF e PA) de cherimóia.
Pólen Período Média Seco Úmido Amanhecido 70,45 84,08 77,26 B Fresco 86,35 95,45 90,90 A Média 78,40 b 89,77 a
Médias seguidas de letras maiúsculas iguais na coluna e letras minúsculas iguais na linha não diferem significativamente pelo teste Tukey a 5%. DMS pólen e período = 5,35.
Amostras coletadas tanto no período seco quanto no período úmido, após o
terceiro dia de conservação, não fixaram frutos em polinizações de flores de cherimóia
(Figura 25).
52
Tabela 20 - Resultados médios da porcentagem de fixação de frutos em flores polinizadas com grãos de pólen de cherimóia, em função dos tratamentos.
Tratamento Período Média Seco Úmido PndG 24,99 28,41 26,70 A PdDG 20,46 23,49 21,97 B PndN 15,91 18,18 17,04 C PdN 15,53 17,80 16,16 C Média 11,93 b 17,24 a
Médias seguidas de letras maiúsculas iguais na coluna e letras minúsculas na linha não diferem significativamente pelo teste Tukey a 5%. DMS período = 0,92; DMS tratamento = 1,72; PndG = pólen fresco não dessecado conservado em geladeira; PdG = pólen fresco dessecado conservado em geladeira; PndN = pólen fresco não dessecado conservado em nitrogênio líquido; PnN = pólen fresco dessecado conservado em nitrogênio líquido.
0 5 10 15 20 25 30Tempo (dias)
0
20
40
60
80
100
Frut
os fi
xado
s (%
)
Período 1 Y= 86,19 x Exp(-1,271X) r2= 0,94 (n=24)Período 2 Y= 95,17 x Exp(-1,144X) r2= 0,94 (n=24)
Figura 25 – Fixação de frutos em flores polinizadas com amostras de grãos de pólen de cherimóia, em função do tempo de conservação e do período de coleta (Período 1= seco, Período 2 = úmido).
Estando as amostras dessecadas ou não, em média, após um dia de conservação
a queda na fixação frutos foi de 95% e 75% para o pólen conservado em geladeira e em
nitrogênio líquido, respectivamente No terceiro dia de armazenamento foi observada
53
redução na frutificação de 97% e 100% para amostras de pólen conservadas em
geladeira e em nitrogênio líquido, respectivamente. Para todos os tratamentos, a partir
do sexto dia de conservação, não houve fixação de frutos (Figura 26 e Anexo 10).
0 5 10 15 20 25 30Tempo (dias)
0
20
40
60
80
100
Frut
os fi
xado
s (%
)
PndG Y= 94,45 x Exp(-0,612X) r2= 0,95 (n=12)PdG Y= 90,24 x Exp(-1,026X) r2= 0,98 (n=12)PndN Y= 99,90 x Exp(-2,079X) r2= 0,99 (n=12)PdN Y= 90,90 x Exp(-2,302X) r2= 0,99 (n=12)
Figura 26 – Fixação de frutos em flores polinizadas com amostras de grãos de pólen de cherimóia, em função do tempo de conservação e dos tratamentos.
4.4.3 Pinha
Quando foram utilizadas amostras de PF de pinha nas polinizações, em média,
aproximadamente 78% das flores polinizadas resultaram em frutos, ao passo que,
quando foram utilizadas amostras de PA, foi observada a fixação de 69% de frutos
(Tabela 21).
Polinizações realizadas com amostras de pólen coletadas no período úmido
foram 24% mais eficientes na fixação de frutos de pinha que quando realizadas
amostras coletadas no período seco (Tabela 21).
Amostras coletadas no período úmido fixaram 35% mais frutos que as amostras
coletadas no período seco, considerando a média de todos os tratamentos aplicados. Na
fixação de frutos, em flores de pinha polinizadas com amostras de pólen dessecadas e
não dessecadas, não foram observadas diferenças significativas quando conservadas em
54
nitrogênio líquido. Foi observada uma diferença de 18% maior entre a fixação de frutos
em polinizações realizadas com amostras de pólen não dessecado em relação às
polinizações com amostras dessecadas, quando foram utilizadas nas polinizações
amostras mantidas em geladeira. (Tabela 22).
Tabela 21 - Resultados médios da porcentagem de fixação de frutos em flores polinizadas com grãos de pólen (PF e PA) de pinha.
Pólen Período Média Seco Úmido Amanhecido 61,36 77,26 69,31 B Fresco 70,45 86,35 78,40 A Média 65,90 b 81,81 a
Médias seguidas de letras maiúsculas iguais na coluna e letras minúsculas iguais na linha não diferem significativamente pelo teste Tukey a 5%. DMS pólen e período = 5,35.
Tabela 22 - Resultados médios da porcentagem de fixação de frutos em polinizações com amostras de grãos de pólen de pinha, em função dos tratamentos.
Tratamento Período Média Seco Úmido PndG 16,67 Ab 23,48 Aa 20,08 A PdG 14,77 Ab 19,32 Aa 17,05 B PndN 11,74 Bb 15,91 Ba 13,82 C PnD 11,74 Bb 15,53 Ba 13,64 C Média 13,73 b 18,56 a
Médias seguidas de letras maiúsculas iguais na coluna e letras minúsculas na linha não diferem significativamente pelo teste Tukey a 5%. DMS período = 0,92; DMS tratamento = 1,72; DMS do desdobramento = 2,40. PndG = pólen fresco não dessecado conservado em geladeira; PdG = pólen fresco dessecado conservado em geladeira; PndN = pólen fresco não dessecado conservado em nitrogênio líquido; PdN = pólen fresco dessecado conservado em nitrogênio líquido.
