INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALtesis.ipn.mx/jspui/bitstream/123456789/8609/1/108.pdf · ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Comparación de los genomas de M. leprae y M. tuberculosis 3 Tabla

Adriana Marcela Venegas Medina ENCBAdriana Marcela Venegas Medina ENCBAdriana Marcela Venegas Medina ENCBAdriana Marcela Venegas Medina ENCB----IPNIPNIPNIPN

Mycobacterium leprae

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

Identificación y estudio de la resistencia a fármacos de

Mycobacterium leprae en casos clínicos sospechosos de

lepra en México

T E S I S

QUE COMO UNO DE LOS REQUISITOS

PARA OBTENER EL GRADO DE:

MAESTRÍA EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA

Y BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR

P R E S E N T A

Q.B.P. VENEGAS MEDINA ADRIANA MARCELA

Directoras de Tesis:

Dra. Rosa María Ribas Jaimes

Dra. Iris Citlali Elvira Estrada García

México, D.F., 2010





La realización del presente trabajo se llevó a cabo en el

Laboratorio de Producción y Control de Biológicos del

Departamento de Microbiología de la Escuela Nacional de Ciencias

Biológicas del Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección de la

Dra. Rosa María Ribas Jaimes y la Dra. Iris Citlali Elvira Estrada

García.



Este trabajo de tesis formó parte del proyecto “Desarrollo e

innovación de productos biológicos mediante el estudio de la

biología molecular de enfermedades infecciosas” con clave SIP-

IPN 20091190.

La sustentante agradece el invaluable apoyo otorgado por el

Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI), y

al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt).

El autor fue becario del Consejo Nacional de Ciencia Tecnología

(CONACYT) y del Programa Institucional de Formación de

Investigadores (P.I.F.I.) del Instituto Politécnico Nacional durante

sus estudios de maestría.



ÍNDICE

ÍNDICE DE FIGURAS i

ÍNDICE DE TABLAS iii

ABREVIATURAS iv

RESUMEN vi

ABSTRACT vii

I. INTRODUCCIÓN 1

I.I Características generales del microorganismo 1

Morfología celular 1

Metabolismo de M. leprae 2

Genoma de M. leprae 2

I. II. Bases clínicas y características inmunopatológicas de la lepra 3

I. III. Identificación de M. leprae 5

I.III.1 La identificación molecular por PCR 5

I. IV. Quimioterapia 6

I. V. Desarrollo de la resistencia a fármacos en M. leprae 7

I.V.1 Mecanismo molecular de la resistencia de M. leprae a los fármacos recomendados en el tratamiento

7

La dapsona 7

La rifampicina 10

La ofloxacina 10

Multirresistencia 11

I. VI. Epidemiología y la identificación de cepas 12

II. JUSTIFICACIÓN 17

III. HIPÓTESIS 18

IV. OBJETIVOS. OBJETIVO GENERAL. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 19

V. MATERIAL Y MÉTODOS 20

V.I. Material biológico 20

V.I.1 Muestras de pacientes con baciloscopia positiva 21

V.I.2 Recuperación del material colectado 22

V.II. Obtención del DNA genómico de M. leprae (de Wit y co., 1991) 22



V.III. Identificación por PCR y secuenciación 23

V.III.1 Análisis de los genes folP1, gyrA, rpoB

23

V.III.2 VNTR del gen rpoT de M. leprae (3 o 4 copias) región 189185-190909

23

V.III.3 Análisis de tres SNP de M. leprae por PCR y

secuenciación

24

VI. RESULTADOS 27

VI.I. Productos amplificados por PCR anidado 27

VI.II. Alineamientos de las secuencias obtenidas 30

VII. DISCUSIÓN 41

VIII. CONCLUSIÓNES 49

IX. PRSPECTIVAS DEL TRABAJO 49

X. BIBLIOGRAFÍA 50

Anexo1. Carta Cesión de Derechos 56



ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Componentes básicos de la envoltura celular de M. leprae

2

Figura 2. Esquema de la dapsona, ofloxacina y rifampicina

8

Figura 3. Análisis de los SNP de aislamientos de diferentes orígenes geográficos.

15

Figura 4. Diseminación de la lepra en el mundo 15

Figura 5. Electroferograma del los productos amplificados por PCR de los genes de la cepa T53 de M. leprae (MLT53) utilizada como control positivo

27

Figura 6. Electroferograma del los productos amplificados por PCR anidado de los genes de la cepa MLT53 utilizada como control positivo

28

Figura 7. Electroferograma representativo del los productos amplificados por PCR anidado en las muestras con número de identificación 82 y 83 de los genes rpoB, gyrA y folP1

30

Figura 8. Resumen de resultados del análisis por BLAST de la secuencia obtenida para el gen folP1 de M. leprae

31

Figura 9. Alineamiento de secuencias utilizando el programa BioEdit para folP1 y la traducción

32

Figura 10. Resumen de resultados del análisis por BLAST de las secuencia obtenidas para gyrA de M. leprae mediante el programa bioinformático Blastn del NCBI

33

Figura 11. Alineamiento de secuencias utilizando el programa BioEdit para el gen gyrA y la traducción

34

Figura 12. Resumen de resultados del análisis por BLAST de la secuencia nucleotídica obtenida para rpoB de M. leprae de la muestra 80

35

Figura 13. Alineamiento y traducción de secuencias utilizando el programa Bioedit para rpoB

36

Figura 14. Resumen de resultados del análisis con tBlasx obtenidas para la secuencia rpoB de la muestra 80 mediante el programa bioinformático tBlastx del NCBI

37

Figura 15. Alineamientos de las secuencias de aminoácidos obtenidas por medio del programa bioinformático tBlastx del NCBI

38

i



Figura 17. AMS utilizando el programa BioEdit para identificar el VNTR del gen rpoT

39

Figura 18. Alineamiento de secuencias utilizando el programa BioEdit para las regiones donde se encuentran los SNP 1-3

40

ii



ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Comparación de los genomas de M. leprae y M. tuberculosis 3

Tabla 2. Mutaciones en los genes que codifican para blancos de fármacos asociados con la resistencia en M. leprae

9

Tabla 3. Muestras de pacientes mexicanos qque se incluyeron en este estudio, colectadas durante el 2007, 2008 y 2009; que provienen del Distrito Federal y de los estados Yucatán, Campeche, Nuevo León, Hidalgo, Guerrero, Oaxaca y Veracruz

20

Tabla 4. Información general de las regiones amplificadas para los genes folp1, gyrA y rpoB

23

Tabla 5. Información general de las regiones de M. leprae importantes para la identificación de los SNPs

24

Tabla 6. Iniciadores utilizados para identificar las regiones involucradas con la resistencia a fármacos de los genes folP1, gyrA, rpoB, y las regiones del gen rpoT y SNP para la identificación

25

Tabla 7. Condiciones de reacción de PCR que se emplearon para amplificar las regiones de los genes folP1, gyrA, rpoB, rpoT y SNPs 1-3

26

Tabla 8. Muestras de los pacientes en las que se realizó la extracción del DNA, señalando aquellas muestras en las que se obtuvo amplificado y secuencia, o aquellas en las que se obtuvo únicamente amplificado

29

iii



ABREVIATURAS

Ala.- Alanina

AMS.- Alineamiento múltiple de secuencias

Arg.- Arginina

BAAR.- Bacteria ácido-alcohol resistente

BB.- Limítrofe dimorfa

BL.- Limítrofe lerpmatosa

Blast.- Del inglés: “Basic Local Alignment and Search Tool “

BT.- Limítrofe tuberculoide

Cys.- Cisteína

DHPS.- Dihidropteroato sintasa

EtBr.- Bromuro de Etidio

EtOH.-Etanol

folP.- Gen que codifica para la enzima dihidropteroato sintetasa

Gln.- Glutamina

Gly.- Glicina

gyrA.- Gen que codifica para la subunidad α de la DNA girasa

Ile.- Isoleucina

LL.- Lepra lepromatosa

TT.- Lepra tuberculoide

MB.- Multibacilar

Met.- Metionina

MTD.- Del inglés: “Multidrug therapy”

NADH.- Nicotinamida adenina dinucleótido reducida

NCBI.- Del inglés: “National Center for Biotechnology Information”

OMS.- Organización Mundial de la Salud

PABA.- Ácido p-aminobenzóico

pb.- pares de bases

PB.- Paucibacilar iv



PCR.- Reacción en cadena de la polimerasa

PGL1.- Glicolípido fenólico 1

Phe.- Fenilalanina

PK.- Proteinasa K

Pro.- Prolina

rpoB.- Gen que codifica para la subunidad β de la RNA polimerasa dependiente de

rpoT.- Gen que codifica para el factor sigma de la RNA polimerasa

SNP.- Del inglés: “Single-Nucleotide Polymorphisms”. Polimorfismo en un solo

nucleótido

STR.- Del inglés: “Short Tandem Repeats”. Secuencias cortas repetidas en tándem

Thr.- Treonina

Val.- Valina

VNTR.- del inglés: “Variable number of tandem repeats”. Repeticiones en tándem de

número variable

WHO.- Del inglés “World Health Ogranization”

v



RESUMEN

La identificación de Mycobacterium leprae, representa un problema debido a que sigue siendo un microorganismo no cultivable en medios artificiales. Debido a esto se han seleccionado blancos moleculares para realizar estudios de susceptibilidad que correlacionan con la resistencia a los fármacos recomendados por la OMS en el tratamiento de la lepra; así como también blancos que ayudan a la genotipificación de cepas, por lo que, el objetivo de este trabajo fue realizar un análisis molecular de susceptibilidad a rifampicina, dapsona y ofloxacina ya que se ha identificado la correlación entre la resistencia a estos fármacos con la presencia de mutaciones en los genes rpoB, folP1 y gyrA respectivamente; y el estudio del VNTR de rpoT y los SNPs para identificar cepas de M. leprae. Se incluyeron en el estudio 40 muestras clínicas de 26 pacientes mexicanos diagnosticados con lepra, colectadas en el Distrito Federal y en algunos estados de la República Mexicana. Para el ensayo de susceptibilidad, se realizó una PCR anidada utilizando 2 pares de iniciadores específicos para los genes folP1, gyrA y rpoB; al amplificar y secuenciar las regiones de estos genes, no se detectaron las mutaciones con sentido equivocado que confieren resistencia a dapsona, ofloxacina y rifampicina en ninguna muestra de pacientes con diagnóstico clínico de lepra; a excepción de la muestra con número de identificación 79, en la que se detectó la mutación Ala426Val en el gen rpoB, la cual no ha sido identificada ni reportada con anterioridad. La identificación del VNTR en el gen rpoT de M. leprae se llevó a cabo a partir de dos rondas de PCR, donde se obtuvo un amplificado de 216 pb en las muestras con número de identificación 2, 4, 80 y 81; el análisis de las secuencias corroboró la presencia de 3 copias de 6 pb en el gen rpoT que corresponde al VNTR del tipo 3 copias que también se ha detectado como predominante en Brasil. Para la determinación del tipo de SNP, se llevó a cabo la amplificación por PCR anidado y secuenciación de tres regiones del genoma de M. leprae, correspondientes a los nucleótidos en las posiciones: 14,676; 1,642,875; 2,935,685 (SNP 1, 2, 3 respectivamente) del genoma de M. leprae TN (clave de acceso NC_002677). El tipo de SNP para las muestras con número de identificación 2 y 4 es el tipo 3, a diferencia de las secuencias de la cepa utilizada como control positivo que es del tipo 1. Se ha reportado que en África occidental, Brasil y otros países de América del Sur, predomina el SNP tipo 4. El estudio de susceptibilidad de los fármacos recomendados en la terapia contra la lepra, es de gran importancia para dar un adecuado tratamiento sobre todo en los casos de recaída o en aquellos casos que no muestren mejoría con el tratamiento convencional. En cuanto al polimorfismo del gen ropT y el estudio de los SNPs se puede identificar que están muy relacionados con el origen geográfico, por lo que, la genotipificación tomando en cuanta estos dos blancos moleculares, es una herramienta adecuada para la identificación de cepas; y con ello; poder determinar como se ha diseminado la lepra, además de poder establecer cadenas de transmisión cortas. Esto contribuirá con la vigilancia epidemiológica y en las estrategias de tratamiento, con el fin de evitar la emergencia y trasmisión de estas cepas.

vi



ABSTRACT

Mycobacterium leprae identification is a problem because it remains a non-culturable microorganism in artificial media. Because of this, molecular targets have been selected for susceptibility studies that correlate with resistance to drugs recommended by WHO for the treatment of leprosy, and also, targets to help the genotyping of strains, therefore, the objective of this study was to perform a molecular analysis of susceptibility to rifampicin, dapsone and ofloxacin given that a correlation has been identified between resistance to these drugs and the presence of mutations in the rpoB, gyrA and folP1 genes respectively, and the study of VNTR in the rpoT and SNPs to identify strains of M. leprae. We included in the clinical study 40 samples from 26 patients diagnosed with leprosy, collected in the Federal District and in some states of Mexico. In the susceptibility study was, nested PCR was performed using 2 pairs of specific primers for the folP1, gyrA and rpoB genes, to amplify and sequence regions of these genes; no missense mutations were detected that confer resistance to dapsone, ofloxacin and rifampicin respectively in any samples of patients with clinical diagnosis of leprosy, except in sample from patient whit identification number 79, in which Ala426Val mutation was detected in the rpoB gene, which has not been identified or reported previously. VNTR Identification in the rpoT gene of M. leprae was carried out after two rounds of PCR, which yielded an fragment of 216 bp in samples from patients with identification numbers 2, 4, 80 and 81, which sequence analysis confirmed the presence of 3 copies of 6 bp in the gene that corresponds to VNTR type 3 copies, also to detect predominantly in Brazil. To determine the type of SNP, nested PCR was carried out followed by sequencing of three regions of the genome of M. leprae, corresponding to nucleotides at positions: 14.676; 1,642,875, 2,935,685 (SNP 1, 2, 3 respectively) in the M. leprae TN genome (NC_002677 acc. Number). The SNP for samples 2, 4 is the type 3, unlike the sequences of the strain used as positive control of type 1. It has been reported that in West Africa, Brazil and other South American countries, SNP type 4 is the dominating type. The susceptibility study of the recommended drugs in therapy for leprosy, is of great importance for providing appropriate treatment especially in cases of relapse or in those cases showing no improvement with conventional treatment. Polymorphism in the ropT gene and the study of SNPs can be identified that are closely related to the geographical origin, so that, taking into account genotyping these two molecular targets, is a suitable tool for identifying strains and thus, to determine how leprosy is spread, as well as to establish short transmission chains, this will contribute to epidemiological surveillance and treatment strategies, in order to prevent the emergence and transmission of these strains.

vii



I. INTRODUCCIÓN

La lepra es una de las enfermedades infecciosas más antiguas, causada por

Mycobacterium leprae, una bacteria también conocida con el nombre de bacilo de

Hansen; se le da este nombre en honor a su descubridor G. Armauer Hansen en

1874. Muchas de sus características todavía se desconocen, como por ejemplo: el

origen, el modo de transmisión, el portal de entrada, entre otras. Se ha propuesto

que la mucosa nasal es la vía de entrada y salida (Ramaprasad y col., 1997); en un

principio se aceptó que el contacto directo de humano a humano era un modo de

transmisión (Fine y col., 1997) y con el tiempo se han evidenciado otras rutas como

la aérea (Smith y col., 2004), mediante vectores y vehículos de transmisión

(Chakrabarty y col., 2001).

