Interpretace hmotnostních spekter měkkých ionizačních

technik

• vliv funkčních skupin na fragmentaci lze orientačně seřadit:nitrát > fosfát ~ sulfát >> sulfonová kyselina > karboxylová kyselina > hydroxy skupina > nitro skupina > halogeny > ostatní funkční skupiny• ve velké většině ionty se sudým počtem e-

• štěpení menšího počtu labilních vazeb ve srovnání s EI• minimum nebo absence fragmentových iontů v MS1

• fragmentace pomocí CID (MS/MS, MSn)• knihovny ESI/APCI spekter neexistují s výjimkou biomolekul a individuálních knihoven pro omezený rozsah látek

Poznámky k interpretaci API spekter

Pravidlo sudého počtu e- (Even-Electron Rule)

1/ Fragmentace iontů s lichým počtem e- (OE+•) – mohou vznikat opět ionty s lichým počtem e- anebo se sudým počtem e-

2/ Fragmentace iontů se sudým počtem elektronů (EE+) -přednostně vznikají opět ionty se sudým počtem elektronů

- vznik kation-radikálů při fragmentaci iontů se sudým počtem elektronů vyžaduje energeticky nevýhodné rozdělení elektronového páru (popsané výjimky)

1/ OE+• EE+ + R•

OE+• + N

2/ EE+ EE+ + N

OE+• + R•EI EI

měkké ion.tech.

Dusíkové pravidloZákladní formulace (platí pro MR a OE+.):

$ lichá MR = lichý počet dusíků v molekule

$ sudá MR = sudý počet dusíků v molekule nebo bez dusíkuPro ionty EE+ přesně naopak:

lichá hodnota m/z znamená sudý počet dusíků nebo bez dusíku, sudá hodnota m/z lichý počet dusíků

O platí pro běžné organické prvky (C, H, N, O, F, Si, P, S, Cl, Br, I)

Počet dusíků m/z lichá m/z sudá

0, 2, 4, ... (sudý) EE+ OE+.

1, 3, 5, ... (lichý) OE+. EE+

Dusíkové pravidloZákladní formulace (platí pro MR a OE+.):

$ lichá MR = lichý počet dusíků v molekule

$ sudá MR = sudý počet dusíků v molekule nebo bez dusíkuPro ionty EE+ přesně naopak:

lichá hodnota m/z znamená sudý počet dusíků nebo bez dusíku, sudá hodnota m/z lichý počet dusíků

O platí pro běžné organické prvky (C, H, N, O, F, Si, P, S, Cl, Br, I)

Počet dusíků m/z lichá m/z sudá

0, 2, 4, ... (sudý) EE+ OE+.

1, 3, 5, ... (lichý) OE+. EE+

m/z = 22

Určení molekulové hmotnosti (API-MS)Positive-ion

APCINegative-ion

APCI

0

100

100 200 300 400 m/z

399

%

[M+K]+

4390

100

100 200 300 400 m/z

401 [M+H]+

[M+Na]+

423%

[M-H]-

[M+H]+ [M+Na]+ [M+K]+

[M+NH4]+

m/z = 2MW = 400

m/z = 16

m/z = 38

m/z = 17

Nejběžnější typy molekulárních aduktů

+

-

• Určení MR, ověření správnosti podle charakteristických aduktů [M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+; méně často adukty s mobilní fází typu [M+H+methanol]+nebo [M+H+acetonitril]+, výjimečně dimerní ionty typu [2M+H]+, [2M+Na]+

- většina aduktů má malou intenzitu (obvykle nejintenzivnější [M+Na]+), ale jejich význam pro potvrzení správnosti určení MR je velký, protože aduktové ionty se obvykle nevyskytují u fragmentů (jsou výjimky)- u záporných iontů kromě [M-H]- lze v závislosti na složení mobilní fáze a matrici vzorku očekávat např. [M+Cl]-, [M+CH3COO]-, [M+HCOO]-, apod.- typ a relativní intenzita aduktových iontů velmi výrazně závisí na složení mobilní fáze a obsahu solí v eluentu či vzorku

• Dusíkové pravidlo• M+2 prvky: určení počtu Cl+Br, event. odhad přítomnosti S+Si• MS/MS (MSn) spektra, měření přesných hmot • Sumarizace všech získaných informací a návrh struktury• Retenční chování – ověřit soulad s návrhem struktury• Potvrzení s komerčním nebo syntetizovaným standardem