Para amostras submetidas ou não ao pré-tratamento de dessecação, em média,
foi observado que, em função do período de coleta das amostras, o percentual de
frutificação das amostras coletadas no período seco apresentou queda de 74%, amostras
coletadas no período úmido, 68% de redução, após um dia de armazenamento. Ao
terceiro dia de armazenamento esses percentuais estavam próximos a 95% em ambas as
amostras (Figura 27).
55
0 5 10 15 20 25 30Tempo (dias)
0
20
40
60
80
100
Frut
os fi
xado
s (%
)
Período 1 Y= 70,44 x Exp(-2,161X) r2= 0,97 (n=24)Período 2 Y= 86,24 x Exp(-1,458X) r2= 0,96 (n=24)
Figura 27 – Fixação de frutos em flores polinizadas com amostras de grãos de pólen de pinha, em função do tempo de conservação e do período de coleta (Período 1= seco, Período 2 = úmido).
Em função dos tratamentos, após um dia de conservação, em média, a redução
na fixação de frutos foi de 95% em polinizações realizadas com amostras de pólen
conservadas em nitrogênio líquido, sendo registrada a fixação média de apenas um fruto
nas polinizações realizadas com amostras dessecadas ou não, mantidas nessa condição.
Após esse período, a fixação de frutos em flores polinizadas com amostras conservadas
em nitrogênio líquido foi nula (Figura 28 e Anexo 11).
Após um dia de armazenamento em geladeira, foi verificada redução de 57% na
fixação de frutos para as polinizações efetuadas com amostras de pólen não dessecadas,
verificando-se a fixação média de três frutos quando utilizadas essas amostras. Para as
amostras dessecadas e conservadas em geladeira pelo mesmo período de um dia,
observou-se a fixação média de dois frutos. No terceiro dia de armazenamento,
registrou-se a fixação média de um fruto para as polinizações realizadas com amostras
dessecadas ou não e conservadas em geladeira. Após o sexto dia de conservação das
amostras em geladeira, não foram observadas frutificações, submetidas ou não ao
dessecamento (Figura 28 e Anexo 11).
56
0 5 10 15 20 25 30Tempo (dias)
0
20
40
60
80
100
Frut
os fi
xado
s (%
)
PndG Y= 77,59 x Exp(-0,840X) r2= 0,96 (n=12)PdG Y= 78,26 x Exp(-1,531X) r2= 0,97 (n=12)PndN Y= 78,40 x Exp(-2,847X) r2= 0,98 (n=12)PdN Y= 78,40 x Exp(-3,134X) r2= 0,98 (n=12)
Figura 28 – Fixação de frutos em flores polinizadas com amostras de grãos de pólen de pinha, em função do tempo de conservação e dos tratamentos.
Os resumos das análises de variância encontram-se nos anexos 12 e 13.
57
5 DISCUSSÃO
5.1 Microsporogênese
O estudo da microsporogênese é fundamental para se determinar problemas de
viabilidade do pólen oriundos de anomalias nas divisões meióticas. Dessa forma,
resultados de estudos de conservação de pólen poderiam ser mascarados tomando-se
amostragens de grãos de pólen portadores dessas anomalias meióticas, o que reflete na
qualidade inferior do pólen conservado, que acarreta o desbalanceamento genético dos
gametas e outras anomalias e não em função dos métodos empregados para a
conservação.
Na tabela 1, verifica-se que a maior porcentagem de anormalidades meióticas
ocorreu na atemóia. Isso significa que houve menor porcentagem de células normais
formadas durante a microsporogênese. De certa forma, tal resultado era esperado devido
o fato dessa fruteira ser resultante de um cruzamento interespecífico.
No presente trabalho foram registrados índices meióticos de aproximadamente
74% para o híbrido atemóia, menores que os obtidos por LOVE (1949) em trigo (90%)
e em confrei (85%) por BATTISTIN et al. (2006). Os resultados não resultaram em má
qualidade ou esterilidade total do pólen produzido pela atemóia, haja vista a formação
de sementes viáveis por esse híbrido. Isso sugere que, para o híbrido, esses valores
possam estar superestimados.
Os valores dos índices meióticos de pinha, A. squamosa (95%) e cherimóia, A.
cherimola (98%) obtidos, quando comparados aos índices observados em trigo e confrei
citados anteriormente, sugerem maior estabilidade meiótica, como já era esperado nos
parentais.
As anomalias meióticas observadas como, presença de pontes anafásicas,
bivalentes fora da placa, cromossomos retardatários, entre outras (Tabela 11),
provavelmente, são responsáveis pela maior porcentagem de pólen estéril no híbrido
estudado, ou seja, na atemóia. Resultados semelhantes foram observados por ZADOO
(1984) em análises meióticas em confrei.
58
5.2 Colorimetria
PINTO-MAGLIO (2003) relata perdas de viabilidade de 70 a 80% em amostras
de pólen que são colhidos e armazenados por breves períodos (12 horas) para posterior
utilização.
Analisando-se os dados obtidos pelo teste de colorimetria como, por exemplo, a
porcentagem de grãos de pólen coloridos, pode-se constatar que o pólen fresco (pólen
padrão), foi o que apresentou maior porcentagem de pólen viável, sendo justificável
pelo fato de ter sido considerado o pólen testemunha ou pólen padrão (Tabelas 3, 6 e 9).