I.I. CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL MICROORGANISMO

Morfología celular: Es un microorganismo no móvil, no esporulado, microaerofílico,

ácido-alcohol resistente por tinción de Ziehl-Neelsen, normalmente forma bastones

delgados curvos o rectos. Los principales componentes estructurales de la envoltura

de las micobacterias son: la membrana plasmática, la pared y la cápsula (Figura 1).

La pared celular es un complejo de ácido micólico-arabinogalactana-peptidoglicana

unidos covalentemente, similar en composición a la pared celular de todas las

micobacterias (Draper y col., 1987; Vissa y col., 2001; Hett & Rubin, 2008). El centro

de la pared celular contiene peptidoglicana, compuesta de N-acetilglucosamina

alternada con N-glicolilmuramato, unidos por enlaces β1–4, y a la vez unidas a

tetrapéptidos (glicina-D-isoglutamina-ácido meso diaminopimélico-D-alanina) por el

ácido murámico, los cuales están unidos a la galactana de la arabinogalactana

(Scollard y col., 2006). También están unidas a la galactana tres cadenas de

arabinana, formando una capa con la peptidoglicana, en una zona densa a los

electrones. Los ácidos micólicos están unidos al final de la cadena de arabinana. El

modelo externo está compuesto de un arreglo intercalado rico en ácidos micólicos de

monomicolatos de trehalosa y ácidos micocerósicos de dimicocerosatos de ftiocerol;

y el glicolípido fenólico 1 (PGL1), formando la zona electrotransparente (Ng y col.,

2000; Scollard y col., 2006; Kai y col., 2007). 1



Hett & Rubin, 2008

Figura 1. Componentes básicos de la envoltura celular de M. leprae. En la figura se puede observar la pared celular, compuesta por el complejo de ácidos micólicos-arabinogalactana-peptidoglicana, cápsula y la membrana celular. Figura tomada de Hett & Rubin, 2008.

Metabolismo de M. leprae: Se han identificado genes en M. leprae, involucrados

con la capacidad de obtener energía por la oxidación de la glucosa a piruvato a

través de la vía Embden-Meyerhof-Parnas. La acetil-CoA de la glicolisis entra al ciclo

de Krebs, produciendo energía en la forma de ATP. Un análisis del genoma y un

estudio bioquímico en M. leprae y Mycobacterium tuberculosis sugieren que estos

organismos dependen en gran medida de la degradación de lípidos y de la vía del

glioxilato para la producción de energía. M. leprae contiene genes útiles en el

proceso de la β−oxidación; sin embargo, tiene muy pocas enzimas que están

involucradas en las vías de degradación de compuestos de carbono y nitrógeno

comparado con M. tuberculosis. En M. leprae la cadena respiratoria aerofílica está

severamente reducida, lo que hace prácticamente imposible producir ATP a partir de

la oxidación de NADH. En contraste con la reducción en la vía catabólica; la

capacidad anabólica no se ha dañado (Scollard y col., 2006).

Genoma de M. leprae: Inicialmente M. leprae fue aislado de la piel lesionada de un

paciente con lepra multibacilar (MB) de Tamil Nadu, India (cepa TN), y después fue

propagado y purificado del hígado de un armadillo de nueve bandas, Dasypus

2



novemcinctus, de donde se obtuvo DNA para la secuenciación del genoma de M.

leprae (Cole y col., 2001; Scollard y col., 2006). Esta bacteria ha sufrido una

reducción evolutiva lo que se ve reflejado en el tamaño de su genoma (3.3 Mb) en

comparación con el tamaño del genoma de 4.4 Mb de M. tuberculosis, así como un

porcentaje menor del contenido G+C (58% para M. leprae en comparación con 66%

de M. tuberculosis) (Cole y col., 2001). En la tabla 1 se pueden observar algunas

diferencias entre los genomas de estos dos microorganismos (Scollard y col., 2006).

Tabla 1. Comparación de los genomas de M. leprae y M. tuberculosis

Parámetro M. leprae (cepa TN)a M. tuberculosis (cepa H37Rv)b No. de acceso EMBL/GenBank/DDBJ AL450380 AL123456 Tamaño del Genome (pb) 3,268,203 4,411,532 No. de genes para proteínas 1,614 3,993 No. de genes desconocidos 142 606 No. de pseudogenes 1,133 6 No. de genes tRNA 45 45 No. de genes rRNA 3 3 No. de genes RNA estables 2 2 Densidad Genética (bases/gene) 2,024 1,106 % de Proteína codificante 49.5 91.2 % G+C 57.8 65.6 Frecuencia de SNPc 1 en 24,000pbd 1 en 3,000pbe a Dato obtenido de http://genolist.pasteur.fr/Leproma/ para el genoma de M. leprae. b Dato obtenido de http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/ para el genoma de M. tuberculosis. c SNP, del ingles single-nucleotide polymorphism. Polimorfismo de un solo nucleótido. d Dato obtenido de la referencia Monot y col., 2005. e Dato obtenido de la referencia Fleischmann y col., 2002. Adaptada de: Scollard y col., 2006.

I. II. BASES CLÍNICAS Y CARACTERÍSTICAS INMUNOLÓGICAS DE LA LEPRA

M. leprae es una bacteria intracelular obligada, que tiene tropismo por macrófagos y

células de Schwann, e infecta los nervios periféricos (Zhang y col., 2005). La lepra

causa una infección granulomatosa crónica en la piel y los nervios periféricos con

deformación característica y pérdida de la función. Esta bacteria muestra mayor

afinidad por los tejidos fríos del cuerpo, tales como la nariz y los lóbulos de las

orejas. La lepra se considera como dos enfermedades juntas, la primera es una

infección bacteriana crónica que mantiene una adecuada respuesta inmune celular

en los humanos; la segunda es una neuropatía periférica que se inicia con la

3



infección y posteriormente se dan los eventos inmunológicos (Scollard y col., 2006).

Por esta razón se dice que es crónica, mutilante, de evolución lenta y su período de

incubación varía entre los ocho meses y los cinco años después de los cuales

aparece una mácula hipopigmentada en la piel que, con el tiempo, es sustituida por

numerosos lepromas (eritemas de aproximadamente 1cm de diámetro, con aspecto

granular, que semejan los bordes de las verrugas); dado que afecta principalmente a

los tejidos: cutáneo, subcutáneo y cartilaginoso, además de la característica

anestesia local (cuyo origen tiene que ver con la afectación del tejido nervioso),

desaparece el tabique nasal, que junto con la presencia de lepromas en la cara,

provocan que el enfermo evidencie el signo conocido como “cara de león” (Zhang y

col., 2005).

Debido a que la lepra presenta un amplio intervalo de manifestaciones clínicas e

histopatológicas, Ridley y Jopling en 1966, propusieron un esquema de clasificación,

en el cual identificaron en un extremo, a los pacientes con un alto grado de

inmunidad mediada por células que desarrollaron hipersensibilidad y presentaron una

única lesión bien delimitada con hipo-pigmentación central e hipoestesia. Una biopsia

mostró una infección granulomatosa bien desarrollada, linfocitos, macrófagos y

limitado número de “células lepra” (macrófagos en cuyo interior se evidencian BAARs

dispuestos en paralelo y ácidos grasos que aparentan espuma); la prueba de la

lepromina resulta positiva, por lo que se le denominó lepra tuberculoide (TT). En el

otro extremo, los pacientes presentan numerosas lesiones elevadas o nodulares

poco demarcadas en todas las partes del cuerpo; las biopsias mostraron capas de

macrófagos espumosos (“células lepra” abundantes) en la dermis, conteniendo un

gran número de bacilos y microcolonias, no se observa una citología en la que se

evidencien linfocitos, la prueba de la lepromina resulta negativa, lo que indica la

ausencia de inmunidad celular contra del bacilo de Hansen. Esta forma de la

enfermedad se denominó Lepra lepromatosa (LL) que es la más grave (Zhang y col.,

2005; Scollard y col., 2006). La mayoría de los pacientes caen entre estas dos

categorías; por lo que la lepra se subdivide en: Limítrofe Lepromatosa (BL), Limítrofe

Dimorfa (BB), y Limítrofe Tuberculoide (BT) (Scollard y col., 2006).

4



La OMS recomienda contar las lesiones para distinguir las formas paucibacilar (PB) y

MB de la enfermedad, por lo que con menos de 5 lesiones y un tronco nervioso

dañado se ha clasificado como PB y con cinco o más lesiones y más de un tronco

nervioso dañado como MB (URL1).

I. III. IDENTIFICACIÓN DE M. leprae

La identificación de M. leprae es problemática, debido a que sigue siendo un

microorganismo no cultivable in vitro y sólo se le ha podido cultivar en el armadillo de

nueve bandas y en el cojinete plantar del ratón. El diagnóstico de la enfermedad se

realiza con base en la detección de los signos clínicos correspondientes y en

biopsias del tejido afectado teñidas por la técnica de Ziehl Neelsen (Scollard y col.,

2006; URL1, 2 y 3).

I.III.1 La identificación molecular por PCR

Los ensayos de tipificación molecular se han desarrollado para la identificación y

detección de M. leprae directamente de las muestras de pacientes (Kurabachew y

col., 1998; Kimura y col., 2009; Torres y col., 2009); usando la información genética

disponible en las bases de datos (URL4, 5 y 6), se han seleccionado blancos

genéticos para la identificación de cepas como son los VNTRs o repeticiones en

tándem de número variable (del inglés: Variable Number of Tandem Repeats) y

SNPs o polimorfismos en un solo nucleótido (del inglés: Single-Nucleotide

Polymorphisms) (Matsuoka y col., 2000; Shin y col., 2000; Cole y col., 2001;

Groathouse y col., 2004; Matsuoka y col., 2004; Zhang y col., 2005; Matsuoka y col.,

2006; Kimura y col., 2009; Torres y col., 2009). Asimismo, se han realizado estudios

de resistencia hacia antimicrobianos con la búsqueda y análisis de mutaciones en

regiones de genes que proporcionan resultados de la susceptibilidad a los fármacos

empleados en el tratamiento de la lepra (Seydel y col., 1980; Williams y col., 1994;

Matsuoka y col., 2000; Williams y col., 2000; Maeda y col., 2001; Williams y col.,

2001; Cambau y col., 2002; You y col., 2004; Cambau y col., 2006; Scollard y col.,

2006; Matsuoka y col., 2007). Estos ensayos están basados en la amplificación y

5



secuenciación de regiones específicas del genoma de esta bacteria en muestras

clínicas.

I. IV. QUIMIOTERAPIA

La estandarización y la aplicación de una terapia múltiple de fármacos han

disminuido el número de casos registrados de lepra (Scollard y col., 2006; URL1;

URL2). De acuerdo con informes oficiales durante el año 2008, la prevalencia

mundial de la lepra registrada a principios de 2008 ascendió a 212,802 casos en 118

países; mientras que el número de casos nuevos detectados durante 2007 fue

254,525. Durante el año 2007, el número de nuevos casos detectados a nivel

mundial se redujo a 11,100, lo que representa un 4%, en comparación con el 2006

(URL2).

En 1950, la dapsona se introdujo como el quimioterapéutico estándar para lepra y se

utilizó en todo el mundo para el tratamiento tanto de las formas MB y PB de la

enfermedad. Por mucho tiempo, la monoterapia se realizó con dapsona; sin

embargo, surgieron cepas resistentes a este fármaco, dando como resultado que el

tratamiento fallara. El tratamiento de la lepra con un solo fármaco siempre termina en

el desarrollo de resistencia para ese medicamento principalmente en pacientes con

la forma MB. Para disminuir el problema de la resistencia de M. leprae a los

antibióticos y para mejorar el tratamiento, la OMS recomendó en 1984 la multiterapia

con rifampicina, clofazimina y dapsona; posteriormente se recomendó también la

ofloxacina y la minociclina en el tratamiento (URL3). Desde 1998 se recomendó el

tratamiento de pacientes con lepra MB por 12 meses con rifampicina, clofazimina y

dapsona y para lepra PB por 6 meses con rifampicina y dapsona (Scollard y col.,

2006; URL1).

El total de casos registrados en todo el mundo ha disminuido dramáticamente; sin

embargo, aún con la combinación de fármacos, el número de nuevos casos no ha

disminuido consistentemente y la resistencia a los antibióticos se sigue presentando

(Kai y col., 1999; Matsuoka y col., 2000; Williams y col., 2000; 2002; Maeda y col.,

2001; Williams y col., 2001; Cambau y col., 2002; Ebanezer y col., 2002; You y col.,

6



2004; Cambau y col., 2006; Lopez-Roa y col., 2006; Matsuoka y col., 2007;

Hernández y col., 2008).