Obvyklé kroky při interpretace API spekter

Uhlovodíky (CxHy), alkyl/aryl substituce• alkany, alkeny, alkiny, aromáty• pro alkyl substituci na aromatickém nebo obecně cyklickém systému očekávány ztráty alkenu (nebo alkanu, zejména u druhé a další ztráty pro více přítomnost více alkylů)• podobně pro aryl substituci jsou obvyklé neutrální ztráty C6H4 (m/z 76) nebo C6H6 (m/z 78)• ztráty alkyl/aryl radikálů jsou méně obvyklé, někdy se vyskytují v záporném módu (zejména pro APCI / APPI)• pro uhlovodíky bez funkčních skupin nejvhodnější APCI / APPI v kladném módu, v ESI jen pomocí tvorby aduktů (Li, Ag, Na, apod.)

Iontové funkční skupiny• orientační pravidlo - čím polárnější je funkční skupina, tím větší vliv na ionizační a fragmentační chování lze očekávat• anionické funkční skupiny (sulfát, sulfo, karboxy) - výborná ionizační účinnost a tím i citlivost v záporném módu (obecně vhodnější ESI než APCI), signál v kladném módu horší nebo žádný, částečně může vylepšit jiná protonovatelná skupina (např. NH2)• intenzivní adukty se sodným iontem (popř. K+, NH4

+), typicky zasolené vzorky• kationické funkční skupiny (např. kvartérní aminy) – vynikající signál v kladném ESI módu, pozor na silné paměťové efekty (lépe se těmto látkám zcela vyhnout), signál v záporném módu obvykle neposkytuje

Více anionických funkčních skupin• často rozsáhlá fragmentace, nízká intenzita [M-H]- iontu• vznik série násobně nabitých iontů typu [M-xH]x- a jejich kombinace se sodnými adukty typu [M-(x+y)H+yNa]x-

• využití sérií vícenásobně nabitých iontů pro určení MW a počtu iontových skupin

Určení MW a počtu iontových skupin• série iontů [M-xH]x- a [M-(x+y)H+yNa]x-

• maximální pozorovaný náboj x a/nebo maximální počet vyměnitelných protonů y = počet iontových skupin

243.24

243.43

243.63

243.84244.05

243.0 243.5 244.0 244.5 m/z0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

5x10Intens.

m/z 0.20

309.85

310.06

310.31

310.56310.81

311.07309.5 310.0 310.5 311.0 m/z

0

1

2

3

5x10Intens.

m/z 0.25

M. Holčapek, P. Jandera, J. Přikryl, Dyes Pigm., 43 (1999) 127

C.I. Direct Green 26MW = 12225 iontových skupin

P

O

O

OH

+

[M-H-HPO3]-

O P

O

O

OH

R OR +

[H2PO4]-

O P

OH

R

O

O (R-H) P

OH

OH

OO

H

Funkční skupiny obsahující fosfor (31P)

Fosfor je monoizotopický

Fosfátová skupina (ROPO3H2)• časté u biomolekul (peptidů, lipidů, cukrů)• lze měřit nejlépe v ESI-, někdy i ESI+ (fosfolipidy), labilní iontová skupina• adukty se sodným iontem a dalšími kationty• diagnostické fragmenty m/z 79 [PO3]-, 97 [H2PO4]-

C. Antonio et al, J. Chromatogr. A 1172 (2007) 170

[PO3]-

[H2PO4]-

[M-H]-

[M-H-H2O]-

+ S

O

O

O

[M-H-SO3]-

ORO S

O

O

O

R + S

O

OH

OO

[HSO4]-

O S

O

O

O

R

H

(R-H)

Funkční skupiny obsahující síru (32S)

M (32S) = 100%M+1 (33S) = 0.79%M+2 (34S) = 4.4%

Sulfátová skupina (ROSO3H)

O S

O

O

O-

H

- SO3(- 80)

O S

O

O

OH

H

[HSO4]-

m/z 97

- H2SO4 (- 98)

• intenzivní adukty se sodným iontem• pro polysulfatované látky rozsáhlá fragmentace, nízká intenzita nebo absence [M-H]- iontu (opakované ztráty H2SO4 a/nebo SO3), násobně nabité ionty• ideální pro ESI-, popř. MALDI- (APCI nelze)

