Intensyvaus ūkininkavimo įtaka antibiotikams atsparių bakterijų atsiradimui ir plitimui aplinkoje

Modestas Ružauskas

Vilnius, 2018-11-14

Problema

• Netvaraus agroekosistemų naudojimo tendencijos ir žemdirbystės praktika;

• Sparčiai plečiasi monokultūrų pasėliai;

• Mažai tyrinėtas agroekosistemų naudojimo intensyvinimo poveikis jų tvarumui ir biologinei įvairovei

• Mikroorganizmai – menkiausiai ištirti Lietuvos ekosistemų komponentai;

• Atsparumas chemikalams, antibiotikams, pereinantis į klinikinę plotmę

UŽDAVINIAI• 1. Nustatyti mikroorganizmų rūšinę įvairovę dirvožemyje ir

vandenyje intensyvaus ir neintensyvaus ūkininkavimo zonose.• 2. Nustatyti dirvožemio ir vandenų taršą antibiotikams ir biocidams

atspariomis, tame tarpe ir patogeninėmis, bakterijomis.• 3. Nustatyti genus, koduojančius mikrobiotos, persistuojančios

intensyvaus ūkininkavimo aplinkoje atsparumą biocidams(ketvirtiniams amonio junginiams), ir įvairių klasių antibiotikams, nustatyti genų raiškos lygį.

• 4. Ištirti galimus atsparių bakterijų platinimo aplinkoje vektorius (žuvis, paukščius).

• 5. Nustatyti, ar intensyvus ūkininkavimas kelia potencialią riziką plisti atsparioms antibiotikams ir biocidams bakterijoms aplinkoje ir patekti į visuomenę (per maistą, vandenį).

Darbo metu

• Išskirtos bakterijos ir bakterijų DNR iš intensyvaus ir ekologinio ūkininkavimo dirvožemių, laukinių gyvūnų (žuvų, paukščių);

• Atlikti metagenominiai tyrimai nustatant mikrobiotos įvairovę;

• Įvertinti mikrobiotos įvairovės skirtumai tos pačios kultūros ekologinio ir intensyvaus ūkininkavimo dirvožemiuose;

• Nustatytas fenotipinis ir genotipinis bakterijų atsparumas

• Įvertina situacija, potenciali rizika

ŽUVŲ TYRIMAI

DIRVOŽEMIO TYRIMAI

PAUKŠČIŲ TYRIMAI

Metodai

DNA Clean & Concentrator

Quick-DNA Fecal/Soil Microbe Kits

Extract high quality, inhibitor-free

metagenomic DNA from feces, soil,

water, etc.

Naujos kartos sekoskaita

Illumina MiSeq platform

> 2x daugiau nei klinikiniai lūžio taškai

QUICK SHOT

Mega 6

Naudoti pradmenys skirti klinikoje paplitusius atsparumą antibiotikams suteikiančius genus ir integronų sekas (tem, ctx-M, oxa1, oxa2, oxa23, shv, blaIND-1, blaL1, blaL2catI, tetA, tetB, tetC, tetD, tetM, aac(6’)-Ib, qnrA, qnrB, qnrS, qnrD, qepA1, ant(3”)-Ia, aph(3”)-I, aph(6)-I, aac(3)IIa, ermA, ermB, ermC, mefAB, vanA, vanB, vanC1, vanC2/3, vanD, vanE, vanG, intI1);

2. Tarp dirvos mikrorganizmų paplitusiusius atsparumą antibiotikams suteikiančius genus (blaLRA-10, blaLRA-13, bla , aac3, arr1, arr2, bla2, tetW, folA, bcr/cflA (pradmenys sukurti projekto metu).