I. V. DESARROLLO DE LA RESISTENCIA A FÁRMACOS EN M. leprae

De manera natural, M. leprae es resistente a muchos antibióticos, lo que es atribuido

a la estructura de su pared celular, que la hace impermeable a un gran número de

compuestos, además de que la bacteria tiene una ventaja en condiciones de estrés,

choque osmótico o de desecación; todo esto contribuye de alguna manera a la

resistencia. Los fármacos lipofílicos como las fluoroquinolonas o la rifampicina, pasan

fácilmente a través de la pared celular rica en lípidos, lo que los hace útiles en el

tratamiento de la enfermedad. Además de la resistencia natural, una de las

estrategias que puede usar el microorganismo para resistir el efecto de estos

antibióticos empleados en el tratamiento, es la modificación de sus sitios blanco de

acción (Hett & Rubin, 2008).

Se ha identificado la correlación entre la mutación en los genes rpoB, folP y gyrA y la

resistencia a rifampicina, dapsona, y quinolonas respectivamente (Kai y col., 1999;

Matsuoka y col., 2000; Williams y col., 2000; Maeda y col., 2001; Williams y col.,

2001; Cambau y col., 2002; Ebanezer y col., 2002; You y col., 2004; Cambau y col.,

2006; Lopez-Roa y col., 2006; Matsuoka y col., 2007; Hernández y col., 2008). Tanto

la rifampicina como la dapsona son fármacos incluidos en la multiterapia para la lepra

(Scollard y col., 2006; URL1).

I.V.1 Mecanismos moleculares de resistencia de M. leprae a los fármacos

recomendados en el tratamiento

La dapsona (4,4´-diaminodifenil sulfona) (Figura 2) es una sulfona sintética que está

relacionada estructural y funcionalmente a las sulfonamidas, y tiene como blanco de

acción a la dihidropteroato sintasa (DHPS), enzima clave en la biosíntesis de folato

en bacterias (Seydel y col., 1980).

Los procariotes sintetizan aminoácidos y ácidos nucleicos usando folato como

coenzima ya que son incapaces de transportar folato extracelular y tienen que

sintetizarlo de novo. La DHPS es una enzima clave involucrada en la síntesis de

7



folato, cataliza la síntesis del 7,8-dihidropteroato a partir de 7,8-dihidropterin-

pirofosfato y ácido para–aminobenzóico (PABA). El mecanismo de acción del

fármaco es la inhibición de la síntesis del 7,8-dihidropteroato por la incorporación

competitiva (inhibición competitiva) de la sulfonamida como análogo estructural del

PABA, lo que lo hace un agente bacteriostático (Kai y col., 1999; Scollard y col.,

2006).

DAPSONA

RIFAMPICI�A

Figura 2. Estructuras de la dapsona, ofloxacina y rifampicina. En esta figura se puede observar

las estructuras químicas de los fármacos recomendados para el tratamiento de la lepra.

Las mutaciones específicas en las regiones altamente conservadas de los sitios de

unión del PABA en la DHPS, codificada por folP, da como resultado la resistencia a

dapsona (Tabla 2) (Williams y col., 2000; Maeda y col., 2001; Williams y col., 2001;

Cambau y col., 2006).

8



Tabla 2. Mutaciones en los genes que codifican para blancos de fármacos asociados con la resistencia en M. leprae

Fármaco/gene blanco Susceptibilidada Mutación (es) No. de aislamientos

(%)b Rifampicina/rpoB R Gly401Ser; His420Asp 1 (2) R Gln407Val 1 (2)

R Phe408/Met409; LysPhe

insertion 1 (2)

NC Asp410Asn 1 (2) NC Asp410Asn; Leu427Pro 1 (2) R Ser416Cys 1 (2) R His420Asp 1 (2) R His420Tyr 11 (20) R Ser425Leu 33 (60) R Ser425Met 1 (2) R Ser425Met; Leu427Val 1 (2) R Ser425Phe 1 (2) NC Ser425Trp 1 (2) Dapsona/folP1 R Thr53Ala 12 (40) NC Thr53Ala; Pro55Leu 1 (3) R Thr53Arg 2 (7) R Thr53Ile 4 (13) R Pro55Arg 3 (10) R Pro55Leu 8 (27) Ofloxacina/gyrA NC Gly89Cys 1 (14) R Ala91Val 6 (86) a R, fenotipo resistente, el análisis de la susceptibilidad a los fármacos se determinó en cojinete plantar de ratón; NC, no confirmado para cada uno de los ensayos. b Porcentaje de los aislamientos en cada grupo de resistencia que contiene una mutación específica.

Tabla adaptada de Scollard y col., 2006.

Una mutación con sentido equivocado en el codón 53 y 55 da como resultado el

desarrollo de altos niveles de resistencia a dapsona en M. leprae (Maeda y col.,

2001).

Cambau y colaboradores (2006), compararon dos técnicas para determinar la

resistencia a dapsona, y analizaron la concordancia entre los resultados obtenidos.

Uno de los métodos fue la detección de mutaciones en el gen folP1 con el uso de

pruebas moleculares y, el segundo la utilización del método de inoculación en

cojinete plantar de ratón para determinar la resistencia in vivo (en el cual se

requieren aproximadamente 12 meses para obtener resultados). Los resultados

mostraron que de las 38 cepas en estudio, se presentó la mutación en 6/6 cepas en

los codones 53 y 55 en el gen folP1 con un nivel de resistencia elevada a dapsona;

en 3/4 con un nivel de resistencia intermedio, y en 1/6 con un nivel de resistencia

bajo. Por otra parte, no se detectó la mutación en el gen folP1 en las 22 cepas

9



susceptibles a dapsona. Por lo que, en el caso de encontrar la mutación en el gen

folP1 en las cepas de M. leprae, se recomienda reemplazar la dapsona en el

tratamiento con la fluoroquinolona ofloxacina.

La rifampicina (3-{[(4-metil-1-piperazinail)-metil]}rifamicina) (Figura 2) es el

antibiótico de elección recomendado en el tratamiento contra la lepra. El blanco para

la rifampicina en micobacterias y E. coli es la subunidad β de la RNA polimerasa

codificada por rpoB (Williams y col., 1994). Comparando la estructura primaria

deducida para la subunidad β de diferentes bacterias con la de M. leprae, se

demuestra que comparten 6 regiones funcionales altamente conservadas en

bacterias. Las micobacterias resistentes a rifampicina correlacionan con los cambios

en la estructura de la subunidad β de la RNA polimerasa, debido a una mutación con

sentido equivocado en los codones de las regiones altamente conservadas del gen

rpoB (Tabla 2). La substitución en el codón Ser425 es la mutación más

frecuentemente asociada con el desarrollo del fenotipo de resistencia a rifampicina

(Matsuoka y col., 2000; Cambau y col., 2002). Maeda y colaboradores (2001),

reportaron la mutación His526Tyr y Asp516Asn presente en M. leprae resistente a

rifampicina y encontraron una cepa con una doble mutación Asp516Asn y

Leu533Pro.

La ofloxacina (4-fluoroquinolona) (Figura 2) tiene una actividad contra M. leprae

moderada. El mecanismo de acción de la ofloxacina es inhibir la DNA girasa y por lo

tanto la replicación del DNA, esta enzima es un tetrámero que está conformada por

dos subunidades, la A (gyrA) y la B (gyrB).

Las mutaciones en la región altamente conservada de gyrA (la región determinante

de resistencia a quinolonas) están asociadas con la resistencia a ofloxacina en

muchas cepas de micobacterias (Scollard y col., 2006). La región determinante de

resistencia a quinolonas de gyrA en M. leprae es homóloga a aquella de M.

tuberculosis, y se ha encontrado una mutación con sentido equivocado en esta

región en cepas de M. leprae resistentes a ofloxacina (Tabla 2) (Maeda y col., 2001;

Cambau y col., 2002).

10



Multirresistencia de M. leprae a los fármacos recomendados para el tratamiento

de la lepra. El uso de la rifampicina sola o combinada con dapsona para el

tratamiento de la lepra con resistencia a dapsona, condujo al desarrollo rápido de

organismos resistentes a rifampicina (Grosset y col., 1989). La clofazimina parece

ser un bactericida poco potente contra M. leprae y no es conveniente usarlo como

único fármaco en la terapia. La detección molecular de la resistencia a dapsona de

M. leprae se combina con la detección de la resistencia a rifampicina, con la finalidad

de detectar multirresistencia (Cambau y col., 2006).

Ebenezer y colaboradores (2002), encontraron al realizar un ensayo de

susceptibilidad en cojinete plantar de ratón, que el 19% de 265 aislamientos de M.

leprae, fueron resistentes a varias concentraciones de dapsona, rifampicina, o

clofazimina y 6.23% fueron resistente a más de un fármaco. También se han

encontrado cepas multirresistentes en Corea (You y col., 2004); en este estudio 3

cepas presentaron mutación en los genes folP y rpoB por lo que les conferían

resistencia a dapsona y rifampicina; y 2 casos con mutaciones en los genes folP y

gyrA y que presentaban resistencia a dapsona y ofloxacina.

En México se realizó por primera vez la detección de una cepa de M. leprae

resistente a dapsona, en un paciente diagnosticado con LL (Lopez-Roa y col., 2006),

en el cual se detectó la substitución de un nucleótido del codón 53 (ACC-GCC) en el

gen folP, que se ha reportado que confiere resistencia a dapsona (Tabla 2). No se

encontraron mutaciones en los genes rpoB ni en gyrA.

Se han realizando estudios para determinar la magnitud de la resistencia a los

medicamentos utilizados para el tratamiento de la lepra. Entre ellos se encuentra el

realizado por Matsuoka y colaboradores (2007), en el cual, de 252 muestras de

pacientes de Indonesia, Myanmar y Filipinas, sólo el 3% fueron dapsona resistente y

2% fueron rifampicina resistente. En pacientes con recaída de lepra se encontraron

más mutaciones que conferían resistencia en M. leprae: 15% de resistencia a

11



dapsona, 8% de resistencia a rifampicina y sólo dos pacientes presentaron M. leprae

con mutaciones que conferían resistencia tanto para dapsona como para rifampicina.

En otro estudio de la resistencia a la rifampicina y a la dapsona en tres pacientes

colombianos con recurrencia de lepra y con sospecha clínica de resistencia, se

reportó la identificación de una mutación en el gen rpoB demostrando la presencia de

bacilos de M. leprae resistentes a la rifampicina en dos de los tres pacientes. No se

detectó la mutación indicadora de resistencia a la dapsona en ninguno de los tres

pacientes (Hernández y col., 2008).

I. VI. EPIDEMIOLOGÍA Y LA IDENTIFICACIÓN DE CEPAS

Para un control efectivo de la lepra, un prerrequisito es el entendimiento de su

epidemiología. Como ya se había mencionado, es imposible debido a que M. leprae

no puede ser cultivado in vitro, por lo que no se pueden realizar ensayos tales como:

exposición y establecimiento de la infección y otros que tienen que ver con la

progresión de la enfermedad. La secuencia de eventos que ocurren para que haya

una transmisión efectiva no se ha entendido todavía, pero los marcadores genéticos

pueden darnos la clave para evaluar la exposición y la transmisión de la bacteria,

diferenciar entre los eventos de recaída y reinfección y establecer marcadores

específicos de especie (Matsuoka y col., 2006; Scollard y col., 2006).

Con la publicación de la secuencia del genoma completo de M. leprae cepa Tamil

Nadu (TN), en la India en el 2001 (Cole y col., 2001), se han seleccionado

marcadores genéticos polimórficos para la tipificación de cepas. Se han realizado

diversas pruebas moleculares para determinar la variación genética en M. leprae, y

se sabe que su genoma está muy conservado (Matsuoka y col., 2000; Shin y col.,

2000; Cole y col., 2001; Groathouse y col., 2004; Matsuoka y col., 2004; Zhang y col.,

2005; Monot y col., 2008; Kimura y col., 2009; Torres y col., 2009).

El primer marcador genético descrito en diferentes aislamientos y que presentó

polimorfismo fue un VNTR de seis pares de bases GACATC en el gen rpoT; el

segundo fue un trinucleótido (TTC) que también es un VNTR río arriba de un

12



pseudogen (Matsuoka y col., 2000; Shin y col., 2000), seguido por el descubrimiento

de los STR o secuencias cortas repetidas en tándem (del inglés Short Tandem

Repeats) también con un importante potencial para la genotipificación e identificación

de cepas (Zhang y col., 2005; Groathouse y col., 2004). El análisis in silico realizado

por Groathouse y colaborarores en el 2004, reveló que había 44 sitios de STR

polimórficos, incluyendo 33 loci microsatélites (unidades repetidas de 1 a 5pb) y 11

minisatélites (unidades repetidas de más de 5pb) en el genoma de M. leprae. En el

2005 Zhang y colaboradores identificaron por secuenciación nucleotídica 32 loci

polimórficos de los 44 STR, en 27 cepas. Estos investigadores demostraron la

aplicabilidad de 9 loci como marcadores genéticos potenciales para diferenciar cepas

de M. leprae al analizar un panel pequeño de 4 aislamientos de humanos y

realizando pases en armadillo. Los STR que se utilizaron para realizar un análisis

epidemiológico mostraron la existencia de cepas variables en áreas con un alta

prevalencia de lepra (Matsuoka y col., 2004; Zhang y col., 2005). Basados en todas

estas observaciones, en el 2009 Kimura y sus colaboradores enlistan y analizan

estos 44 loci (donde incluyen los loci rpoT y TTC) (Groathouse y col., 2004).

Los VNTR en el gen rpoT, con un intervalo pequeño de divergencia de tres copias de

6 pb repetidos en tándem, o cuatro copias de 6 pb repetidas en tándem (VNTR del

tipo tres copias y del tipo cuatro copias, respectivamente), son importantes para el

análisis de la transmisión global de la lepra (Matsuoka y col., 2006). Un

descubrimiento importante fue que el tipo cuatro copias predomina en los países de

Asia Oriental tales como Corea y Japón (Matsuoka y col., 2000). No se observó

variación en las secuencias repetidas de los hexanucleótidos en la secuencia

codificante del gen rpoT (Monot y col., 2005).