100 150 300 3500.0

[M+H]+

382

364250200

150 200 350 4000.0

300250

400

100

265201

324

280

[M+H-H O]2+

[M+H-NH (CH ) OH-SO ]2 2 6 2+ [M+H-NH (CH ) OH]2 2 6

+

[M-H-SO ]3-

APCI+

MS of m/z 4042

[M-H-SO -CH CHO]3 3-

217

217 404[M-H]-

SO2NH(CH2)6OH

SO2NH(CH2)2OSO3H

Vliv zavedení iontové funkční skupiny (sulfát)

APCI+(alkohol)

ESI-(sulfát)

MS1

MS/MS

Sulfonové kyseliny (RSO3H)

S

O

O

O+[M-H-SO3]-

S

O

O

OR R

[SO3]-.+ S O

O

O

. .S

O

OR

OR

S

O

O

OH

ESI-(APCI-)

S

O

O

O-

- SO3(- 80)

[SO3]-.

m/z 80

- SO2(- 64)

Sulfonové kyseliny (RSO3H)

• vynikající citlivost v ESI-, lze i MALDI-, pro mono- a disulfonané sloučeniny lze s horší citlivostí i APCI- a APPI-• intenzivní adukty se sodným iontem • pro polysulfonované látky série násobně nabitých iontů a jejich aduktů s Na+, ale nikoliv fragmentace v MS1, proto snadné určení MW a počtu sulfo skupin• typické ztráty v MS/MS jsou m/z 80 = SO3 (někdy může poskytnout i sulfát) a m/z 64 = SO2 (naprosto charakteristické) a radikál anion m/z 80 = [SO3]-.

HO3SOCH2CH2O2S N N N N SO2CH2CH2OSO3H

OH NH2

SO3HHO3S

• 2 sulfát

• 2 sulfo

• 2 azo

• 1 hydroxyl

• 1 amino

ESI-MS – barvivo Reactive Black 5

MW=901[M-2H]2- = 449.5

+[M+H-NH3]+

NH3R R NH3 NH3+[M+H-NH3]+

C

O

NH3R C

O

R

M (14N) = 100%M+1 (15N) = 0.37%

Funkční skupiny obsahující dusík (14N)

Funkční skupiny obsahující dusík (14N)

• bez aditiv úplná absence [M+H]+ / [M-H]- iontů, intenzivní fragmenty m/z 62 = [NO3]-, m/z 46 = [NO2]-, obtížně intepretovatelné adukty a fragmenty

• přídavek CCl4 (nebo halogenidu,octanu, mravenčanu) – velmi charakteristická tvorba aduktů [M+Cl]-, [M+CH3COO]-, atd. u APCI

Alifatické nitráty - výbušniny (RONO2)

X.M. Zhao, J. Yinon, J. Chromatogr. A, 977 (2002) 59

Nitro sloučeniny (RNO2)

NO-

O

- NO2(- 46)

- O(- 16)

O

- NO(- 30)

NO-

O

Nitroso sloučeniny (RNO)

Nitro sloučeniny (RNO2)• známá výjimka tvorby molekulárního radikál aniontu M-. v APCI-• obecně hodně radikálových ztrát pro nitro látky: m/z 46 = NO2

., m/z 30 = NO., někdy i ztráta m/z 17 = OH.

• méně obvyklé ztráty m/z 31 = HNO, m/z 47 = HNO2

• ztráta m/z 30 = NO.

• dusíkové pravidlo; dusík je obvykle místem protonace

Primární aminy RNH2• ztráta amoniaku [M+H-NH3]+

je spíše výjimečná

Sekundární a terciární aminy R1NHR2 nebo R1NR2R3• ionty typu [R1NH3]+ a [R2NH3]+ (na aminoskupině dochází obvykle k protonacia přenosu vodíku při fragmentaci), analogicky [R1NH2R2]+ či [R1NHR2R3]+ ionty• vedle toho mohou být přítomny též ionty [R1NH]+ a [R2NH]+, méně časté• neutrální ztráty R1NHR2 vedou ke vzniku iontů např. [M+H-R1NHR2]+, typický příklad ztráta dimethylaminu či podobného dialkylaminu• ztráty radikálů R. méně obvyklé, nicméně v APCI- existují, např. [M-H-butyl]-.