Atsparumą koduojančių genų nustatymas

REZULTATAI

Bakterijų genčių įvairovė

0

200

400

600

800

1000

1200

Intensyvus ūkis Ekologinis ūkis

609 taksonominiai vienetai genčių lygmenyje išskirti iš ekologinio ir 1103 iš intensyvaus

Vyraujančios bakterijų gentys intensyvaus ir ekologinio ūkininkavimo dirvožemiuose

3,63,3

1,9 1,8 1,7 1,7 1,71,4

1,2 1,20,9

1,1 1,1 1

4

2,6

1,51,7

1,9

1,5 1,6 1,7

0,91,2

1,6 1,5 1,5 1,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

Labiausiai paplitusios bakterijų gentys intensyvaus ir ekologinio ūkininkavimo dirvožemyje

Intense Ecological

Antibiotikams atsparių bakterijų kiekis dirvožemiuose 1 g >x106

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensyvus ūkis Ekologinis ūkis

Atsparių antibiotikams bakterijų dažniausiai aptinkamų dirvožemiuose, rūšinė sudėtis

85

100

73,1

81,8

94,1

95,2

80

96,1

73,1

77,3

94,1

95,2

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Ž. kv. ekolog.

Ž. kv. intens.

Rapsai ekolog.

Rapsai intens.

Kukurūz. ekolog.

Kukurūz. intens.

FUR FAZ

FUR – cefuroksimas, FAZ – cefazolinas

Iš ekologinių ir intensyvaus ūkininkavimo dirvožemių išskirtų bakterijų atsparumas I-II kartos

cefalosporinams, proc. (n=132)

5

15,4 13,6 11,8

4,8

80

100

86,9

94,1100

3,8

15,4 13,6 11,814,3

0

20

40

60

80

100

120

Ž. kv. ekolog. Ž. kv. intens. Rapsai ekolog. Rapsai intens. Kukurūz. ekolog. Kukurūz. intens.

TAZ AXO FEP

TAZ – ceftazidimas, AXO – ceftriaksonas, FEP – cefepimas

pav. Iš ekologinių ir intensyvaus ūkininkavimo dirvožemių išskirtų bakterijų atsparumas III–IV kartos

cefalosporinams, proc. (n=132)

5

15,4

4,5

11,8

4,8

19,2

4,5

17,7

9,510

30,8

3,84,5

23,5

9,5

0

5

10

15

20

25

30

35

Ž. kv. ekolog. Ž. kv. intens. Rapsai ekolog. Rapsai intens. Kukurūz. ekolog. Kukurūz. intens.

AMI GEN TOB

AMI – amikacinas, GEN – gentamicinas, TOB – tobramicinas

pav. Iš ekologinių ir intensyvaus ūkininkavimo dirvožemių išskirtų bakterijų atsparumas

aminoglikozidams, proc. (n=132)

10

3,8

94,8

9,5

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Ž. kv. ekolog. Ž. kv. intens. Rapsai ekolog. Rapsai intens. Kukurūz. ekolog. Kukurūz. intens.

CIP GAT

GAT – gatifloksacinas, CIP – ciprofloksacinas

pav. Iš ekologinių ir intensyvaus ūkininkavimo dirvožemių išskirtų bakterijų

atsparumas chinolonams, proc. (n=132)

Genų, būdingų klinikiniams izoliatams paplitimas dirvožemio mikrobiotoje

Unikalių, tik dirvožemiams būdingų atsparumą koduojančių genų paplitimas dirvožemiuose

Judriųjų genomo elementų paieška

Išvada

Tiek ekologinio, tiek ir intensyvaus ūkininkavimo dirvožemiuose gausiai paplitusiosantibiotikams atsparios bakterijos (>106/g), tačiau šios bakterijos didžiąja dalimineturi atsparumą koduojančių genų, kurie paplitę klinikinėse padermėse,žmonėse bei gyvūnuose, sukeliančiuose bakterijų atsparumo antibiotikamsproblemą gydant žmones ir gyvūnus.

Todėl dirbamos žemės dirvožemis šiuo metu nekelia padidintos rizikos žmonėms užsikrėsti, o aplinkai būti kontaminuotai atspariomis antibiotikams bakterijomis, galinčiomis sukelti problemas susijusias su atsparioms antibiotikams bakterijomis klinikinėje plotmėje t.y. patekti į žmones, vėliau gydymo įstaigas, sukelti visuomenėje įgytas infekcijas, sukeltas antibiotikais neišgydomų bakterijų.