Tal comportamento foi verificado para os três materiais testados, sendo a diferença
significativa estatisticamente. Com relação aos tratamentos de conservação, as amostras
de pólen oriundas do período úmido, de forma geral, apresentaram melhor perfomance
em todos os testes aplicados. Esta informação tem importância prática para os
produtores, no aspecto de uma recomendação para que instalem seus pomares em locais
mais úmidos, ou que, em pomares já formados, utilizem a prática de irrigação,
preferencialmente aspersão, na época da floração.
Estudo realizado no mês de janeiro por SAAVEDRA (1977), no Chile, mostrou
que a aspersão de água em flores de cherimóia recém polinizadas aumentou a fixação de
frutos, quando comparado com os resultados de frutificações efetivas obtidos em flores
não submetidas ao umedecimento. O autor relacionou o maior número de frutos
resultantes à redução do efeito da desidratação do pólen e do estigma das flores, uma
vez que o trabalho foi realizado em período seco do ano, nas condições chilenas.
Nesse sentido, o escalonamento na produção de frutos de anonas, através da
prática da poda das plantas, deve ser criteriosamente analisado pelo produtor, de forma
que a época de floração e, conseqüentemente, a coleta de pólen e polinizações manuais
venham a coincidir com períodos relativamente mais úmidos do ano.
Com relação aos diferentes tratamentos de conservação empregados, pode-se
observar que o teste de colorimetria mostrou que a maior porcentagem de grãos de
pólen viáveis foi obtida em amostras de pólen não dessecadas e conservadas em
nitrogênio líquido para a espécie cherimóia (Tabela 7). Já para atemóia e pinha, o
melhor resultado foi observado em amostras de pólen dessecado e armazenado em
nitrogênio líquido (Tabelas 4 e 10).
As análises polínicas indicam maior viabilidade do pólen para cherimóia e pinha
tanto nos testes de colorimetria, germinação in vitro quanto nos de polinização
59
efetuados a campo, quando comparados à atemóia. Em relação à germinação in vitro foi
verificada porcentagens de emissão de tubos polínicos de 38,59% para cherimóia,
36,9% para pinha e 19,7% em atemóia. Quanto à fixação de frutos: 90,9% para
cherimóia, 78,4% para pinha e 74,99% para atemóia (Tabelas 11, 13, 15, 17, 19 e 21).
Baseado no teste de colorimetria, tanto para o PF quanto para o PA, verificou-se
ainda que a maioria dos arranjos observados nos grãos de pólen de atemóia, cherimóia e
pinha foi do tipo tétrade, nos dois períodos de coleta (Tabelas 2, 5 e 8). Dentre as
anonas testadas, constata-se que a atemóia foi a que apresentou menor porcentagem de
arranjos em tétrade, quando comparada às demais. Para essa anona, uma porcentagem
significativa de arranjos tríades (15%) e díades (12%) foi observada (Tabela 2),
confirmando sua origem híbrida. Já para cherimóia e pinha (Tabelas 5 e 8), observou-se
em média a presença de 90% de tétrades nos grãos de pólen avaliados.
A presença de arranjos díades e mônades foi relativamente menor nas amostras
de pólen avaliadas das três anonas. Fato semelhante foi observado para a porcentagem
de grãos de pólen vazios (Tabelas 2, 5 e 8). Segundo estudos de COPENHAVER
(2005), a formação de tétrades é a mais comum nas anonáceas; dentre os 23 gêneros
englobando 83 espécies de anonáceas, apenas quatro delas formam mônades. A
implicação biológica da formação de tétrade está relacionada com polinizadores
específicos como os besouros nutidolídeos, uma vez que o pólen formado por essas
anonas é pesado e “pegajoso”. Na prática, esse fato demanda polinizações manuais,
principalmente onde a população de besouros é pequena ou inexistente.
Com relação aos tratamentos de conservação (PndG, PdG, PndN e PdN) pode-
se observar que o teste de colorimetria mostra diminuição gradativa de coloração ainda
indicando falsamente a manutenção da viabilidade, pela alta porcentagem de grãos de
pólen coloridos obtidos nas diferentes amostras de pólen de atemóia, cherimóia e pinha
(Tabelas 4, 7 e 10). Esses resultados evidenciam a importância de se utilizar
preferencialmente pólen recém coletado das flores para a realização da polinização
manual ou mesmo a transferência direta de pólen das flores macho para as flores
fêmeas.
60
5.3 Germinação in vitro
Com relação ao pólen utilizado, maior porcentagem de germinação foi obtida
quando se utilizaram amostras de pólen fresco, coletadas no período úmido para ambas
as espécies e para o híbrido estudado (Tabelas 11B, 13B e 15B), o que de certa forma
era esperado para o pólen considerado padrão.
Quando comparada a germinação in vitro do PF em relação ao PA sobre o
mesmo meio de cultura, notou-se maior vigor do pólen recém coletado, dado pelo
desenvolvimento mais rápido dos tubos polínicos, ou seja, observou-se crescimento
relativamente maior em um mesmo período de horas (Figuras 16A, 16B e 16C). Dessa
forma, em relação ao crescimento do tubo polínico foi possível observar que o
comprimento do tubo polínico do PA, após 12 horas de inoculação sobre o meio A
(Figura 16D), era proporcional ao comprimento atingido pelos tubos polínicos do PF ao
redor das três horas de inoculação (Figuras 9A a 9C). Essa observação pode estar
relacionada aos menores resultados alcançados pelo PA, nos testes de colorimetria,
germinação in vitro e polinização a campo aplicados.