Kvartérní aminy (R)4N+X-

• velice stabilní ionty [(R)4N]+ s vysokou ionizační účinností (např. tetrabutylamoniová ion-párová činidla), POZOR: velmi silné paměťové efekty!!!• záporný mód není vhodný

Dusíkaté sloučeniny

Azo sloučeniny – organická barviva (N2)

N N

Y + 14

X - 14X

YY - 14

X + 14

- N2(- 28)

N N

Azo sloučeniny – organická barviva (N2)

• azo skupina je typicky doprovázené řadou dalších polárních funkčních skupin (sulfo, sulfát, karboxy, amino, atd.) v molekule barviva, které podléhají fragmentaci přednostně

• zajímavá a typická je přesmyková ztráta m/z 28 = N2 (analogie EI)

MW = 389

• 1 sulfo

• 1 nitro

• 1 azo

• 2 hydroxyl

ESI-MS/MS – barvivo Mordant Black 15

N-oxidy• labilní vazba s iontovým charakterem, tato část molekuly bývá často primárním místem štěpení

• příklad: skupina N,N-dimethylaminooxid vznikající metabolizmem dimefluronu se primárně štěpí, čímž lze identifikovat místo oxidace v metabolitu

• pozorovaná preference tvorby aduktů s chloridem [M+Cl]- v záporném ESI módu (pro malé množství dat není jasné, zda lze zobecnit)

Nitrily (RCN)• neutrální ztráta m/z 27 = HCN, tato ztráta může být běžně pozorována i u dusíkatých heterocyklických sloučenin (nebo ztráta m/z 41 = acetonitril či obecně alkylnitril) a aromatických aminů, málo specifické

• nepatří mezi příliš preferované fragmentační cesty, pokud je přítomna jiná polárnější funkční skupina, pak ztráta nitrilu obvykle málo významná

Halogeny (19F, 35Cl, 79Br, 127I)

RX HR X H+[M+H-HX]+

Halogeny – monoizotopické 19F a 127I• monoizotopické prvky jsou oblíbené pro kalibrační směsi

• obecně ve spektrech ztráty HF (20) nebo HI (128), ale ztráta HF vůbec nemusí být pozorována (zejména v případě substituce F na aromátu) a přítomnost F se pozná pouze podle zvýšení MW o 18 (MW = F – H = 18)

• ionty m/z 19 [F]- nebo m/z 127 [I]- mohou být důležité diagnostické ionty při záznamu záporných iontů (MS nebo lépe MS/MS), pozor na nastavení m/z rozsahu (m/z 19 lze spolehlivě diagnostikovat na kvadrupólu, IT nelze)

• pro polyfluorované nebo perfluorované sloučeniny opakované ztráty HF, F2nebo F., což může vést k poklesu intenzity [M+H]+ / [M-H]- iontů, tento typ látek se měří spíše na GC/MS; typické ionty m/z 69 [CF3]+ pro perfluorované látky, m/z 113 [CF3COO]- pro kyselinu trifluoroctovou a její deriváty

• přítomnost jódu v molekule je natolik neobvyklá, že je většinou očekávána předem na základě předběžných informací

Halogeny – Cl, Br

373635

100%

32%

m/z

818079 m/z

Cl

H

- HCl(- 36)

Br

H

- HBr(- 80)

Poměr izotopů35Cl : 37Cl = 3 : 1

n * Cl = (3a + b)n

Poměr izotopů79Br : 81Br = 1 : 1

n * Br = (a + b)n

• pro poly- a perhalogenované sloučeniny opakované ztráty HX nebo X.

(zejména Br.), což vede k výraznému poklesu [M+H]+ či [M-H]- iontů

+ O H

H

[M+H-H2O]+

O O H

H

R OR RO O H

H

R + O O H

H

[M+H-H2O2]+

RO H

H

R O H

H

+[M+H-H2O]+

Funkční skupiny obsahující kyslík (16O)

O

H

RO CH3

H

R

[M+H-CH3]+.