Tuo pačiu pažymėtina, kad dirvožemio bakterijose yra unikalių šiomsbakterijoms būdingų atsparumą antibiotikams koduojančių genų, galinčių turėtiklinikinės reikšmės. Tokios bakterijos esant dirvožemyje antibiotikų ar panašioscheminės struktūros medžiagų “spaudimui" galėtų išgyventi ir daugintis,mažėjant jautrių mikroorganizmų skaičiui. Tai sukeltų mikrobiotos disbalansą irrūšinius pokyčius, o tuo pačiu padidintų ir riziką tokių bakterijų patekimui įmaisto žaliavas su augaliniais produktais.

ŽUVYS

PROBLEMA

Išskirti identifikuoti ir apibūdinti daugiaatspariasgramneigiamas bakterijas aptinkamaspramoninio auginimo ir laukinėse žuvyse

Tikslas:

METODAI

Mėginių skaičius = 240

Photo: Grant Bobo

gentamicin (8 mg/L), ciprofloxacin (1 mg/L), chloramphenicol(16 mg/L), and colistin (4 mg/L); Colorex mSuperCarba, ColorexESBL and Colorex C3GR

1-3 atskiros kolonijos

Biocheminis tyrimasMSK

DNA

Koduojančių atsparumą genų nustatymas

REZULTATAI 155 izoliatai išskirti atsparūs bent vienam antibiotikui

Biocheminiais testais pavyko identifikuoti tik 15 izoliatų, likusieji nustatyti pagal DNR sekoskaitosbūdu.

Akvakultūros žuvys

Dominavo Pseudomonas genties bakterijos. Dažniausios rūšys – P. putida, P. syringae, P. fragi, P. azotoformans, P. migulae. Daugiaatspariųizoliatų buvo 44,4%.

Tarp Enterobacteriaceae dominavo Citrobacter, Hafnia, Kluyvera, ir Proteus, bet išskirta ir Rahnella, Moellerella bei Escherichia.Daugiaatsparių izoliatų kiekis 16%.

Aeromonas labai retais atvejais buvo atsparios antibiotikams. Tik 2 izoliatai buvo atsparūs aztreonamui, cefoksitinui, o vienas – ko-trimoksazoliui ir karbepenemams.

REZULTATAIAkvakultūros žuvys

Iš laukinių žuvų išskirtų izoliatų atsparumas

REZULTATAILAUKINĖS ŽUVYS

1. Retas atsparumas fluorochinolonams ir taksonominė atsparių bakterijų sudėtis leidžia manyti, kad didžioji dalis atsparių bakterijų paplitusių žuvininkystės tvenkinių žuvyse yra autochtoninė t.y. natūrali vandens telkinių mikrobiota. Tvenkiniai/žuvys neužteršti fermų mikroorganizmais, kurie paprastai kur kas dažniau yra atsparūs fluorochinolonams.

2. Pseudomonas ir Chryseobacterium genčių atsparumo mechanizmai susiję su išmetimo siurbliais, kitų genų, svarbių klinikinėje plotmėje aptikta mažai.

3. Daugiaatsparūs bakterijų izoliatai aptikti tik upėse gyvenančiose žuvyse. Jose pasitaiko izoliatų greičiausiai patekusių iš nutekamųjų vandenų ar kitų objektų, kur yra paplitę atsparios kliniškai svarbios padermės.

Rekomendacija: laukinių žuvų jautrumo antibiotikams tyrimai galėtų būti atliekami monitoringo pagrindais.

IŠVADOS

LAUKINIAI PAUKŠČIAI

UŽDAVINIAI

1. Išskirti laukiniuose paukščiuose paplitusias indikatorines-zoonotines bakterijas (Escherichia coli ir Staphylococcus spp.)ir nustatyti šių bakterijų jautrumą antibiotikams.

2. Nustatyti genus koduojančius atsparumą ir jas palyginti juossu bakterijų, paplitusių žmonėse ir naminiuose gyvūnuose,žinomais genais.

3. Įvertinti paukščių, kaip galimo atsparių antibiotikams bakterijųplatintojų vaidmenį.

Stafilokokų genties bakterijų paplitimas laukiniuose paukščiuose

415

237

196

57

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

Laukinių paukščių mėginių

skaičius

Išskirtų stafilokokų iš

laukinių paukščių padermių

skaičius

Stafilokokų padermių

skaičius, kurios buvo

atsparios bent vienam ar

daugiau tirtų antibiotikų

Daugiaatsparios stafilokokų

padermės

vn

t.