La genotipificación tomando en cuenta el SNP es útil para el análisis de la

diseminación global de la lepra (Matsuoka y col., 2006; Monot y col., 2005; Monot y

col., 2008). La frecuencia de los SNPs de M. leprae es de aproximadamente 1 por

28kb, que es la cantidad mas baja observada para patógenos en humanos (Monot y

col., 2005) y se han identificado 3 SNPs informativos para lepra. Las variaciones en

los genotipos de los SNPs están muy relacionados con el origen geográfico de las

13



cepas, y ha sido muy útil un análisis de las cepas de diferentes continentes para

predecir la evolución y diseminación global de la lepra (Monot y col., 2005; Matsuoka

y col., 2006; Scollard y col; 2006).

La distribución geográfica de los genotipos específicos de M. leprae puede

correlacionarse con los desplazamientos humanos prehistóricos, y más aún, con los

desplazamientos humanos recientes. Los textos antiguos indican la existencia de la

lepra 600 años A.C. en China, India y Egipto; según estos documentos se cree que la

enfermedad se originó en la India Subcontinental, África Oriental o el Cercano

Oriente y se diseminó con la migración humana sucesiva, se introdujo en Europa por

los soldados griegos que regresaban de los campamentos de Alejandro Magno en la

India. De Grecia, la enfermedad se esparce alrededor del Mediterráneo, con los

romanos introduciendo la lepra en la parte occidental de Europa (Mount y col., 2005).

Los resultados de Monot y colaboradores (2005) dieron evidencia de un esquema

global de evolución para M. leprae y, a partir de los datos obtenidos de los SNP;

brindaron 2 conclusiones para la diseminación global que difiere de la explicación

clásica. Dos posibles eventos de evolución son igualmente importantes. En el

primero, el SNP tipo 2 del África del este/Asia central, precedió al tipo 1, y migró

hacia el este, y el tipo 3 se diseminó al oeste de las poblaciones humanas, antes de

que apareciera el tipo 4. El segundo evento posible es que el tipo 1 fue el progenitor

del tipo 2, seguido por el SNP tipo 3 y finalmente el tipo 4 (Figuras 3A, 3B y 4).

Monot y colaboradores (2005) proponen que la lepra se introdujo en África occidental

por los exploradores infectados, el comercio o el colonialismo de los europeos o los

africanos del norte, en lugar de los migrantes de África del este, debido a que el SNP

tipo 4 (círculo verde) está mucho más cercano al SNP tipo 3 (círculo morado) que al

tipo 1 (círculo amarillo) (Figura 4). Debido al comercio de esclavos en el siglo XVIII, la

lepra fue introducida de África occidental a las islas del Caribe, Brasil y

probablemente otras partes de América del Sur, debido a que se encontró el mismo

SNP tipo 4 que en África occidental (Monot y col., 2005; Monot y col., 2008). La cepa

de M. leprae responsable de la enfermedad en América es mas cercana a la

variedad de Europa/África del Norte, lo que indica que el colonialismo y la emigración

14



de el viejo mundo fue lo que probablemente contribuyó a la introducción de lepra en

el nuevo mundo (Monot y col., 2005).

Figura 3. Análisis de los SNP de aislamientos de diferentes orígenes geográficos. (A) Comparación de sitios polimórficos en el genoma de las cepas TN y Br4923 por secuenciación automatizada. Las coordenadas son las posiciones en el genoma de la cepa TN, y la barra vertical indica la base polimórfica. (B) Los resultados de la ruta más parsimoniosa para los cuatro tipos de SNP. Las flechas gruesas indican la dirección más común, basada en las consideraciones históricas y geográficas; las flechas finas indican una ruta alternativa (Monot y col., 2005).

Figura 4. Diseminación de la lepra en el mundo. Los círculos indican el país de origen de las muestras examinadas y su distribución en los cuatro tipos de SNP, en el cual el código de colores indica el tipo de SNP (amarillo: SNP1, naranja: SNP2, morado: SNP3, verde: SNP4). El color de las flechas indica la dirección de la migración humana, inferida por el análisis de SNP; la flecha gris corresponde a las rutas migratorias de humanos derivada los estudios: genético, arqueológico, y antropológico, con el tiempo estimado de la migración en años.

SNP-tipo 1

SNP-tipo 1

SNP-tipo 4

SNP-tipo 4

SNP-tipo 2

SNP-tipo 3

Monot y col., 2005

Colonialismo Migración

Comercio de

esclavos

Origen?

15



En el 2006 Matsuoka y colaboradores, detectaron los mismos genotipos que habían

sido detectados por Monot y colaboradores (2005): SNP tipo 1, CGA; SNP tipo 2,

CTA; SNP tipo 3, CTC; SNP tipo 4, TTC; en las posiciones 14676, 1642875 y

2935685 respectivamente. El SNP tipo 1 predominó en Myanmar y el SNP tipo 3

predominó en Japón. El tipo 4 fue detectado en pacientes de descendencia japonesa

y que radican en Brasil. En cuanto al gen rpoT con 91 a 97 pb, se identificaron el tipo

tres copias y el tipo cuatro copias respectivamente (Matsuoka y col., 2005, 2000).

Las secuencias de los productos mostraron 3 copias o 4 copias de una secuencia de

6 pb GACATC. El VNTR del gen rpoT tipo cuatro copias fue detectado en Japón y

Corea predominantemente. Encontraron un SNP tipo 4 de pacientes de

descendencia japonesa que radican en Brasil. No se detectaron estas cepas en

pacientes japoneses o de otros países de Asia.

Una visa de trabajo japonesa es adquirida fácilmente por los brasileños de

descendencia japonesa. La hipótesis es que los pacientes que vivían en Brasil

durante la niñez, y que no han estado mucho tiempo en Japón, contrajeron la lepra

en Brasil y se desarrolló la enfermedad en Japón, ya que presentaron un SNP tipo 3

y un VNTR tipo tres copias. La prevalencia de este genotipo en Japón es muy baja,

pero tiene una frecuencia muy alta en pacientes brasileños (Matsuoka y col., 2006).

El SNP tipo 4 también se ha encontrado en África occidental, por lo que se cree que

este tipo de SNP fue introducido en America durante la época en la que se

comercializaba con esclavos (Monot y col., 2005; Monot y col., 2008).

16



II. JUSTIFICACIÓN

Debido a que se ha identificado la correlación entre la presencia de mutaciones en

los genes rpoB, folP y gyrA, con la resistencia a rifampicina, dapsona, y quinolonas

respectivamente; es importante realizar un estudio a nivel molecular de

susceptibilidad de los fármacos recomendados en la terapia contra la lepra, para dar

un adecuado tratamiento sobre todo en los casos de recaída o en aquellos casos que

no muestren mejoría con el tratamiento convencional, así como determinar el

polimorfismo del gen ropT y el estudio de los SNP que están relacionados con el

origen geográfico para la identificación de cepas. Esto contribuirá con la vigilancia

epidemiológica de la lepra y en las estrategias de tratamiento, con el fin de evitar la

emergencia y trasmisión de estas cepas.

17



III. HIPÓTESIS

- Las mutaciones en las regiones altamente conservadas de los genes folP, rpoB y

gyrA confieren resistencia a dapsona, rifampicina y quinolonas respectivamente; las

mutaciones encontradas en estos genes en cepas de M. leprae de pacientes

mexicanos serán informativas para determinar la situación de resistencia en México y

dirigir el tratamiento.

- El estudio de VNTRs y SNPs será una herramienta adecuada para la identificación

de cepas de M. leprae aisladas de las muestras de pacientes mexicanos.

18



IV. OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Realizar un análisis de la secuencia de genes que correlacionan con la resistencia a

rifampicina, dapsona y quinolonas; y el estudio del VNTR de rpoT y los SNPs para

identificar cepas de M. leprae de muestras de pacientes mexicanos.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Analizar las regiones de los genes de M. leprae folP1 gyrA, y rpoB que

confieren resistencia a dapsona, rifampicina y ofloxacina respectivamente por

medio de PCR y secuenciación.

- Realizar la identificación del VNTR del gen rpoT y el tipo de SNP de cepas de

M. leprae provenientes de muestras de pacientes mexicanos por PCR y

secuenciación.

19



V. MATERIAL Y MÉTODOS

V.I. MATERIAL BIOLÓGICO. En el estudio se incluyeron 40 muestras clínicas de

pacientes mexicanos diagnosticados con lepra, que se colectaron durante los años

2007, 2008 y 2009. Estas muestras provenían de algunos estados de la República

Mexicana y el Distrito Federal (Tabla 3). Las muestras de DNA se sometieron al

análisis de los genes folP1, gyrA, rpoB, el VNTR del gen rpoT y SNPs informativos

para lepra. Estos ensayos consistieron en amplificar por PCR el DNA blanco

utilizando iniciadores específicos, con los cuales se detectaron las regiones

determinantes para la resistencia a rifampicina, dapsona o quinolonas y el genotipo

en M. leprae para la identificación de cepas.

Se contó con el consentimiento informado de los pacientes implicados en el estudio

que fue aprobado por la Secretaría de Salud. Las muestras se tomaron después de

que se obtuvo el consentimiento informado.

Tabla 3.- Muestras de pacientes mexicanos que se incluyeron en este estudio, colectadas durante el 2007, 2008 y 2009; que provenían del Distrito Federal y de los estados Yucatán, Campeche, Nuevo León, Hidalgo, Guerrero, Oaxaca y Veracruz

Fecha Muestra No.

Identificación

Paciente

No.

Sexo Edad Diag Muestra

Tomada de

YUCATAN

10-10-07 2 1 M 58 LL Lob aur Der (D)

10-10-07 4 2 M 35 BB D

10-10-07 6 3 F 63 BB D

10-10-07 8 4 M 25 LL D

10-10-07 10 5 M 61 LL D

10-10-07 12 6 F 86 BB Lob aur Izq (I)

10-10-07 14 7 M 43 BB I

CAMPECHE

10-11-07 16 D

10-11-07 17

8 F BL

I

10-11-07 18 D

10-11-07 19

9 M LL

I

10-12-07 20 E

10-12-07 21

10 F 31 TT

I

10-12-07 22 D

10-12-07 23

11 M 31 LL

I

20



MONTERREY, N.L.

10-15-07 24 D

10-15-07 25

12 M 64 LL

I

10-15-07 26 D

10-15-07 27

13 M 42 LL

I

10-15-07 28 D

10-15-07 29

14 M 66 LL

I

10-15-07 30 D

10-15-07 31

15 M 15 LL

I

10-15-07 32 D

10-15-07 33

16 F 48 LL

I

10-15-07 34 D

10-15-07 35

17 F 56 LL

I

10-15-07 36 D

10-15-07 37

18 F 73 LL

I

10-15-07 38 D

10-15-07 39

19 F 58 LL

I

10-15-07 40 D

10-15-07 41

20 M 55 TT

I

10-15-07 42 D

10-15-07 43

21 M 35 LL

I

DISTRITO FEDERAL

04-08 79 39? M ? LL Lób aur Izq (I)

HIDALGO

17-09-09 80 40* M 65 LL D

TAMAULIPAS

22-09-09 81 41+ M 30 LL D

VERACRUZ

25-09-09 82 42+ M 56 LL D

GUERRERO

19-09-09 83 43* F 30 LL D

Lob aur Izq (I) y Der (D).- Lóbulo auricular Izquierdo y Derecho respectivamente. De acuerdo a la clasificación de Ridley y Jopling se tiene: TT.- Lepra Tuberculoide, BT.- Limítrofe Tuberculoide, BB.- Limítrofe Dimorfa, BL.- Limítrofe Lepromatosa, LL.- Lepra Lepromatosa * Sin tratamiento + Tratamiento 3 medicamentos ? No se tiene el dato

V.I.1 Muestras de pacientes con baciloscopia positiva. Estas fueron obtenidas a

partir de raspados del lóbulo auricular izquierdo o derecho de pacientes con

clasificación de lepra MB, de acuerdo con los criterios de la OMS (URL1). Una vez

realizada la limpieza del lóbulo, se procedió a realizar la hipoxia de la zona con una

pinza, al presentarse ésta, se realizó un corte lineal poco profundo, para la obtención

de linfa, con una hoja de bisturí nueva, estéril y de acero inoxidable. La hoja de

21



bisturí con el material colectado se depositó en un tubo estéril de tapón de rosca con

etanol al 70% grado biología molecular.

V.I.2 Recuperación del material colectado. En condiciones de esterilidad, se abrió

el tubo con la muestra y con unas pinzas esterilizadas al rojo vivo y enfriadas en

agua MilliQ estéril, se sacó la hoja de bisturí sujetándola firmemente para raspar la

muestra con un palillo, tratando de desprender todo el material que se encontraba

adherido a la hoja, asegurándose de depositarlo en el etanol del tubo y cerrarlo

herméticamente. La hoja de bisturí se desechó en una caja para material punzo-

cortante.

V.II. OBTENCIÓN DEL DNA GENÓMICO DE M. leprae (de Wit y col., 1991)

Los tubos se centrifugaron a 15,000 x g/20 min. Se descartó el sobrenadante

cuidadosamente por aspiración suave del etanol con la punta de una micropipeta, sin

destruir el botón y evitando tocar el botón de bacilos. Se adicionaron 500 µL de PBS

para cada muestra. Se mezcló utilizando un vórtex.