Nos testes de conservação, também verificou-se que as amostras de pólen
coletadas no período úmido e conservadas em geladeira, independentemente do
tratamento de dessecação, foram os que apresentam os melhores resultados quanto a
manutenção da viabilidade de modo geral (Tabelas 12, 14 e 16). ROSELL et al. (2006),
não observaram diferenças na germinação in vitro em amostras de pólen recolhidas 90
minutos após a deiscência de flores de cherimóia, em relação ao pólen deiscente fresco.
Porém, 120 minutos após a deiscência, as amostras apresentavam redução significativa
na porcentagem de germinação in vitro. Esses autores relataram baixa germinação in
vivo em amostras de pólen coletadas antes da deiscência natural das flores, relacionando
esse fato à importância das últimas horas antecedentes à antese para o completo
desenvolvimento do pólen.
Os testes de germinação in vitro, evidenciaram que as maiores porcentagens de
emissão de tubos polínicos em grãos de pólen (PF e PA) de atemóia, cherimóia e pinha
foram obtidos quando as amostras foram inoculadas sobre o meio de cultura BK
(Tabelas 11A, 11B, 13A, 13B, 15A e 15B). Provavelmente o tipo de agar utilizado
dever ter influenciado na germinação dos grãos de pólen. A consistência do meio de
cultura depende da concentração de agar, dentre outros fatores que interferem na
germinação dos grãos de pólen (CALDAS et al., 1998). Outro aspecto a ser considerado
61
é que, segundo SHIVANNA & RANGASWAMY (1992), períodos de florescimento,
horários de coleta de pólen, ambientes e genótipos influenciam na germinação in vitro
do pólen.
Comparando-se as duas condições de conservação (geladeira e nitrogênio),
constatou-se que os grãos de pólen não dessecados e conservados na geladeira foram os
que mantiveram o maior potencial germinativo (Tabelas 12, 14 e 16), nas três fruteiras
estudadas. Observa-se que, nas condições em que foi realizado o experimento, a
geladeira foi a que proporcionou melhores condições de conservação de grãos de pólen
nos três materiais. Além disso, também constatou-se que houve decréscimo linear na
porcentagem de grãos de pólen identificados como viáveis pelo corante Alexander,
durante o período de conservação (Figuras 8, 11 e 13). Para a germinação in vitro
(Figuras 19 e 22) e fixação de frutos (Figuras 24, 26 e 28) esse decréscimo foi
exponencial em função do período de conservação. SCHROEDER (1942), estudando
diferentes variedades de abacate, demonstrou que pólen conservado a baixas
temperaturas, mantinha sua viabilidade por diferentes períodos, podendo ser utilizado
em cruzamentos. GUIRADO et al. (2004) constatou que o pólen de cherimóia retirado
de flores macho melhorava a sua performance quando conservado em temperaturas
entre 3 e 7 ºC, quando comparado com pólen conservado em temperatura ambiente
(20º).
Segundo STANLEY & LINSKENS (1974), nenhum teste é completamente
satisfatório, principalmente após o pólen ter sido armazenado, pelas seguintes razões: os
testes químicos usam corantes que reagem com constituintes químicos ou estruturas
cuja presença pode não refletir a capacidade do grão de pólen germinar. GALLETA
(1983) cita ainda, que comparações entre métodos para estimar a viabilidade do pólen, a
exemplo da colorimetria e da germinação in vitro, podem fornecer resultados
discrepantes. BARNABAS (1985) verificou, em milho, que o aumento ou diminuição
acentuada de temperatura pode inativar o controle de crescimento do tubo polínico.
Embora não tenham sido observadas diferenças significativas na emissão de
tubos polínicos entre as amostras de pólen dessecadas e não dessecadas, numa mesma
condição de conservação (geladeira ou nitrogênio), foram registradas diferenças entre as
duas condições (Tabelas 12, 14 e 16). Esses resultados sugerem que as condições de
conservação de amostras de pólen das anonas estudadas foram muito importantes para a
manutenção da viabilidade e longevidade dos grãos de pólen, independentemente das
amostras terem sido dessecadas ou não. Dessa forma, estudos relacionados à dessecação
62
poderiam contribuir significativamente para a determinação de uma condição ideal para
a conservação do pólen dessas fruteiras, uma vez que tempos diferentes de dessecação
proporcionariam teores de umidade distintos, de tal sorte a permitir sua conservação.
5.4 Polinizações
Os melhores resultados para a fixação de frutos para as três anonas, oriundos da
polinização manual a campo, foram obtidos utilizando-se amostras de pólen recém
coletado, no período úmido (Tabelas 17, 19 e 21), esse resultado já era esperado uma
vez que o pólen fresco possui, naturalmente, maior potencial germinativo, aliado a
condições ambientais favoráveis à manutenção da qualidade do pólen.
Muitos são os fatores que influenciam na germinação do grão de pólen sobre o
estigma das flores no campo. Dentre eles, a temperatura e a umidade relativa são os
fatores mais importantes (MENZEL & SIMPSON, 1994). Destaca-se, ainda, que o
manejo do pólen também influencia na germinação e, conseqüentemente, na fixação e
frutificação efetiva em polinizações de flores de pinha (MANICA, 2003). Em pêssego,
HEDHLY et al. (2005) também cita que elevadas temperaturas aliadas à baixa umidade
do pólen afetam a cinética do tubo polínico, prejudicando a emissão do tubo e,
conseqüentemente, afetando a taxa de fertilização no campo. Segundo MANICA
(2003), é possível obter 100% de frutificação em atemóia realizando polinizações
manuais corretamente e na época certa. O autor cita ainda que, ensaios de polinização
artificial realizados com Annona squamosa, na Estação Experimental de Macaé (RJ),
resultaram em 98% de frutificação. Esses resultados são similares aos obtidos no
presente trabalho com pólen fresco de Annona squamosa, onde foram alcançados 86%
de frutificação.