Stafilokokų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms laukiniuose paukščiuose

39,3

37,8

27,6

31,1

36,7

33,2

53,1

3

1,5

60,7

59,2

72,4

68,9

63,3

65,3

46,9

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

C (30)

E (15)

CIP (5)

FOX (30)

CN (10)

TET (30)

P (10)

An

tim

ikro

bin

ė m

edži

ag

a

Atsparios Vidutiniškai jautrios Jautrios

(n=196)

P – penicilinas, TET – tetraciklinas, CN – gentamicinas, FOX –cefoksitinas, CIP – ciprofloksacinas, E – eritromicinas, C – chloramfenikolis

42,3

28,6

3,1

14,8

8,7

02,6

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

1 2 3 4 5 6 7

%

Atsparumas antibiotikų skaičiui (vnt.)

Iš laukinių paukščių išskirtų Staphylococcus spp. atsparumas skirtingam antibiotikų skaičiui (%), (n=196)

1,85,2

3,68,7

8,7

1,8

5,2

10,5

3,6

5,2

7,7

5,2

5,2 1,8 1,8

1,8

3,6

1,8

1,8

1,8

1,8

5,2

3,6

1,8 Pilkoji varna

(Corvus cornix)

Kovas (Corvus

frugilegs)

Didžoji antis

(Anas

platyrhynchos)

Gulbė nebylė

(Cygnus olor)

Rudagalvis kiras

(Larus

ridibundus)

Sidabrinis kiras

(Larus

argentatus)

Iš laukinių paukščių išskirtų daugiaatsparių Staphylococcus spp. rūšinis

pasiskirstymas skirtingose paukščių rūšyse, proc.

Atsparumą lemiančių genetinių determinančių paplitimas tarp Staphylococcus spp. laukiniuose paukščiuose

Antibiotikų klasė Baltymų grupės Genai Pradmuo

Genetinės determinantės

daugiaatspariose padermėse

Tirta Rasta Proc.

β laktamai β -laktamazės blaZblaZ-F

47 18 38,3blaZ-R

Penicilinazėms atsparūs β-

laktamai

Penicilinus surišantys

baltymai

mecAmecA-1

47 10 21,3mecA-2

mecLGA251

(mecC)

mecLGA251

F47 0 0

mecLGA251

R

AminoglikozidaiAminoglikozidų

fosfotransferazės

aph(3’)-IIIa

aph(3’)-IIIa -

F54a 16b 29,6

aph(3’)-IIIa -

R

aac(6’)-Ie-aac6-F

54a 21b 38,9aac6-R

Makrolidai

Makrolidų

metiltransferazės

ermAermA-F

18 5 27,8ermA-R

ermCermC-F

18 0 0ermC-R

Makrolidų nešikliai msrABmsrAB-F

18 0 0msrAB-R

Tetraciklinai

Tetraciklinų nešikliai tetKtetK-F

21 13 61,9tetK-R

Apsauginis ribosomų

baltymastetM

tetM-F21a 5b 23,8

tetM-R

E. coli bakterijų paplitimas laukiniuose paukščiuose

415

188 179

60

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

Laukinių paukščių mėginių

skaičius

Iš laukinių paukščių mėginių

išskirtų ešerichijų skaičius

Ešerichijų padermių skaičius,

kurios buvo atsparios bent

vienam ar daugiau tirtų

antibiotikų

Daugiaatsparių ešerichijų

padermių skaičius

vnt.

E. coli bakterijų paplitimas laukiniuose paukščiuose (vnt.)

E.coli izoliatų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms laukiniuose paukščiuose

77,7

21,8

30,7

21,8

32,9

38,5

7,8

1,7

2,8

1,1

22,3

76,5

66,5

78,2

67,1

61,5

91,1

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

AMP (10)

CN (10)

CIP (5)

FOX (30)

TE (30)

C (30)

IMP (10)

An

tim

ikro

bin

ė m

edži

aga

Atsaparios Vidutiniškai jautrios Jautrios

. (n=179) ;

AMP-ampicilinas, CN-gentamicinas, CIP-ciprofloksacinas, FOX- cefoksitinas, TET-

tetraciklinas, C-chloramfenikolis, IMI-imipenemas

35,75

30,72

17,31

11,17

3,3

0,5 1,1

0

5

10

15

20

25

30

35

40

1 2 3 4 5 6 7

%

Atsparumas antibiotikų skaičiui (vnt.)