La muestra se centrifugó 15 segundos y se dejó de 3-4 h (o toda la noche en

refrigeración). Se centrifugó nuevamente para formar un botón de las bacterias

(15,000 x g/20 min). Se descartó el sobrenadante (PBS) y se resuspendieron las

bacterias en 100 µL de amortiguador de lisis (1 mg/ml PK/0.05% Tween 20) (100 µL

10 mg/mL PK-TrisHCl 8.5/ 100 µL 0.5% Tween 20/ 800 µL de agua MilliQ), pudiendo

variar el volumen, dependiendo de la cantidad del botón obtenido. El agua MilliQ

utilizada debe estar fría por lo que se utilizan alícuotas envasadas en tubos de 1 mL

y se mantienen en congelación. Se cubrió con 3 gotas de aceite mineral, para evitar

la evaporación. Se incubó a 60 °C toda la noche. Se transfirieron los tubos a

70 °C/30 min para lisar los bacilos (1 min en N2 líquido o en un baño de agua hielo

seco/acetona). Los tubos se incubaron a 97 °C/10 min. Se centrifugó 15 segundos,

para que el DNA estuviera listo para ser utilizado como molde en la reacción de PCR.

22



V.III. IDENTIFICACIÓN POR PCR Y SECUENCIACIÓN

El DNA obtenido se utilizó como molde en la reacción de PCR para someterlo al

análisis de los genes folP1, gyrA, rpoB, rpoT, y los SNPs 1-3 informativos para lepra.

V.III.1 Análisis de los genes folP1, gyrA, rpoB

Las regiones de los genes involucrados en la resistencia a fármacos (Tabla 4), se

identificaron por medio de la PCR anidada (PCR I y PCR II). Los iniciadores que se

utilizaron en este estudio para la ronda I, fueron diseñados utilizando el programa

Genefisher2 (URL7), a partir de la secuencia de la cepa TN de M. leprae (No. de

acceso en el GenBank: NC_002677). Los iniciadores utilizados para la ronda II

fueron los reportados previamente por Maeda y colaboradores en el 2001 (Tabla 6).

Condiciones de reacción en la tabla 7. Los amplicones de tamaño esperado

obtenidos y purificados, se secuenciaron por un método automatizado.

Tabla 4. Información general de las regiones amplificadas para los genes folP1, gyrA, y rpoB

Tamaño del producto (pb) Gen Características Análisis Ronda I Ronda II

folP1 Dihidropteroato sintasa Resistencia Dapsona

513 253

gyrA DNA girasa subunidad α Resistencia Ofloxacina

364 223

rpoB RNA polimerasa dependiente

de DNA, subunidad β Resistencia Rifampicina

514 277

V.III.2 VNTR del gen rpoT de M. leprae (3 ó 4 copias) región 189185 - 190909

Se realizaron dos rondas de PCR utilizando iniciadores específicos para amplificar la

región de interés del gen rpoT (Factor σ de la RNA polimerasa), los iniciadores

utilizados para la ronda I, fueron diseñados con el programa Genefisher2 (URL 7)

(Tabla 6), a partir de la secuencia de la cepa TN de M. leprae (No.de acceso en el

GenBank: NC_002677). Los iniciadores utilizados para la ronda II fueron reportados

previamente por Matsuoka y colaboradores en el 2006 (Tabla 6). El tamaño de los

23



fragmentos esperados en la primera ronda es de 620 pb a 626 pb aproximadamente

dependiendo si es rpoT del tipo 3 copias ó del tipo 4 copias.

En la segunda ronda de PCR el tamaño del fragmento esperado es entre 216 ó

222 pb, dependiendo de si hay tres copias de seis bases repetidas en tándem o

cuatro copias de seis bases repetidas en tándem (tipo tres copias o el tipo cuatro

copias respectivamente). Condiciones de reacción en la tabla 7.

V. III.3 Análisis de tres SNPs de M. leprae (Monot y col., 2005) por PCR y

secuenciación

Se amplificaron tres regiones del genoma que presentan SNPs (Tabla 5). Los

nucleótidos en las posiciones 14676, 1642875, 2935685 en el DNA genómico de M.

leprae (No. de acceso en el GenBank NC002677), en los cuales se localizaron los

SNPs (Monot y col., 2005; Cole y col., 2001) (Figura 3B), se determinaron por PCR

anidado y secuenciación. Los iniciadores se muestran en la tabla 6 y las condiciones

de reacción en la tabla 7.

Tabla 5. Información general de las regiones de M. leprae importantes para la identificación de los SNPs

Posición Característica SNP Tamaño del producto pb

Iniciador ronda I Iniciador ronda II

(anidado) SNP1 14676 Prot. Hipotética C/T SNP1-Fm/Rm 448 SNP1-OF/OR 140 SNP2 1642875 Prot. Conservada G/T SNP2-Fm/Rm 507 SNP2-OF/OR 132 SNP3 2935685 Pseudogene icl A/C SNP3-Fm/Rm 505 SNP3-OF/OR 164 Las posiciones de los nucleótidos y las características de estas regiones corresponden al DNA genómico de M. leprae con número de acceso en el GenBank NC002677, de la cepa TN (genoma completo).

24



Tabla 6. Iniciadores utilizados para identificar las regiones involucradas con la resistencia a fármacos de los genes folP1, gyrA, rpoB, y las regiones del gen rpoT para

la identificación.

Gen Iniciadores folP-Fm 5´ GCCTCATCCTGCGTAAGTGA 3´ 20mer

Externos, Ronda I folP-Rm 5´ GCCACAGCCTGATCGACA 3´ 18mer *folP-F1 5´ GTGAGTTTGGCGCCAGTGCA 3´ 20mer

folP1 Internos, Ronda II (anidado) *folP-R1 5´ GCCATCGCGGGATCTGCTCG 3´ 20mer

gyrA-Fm 5´ GAAGTCCGCGATGGTCTCA 3´ 19mer Externos, Ronda I

gyrA-Rm 5´ AGTCGATCGGATTGTCCGAA 3´ 20mer *gyrA-OF 5´ ATGGTCTCAAACCGGTACATC 3´ 21mer

gyrA Internos, Ronda II (anidado) *gyrA-OR 5´ ACCCGGCGAACCGAAATTG 3´ 29mer

rpoB-Fm 5´ GTCAGCGGTCAAGTATTCGA 3´ 18mer Externos, Ronda I

rpoB-Rm 5´ GTCAGCGGTCAAGTATTCGA 3´ 20mer *rpoB-OF 5´ TCGAGGCGATCACGCCGCA 3´ 19mer

rpoB Internos, Ronda II (anidado) *rpoB-OR 5´ CGACAATGAACCGATCAGAC 3´ 20mer

rpoT-Fm 5´ CCGAAGGGGTGTATGTGGTA 3´ 20mer Externos. Ronda I

rpoT-Rm 5´ GGATTCATCTTCGTCCCAGA 3´ 20mer **rpoT-OF 5´ AGCCAAAGACACCCTGAACG 3´ 20mer

rpoT Internos. Ronda II

**rpoT-OR 5´ AGTAGCTTCGCCATCCTCG 3´ 19mer SNP1-Fm 5´ GTGGATAGCTTGGTTGGGTA 3´ 20mer

Externos. Ronda I SNP1-Rm 5´ CGATTCCTGCACAGATGAGA 3´ 20mer **SNP1-OF 5´ TGAACAGTCTCGTAACCGTG 3´ 20mer

SNP1 Internos. Ronda II

**SNP1-OR 5´ TGAATAAAGTGGTAATAAAC 3´ 20mer SNP2-Fm 5´ GGTGGGCGAGTACTGCTA 3´ 18mer

Externos. Ronda I SNP2-Rm 5´ CGTTGCACAGAATTGCTCA 3´ 19mer **SNP2-OF 5´ GCGGCTTCATGGCTCGTCAC 3´ 20mer


**SNP2-OR 5´ GTCGGGGGTAGTAGTCTTCC 3´ 20mer SNP3-Fm 5´ CCAGTATCTGGTCCGGGTA 3´ 19mer

Externos. Ronda I SNP3-Rm 5´ CTCGGTGGAGAACTGGCTA 3´ 19mer **SNP3-OF 5´ TGGTGTCGGTCTCCATCCAG 3´ 20mer


**SNP3-OR 5´ CACCCTGATAACCTCCGACG 3´ 20mer Los iniciadores empleados para cada uno de los genes y regiones a estudiar en la ronda I, fueron diseñados con el programa Genefisher2 http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher2/. Los iniciadores de la ronda II fueron diseñados previamente por *Maeda y colaboradores en el 2001 y, **Matsuoka y colaboradores en el 2006.

25



Tabla 7. Condiciones de la PCR que se emplearon para amplificar las regiones de los genes folP1, gyrA, rpoB, rpoT y los SNPs 1 - 3

Conc. Vol. (µL) Conc. final Condiciones de PCR

Regulador de la TaqPol

10X 2.5 1X Temperatura de desnaturalización

94°C 4m

1 ciclo

Agua destilada (AD) 17.5

MgCl2 50mM 0.75 1.5mM T de fusión 94°C 30s

35 ciclos

Iniciador Directo 30µM 0.5 0.6µµµµM Alineamiento * 1m

Iniciador Reverso 30µM 0.5 0.6µµµµM Extensión 72°C 2m

TaqPol 2.5U/µL 0.25 0.625 /reac

dNTP 2mM 2 0.16mM Extensión final 72°C 5m

1 ciclo

DNA Molde 1 Volumen final 25

*Temperatura de alineamiento (Tm): Ronda I; para el gene folP1 55°C, gyrA 56.1, rpoT 53.8, rpoB 51.4°C, SNP1 y SNP3 52.6°C, SNP2 50.2°C. Ronda II; para el gene folP1 es de 51.8°C, gyrA 54.1, rpoB 53°C y rpoT 53°C, SNP1 47°C, SNP2

54.8°C, SNP3 55°C.

Se incluyeron controles de reacción de PCR (positivo y negativo). Se utilizó como

control positivo para la reacción de PCR, DNA de M. leprae T53.

M. leprae T53.- Susceptible a los medicamentos empleados en el tratamiento de la

lepra, VNTR de rpoT del tipo 3 copias, SNP Tipo 1.

Los productos de PCR para folP1, gyrA, rpoB, rpoT, SNP1-3; se sometieron a

electroforesis en geles de agarosa al 1.5%, utilizando como regulador SB 1X, a 90 V.

Los geles se revelaron con bromuro de etidio (Sambrook & Russell, 2001) y se

fotografiaron con el fotodocumentador “Gel Documentation System, BioSens SC

645”. Los fragmentos amplificados se purificaron de acuerdo a lo especificado por el

fabricante, utilizando el equipo de reactivos de purificación rápida de Qiagen,

“MinElute PCR Purification Kit”. Para la secuenciación correspondiente se solicitaron

los servicios del Instituto de Fisiología de la UNAM.

26



VI. RESULTADOS

La extracción del DNA se realizó para las 41 muestras de los 26 pacientes con

diagnóstico clínico de lepra. Mediante PCR anidada se amplificaron regiones de los

genes folP1, gyrA y rpoB involucrados en la resistencia a fármacos y la región del

gen rpoT, empleado para la identificación del VNTR y el tipo de SNP de cepas de M.

leprae.

VI.I. PRODUCTOS AMPLIFICADOS POR PCR anidado

Ronda I de PCR. Empleando el DNA de la cepa MLT53 como control positivo de

reacción, se obtuvo un amplicón de 513 pb para el gen folP1 con los iniciadores folP-

Fm-Rm, de 364 pb para el gen gyrA con los iniciadores gyrA-Fm-Rm, de 514 pb para

el gen rpoB con los iniciadores rpoB-Fm-Rm, para el gen rpoT se obtuvo un

amplificado de 620 pb con los iniciadores ropT-Fm-Rm, para SNP1 de 448 pb con los

iniciadores SNP1-Fm-Rm, para SNP2 de 507 pb con los iniciadores SNP2-Fm-Rm y

para SNP3 de 505 pb con los iniciadores SNP3-Fm-Rm. En la figura 5 se observan

las bandas correspondientes a los productos amplificados de tamaño esperados.

Figura 5. Electroferograma del los productos amplificados por PCR de los genes de la cepa T53 de M. leprae (MLT53) utilizada como control positivo. Las amplificaciones se realizaron con los iniciadores Fm y Rm para cada gen (Tabla 6). 1) Marcador de tamaño molecular de 1 Kb, Fermentas; 2) amplificado de 513 pb del gen folP1, DNA MLT53; 3) amplificado de 364 pb del gen gyrA, DNA MLT53; 4) amplificado de 514 pb del gen rpoB, DNA MLT53; 5) amplificado de 620 pb del gen rpoT, DNA MLT53; 6) amplificado de 448 pb para la región del SNP1, DNA MLT53; 7) amplificado de 507 pb para la región del SNP2, DNA MLT53; 8) amplificado de 505 pb para la región del SNP3, DNA MLT53.

500 pb

250 pb

1 2 3 4 5 6 7 8

27



Ronda II de PCR. Empleando el DNA de la cepa MLT53 como control positivo de

PCR, se obtuvo un amplicón de 253 pb para el gen folP1 con los iniciadores folP-F1

y folP-R1, de 223 pb para el gen gyrA con los iniciadores gyrA-OF y gyrA-OR, de 277

pb para el gen rpoB con los iniciadores rpoB-OF y rpoB-OR, y para el gen rpoT se

obtuvo un amplificado de 216 pb con los iniciadores rpoT-OF y rpoT-OR. En la figura

6 se observan las bandas que corresponden a los productos obtenidos a partir de los

amplificados de la ronda I.

Figura 6. Electroferograma del los productos amplificados por PCR anidado de los genes de la cepa T53 de M. leprae (MLT53) utilizada como control positivo. Las amplificaciones se realizaron con los iniciadores OF y OR para cada gen (Tabla 6). 1) amplificado de 253 pb del gen folP1, 26 ng DNA MLT53; 2) folP1, 13 ng DNA MLT53; 3) amplificado de 223 pb del gen gyrA, 26 ng DNA MLT53; 4) gyrA, 13 ng DNA MLT53; 5) amplificado de 216 pb del gen rpoT, 26 ng DNA MLT53; 6) rpoT, 26 ng DNA MLT53; 7) rpoT, 13 ng DNA MLT53; 8) amplificado de 277 pb del gen rpoB, 26 ng DNA MLT53; 9): rpoB, 13ng DNA MLT53; 10) Marcador de 100 pb Fermentas.