O melhor resultado de conservação de grãos de pólen foi obtido quando as
amostras de pólen não dessecadas foram conservadas em geladeira para todas as anonas
estudadas (Tabelas 18, 20 e 22). Para curto período de tempo, a geladeira tem se
mostrado excelente opção para conservação de pólen de diversas fruteiras, hortaliças e
espécies florestais. Entretanto, o presente resultado difere do trabalho realizado com
pólen de uva no qual BOYDEN & COUSINS (2003) verificaram maior eficiência de
conservação em temperaturas abaixo de -20ºC.
Os dados resultantes das análises da microsporogênese nas três anonas aqui
estudadas explicam de certa forma os resultados obtidos por MELO et al. (2002 a), que
63
ressalta que polinizações em flores de atemóia com pólen de pinha são mais efetivas que
as realizadas com o pólen do próprio híbrido. Isso porque as análises da
microsporogênese mostraram que os maiores índices de anomalias foram registrados na
meiose das células mãe de pólen de atemóia, quando comparado às de cherimóia e
pinha (Tabela 1). Conseqüentemente essas anomalias resultaram em grãos de pólen
desbalanceados geneticamente. Tais anomalias presentes em atemóia refletiram de certa
maneira nos testes de colorimetria pela menor porcentagem de grãos viáveis (coloridos),
nos testes de germinação in vitro pela menor emissão de tubos polínicos e na
porcentagem de fixação de frutos, quando comparados aos mesmos resultados destes
testes obtidos nos parentais (Anexo 2).
Quanto à fixação de frutos de pinha, os resultados aqui obtidos (86%) com
pólen fresco foram muito próximos aos 80% obtidos por KILL & COSTA (2003), em
polinizações cruzadas, utilizando o pólen da espécie.
No presente trabalho, observou-se acentuada queda na porcentagem de fixação
de frutos, em função do tempo de conservação, quando amostras de pólen submetidas
aos diferentes tratamentos (pré-dessecação e temperatura de conservação) foram
utilizadas na polinização, em ambos períodos de coleta (Figuras 23, 24, 25, 26, 27 e 28).
Esse resultado indica que há necessidade de maiores estudos relacionados com os
métodos e técnicas de conservação de modo a proporcionar maior longevidade ao pólen
dessas anonas, inclusive com repetições anuais, pois em estudo realizado por SPARKS
& YATES (2008) em pecan, foram registradas diferenças na longevidade e viabilidade
do pólen conservado, proveniente de diferentes amostras que haviam sido coletadas em
anos sucessivos.
Pelo fato deste estudo estar relacionado a projeto de dissertação, não foi possível
realizar maior número de repetições anuais dentro do prazo regularmente exigido para a
conclusão da dissertação (dois anos), uma vez que as anonas possuem períodos de
floração concentrados apenas no segundo semestre do ano.
Repetições anuais adicionais dos testes aplicados neste estudo, nas mesmas
espécies e híbrido, serão necessárias para que se possa estabelecer, com mais segurança,
padrões metodológicos para conservação de pólen de anonas e, eventualmente, registrar
a ocorrência de influências climáticas e/ou ambientais no processo de conservação do
pólen destas fruteiras.
64
6 CONCLUSÕES
Os testes de conservação realizados permitem concluir que:
• Os testes com nitrogênio líquido, para todas as amostras de pólen, podem ser
considerados ineficientes pois não aumentam a longevidade do pólen das anonas
estudadas.
• O pólen fresco (PF) ou pólen padrão, não dessecado, coletado em período
úmido e conservado em geladeira (4 a 5oC), apresenta, em média, uma
sobrevida de 24 horas, com perda de vigor germinativo.
• O pólen fresco nas três fruteiras estudadas apresenta maiores taxas para as
características de vigor, viabilidade e longevidade em todos os testes aplicados.
• O meio BK é o meio de cultura mais adequado para a avaliação da germinação
in vitro do pólen das espécies e do hibrido estudados.
• O tempo de dessecação de 90 minutos, nos três materiais estudados, não
influencia a viabilidade ou o aumento da longevidade do pólen.
• Nas três anonas analisadas há predominância na formação de pólen em arranjos
do tipo tétrades.
• Para os três materiais o pólen coletado no período úmido mostra maior
fecundidade, verificada pelo aumento significativo da frutificação.
• Apesar de ter sido registrada a ocorrência de anormalidades meióticas nos três
materiais, estas não interferem significativamente na viabilidade polínica.
65
7 REFERÊNCIAS
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8 ANEXOS
Anexo 1 – Datas, temperaturas e umidade relativa de coletas (*) e polinizações de flores de cherimóia, pinha e atemóia.