Iš laukinių paukščių išskirtų Esherichia coli atsparumas tam tikram antibiotikų

skaičiui (proc.), (n=179).

Atsparumą lemiančių genetinių determinančių paplitimas tarp E. coli laukiniuose paukščiuose

Antibiotikų klasė Baltymų grupės Genai Pradmuo Genetinės determinantės

Tirta Rasta Proc.

β-laktamai β-laktamazės

tem blaTEM-F

57a 38b 67blaTEM-R

shv blaSHV-F

59 29 49,1blaSHV-R

oxa 1 grupė oxa1-F 56a 6b 10,7

oxa1-R

oxa 3 grupė oxa3-F 56a 10b 17,8

oxa3-R

oxa 5 grupė oxa5-F 56 0 0

oxa5-R

ctx M ctxM-F 49 31 63,2

ctxM-R

cmy cmy2-F 49a 1b 2

cmy2-R

per per1-F 49 0 0

per1-R

per2-F 49 0 0

per2-R

Tetraciklinai Tetraciklinų nešikliai

tetA tetA-F 33 28 85

tetA-R

tetB tetB-F 33a 6b 18

Aminoglikozidai

Aminoglikozidų

adenilyltransferazės

aadB aadB-F 10 0 0

aadB-R

aadA aadA-F 10a 1b 10

aadA-R

Aminoglikozidų

metiltransferazės

rmtB rmtB-F 10 0 0

rmtB-R

armA armA-F 10 0 0

armA-R

Aminoglikozidų

fosfotransferazės

aphA1 aphA1-F 10 10 100

aphA1-R

Aminoglikozidų

acetiltransferazės

aacA4 aacA4-F 10a 1b 10

aacA4-R

aac(3)II aac(3)II-F 10 5 50

aac(3)II-R

Streptomicinas

Streptomicino

fosfotransferazės

strA strA-F 55 20 36,3

strA-R

strB strB-F 55 21 38,1

Sulfonamidai Dihidropteorato

sinatazės

sul1-F sul1-F 49a 11b 22,4

sul1-R

sul2-F sul2-F 49 25 51

sul2-R

sul3-F sul3-F 49 23 46,9

sul3-R

Trimetoprimas Dihidrofoliato reduktazės

dfr1 dfr1-F 13a 2b 15,3

dfr1-R

dfr5 dfr5-F 13a 11b 84,6

dfr5-R

dfr7 dfr7-F 13a 2b 15,3

dfr7-R

Tiriamose ešerichijų padermėse nustatyta dvidešimt vienas skirtingas genas,

koduojantis atsparumą skirtingų klasių antibiotikams.

E. coli atsparumas kolistinui ir mcr-1 geno nustatymas, laukiniuose paukščiuose

• Nustatytos 8 E. coli (6,8 proc.) atsparios kolistinui

• Vienoje padermėje nustatytas mcr-1 genas.

IŠVADOS

1. Tiriant 29 laukinių paukščių rūšis, atsparūs stafilokokaibuvo išskirti iš 6 rūšių: sidabrinių kirų (Larus argentatus),rudagalvių kirų (Larus ridibundus), gulbių nebylių (Cygnusolar), didžiųjų ančių (Anas platyrhynchos), kovų (Corgusfrugilegus) ir pilkųjų varnų (Corvux cornix).

2. Visi iš laukinių paukščių išskirti stafilokokai buvo jautrūssulfametoksazolio/trimetoprimo kombinacijai,vankomicinui, daptomicinui bei linezolidui.