.. CH3+RO CH3

H

R O CH3

H

[M+H-CH3OH]++

Methoxy skupina

Funkční skupiny obsahující kyslík (16O)

M (16O) = 100%M+1 (17O) = 0.04%M+2 (18O) = 0.2%

Karboxylové kyseliny (RCOOH)

C

O

RC

O

O H

H

R O H

H

[M+H-H2O]+

+ RC

O

OR

[M-H-CO2]-

+ C

O

O

C

O

OH C

OO-

- CO2(- 44)

Karboxylové kyseliny (RCOOH)APCI-ESI-

• lze použít záporný mód všech API technik i MALDI, v případě dalších funkčních skupin možný i záznam kladných iontů• naprosto charakteristická ztráta m/z 44 = CO2, může být intenzivní již v MS1, typické pro záznam záporných iontů, často i v kladném módu (další ztráty H2O, CO, H2O+CO), u alifatických kyselin ztráta CO2 méně výrazná• v oblasti nízkých m/z může být pozorován ion m/z 44 [CO2]-, jiné ztráty nejsou• polykarboxyláty (nebo kombinace karboxy + sulfo skupin) tvoří aduktové ionty záměnou kyselých protonů za sodné ionty podobně jako sulfo kyseliny_______________________________________________________________________________________________________________________________

• falešná interpretace m/z 44 téměř vyloučena, jediná možná záměna je ztráta radikálu NH2CO. pro dusíkaté heterocykly obsahující karbonylovou skupinu, avšak tato ztráta nebývá jednotně 44 v obou módech polarity, ale doprovázena m/z 43 = NHCO

Kyslíkaté sloučeniny• ztráta vody m/z 18 - teoreticky možná téměř pro všechny kyslíkaté sloučeniny – diagnostická hodnota je malá, nutno posuzovat i intenzitu iontu• alifatické alkoholy – velice intezivní ztráta vody již v MS1, v APCI většinou 100% intenzitu již v MS1 (často i v ESI), v MS/MS ion [M+H-H2O]+ opět převládá• fenoly a chinony – ztráta vody může být patrná, ale oproti alkoholům nižší relativní intenzita, někdy ztráta radikálu OH. (např. nitro látky), přesmyková ztráta m/z 28 = CO• polyhydroxylované sloučeniny (např. cukry) – nutné použít ESI, opakované ztráty vody, pokles intenzity [M+H]+ / [M-H]-• ketony - analogicky -štěpení u EI vznikají [R1CO]+ a [R2CO]+, někdy též ztráta vody [M+H-H2O]+ s velmi malou intenzitou• aldehydy – ztráta CO pozorovaná v obou módech polarity (nespecifické, běžné např. pro karbonyl v cyklické struktuře), někdy ztráta m/z 30 = HCOH• estery – při absenci dalších funkčních skupin vhodnější záznam kladných iontů, typická ztráta alkoholu R2OH z esterové funkční skupiny R1COOR2 (např. ztráta methanolu u methylesteru) následovaná ztrátou CO, dále vznik karbonylových iontů [R1CO]+

• obecně výrazné analogie s EI, zejména při použití APCI

Shrnutí vlivu funkčních skupin na fragmentaci

K. Levsen et al., J. Mass Spectrom.,42 (2007) 1024

Obecný postup HPLC/MS/MS identifikace(analýza metabolitů, přírodních extraktů, syntetických produktů)

A/ Hlavní (cílová, výchozí, parentní) látka – struktura známá, dostatečné množství standardu- změření a detailní interpretace „všech možných“ MS experimentů, lze využít i přímé infúze (různé ionizační techniky, obě polarity záznamu, různé typy analyzátorů, chromatografické chování, UV spektra z PDA detektoru)Cíl: a) znalost chování hlavní látky při ionizaci, fragmentaci a HPLC retenci kvůli uplatnění analogie pro identifikaci „vedlejších“ látek (metabolitů, meziproduktů, nečistot, minoritních složek, atd.)b) volba optimálních podmínek pro vlastní analýzu vzorku

B/ Standardy „vedlejších“ látek – pokud jsou k dispozici, provést vše viz A/

C/ HPLC/MS analýza – vzhledem ke komplexnosti uvedených typů vzorků není vhodné vynechání separačního kroku, jinak ztráta informace- volba HPLC podmínek – optimalizace separace, MS kompatibilní podmínky- měřit oba módy polarity, podle charakteristických iontů určení MR všech hlavních složek a maximálního počtu minoritních píků- ověřovat a rozlišovat koeluce pomocí rekonstrukce iontových proudů (RIC)