Planta/Local Período seco Período úmido Data T °C UR (%) Data T °C UR (%)
Cherimóia (Pedra Bela)
08/10/07* 21,6 53 16/11/07* 16,8 91 09/10/07 21,8 53 17/11/07 16,4 89 11/10/07 20,4 49 19/11/07 18,6 88 14/10/07 22,6 48 22/11/07 18,4 89 23/10/07 23,2 79 01/12/07 19,2 87 07/11/07 18,8 91 16/12/07 20,6 91
Pinha e Atemóia (Lins)
16/10/07* 23,2 43 29/11/07* 21,8 86 17/10/07 24,0 43 30/11/07 23,8 84 19/10/07 23,4 42 02/12/07 21,8 80 22/10/07 25,6 42 05/12/07 22,6 78 31/10/07 26,2 76 14/12/07 22,2 88 15/11/07 24,8 88 29/12/07 23,4 87
Anexo 2 – Porcentagem do índice meiótico, colorimetria, germinação in vitro, e frutos fixados de atemóia, cherimóia e pinha.
Planta Índice meiótico(1) Colorimetria(2) Germinação in vitro(3) Frutos fixados(4)
% Atemóia 73,7± 3,26 88,7± 0,8 28,3± 2,4 84,1± 4,5 Cherimóia 97,8± 2,05 99,5± 0,2 47,9± 6,8 95,5± 5,1 Pinha 94,8± 3,29 95,9± 0,8 44,8± 4,2 86,4± 5,1
(1)Intervalo de confiança (IC 95%) para as médias dos índices meióticos; (2) IC 95% para as médias das porcentagens de grãos corados; (3) IC 95% para a porcentagem de grãos de pólen germinados in vitro seis horas após a inoculação; IC 95% para a porcentagem de frutos fixados aos 15 dias após a polinização.
Anexo 3 - Resultados do valor do teste F para colorimetria de amostras de grãos de pólen (fresco e amanhecido), coletadas em dois períodos (seco e úmido).
Plantas Atemóia Cherimóia Pinha F.V. G.L. F Pr < F F Pr < F F Pr < F Pe 1 136,18 <0,0001 20,05 0,0008 21,86 <0,0001 Po 1 163,67 <0,0001 33,63 <0,0001 146,11 <0,0001 Pe x Po 1 47,87 <0,0001 9,01 0,0110 1,09 0,3173 C.V. 0,82 0,69 0,96 Pe = período de coleta; Po = pólen.
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Anexo 4 - Resultados do valor do teste F da colorimetria de amostras de grãos de pólen submetidos a diferentes tratamentos, períodos de coleta e tempo de conservação.
Planta Atemóia Cherimóia Pinha F.V. G.L. F Pr < F F Pr < F F Pr < F Pe 1 703,65 <0,0001 0,30 0,5824 1.059,66 <0,0001 Tr 3 23,45 <0,0001 24,17 <0,0001 65,82 <0,0001 Te 5 838,87 <0,0001 213,75 <0,0001 1.025,61 <0,0001 Pe x Tr 3 4,57 0,0044 29,88 <0,0001 7,46 0,0001 Pe x Te 5 32,61 <0,0001 11,21 <0,0001 73,83 <0,0001 Tr x Te 15 42,03 <0,0001 19,25 <0,0001 15,37 <0,0001 Pe x Tr x Te 15 3,29 0,0001 22,87 <0,0001 12,73 <0,0001 C.V. (%) 2,33 2,33 1,63
Pe = período de coleta; Tr = tratamento; Te = tempo.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12Tempo (horas)
0
10
20
30
40
50
60
Ger
min
ação
(%)
Pólen 1 Y= 4,08 + 29,37 log X r2= 0,95 (n=4)Pólen 2 Y= 23,81 + 25,31 log X r2= 0,99 (n=4)
Anexo 5 - Germinação in vitro de amostras de pólen de cherimóia (PA- Pólen 1 e PF- Pólen 2) em função do tempo de inoculação.
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Anexo 6 - Resultados do valor do teste F para a porcentagem de germinação in vitro de amostras de grãos de pólen (PF e PA), coletadas em dois períodos (seco e úmido), germinando sobre dois meios de cultura (A e BK).
Planta Atemóia Cherimóia Pinha F.V. G.L. F Pr < F F Pr < F F Pr < F Pe 1 170,93 <0,0001 18,44 <0,0001 195,57 <0,0001 Me 1 447,00 <0,0001 28,12 <0,0001 635,22 <0,0001 Po 1 61,34 <0,0001 459,88 <0,0001 70,81 <0,0001 Te 3 42,08 <0,0001 245,12 <0,0001 97,61 <0,0001 Pe x Po 1 5,67 0,0193 1,18 0,2809 7,79 0,0058 Pe x Me 1 28,52 <0,0001 0,02 0,8922 48,19 <0,0001 Pe x Te 3 0,73 0,5359 1,83 0,1469 3,44 0,0198 Po x Me 1 0,63 0,4307 0,60 0,4408 0,01 0,9371 Po x Te 3 0,22 0,8846 5,27 0,0021 1,88 0,1382 Me x Te 3 1,75 0,1629 2,06 0,1102 4,99 0,0029 Po x Me x Te 3 1,84 0,1445 0,21 0,8898 1,27 0,2900 Pe x Po x Me 1 3,71 0,0569 0,26 0,6167 0,03 0,8655 Pe x Po x Te 3 1,43 0,2386 1,21 0,3098 0,27 0,8442 Pe x Me x Te 3 3,34 0,0065 0,78 0,5091 3,84 0,0122 Pe x Po x Me x Te 3 2,80 0,0439 0,10 0,9596 2,40 0,0728 C.V. (%) 17,57 15,31 14,37
Pe = período de coleta; Me = meio de cultura; Po = pólen; Te = tempo.