IŠVADOS

Įvertinus paukščių, kaip galimo atsparių antibiotikams bakterijų vektoriaus vaidmenį nustatyta, kad laukiniuose paukščiuose cirkuliuoja meticilinui atsparios Staphylococcus aureus (MRSA), praplėsto veikimo spektro betalaktamazes (ESBL) gaminančios E. coli, atsparios kolistinui enterobakterijos, bei fluorochinolonams ir aminoglikozidams atspari mikrobiota. Todėl galima teigti, kad laukiniai paukščiai platina bakterijas, atsparias antimibiotikams, kurie pagal PSO ir OIE yra priskirti kritiškai svarbioms antimikrobinių medžiagų klasėms, naudojamoms žmonių ir gyvūnų gydymui.

PASKELBTOS PUBLIKACIJOS

• Ružauskas, Modestas; Klimienė, Irena; Armalytė, Julija; Bartkienė, Elena; Šiugždinienė, Rita; Skerniškytė, Jūratė; Krasauskas, Renatas; Sužiedėlienė, Edita. Composition and antimicrobial resistance profile of Gram- negative microbiota prevalent in aquacultured fish. Journalof food safety. Malden, MA: Wiley. (Original article). ISSN 0149-6085. 2018, vol. 38, no. 3, p. 1-10. https://doi.org/10.1111/jfs.12447. [Science Citation Index Expanded (Web of Science); MEDLINE]. [Citav. rod.: 1.275 (2017).

• Merkevičienė, Lina; Klimienė, Irena; Šiugždinienė, Rita; Virgailis, Marius; Mockeliūnas, Raimundas; Ružauskas, Modestas. Prevalence andmolecular characteristics of multi-resistant Escherichia coli in wild birds. Acta veterinaria Brno. Brno: University School Of VeterinaryMedicine. ISSN 0001-7213. 2018, vol. 87, no. 1, p. 9-17. Prieiga per internetą: https://actavet.vfu.cz/media/pdf/actavet_2018087010009.pdf. [Science Citation Index Expanded (Web of Science); DOAJ]. [Citav. rod.: 0.422 (2017)].

• Merkevičienė, Lina; Ružauskaitė, Neda; Klimienė, Irena; Šiugždinienė, Rita; Dailidavičienė, Jurgita; Virgailis, Marius; Mockeliūnas, Raimundas; Ružauskas, Modestas. Microbiome and antimicrobial resistance genes in microbiota of cloacal samples from European herringgulls (Larus argentatus). Journal of Veterinary Research. Puławy: National Veterinary Research Institute. ISSN 2450-7393. 2017, vol. 61, no. 1, p. 27-35. Prieiga per internetą: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5894407/ [Science Citation Index Expanded (Web ofScience); MEDLINE; AGRICOLA; CABI - Index Veterinarius; DOAJ]. [Citav. rod.: 0.811]

• Ružauskas, Modestas; Misytė, Skaistė; Merkevičienė, Lina; Miknienė, Zoja; Šiugždinienė, Rita; Klimienė, Irena; Pikūnienė, Alma; Kučinskienė, Jūratė. Gut microbiota isolated from the European pond turtle (Emys orbicularis) and its antimicrobial resistance. Polishjournal of veterinary sciences. Warsaw: De Gruyter Open. (Original article). ISSN 1505-1773. 2016, vol. 19, no. 4, p. 723-730. Prieiga per internetą: https://content.sciendo.com/view/journals/pjvs/19/4/article-p723.xml [Science Citation Index Expanded (Web of Science); MEDLINE]. [Citav. rod.: 0.697]

• Ružauskas, Modestas; Vaškevičiūtė, Lina. Detection of the mcr-1 gene in Escherichia coli prevalent in the migratory bird species Larusargentatus. Journal of antimicrobial chemotherapy. London: Oxford University Press. ISSN 0305-7453. 2016, vol. 71, no. 8, p. 2333-2334. Prieiga per internetą: http://jac.oxfordjournals.org/content/early/2016/06/20/jac.dkw245.full.pdf+html. [Science Citation Index Expanded( Web of Science); MEDLINE]. [Citav. rod.: 5.071] 58

Rėmėjas Partneris kartu vykdantis projektą

SIT-6/2015Vykdytojai:M. VirgailisL. MerkevičienėJ. ArmalytėJ. SkerniškytėI. Klimienė

R. KrasauskasR. ŠiugždinienėM. RužauskasKonsultantė: E. Sužiedėlienė