Obecný postup HPLC/MS/MS identifikaceD/ HPLC/auto MS/MS – experimentálně lze provést zároveň s C/ HPLC/MS- interpretace následně po určení MR z HPLC/MS- optimální volba podmínek (práh citlivosti „threshold“), počet iontů pro kolize, kolizní energie, exkluze iontů, ukončení exkluze, atd.) by měla zajistit změření MS/MS spekter pro všechny píky včetně koelucí, obvykle pro ionty [M+H]+ nebo [M-H]-, možnost interaktivní úpravy nastavení v průběhu analýzy- ne vždy se podaří, obtížné nastavení u koelucí, chvostování píků, stopových složek

(D2/ HPLC/manuální MS/MS - dodatečné experimenty v případě chybějících důležitých MS/MS spekter, nutnosti doměření MS3 či „in-source“ CID +MS2)

E/ Měření přesných hmot – pomocí QqTOF, Orbitrap, FTICR, určení elementárního složení pro prekurzorové i produktové ionty (kalibrace, <3 ppm)

F/ Sumarizace a korelace všech dostupných dat – retenční chování, UV spektra z PDA detekce, určení MR, interpretace MS/MS spekter, další spektrální informace + základní chemický cit = návrh struktury (nebo aspoň její části)

G/ Ověření návrhu struktury pomocí identického standardu

HPLC/MS/MS identifikace nečistoty

8.0012.72

Time [min]

Acid Red 118Nečistota

[M-H]- [M-H]-

Int.

100%

MR=512 MR=540MR=28

UV chromatogram

ESI spektrumnečistotyv záporném módu

ESI spektrumAcid Red 118v záporném módu

H250

355

237

431

80

N N

H2N

HO

SO3-

H3C

O2SHN

-SO2 (186)

-N2 (327)-SO3 (275)

N N

H2N

HO

SO3-

H3C

O2SNCH2

CH3

80

459

237

355

250H

-SO2 (186)

-SO3 (275)-N2 (327)

IDENTICKÉ

IDENTICKÉ

HPLC/MS/MS barviva a nečistoty

Očekávaný produktVýchozí látka

Zadání syntetika:Potvrdit strukturu očekávaného produktu syntézy.

Cíl servisních měření:Co nejrychleji a nejsnadněji dát jasnou odpověď na otázku.

Volba MS podmínek:1/ Ionizační technika? Polarita záznamu?2/ Separace?3/ Měření přesných hmot?

N

NN

CN

CN

N

NN

Cl

Cl

Identifikace produktů syntézy

m/z 129m/z 207 (OE+.)

+H = m/z 208 (EE+)

516

507 682[M+H]+

[M+H]+

[M+H]+

496

506 681M-. M-.

[2M-2H-HCl]2-

Identifikace produktů syntézy

228

228

228

200

200

480

480

200

682

516

507

MS/MS = 682

MS/MS = 516

MS/MS = 507

Identifikace produktů syntézy

N

NN

CN

N

NN

N

NN

Cl

Očekávaný produktVýchozí látka

Produkt 1 Produkt 2 Produkt 3

N

NN

CN

CN

N

NN

Cl

Cl

N

NN

CN N

NN

Cl N

NN

Identifikace produktů syntézy

Schéma značení fragmentových iontů peptidů

CNH2

R1

H

C

O

N

H

C

H

R2

C

O

N C C

R3

HH

O

N C

H H

R4

COOH

a1 b1 c1

x3y3z3

a3a2 b3b2 c3c2

x1x2 y1y2 z1z2

ESI-MS/MS analýza peptidů

(typická písemková otázka)

ESI-MS/MS spektrum peptiduSérie iontů typu „b“ a „y“

Metabolismus xenobiotik• Základní funkce metabolismu xenobiotik (látky cizí organismu – léčiva,

pesticidy, kontaminanty, atd.) je transformace na derivát s vyšší rozpustnostíve vodě, který může být snáze eliminován z těla

• Metabolismus xenobiotik má dva základní kroky:I. fáze – reakce funkčních skupinII. fáze – konjugační reakce

H OH OSO3HI. fáze II. fáze

• HPLC/MS v obou módech polarity, správná volba ionizační techniky

• Určení molekulové hmotnosti: I. fáze – APCI, ESI, APPI, II. fáze – ESI

• Identifikace metabolitů je založena na interpretaci MS/MS spekter, retenčního chování, UV spekter z PDA detektoru, popř. informací z dalších spektrálních technik

Experimentální přístup

Nejběžnější metabolické reakce I. fáze

Defekty atomových hmotností

Metabolic reaction (elemental composition change)