Empleando el DNA extraído a partir de las muestras de pacientes, no se pudo

obtener amplificados de todas las muestras por medio de la PCR anidada (PCR I y

PCR II). En las muestras en las que se obtuvo un amplicón de tamaño esperado,

solamente se puedo obtener las secuencias de algunos genes en las muestras con

número de identificación 2, 4, 79, 80, 83 (Ver tabla 8).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

200 pb

300 pb

28



Tabla 8. Muestras de los pacientes en las que se realizó la extracción del DNA, señalando aquellas muestras en las que se obtuvo amplificado y secuencia, o aquellas

en las que se obtuvo únicamente amplificado

SNP Muestra No.

Identificación

Paciente

No

Sexo Edad Diag folP1 gyrA rpoB rpoT

1 2 3

A S A S A S A S A S A S A S

2 1 M 58 LL + - + + + - + + + + + + + +

4 2 M 35 BB + - + - + - + + - + + + + +

6 3 F 63 BB - - + - + - + - - - + - + -

8 4 M 25 LL - - + - - - + - - - - - - -

10 5 M 61 LL - - + - - + - - - - - - -

12 6 F 86 BB - - - - - - + - - - + - - -

14 7 M 43 BB - - - - - - + - - - + - - -

16 + - + - + - - - - - - - - -

17

8 F BL

+ - + - - - - - - - - - - -

18 + - + - - - - - - - - - - -

19

9 M LL

- - + - - - - - - - - - - -

20 - - - - - - - - - - - - - -

21

10 F 31 TT

+ - - - - - - - - - - - - -

22 - - + - - - - - - - - - - -

23

11 M 31 LL

- - - - - - + - - - - - - -

24 + - - - - - + - - - - - - -

25

12 M 64 LL

- - - - - - + - - - - - - -

26 + - + - - - - - - - - - - -

27

13 M 42 LL

- - - - - - - - - - - - - -

28 - - - - - - + - - - - - - -

29

14 M 66 LL

- - - - + - - - - - - - - -

30 - - + - - - + - - - - - - -

31

15 M 15 LL

- - + - + - - - - - - - - -

32 - - + - - - - - - - - - - -

33

16 F 48 LL

- - + - - - - - - - - - - -

34 + - + - + - - - - - - - - -

35

17 F 56 LL

- - + - - - - - - - - - - -

36 - - + - - - + - - - - - - -

37

18 F 73 LL

- - + - - - - - - - - - - -

38 + - + - + - - - - - - - - -

39

19 F 58 LL

+ - + - + - - - - - - - - -

40 + - - - + - - - - - - - - -

41

20 M 55 TT

+ - + - + - - - - - - - - -

42 + - - - + - - - - - - - - -

43

21 M 35 LL

+ - - - + - - - - - - - - -

79 39 M ? LL + - + + + + - - - - - - - -

80 40 M 65 LL + + + + + + + + - - - - - -

29



81 41 M 30 LL + - - - - - - - - - - - - -

82 42 M 56 LL + - - - - - - - - - - - - -

83 43 F 30 LL + + + + + + + + - - - - - -

A: Amplificado obtenido por PCR anidado

S: Secuencia

+: Se obtuvo secuencia a partir del producto amplificado

- : No se obtuvo secuencia a partir del producto amplificado

En la figura 7 se muestran los productos amplificados por PCR anidado de los genes

gyrA, rpoB en las muestras 83 y folP1 en la muestra 82.

A) B)

Figura 7. Electroferograma representativo de los productos amplificados por PCR anidado en las muestras con número de identificación 82 y 83 de los genes rpoB, gyrA y folP1. (A) carril 1: Marcador de tamaño molecular 100 pb Fermentas; carril 3: amplificado de 277 pb para rpoB de la muestra 83; carril 4: amplificado de 223 pb para gyrA de la muestra 83. (B) carril 1: Marcador de tamaño molecular de 100 pb Fermentas; carril 2: amplificado de 253 pb para folP1 de la muestra 82.

VI.II. ALINEAMIENTOS DE LAS SECUENCIAS OBTENIDAS

Las secuencias obtenidas en las cepas MLT53 utilizada como control positivo y

muestras de pacientes se compararon con la base de datos del GenBank y mediante

el programa bioinformático Blast/Blastn (“Basic Local Alignment and Search Tool”),

disponible en la página principal del NCBI (“National Center for Biotechnology

Information”) (URL4), se corroboró que correspondían a las regiones de los genes de

M. leprae como se indicará para cada gen mas adelante.

1 2 3 4

1 2

200 pb

100 pb

200 pb

100 pb

253 pb

30



Al corroborar por medio del Blast que las secuencias obtenidas correspondían a M.

leprae, se realizó un alineamiento múltiple de secuencias (AMS) con el programa

BioEdit, utilizando la herramienta CLUSTALW. Se tomaron como referencia las

secuencias descargadas de la base de datos del NCBI y la secuencia obtenida de

MLT53 utilizada como control positivo; y con ellas se pudo realizar un análisis de los

cambios que pudieran estar presentes y asociados con la resistencia a dapsona,

ofloxacina y rifampicina, así como el VNTR del gen rpoT y el tipo de SNP. A

continuación se presentan los resultados obtenidos:

folP1. Gen que codifica para la enzima DHPS donde las mutaciones con sentido

equivocado en los codones 53 y 55 están relacionadas con resistencia a dapsona

(Tabla 2) (Williams y col., 2000; Maeda y col., 2001; Williams y col., 2001).

Se compararon las secuencias obtenidas de las muestras 80 y 83, con las

secuencias de la base de datos del NCBI y se corroboró que correspondían a M.

leprae, con un resultado de identidad máxima del 99% (Figura 8).

Figura 8. Resumen de resultados del análisis por BLAST de la secuencia obtenida para el gen folP1 de M. leprae. Las secuencias obtenidas para la cepa utilizada como control positivo y la muestra de 80 y 83 se compararon con las secuencias del “GenBank” a través del BLAST/Blastn del NCBI.

Se realizó un AMS y la traducción correspondiente con el programa BioEdit, de las

secuencias de la muestra MLT53 que es utilizada como control positivo, la secuencia

reportada en el NCBI de la cepa TN con clave de acceso NC_002677 y las

31



secuencias de M. leprae provenientes de las muestras de los pacientes 80 y 83;

corroborando que no hay cambios con sentido equivocado en los codones 53 y 55

que estén relacionados con la resistencia a dapsona (Figura 9).

Figura 9. Alineamiento de secuencias utilizando el programa BioEdit para folP1 y la traducción. La secuencia “MLT53” corresponde a la cepa utilizada como control positivo y amplificada en el laboratorio, “TN_AL583917” secuencia de M. leprae cepa TN con clave de acceso en NCBI NC_002677 (AL583917); y finalmente las muestras 80 y 83.

gyrA. Gen que codifica para la subunidad α de la DNA girasa, donde mutaciones con

sentido equivocado en los codones 89 y 91 están relacionadas con resistencia a

ofloxacina (Cambau y col., 2002; Maeda y col., 2001).

Se realizó el alineamiento de las secuencias obtenidas en el laboratorio tanto para la

cepa MLT53 utilizada como control positivo; como las obtenidas de las muestras 2,

79, 80 y 83. Se obtuvo un 99% de identidad máxima al compararlas con las

secuencias de la base de datos del GenBank mediante el Blast/Blastn de la página

principal del NCBI (URL4). Se corroboró que correspondían a la región diana del gen

gyrA de M. leprae (Figura 10).

CODONES 53 55 MLT53 : GAAGGCGCGGCGATTGTCGACGTCGGTGGCGAATCGACCCGGCCCGGTGCCATTAGGACC : 106

TN_NC002677: GAAGGCGCGGCGATTGTCGACGTCGGTGGCGAATCGACCCGGCCCGGTGCCATTAGGACC : 180 80-folP1 : GAAGGCGCGGCGATTGTCGACGTCGGTGGCGAATCGACCCGGCCCGGTGCCATTAGGACC : 83 83_folP : GA-GGCGCGGCGATTGTCGACGTCGGTGGCGAATCGACCCGGCCCGGTGCCATTAGGACC : 80

TRADUCCION

136 GTC GAC GTC GGT GGC GAA TCG ACC CGG CCC GGT GCC ATT AGG ACC 180

46 Val Asp Val Gly Gly Glu Ser Thr Arg Pro Gly Ala Ile Arg Thr 60

32



A) MLT53

B) Muestra 2

C) Muestra 79

D) Muestra 80

E) Muestra 83

Figura 10. Resumen de resultados del análisis por BLAST de las secuencia obtenidas para gyrA de M. leprae mediante el programa bioinformático Blastn del NCBI. Se compararon con las secuencias del “GenBank” a través del BLAST/Blastn de la NCBI; (A) Control positivo MLT53, (B) muestra 2, (C) muestra 79, (D) muestra 80 y (E) muestra 83.

Con el AMS y la traducción correspondiente obtenidos con el programa BioEdit, se

corroboró que no hay cambio en las secuencias de M. leprae obtenidas de las

muestras de pacientes que indiquen mutación con sentido equivocado en los

codones 89 y 91 y que están relacionados con la resistencia a ofloxacina (Figura 11).

33



Figura 11. Alineamiento de secuencias utilizando el programa Bioedit para gyrA y la traducción. La secuencia “MLT53” corresponde a la de la cepa utilizada como control positivo y amplificada en el laboratorio. NC_002677” M. leprae cepa TN con clave de acceso en NCBI NC_002677; finalmente las secuencias de las muestras 2, 79, 80 y 83 amplificadas en el laboratorio.

rpoB. Gen que codifica para la subunidad β de la RNA polimerasa dependiente de

DNA, donde mutaciones con sentido equivocado en los codones 401, 407, 410, 416,

420, 425 y 427 están relacionadas con resistencia a rifampicina.

Se realizó el alineamiento de las secuencias obtenidas tanto para la cepa MLT53

utilizada como control positivo y amplificada en el laboratorio para el gen rpoB; como

las obtenidas de las muestras de los pacientes 79 y 83, se obtuvo un 99% de

identidad al compararlas con las secuencias de la base de datos del GenBank

mediante el programa bioinformático Blast/Blastn de la página principal del NCBI

(URL4). Se corroboró que correspondían a la región diana del gen rpoB de M. leprae

(Dato no mostrado). En contraste con la secuencia obtenida de la muestra del

paciente 80, el resultado de máxima identidad fue del 98% para Propionibacterium

acnes, quedando por arriba del resultado esperado de M. leprae cepas Br4923 y TN

con un valor de máxima identidad del 86% (Figura 12).

CODONES 89 91 * 260 * 280 * 300 MLT53 : ACGATGGGCAATTACCATCCGCACGGCGACGCATCGATTTATGACACGTTAGTGCGCATG : 163

NT_NC002677: ACGATGGGCAATTACCATCCGCACGGCGACGCATCGATTTATGACACGTTAGTGCGCATG : 300 79-gyrA : ACGATGGGCAATTACCATCCGCACGGCGACGCATCGATTTATGACACGTTAGTGCGCATG : 163

2-gyrA : ACgATGGGCAaTTACcATCCGCACGGCGACGCATCGATTTATGACACGTTAGTGCGCATG : 74

80_gyrA : ACGATGGGCAATTACCATCCGCACGGCGACGCATCGATTTATGACACGTTAGTGCGCATG : 142 83_gyrA : ACGATGGGCAATTACCATCCGCACGGCGACGCATCGATTTATGACACGTTAGTGCGCATG : 142

TRADUCCIÓN

238 GAG ACG ATG GGC AAT TAC CAT CCG CAC GGC GAC GCA TCG ATT TAT GAC ACG 288 80 Glu Thr Met Gly Asn Tyr His Pro His Gly Asp Ala Ser Ile Tyr Asp Thr 96

34



Figura 12. Resumen de resultados del análisis por BLAST de la secuencia nucleotídica obtenida para rpoB de M. leprae de la muestra 80. Se compararon con las secuencias del “GenBank” a través del BLAST/Blastn de la NCBI. Para la muestra 80 el resultado de máxima identidad es de 98% que corresponde al microorganismo P. acnes, dejando a M. leprae cepas TN y Br4923 con un 86% de máxima identidad.

Se realizó el AMS con el programa BioEdit, utilizando la herramienta CLUSTALW,

con las secuencias MLT53 (control positivo); pacientes 79, 80 y 83, obtenidas en el

laboratorio y la secuencia de la base de datos del NCBI para la cepa TN con clave de

acceso NC_002677. Se detectó que había cambios en las secuencias provenientes

de los pacientes 79 y 80 (Figura13C y D).

En la muestra 79 no se observaron cambios en los codones 401, 407, 416, 420, 425,

427 que han sido señalados previamente por algunos investigadores como

relacionados con resistencia a rifampicina (Tabla 2, Figuras 13A y C), pero se

observa un cambio en el codón 426, Ala426Val, que no ha sido identificado aún ni

reportado que confiera resistencia (Figura 13C).

Los alineamientos de las secuencias utilizando el programa BioEdit, muestran

diferencias entre las secuencias reportadas en la base de datos del NCBI y la

muestra 80 para el gen rpoB de M. leprae (Figuras 13A y 13D).

35



Figura 13. Alineamiento y traducción de secuencias utilizando el programa Bioedit para rpoB. (A) Alineamiento de secuencias indicando los codones 401, 407, 410, 416, 420, 425, 427; los cambios que pudieran presentarse y que han sido reportados por algunos investigadores que confieren resistencia a rifampicina. La secuencia “MLT53” corresponde a la cepa utilizada como control positivo y amplificada en el laboratorio. “TN_AL58392” secuencia de M. leprae cepa TN con clave de acceso en NCBI NC_002677 (AL58392). Las secuencias obtenidas a partir de las muestras 79, 80, 83, amplificada en el laboratorio. (B).Traducción de la secuencia MLT53; (C) Traducción de la secuencia 79; (D) Traducción de la secuencia 80.