Anexo 7 - Resultados do valor do teste F para a porcentagem de germinação in vitro de amostras de grãos de pólen (PF e PA), coletadas em dois períodos.
Plantas Atemóia Cherimóia Pinha F.V. G.L. F Pr < F F Pr < F F Pr < F Pe 1 3,62 0,0812 0,66 0,4329 32,54 <0,0001 Po 1 3,42 0,0890 28,59 0,0002 6,03 0,0303 Pe x Po 1 0,96 0,3461 0,03 0,8698 1,54 0,2388 C.V. 14,92 14,55 13,30
Pe = período de coleta; Po = pólen.
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Anexo 8 - Resultados do valor do teste F para a porcentagem média de germinação de amostras de grãos de pólen submetidas a diferentes tratamentos, períodos de coleta e tempo de conservação.
Planta Atemóia Cherimóia Pinha F.V. G.L. F Pr < F F Pr < F F Pr < F Pe 1 85,80 <0,0001 4,85 0,0292 184,80 <0,0001 Tr 3 43,55 <0,0001 6,96 0,0002 14,70 <0,0001 Te 5 2872,32 <0,0001 1101,79 <0,0001 2157,89 <0,0001 Pe x Tr 3 0,95 0,4203 0,32 0,8136 0,79 0,4990 Pe x Te 5 26,73 <0,0001 1,31 0,2634 98,46 <0,0001 Tr x Te 15 21,12 <0,0001 2,83 0,0007 6,10 <0,0001 Pe x Tr x Te 15 1,70 0,0578 0,16 0,9999 0,35 0,9884 C.V. (%) 18,5 30,34 21,34
Pe = período de coleta; Tr = tratamento; Te = tempo.
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Anexo 9 – Número, médias e porcentagens médias de frutos de atemóia fixados em função dos tratamentos, períodos de coleta e tempos de conservação.
Trat. Blocos
Períodos seco úmido Tempo de Armazenamento (dias)
0 1 3 6 15 30 0 1 3 6 15 30
PndG
B1 8 1 0 0 0 0 9 4 1 0 0 0 B2 6 1 0 0 0 0 10 3 2 0 0 0 B3 8 2 0 0 0 0 9 3 0 0 0 0 B4 7 1 0 0 0 0 9 4 1 0 0 0 média 7,25 1,25 0 0 0 0 9,25 3,5 1 0 0 0 % 65,9 11,36 0 0 0 0 84,09 31,82 9,09 0 0 0
PdG
B1 8 1 0 0 0 0 9 2 1 0 0 0 B2 6 2 0 0 0 0 10 2 0 0 0 0 B3 8 1 0 0 0 0 9 2 1 0 0 0 B4 7 1 0 0 0 0 9 1 1 0 0 0 média 7,25 1,25 0 0 0 0 9,25 1,75 0,75 0 0 0 % 65,9 11,36 0 0 0 0 84,09 15,91 6,82 0 0 0
PndN
B1 8 0 0 0 0 0 9 1 0 0 0 0 B2 6 0 0 0 0 0 10 1 0 0 0 0 B3 8 0 0 0 0 0 9 1 0 0 0 0 B4 7 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 média 7,25 0 0 0 0 0 9,25 0,75 0 0 0 0 % 65,9 0 0 0 0 0 84,09 6,82 0 0 0 0
PdN
B1 8 0 0 0 0 0 9 1 0 0 0 0 B2 6 0 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0 B3 8 0 0 0 0 0 9 1 0 0 0 0 B4 7 0 0 0 0 0 9 1 0 0 0 0 média 7,25 0 0 0 0 0 9,25 0,75 0 0 0 0 % 65,9 0 0 0 0 0 84,09 6,82 0 0 0 0
*DMS tratamento = 1,86 *DMS período = 1,00 *CV(%) = 24,09 *calculados a partir da transformação dos resultados originais em porcentagens; Trat. = tratamentos; PndG = pólen fresco não dessecado conservado em geladeira; PdG = pólen fresco dessecado conservado em geladeira; PndN = pólen fresco não dessecado conservado em nitrogênio líquido; PdN = pólen fresco dessecado conservado em nitrogênio líquido.
76
Anexo 10 – Número, médias e porcentagens médias de frutos de cherimóia fixados em função dos tratamentos, períodos de coleta e tempos de conservação.