-44 Decarboxylation (-CO2) +10.2-18 Alcohol dehydration (-H2O) +10.6-14 Demethylation (-CH2) -15.7-2 Ring formation (-H2) -15.7+2 Ring opening (+H2) +15.7+14 Hydroxylation and cyclization (+O-H2) -20.7

Hydroxylation (+O) -5.1Epoxidation (+O) -5.1Oxidation (+O) -5.1

+34 Epoxidation and hydration (+H2O2) +5.5

Nominal mass shift [ΔDa]

Exact mass shift [mDa]

+16

Element Nominal atomic mass [Da]

Mass defect [mDa]

H 1 +7.8C 12 0N 14 +3.1O 16 -5.1F 19 -1.6Si 28 -23.1P 31 -26.2S 32 -27.9Cl 35 -31.1Br 79 -81.7I 127 -95.5

Nominal mass shift [ΔDa] Conjugation reaction (elemental composition change) Drug functional group Exact mass

shift [mDa]+14 Methylation (+CH2) NH2, OH, SH +15.7+42 Acetyl conjugation (+C2H2O) NH2, NHNH2, SO2NH2, OH +10.6+57 Glycine conjugation (+C2H3ON) COOH +21.5+79 Phosphorylation (+PO3) OH -41.5+80 Sulfation (+SO3) NH2, SO2NH2, OH -43.2

+162 Glucosylation (+C6H10O5) OH, COOH +52.8+176 Glucuronidation (+C6H8O6) OH +32.1+220 Indirect carbamate glucuronidation of amines (+C7H8O8) NH2 + CO2 +21.9

+306-X Glutathione conjugation – halide substitution (-X+C10H16O6N3S) Halide (X) +76.0+305 Glutathione conjugation via epoxidation (+C10H15O6N3S) Aromatic +68.2

• V review celkem popsáno 54 metabolických reakcí I. fáze a 25reakcí II. fáze

M. Holčapek, L. Kolářová, M. Nobilis, Anal. Bioanal. Chem, 216 (2008) 1962

Nejběžnější metabolické reakce II. fáze

Metabolismus dimefluronu

O

H3CO O

NH3C

CH3

OCH3

Dimefluron (DMF) - 3,9-dimethoxy-5-(2-dimethylaminoethoxy)-7H-benzo[c]fluoren-7-one-hydrochlorid

• potenciální antineoplastikum• vzorky: krysí výkaly

P. Císař et al., J. Pharm. Biomed. Anal., 37 (2005) 1059

O

O

NH3C

CH3

OCH3

HO

O

O

NH3C

CH3

OH

HO

O

H3CO O

NH3C

CH3

OH

O

H3CO O

NH3C

CH3

OCH3

H3CO O

NH3C

CH3

OCH3

OHH

O

H3CO O

NH3C

CH3

OCH3

O

O

H3CO O

NH3C

H

OCH3

1

2

3

5

4

6

O

H3CO O

OCH3

NCH3

CH3

DMF I.S.

redukovaný DMF

3-O-desmethyl DMF

3,9-O-desmethyl DMF

9-O-desmethyl DMF

N-desmethyl DMF

DMF N-oxid

MW = 391MW = 377

MW = 349

MW = 363

MW = 363

MW = 363

MW = 379

MW = 393

DMF (ESI-MS a MSn)ESI+

ESI-

O

H3CO O

NH3C

CH3

OCH3

MS2 (378) MS3 (378-333)

378

[378-CH3NHCH3]+

[M+H]+

MW = 377

[333-H2O]+[333-CO]+

žádný signál

[M+Na]+

[M+K]+

9-O- or 3-O-desmethyl DMF

ESI+ ESI-

shodná spektra pro 3,9-O-desmethyl DMF (MW = 349)

MS2 (364)

364

[364-CH3NHCH3]+

[M+H]+ [M-H]-

[362-(CH3)2NCH2CH2]-•

[2M-H]-[M+Na]+

[M+K]+

[362-(CH3)2NH]-

MS2 (362)

O

H3CO O

NH3C

CH3

OH MW = 363

N-desmethyl DMF

ESI+

ESI-MS2 (364)

364

[364-CH3NH2]+

[M+H]+

[2M+H]+O

H3CO O

NH3C

H

OCH3

[364-CH3NHCHCH2]+žádný signál

MW = 363

Redukovaný DMF

ESI+ ESI-

MS2 (380)