Para comprobar que los cambios observados en la secuencia 80_rpoB-OF de la

muestra 80 efectivamente correspondían a P. acnes, se realizó un análisis

empleando la herramienta bioinformática tBlastx disponible en la página principal del,

Codones 407 410 416 420 425 427

A) MLT53 : CAGTTCATGGATCAGAACAACCCTCTGTCGGGCCTGACCCACAAGCGCCGGCTGTCGGCGCTG : 175

TN_AL58392: CAGTTCATGGATCAGAACAACCCTCTGTCGGGCCTGACCCACAAGCGCCGGCTGTCGGCGCTG : 1400

79-rpoB-OF: CAGTTCATGGATCAGAACAACCCTCTGTCGGGCCTGACCCACAAGCGCCGGCTGTCGGTGCTG : 161

80_rpoB-OF: CAGTTCATGGATCAGAACAACCCGCTGGCCGAGATGACCCACAAGCGTCGCCTGTCGGCCTTG : 157 83_rpoB-OF: CAGTTCATGGATCAGAACAACCCTCTGTCGGGCCTGACCCACAAGCGCCGGCTGTCGGCGCTG : 156 413 422 423 426

B) MLT53 : CAGTTCATGGATCAGAACAACCCTCTGTCGGGCCTGACCCACAAGCGCCGGCTGTCGGCGCTGGGC

1206 CAG TTC ATG GAT CAG AAC AAC CCT CTG TCG GGC CTG ACC CAC AAG CGC CGG CTG TCG GCG CTG 407 Gln Phe Met Asp Gln Asn Asn Pro Leu Ser Gly Leu Thr His Lys Arg Arg Leu Ser Ala Leu

C) 79-rpoB- : CAGTTCATGGATCAGAACAACCCTCTGTCGGGCCTGACCCACAAGCGCCGGCTGTCGGTGCTGGGC Codón 426

CAG TTC ATG GAT CAG AAC AAC CCT CTG TCG GGC CTG ACC CAC AAG CGC CGG CTG TCG GTG CTG

Gln Phe Met Asp Gln Asn Asn Pro Leu Ser Gly Leu Thr His Lys Arg Arg Leu Ser Val Leu

D) 80_rpoB-O : CAGTTCATGGATCAGAACAACCCGCTGGCCGAGATGACCCACAAGCGTCGCCTGTCGGCCTTGGGC

CTG TCG CAG TTC ATG GAT CAG AAC AAC CCG CTG GCC GAG ATG ACC CAC AAG CGT CGC CTG TCG GCC TTG

Leu Ser Gln Phe Met Asp Gln Asn Asn Pro Leu Ala Glu Met Thr His Lys Arg Arg Leu Ser Ala Leu 416 417 418

36



el cual busca en la base de datos nucleótidos traducidos y realiza el alineamiento al

traducir la secuencia problema (80_rpoB-OF). El resumen de resultados del análisis

con tBlasx se muestra en la figura 14, el valor de E para P. acnes es de 1e-49 y para

M. leprae es de 2e-45, lo que implica que la secuencia si corresponde a P. acnes

(Figura 14).

Figura 14. Resumen de resultados del análisis con tBlasx obtenidas para la secuencia rpoB de la muestra 80 mediante el programa bioinformático tBlastx del NCBI. Se comparan las secuencias traducidas de la base de datos del “GenBank” a través del BLAST/tBlastx de la NCBI con la secuencia traducida 80_rpoB-OF, proveniente de la muestra 80.

Los alineamientos de las secuencias de aminoácidos obtenidas por medio del tBlasx

con la secuencia problema 80_rpoB-OF se muestran en la figura 15. En la figura 15A

se tiene la secuencia problema 80_rpoB-OF con mayor identidad para la secuencia

de P. acnes que con la de M. leprae Br4923 (Figura 15B).

37



A)

B)

Figura 15. Alineamientos de las secuencias de aminoácidos obtenidas por medio del programa bioinformático tBlasx del NCBI. (A) Alineamiento de la secuencia problema 80_rpoB-OF con la secuencia de la base de datos de P. acnes. (B) Alineamiento de la secuencia problema 80_rpoB-OF con la secuencia de la base de datos de M. leprae Br4923.

rpoT. Gen que codifica para el factor sigma de la RNA polimerasa, cuya secuencia

presenta polimorfismo. Los VNTR en el gen rpoT, con un intervalo pequeño de

divergencia de tres copias de 6 pb repetidos en tándem, o cuatro copias de 6 pb

repetidas en tándem (VNTR del tipo tres copias y del tipo cuatro copias,

respectivamente) (Kimura y col., 2009; Matsuoka y col., 2006, Matsuoka y col., 2005;

Matsuoka y col., 2000).

38



Se realizó el alineamiento de las secuencias obtenidas tanto para la cepa MLT53

utilizada como control positivo, las muestras 2 y 4 provenientes del estado de

Yucatán (Tabla 3) y las de los pacientes 80 y 83; amplificadas en el laboratorio para

el gen rpoT. Se obtuvo un valor del 99% de identidad al compararlas con las

secuencias de la base de datos del GenBank mediante el programa bioinformático

Blast/Blastn de la página principal del NCBI (URL4), cepas TN de M. leprae. Se

corroboró que correspondían a la región diana del gen rpoT de M. leprae (Dato no

mostrado).

La figura 16 muestra el alineamiento entre secuencias que presentan el VNTR del

tipo 3 copias o 4 copias en el gen rpoT.

Figura 16. AMS utilizando el programa BioEdit para identificar el VNTR del gen rpoT. La secuencia “MLT53” de la muestra MLT53 que es utilizada como control positivo. Secuencia “T53_AB019” de M. leprae cepa Thai 53 con clave de acceso en NCBI AB019193 correspondiente al gen rpoT. “TN_AL58392” secuencia de M. leprae cepa TN con clave de acceso en NCBI NC_002677. “Kyoto-2 secuencia de M. leprae cepa Kyoto-2 con clave de acceso en NCBI AB019194 rpoT del tipo 4 copias. Finalmente muestras 2, 4, 80 y 83.

SNP 1 – 3

El tipo de SNP de la secuencia MLT53 que es utilizado como control positivo y que

fue amplificada en el laboratorio es del tipo 1 (Figuras 3 y 17), al igual que la

secuencia Mat 1-3, que corresponde a la secuencia de la cepa TN de M. leprae de la

base de datos del GenBank con clave de acceso en el NCBI NC_002677. El SNP1

corresponde al nucleótido localizado en la posición 14,676 del genoma de M. leprae

* 660 * 680 * 700

MLT53 : CAGCGAGGACATCGACATCGACATC------GAAGCCGCCGACCTCGGTCTCGACGAC : 130

T53_AB0191: CAGCGAGGACATCGACATCGACATC------GAAGCCGCCGACCTCGGTCTCGACGAC : 697 TN_AL58392: CAGCGAGGACATCGACATCGACATC------GAAGCCGCCGACCTCGGTCTCGACGAC : 594

Kyoto-2_AB: CAGCGAGGACATCGACATCGACATCGACATCGAAGCCGCCGACCTCGGTCTCGACGAC : 703

2-rpoT : CAGCGAGGACATCGACATCGACATC------GAAGCCGCCGACCTCGGTCTCGACGAC : 127 4-rpoT : CAGCGAGGACATCGACATCGACATC------GAAGCCGCCGACCTCGGTCTCGACGAC : 134

80_rpoT : CAGCGAGGACATCGACATCGACATC------GAAGCCGCCGACCTCGGTCTCGACGAC : 136

83_rpoT : CAGCGAGGACATCGACATCGACATC------GAAGCCGCCGACCTCGGTCTCGACGAC : 148

VNTR tipo 3 copias GACATC GACATC GACATC de 6 pb cada uno

39



TN, que pertenece a una proteína hipotética; el SNP2 corresponde al nucleótido que

está localizado en la posición 1,642,875 del genoma de M. leprae TN, y pertenece a

una proteína conservada; el SNP3 corresponde al nucleótido localizado en la

posición 2,935,685 del genoma de M. leprae TN que pertenece al pseudogene icl. En

la figura 17 se muestra la manera para determinar el tipo de SNP tomando en cuenta

los tres nucleótidos en las tres distintas posiciones de acuerdo a lo reportado por

Monot y colaboradores en el 2005.

SNP1 nt 14,676

C

SNP2 nt 1,642,875

G

SNP3 nt 2,935,685

A

C G A Figura 17. Alineamiento de secuencias utilizando el programa BioEdit para las regiones donde se encuentran los SNP 1-3. La secuencia “T53” corresponde a la cepa MLT53 que es utilizada como control positivo, amplificada en el laboratorio. “Mat-SNP1, SNP2, SNP3” corresponde a la secuencia depositada en el GenBank de M. leprae cepa TN con clave de acceso en el NCBI NC_002677.

S�P Tipo 1

40



VII. DISCUSIÓN

El diagnóstico de la enfermedad se realiza con base en la detección de los signos

clínicos correspondientes y las biopsias del tejido afectado teñidas por la técnica de

Ziehl Neelsen, según lo estipulado por la OMS (URL1, 2, 3), aunque es importante

incluir estudios a nivel molecular, para la búsqueda de mutaciones en los genes:

folP1, gyrA y rpoB de M. leprae, para la detección de cepas resistentes a dapsona,

rifampicina y ofloxacina respectivamente (Grosset y col., 1989; 2001; Williams y col.,

2001; Williams y col., 2000; Cambau y col., 2002; Scollard y col., 2006; Hernández y

col., 2008). A los pacientes se les proporciona una terapia múltiple de fármacos que

han disminuido el número de casos de lepra registrados (Scollard y col., 2006; URL1

y 2), pero la resistencia aún se está presentando (Kai y col., 1999; Matsuoka y col.,

2000; Williams y col., 2000; Maeda y col., 2001; Williams y col., 2001; Cambau y col.,

2002; Ebanezer y col., 2002; You y col., 2004; Cambau y col., 2006; Lopez-Roa y

col., 2006; Matsuoka y col., 2007; Hernández y col., 2008), por lo que el realizar un

examen de susceptibilidad a la terapia contra la lepra mediante la detección de

mutaciones en estos genes por técnicas de biología molecular como la amplificación

por PCR de blancos moleculares, es un método que debe ser aplicado sobre todo en

casos de recaída o en aquellos que no muestran mejoría con el tratamiento

convencional y no únicamente con fines de investigación.

A pesar de que la identificación de M. leprae es problemática, debido a que sigue

siendo un microorganismo no cultivable in vitro, y solo se le ha podido cultivar en

armadillo de nueve bandas y el cojinete plantar de ratón (Scollard y col. 2006), el

diagnóstico y la identificación a partir de las muestras de pacientes ha tenido

resultados aceptables (Kurabachew y col., 1998; Kimura y col., 2009; Torres y col.,

2009), pero nos hemos dado cuenta que es muy importante que las muestras sean

procesadas lo más pronto posible, además de que para tener un resultado exitoso

depende de varios factores, como son el tiempo de conservación corto, la correcta

toma de la muestra, el inóculo, la especificidad de los iniciadores, entre otros. En el

caso del presente trabajo, la identificación y el estudio de resistencia se hicieron

41



directamente de las muestras de pacientes con diagnóstico clínico de lepra, de las

cuales, para las muestras colectadas durante octubre de 2007, se obtuvieron

resultados para las muestras 2 y 4 que corresponden a dos pacientes, uno con

diagnóstico clínico de LL y otro con diagnóstico clínico BB respectivamente,

provenientes del estado de Yucatán; y las muestras 79, 80, 83 (Tabla 3); en las

cuales no se detectaron mutaciones con sentido equivocado en los codones

señalados por algunos investigadores, a excepción de la muestra 79 para el gen

rpoB, como se discutirá mas adelante.

En el caso de folP1 (que codifica para la enzima DHPS), los codones 53 y 55

corresponden a Thr y Pro respectivamente. En las secuencias de las muestras 80 y

83 no se observó cambio que pudiera correlacionar con resistencia a dapsona

(Figura 9). En estos codones se han identificado las mutaciones: Thr53Ala (Maeda y

col., 2001), Thr53Arg (Williams y col., 2001), Thr53Ile (Williams y col., 2000), la doble

mutación Thr53Ala;Pro55Leu (Maeda y col., 2001), Pro55Arg (Williams y col., 2001;

Williams y col., 2000), Pro55Leu (Williams y col., 2001), localizadas en el sitio de

unión del PABA y la dapsona (análogo estructural del PABA) y que daría como

resultado la resistencia a dapsona.

En el caso de gyrA, las mutaciones con sentido equivocado en la región altamente

conservada determinan la resistencia a la ofloxacina (4-fluoroquinolona) en M. leprae

(Maeda y col., 2001; Cambau y col., 2002).

Con la comparación de resultados del análisis a través del BLAST/Blastn (URL4) del

NCBI de las muestras de los pacientes 2 y 79, 80 y 83; y la MLT53 utilizada como

control positivo, se obtuvo una identidad máxima de entre 97 y 100% y se comprobó

que correspondían a un fragmento de la región diana del gen gyrA de M. leprae

(Figura 10A, B, C, D, E). Al realizar los alineamientos y al comparar las secuencias

del control positivo y las secuencias obtenidas de las muestras de los pacientes

(Figura 11), se observó que los codones 89 y 93 codifican para los aminoácidos Gly y

Ala, al igual que la secuencia de la base de datos reportada en el NCBI para el gen

42



gyrA de M. leprae TN (clave de acceso NC_002677). No se observó algún cambio

que indique mutación con sentido equivocado como las reportadas Gly89Cys (Maeda

y col., 2001), Ala91Val (Maeda y col., 2001; Cambau y col., 2002) que correlacionen

con la resistencia a la ofloxacina.

La resistencia de M. leprae a rifampicina, correlaciona con los cambios en la

estructura de la subunidad β de la RNA polimerasa por mutación con sentido

equivocado en la región altamente conservada del gen rpoB. (Honore y col., 1993;

Maeda y col., 2001; Cambau y col., 2002).