Trat. Blocos
Períodos seco úmido
Tempo de Armazenamento (dias) 0 1 3 6 15 30 0 1 3 6 15 3
0
PndG
B1 10 5 2 0 0 0 10 6 2 0 0 0B2 10 6 1 0 0 0 11 6 2 0 0 0B3 9 6 2 0 0 0 11 7 2 0 0 0B4 9 5 2 0 0 0 10 7 1 0 0 0média 9,5 5,5 1,75 0 0 0 10,5 6,5 1,75 0 0 0% 86,36 50,0 15,9 0 0 0 95,45 71,5 15,9 0 0 0
PdG
B1 10 3 2 0 0 0 10 4 1 0 0 0B2 10 4 1 0 0 0 11 3 1 0 0 0B3 9 2 2 0 0 0 11 4 1 0 0 0B4 9 3 1 0 0 0 10 3 1 0 0 0média 9,5 3 1,5 0 0 0 10,5 3,5 1 0 0 0% 86,36 27,3 13,6 0 0 0 95,45 31,82 9,09 0 0 0
PndN
B1 10 1 0 0 0 0 10 2 0 0 0 0B2 10 0 0 0 0 0 11 1 0 0 0 0B3 9 1 0 0 0 0 11 2 0 0 0 0B4 9 1 0 0 0 0 10 1 0 0 0 0média 9,5 0,75 0 0 0 0 10,5 1,5 0 0 0 0% 86,36 6,81 0 0 0 0 95,45 13,6 0 0 0 0
PdN
B1 10 1 0 0 0 0 10 2 0 0 0 0B2 10 1 0 0 0 0 11 1 0 0 0 0B3 9 1 0 0 0 0 11 1 0 0 0 0B4 9 1 0 0 0 0 10 1 0 0 0 0média 9,5 1 0 0 0 0 10,5 1,25 0 0 0 0% 86,36 9,09 0 0 0 0 95,45 13,36 0 0 0 0
*DMS tratamento = 1,72 *DMS período = 0,92 *CV(%) = 15,72
*calculados a partir da transformação dos resultados originais em porcentagens; Trat. = tratamentos; PndG = pólen fresco não dessecado conservado em geladeira; PdG = pólen fresco dessecado conservado em geladeira; PndN = pólen fresco não dessecado conservado em nitrogênio líquido; PdN = pólen fresco dessecado conservado em nitrogênio líquido.
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Anexo 11 – Número, médias e porcentagens médias de frutos de pinha fixados em função dos tratamentos, períodos de coleta e tempos de conservação.
Trat. Blocos
Períodos seco úmido
Tempo de Armazenamento (dias) 0 1 3 6 15 30 0 1 3 6 15 30
PndG
B1 8 2 1 0 0 0 10 4 2 0 0 0 B2 7 3 1 0 0 0 9 5 1 0 0 0 B3 8 2 1 0 0 0 9 4 2 0 0 0 B4 8 3 1 0 0 0 10 5 1 0 0 0 média 7,75 2,5 1 0 0 0 9,5 4,5 1,5 0 0 0 % 70,45 22,7 9,09 0 0 0 86,36 40,9 13,6 0 0 0
PdG
B1 8 1 1 0 0 0 10 3 1 0 0 0 B2 7 2 0 0 0 0 9 2 1 0 0 0 B3 8 1 1 0 0 0 9 2 1 0 0 0 B4 8 1 1 0 0 0 10 2 1 0 0 0 média 7,75 1,25 0,75 0 0 0 9,5 2,25 1 0 0 0 % 70,45 13,4 6,81 0 0 0 86,36 20,45 9,09 0 0 0
PndN
B1 8 0 0 0 0 0 10 1 0 0 0 0 B2 7 0 0 0 0 0 9 1 0 0 0 0 B3 8 0 0 0 0 0 9 1 0 0 0 0 B4 8 0 0 0 0 0 10 1 0 0 0 0 média 7,75 0 0 0 0 0 9,5 1 0 0 0 0 % 70,45 0 0 0 0 0 86,36 9,09 0 0 0 0
PdN
B1 8 0 0 0 0 0 10 1 0 0 0 0 B2 7 0 0 0 0 0 9 1 0 0 0 0 B3 8 0 0 0 0 0 9 1 0 0 0 0 B4 8 0 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0 média 7,75 0 0 0 0 0 9,5 0,75 0 0 0 0 % 70,45 0 0 0 0 0 86,36 6,81 0 0 0 0
*DMS tratamento = 1,43 *DMS período = 0,77 *CV(%) = 16,75
*calculados a partir da transformação dos resultados originais em porcentagens; Trat. = tratamentos; PndG = pólen fresco não dessecado conservado em geladeira; PdG = pólen fresco dessecado conservado em geladeira; PndN = pólen fresco não dessecado conservado em nitrogênio líquido; PdN = pólen fresco dessecado conservado em nitrogênio líquido.
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Anexo 12 - Resultados do valor do teste F para a porcentagem média de fixação de frutos em polinizações realizadas com amostras grãos de pólen submetidas a diferentes tratamentos, períodos de coleta e tempo de conservação.
Planta Atemóia Cherimóia Pinha F.V. G.L. F Pr < F F Pr < F F Pr < F Pe 1 109,410 <0,0001 34,6 <0,0001 153,13 <0,0001 Tr 3 13,410 <0,0001 102,53 <0,0001 61,19 <0,0001 Te 5 2313,170 <0,0001 3931,94 <0,0001 4195,05 <0,0001 Pe x Tr 3 3,170 0,0263 0,37 0,7726 3,03 0,0314 Pe x Te 5 35,120 <0,0001 11,09 <0,0001 53,65 <0,0001 Tr x Te 15 8,130 <0,0001 55,89 <0,0001 30,25 <0,0001 Pe x Tr x Te 15 1,800 0,0401 0,31 0,9942 1,71 0,0542 C.V. (%) 24,09 15,72 16,75
Pe = período de coleta; Tr = tratamento; Te = tempo. Anexo 13- Resultados do valor do teste F para a porcentagem média de fixação de frutos em polinizações realizadas com de amostras de grãos de pólen (PA e PF), coletadas em dois períodos.
Plantas Atemóia Cherimóia Pinha F.V. G.L. F Pr < F F Pr < F F Pr < F Pe 1 32,14 0,0001 21,42 0,0006 42,00 <0,0001 Po 1 7,00 0,0213 30,85 0,0001 13,71 0,0030 Pe x Po 1 0,14 0,7121 0,85 0,3734 0,00 1,0000 C.V. 8,47 5,84 6,65
Pe = período de coleta; Po = pólen.