380

[380-H2O]+

[M+H]+ [M-H]-

[378-(CH3)2NCH2CH2]-•

[M+Na]+

[378-CO]-

H3CO O

NH3C

CH3

OCH3

OHH

[362-CH3NCH2]+[362-(CH3)2NCHCH2]+

[319-CH2O]+

378

[350-CH3OH]-[306-CO]-

MS2 (378)

MW = 379

O

H3CO O

NH3C

CH3

OCH3

H3CO O

NH3C

CH3

OCH3

OHH

DMFRedukovaný DMF

UV spektra

nm 200 250 300 350

mAU

200

400

600

800

1000

nm200 250 300 350

mAU

500

1000

1500

HPLC/ESI-MS

1 - MW = 3492 - MW = 3633 - MW = 3634 - MW = 3795 - MW = 3636 - MW = 3937 - MW = 3778 - MW = 391

1

2

34

5

6 78

1

3

2

6

DMFI.S.ESI+

ESI-

Standardy

HPLC podmínky: 0 min – 40%, 20 min - 80% acetonitril / 5 mM CH3COONH4 ve vodě (pH=3), kolona Supelco Discovery (250x4 mm), F=1ml/min, T=30°C.

redukovaný3-O-

3,9-O- 9-O-

N-desmethylN-oxid

ESI-ESI+Vzorky

13

456

7 8

2 23

1

16.6 min

metabolity I. fáze od tr = 16 min

metabolity II. fáze ionty: [M+Na]+, [M-H2O+H]+, atd., sudé MW adukty s glycinem nebo kyselinou glukuronovou

HPLC/ESI-MS

ESI+

13

4

6

7 8

2

5

DMF I.S.

3,9-

O-d

esm

ethy

l DM

F

9-O

-des

met

hyl D

MF

3-O

-des

met

hyl D

MF

redu

kova

ný D

MF

N-d

esm

ethy

l DM

FN

-oxi

d D

MF

MW

= 3

91

MW

= 3

77

MW

= 3

49

MW

= 3

63 MW

= 3

63

MW

= 3

79

MW

= 3

93

HPLC/ESI-MS a MS/MS(zvětšená oblast metabolitů I. fáze od tR=16 min)

O

H3CO O

NH3C

H

OH

3-O-desmethylN-desmethyl DMF

1 3

46

7 8

25

DMF I.S.

redukovaný3-O-

3,9-O- 9-O- N-desmethylN-oxid

9

[M+H]+

10MW = 349

-31

-57

NH2CH3

-43CH2NCH3

CH2CHNHCH3

MS2

1 3

46

7 8

25

DMF I.S.

redukovaný3-O-

3,9-O- 9-O- N-desmethylN-oxid

910

[M+H]+

[M+H]+

11

13MW = 379

MS2-31

-57

NH2CH3

-43CH2NCH3

CH2CHNHCH3

H3CO O

NH3C

H

OCH3

OCH3H

O-methyl redukovanýN-desmethyl DMF

O

H3CO O

NH3C

CH3

OCH3

O

HO O

NH3C

CH3

OCH3

O

H3CO O

NH3C

CH3

OH

O

HO O

NH3C

CH3

OH

O

H3CO O

NH3C

H

OCH3

O

H3CO O

NH3C

CH3

OCH3

O

H3CO O

NH3C

CH3

OCH3

OHH

O

HO O

NH3C

H

OCH3

O

H3CO O

NH3C

H

OH

HO O

NH3C

CH3

OCH3

OHH

H3CO O

NH3C

CH3

OH

OHH

H3CO O

NH3C

H

OCH3

OHH

Metabolismus dimefluronu

DMF reduced DMF3-O-desmethyl DMF

3,9-O-desmethyl DMF 9-O-desmethyl DMFreduk. 9-O-desmethyl DMF

reduk. 3-O-desmethyl DMF N-desmethyl DMF DMF N-oxid

reduk. N-desmethyl DMF9-O-desmethylN-desmethyl DMF

3-O-desmethylN-desmethyl DMF

1

2

3

54

6

MW = 349 MW = 363

MW = 363

MW = 363MW = 379

MW = 393MW = 377

10

MW = 349

11

MW = 349

14

MW = 365

15

MW = 365

13

MW = 365