Se comprobó que las secuencias obtenidas para los pacientes 79 y 83, el control

positivo MLT53 y las secuencias del GenBank a través del BLAST/Blastn (URL4) del

NCBI; que los fragmento de 277 pb obtenidos para estas muestras, con una

identidad máxima del 99%, correspondían al gen de la RNA polimerasa (rpoB) de M.

leprae (dato no mostrado). A diferencia de la muestra 80, en la cual se obtuvo un

valor de identidad máxima de 98% con P. acnes, muy por arriba del que se esperaba

para M. leprae de 86% (Figura 12). Por lo que fue necesario analizar las secuencias

nucleotídicas con más detalle.

Los alineamientos de las secuencias obtenidas de los pacientes 79 y 83, y el control

positivo (Figura 13), mostraron que los codones en las posiciones 401, 407, 410,

416, 420, 425 y 427 codifican para Gly, Gln, Phe, Met, Asp, Ser, His, Ser y Leu

respectivamente, al igual que la secuencia reportada en el NCBI con clave de acceso

NC_002677 para la cepa de M. leprae TN (Figura 13A y B), en este alineamiento no

se observó algún cambio que indicara una mutación con sentido equivocado como

las reportadas por algunos investigadores: Gly401Ser (Cambau y col., 2002),

Gln407Val (Cambau y col., 2002), Asp410Asn (Maeda y col., 2001), la doble

mutación Asp410Asn;Leu427Pro (Maeda y col., 2001), Ser416Cys, His420Asp,

His420Tyr (Honore y col., 1993), Ser425Leu (Cambau y col., 2002; Williams y col.,

1994), Ser425Met (Maeda y col., 2001), la doble mutación Ser425Met;Leu427Val

(Cambau y col., 2002), Ser425Phe (Honore y col., 1993), Ser425Trp (Maeda y col.,

43



2001); sin embargo, en la muestra 79 para el gen rpoB, se detectó una mutación con

sentido equivocado en el codón 426, que no ha sido reportada previamente; en este

caso la substitución en el codón 426: Ala426Val (Figura 13C) con cambio de

aminoácidos con las mismas propiedades fisicoquímicas; es decir; aminoácidos con

grupos R no polares que pudieran no tener un impacto directo en la conformación

tridimensional de la proteína y por ende en su afinidad, pero no se puede descartar

que se han reportado mutaciones que dan como resultado cambios en la secuencia

de aminoácidos con las mismas propiedades fisicoquímicas y que sí tienen un

impacto sobre todo en la afinidad de las proteínas por su sustrato, como es el caso

de la mutación descrita previamente por algunos investigadores para el gen gyrA

Ala91Val (Cambau y col., 2002; Maeda y col., 2001) y de la cual se ha hecho

mención en este trabajo.

Es importante recalcar que el blanco para la rifampicina es la subunidad β de la RNA

polimerasa codificada por rpoB (Williams y col., 1994), impidiendo la transcripción.

Se sabe que la rifampicina no bloquea la unión de la RNA polimerasa al DNA molde;

pero si interfiere con la formación de los primeros enlaces fosfodiéster en la cadena

en formación del RNA. El antibiótico bloquea el canal en la enzima por el cual el

híbrido DNA-RNA debe pasar. Al cambiar el microambiente debido a las mutaciones,

la afinidad del fármaco por la enzima disminuye y con ello no se lleva acabo el efecto

bactericida de la rifampicina. Para decir que la mutación Ala426Val del gen rpoB

correlaciona con la resistencia a rifampicina sería necesario realizar un ensayo de

susceptibilidad in vivo en cojinete plantar de ratón, como el realizado por Ebenezer y

colaboradores (2002), además de realizar estudios de simulación dinámica molecular

para determinar in silico como afecta esta mutación la estructura y afinidad de la

proteína. Además de que sería importante tener más información acerca de la

evolución de la enfermedad en el paciente, el tipo de tratamiento, si lo toma como

está indicado, etc. Para los pacientes diagnosticados con lepra, que reciben una

terapia múltiple de fármacos, se sospecha de mutaciones en los genes que

correlacionan con resistencia en las cepas de M. leprae cuando el tratamiento falla,

de otro modo es difícil saberlo únicamente con la información obtenida por los

44



pacientes, a menos que se realicen los ensayos de susceptibilidad mediante la

detección de mutaciones.

Como se había mencionado con anterioridad, se obtuvo un resultado inesperado

para la secuencia obtenida a partir de la muestra 80 para el gen rpoB, ya que el

resultado que se obtuvo utilizando el programa bioinformático Blastn de la página

principal del NCBI (URL4), dio un valor de máxima identidad de 98% para P. acnes,

superior al que se esperaba para M. leprae con un valor de máxima identidad de

86% (Figura 12). Debido a que los cambios observados en la secuencia de

nucleótidos obtenida para la muestra 80 no impactaban en gran medida la secuencia

de aminoácidos, es decir, los cambios en los codones 413, 422, 423 y 426,

codificaban para los mismos aminoácidos de la secuencia de M. leprae, a excepción

de los codones 416, 417 y 418, en los que se observa un cambio de Ser416Ala

Gly417Glu y Leu418Met (Figura 13D); y para comprobar que efectivamente la

secuencia obtenida correspondía a P. acnes y no a M. leprae, se realizó un AMS

pero con la secuencia traducida por medio del programa bioinformático tBlastx de la

página principal del NCBI (URL4) considerando que:

- Las secuencias de DNA no se parecen mucho sobre todo cuando hay cambios

en ellas por mutaciones, pero las secuencias de aminoácidos sí, ya que en la

evolución lo que se conserva son las proteínas.

- El DNA es muy variable, pero la secuencia de aminoácidos no, gracias a que

el código genético es degenerado.

Por lo que en este caso era importante realizar con las secuencias traducidas. El

análisis con tBlastx dio un valor de E de 1e-49 para P. acnes y de 2e-45 para M.

leprae, con lo que se comprueba que la secuencia obtenida para rpoB corresponde a

P. acnes y que los cambios observados en la secuencia no son debidos a

mutaciones del gen rpoB de M. leprae. Es importante tomar en cuenta que aunque

los iniciadores fueron diseñados para ser específicos de M. leprae, en proteínas tan

conservadas en la naturaleza como es el caso la subunidad β de la RNA polimerasa

para ambos microorganismos, se puedo inferir que ambos microorganismos pueden

estar provocando daño en el paciente, localizados en la misma región anatómica

donde se toma la muestra para el diagnóstico de la lepra; P. acnes pertenece a la

45



biota normal de la piel, pero debido a la condición del paciente 80, puede volverse un

microorganismo patógeno. Se puede tener inespecificidad sobre todo en secuencias

tan conservadas en la naturaleza, generando falsos positivos, lo que no se ha

observado para otros blancos moleculares, por lo que es importante emplear varios

blancos moleculares específicos o que no estén tan conservados para el diagnóstico

e identificación de M. leprae.

Con la publicación de la secuencia del genoma completo aislado de la cepa Tamil

Nadu (TN), India en 2001 (Cole y col., 2001), se han seleccionado marcadores

genéticos polimórficos para la identificación y tipificación de cepas. Los métodos de

tipificación de cepas de M. leprae pueden ser de gran ayuda para el conocimiento

epidemiológico de este microorganismo y ayudar a identificar las fuentes de infección

para entender sus patrones de transmisión y poder diferenciar entre los eventos de

recaída y reinfección (Torres y col., 2009). De todos los marcadores genéticos para

la identificación y tipificación descritos hasta el momento que ayudan a descubrir la

variación entre cepas de M. leprae (Kimura y col., 2009; Matsuoka y col., 2005;

Zhang y col., 2005; Groathouse y col., 2004; Matsuoka y col., 2000; Shin y col.,

2000), en las muestras de pacientes mexicanos con diagnóstico clínico de lepra

multibacilar se analizan los VNTR del gen rpoT de M. leprae (Kimura y col., 2009;

Matsuoka y col., 2000, Matsuoka y col., 2005) y los SNPs 1 – 3 (Monot y col., 2005)

que han mostrado ser polimórficos en distintas muestras de pacientes analizadas y

útiles para ayudar a la identificación de cepas.

Los VNTR en el gen rpoT, con un intervalo pequeño de divergencia de tres copias de

6 pb repetidos en tándem, o cuatro copias de 6 pb repetidas en tándem (VNTR del

tipo tres copias y del tipo cuatro copias, respectivamente), son importantes para el

análisis de la transmisión global de la lepra (Matsuoka y col., 2006). Ha habido

descubrimientos importantes en cuanto a la presencia y predominancia de cada uno

de estos tipos en diferentes regiones del mundo (Matsuoka y col., 2006; Matsuoka y

col., 2000).

46



En este trabajo se obtuvieron amplificados de 620 pb para la ronda I y de 216 pb

para la ronda II (Figuras 5 y 6) para el control positivo al igual que las muestras de

pacientes 2, 4, 80 y 83. Las secuencias nucleotídicas obtenidas para el gen rpoT se

compararon con las del GenBank a través del BLAST/Blastn (URL4) del NCBI,

comprobando que los fragmento de 216 pb con una identidad máxima del 97% (dato

no mostrado), corresponden a la región del gen rpoT, con la cepa TN y T53 de M.

leprae.

Los alineamientos a partir de las secuencias obtenidas de la región codificante del

gen rpoT, para las muestras de pacientes del estado de Yucatán; las muestras 80 y

83; tienen el VNTR de 6 pb del tipo tres copias (Figura 16). Se compararon con las

secuencias de cepas de M. leprae depositadas en el banco de genes del NCBI,

cuyas diferencias para esta región del gen, radican en el número de copias. En la

cepa T53 (No. de acceso del GenBank: AB019193) y en la cepa TN (No. de acceso

del GenBank: NC_002677) son del tipo tres copias; la cepa Kyoto-2 es del tipo cuatro

copias. El estudio publicado por Torres y colaboradores (2009) indica que es

recomendable incluir un mayor número de VNTRs para la identificación y

diferenciación de cepas. Se ha demostrado que el estudio de diferentes

polimorfismos en los que se incluyen los VNTRs del gen rpoT, como el realizado en

este trabajo, son útiles para la identificación y la información obtenida es muy

importante parea realizar estudios epidemiológicos a nivel molecular (Matsuoka y

col., 2000; Matsuoka y col., 2004; Matsuoka y col. 2006; Kimura y col., 2009).

Con esto se comprueba hasta el momento que lo predicho por Matsuoka y

colaboradores en el 2000 y 2005, en cuanto a que se observa una tendencia de las

cepas de M. leprae con un VNTR del gen rpoT del tipo 4 copias predominan en

países de Asia tales como Corea y Japón, el tipo 3 copias predomina en los países

de America.

La genotipificación tomando en cuenta el polimorfismo en un solo nucleótido o SNP

(del inglés: Single-Nucleotide Polymorphisms) es útil para el análisis de la

47



diseminación global de la lepra (Monot y col., 2005; Matsuoka y col., 2006). Las

variaciones en los genotipos de los SNP sí puede estar muy relacionado con el

origen geográfico de las cepas (Mount y col., 2005).

En este estudio hasta el momento se han obtenido las secuencias de las muestras 2

y 4, el nucleótido en la posición 14,676 es C (Citosina), el nucleótido en la posición

1,642,875 es T (Timina), y finalmente el nucleótido en la posición 2,935,685 es C,

dando como resultado un SNP del tipo 3 para ambas muestras (Figura 3). Con los

reportes hechos por Monot y colaboradores (2005), quiénes proponen un esquema

global de evolución para M. leprae y a su vez aportaron datos para la detección de

los SNP (Figuras 3 y 4). La comparación con los resultados obtenidos en el 2006 por

Matsuoka y colaboradores, que detectaron los mismos genotipos que habían sido

detectados por Monot y colaboradores (2005): SNP tipo 1, CGA; SNP tipo 2, CTA;

SNP tipo 3, CTC; SNP tipo 4, TTC; en las posiciones 14676, 1642875 y 2935685

respectivamente, determinan que el SNP tipo 1 predominó en Myanmar y el SNP tipo

3 predominó en Japón. El tipo 4 fue detectado en pacientes de descendencia

japonesa y que radican en Brasil. Se ha demostrado que el genotipo tomando en

cuanta los SNP de M. leprae, tiene una diseminación geográfica mundial

característica (Monot y col., 2005).

En la figura 18 se observa el alineamiento de las secuencias obtenidas para la cepa

MLT53 que fue utilizada como control positivo, comparada con la secuencia

depositada en el GenBank para M. leprae cepa TN, con clave de acceso

NC_002677, para demostrar como se realiza la determinación del tipo de SNP que

según el esquema de Monot y colaboradores en 2005 (Figura 17), correspondería al

SNP tipo 1 (CGA).

El principal interés era saber también, si hay una concordancia en la distribución de

los genotipos específicos de los SNP con la distribución de los VNTR de los tipos

cuatro copias y tres copias del gen rpoT, que al parecer predomina el VNTR del tipo

3 copias y el SNP tipo 3 en muestras de pacientes mexicanos. Matsuoka en el 2006

describió la presencia de un SNP tipo 4 de pacientes de descendencia japonesa que

radican en Brasil y no se detectaron estas cepas en pacientes japoneses o de otros

países de Asia.

48



VIII. CONCLUSIONES

En las secuencias obtenidas hasta el momento, no se detectaron mutaciones en los

codones previamente identificadas por algunos investigadores en los genes folP,

gyrA y rpoB que pudieran tener relación con la resistencia a dapsona, ofloxacina y

rifampicina respectivamente a los fármacos recomendados en el tratamiento de la

lepra.

Se detectó la mutación Ala426Val en el gen rpoB que no ha sido identificada

previamente, por lo que aún no se puede saber si correlaciona con la resistencia a

rifampicina.

En las dos muestras de pacientes del estado de Yucatán se tiene el VNTR de 6 pb

del tipo 3 copias en el gen rpoT y el SNP del tipo 3.

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALtesis.ipn.mx/jspui/bitstream/123456789/8609/1/108.pdf · ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Comparación de los genomas de M. leprae y M. tuberculosis 3 Tabla