RCSB PDB

Progr. NMR

RCSB PDB

NMR biomakromolekulTypy biomakromolekul a možnosti studia pomocí NMR

● proteiny a peptidy

– rozmanité složení, omezení jen velikostí molekul

● nukleové kyseliny (RNA, DNA) a oligonukleotidy

– omezení malou rozmanitostí chemického složení

● polysacharidy a oligosacharidy

– omezení malou rozmanitostí chemického složení

● kombinace výše uvedených

NMR Proteinů

• Polymery α-aminokyselin, mnoho funkcí v organismu

• Katalytická - enzymy

• Strukturní a pohybové

• Signální

• Zásobní a transportní

• Obranné

• Pomocí NMR spektroskopie studujeme:

• Prostorové uspořádání

• Interakce s jinou molekulou

• Dynamika proteinu

Ala Asp Asn Arg Cys Glu Gln Gly His Ile

Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val

Stavba a struktura proteinů

+

Ala1 Ala2 Ala1–Ala2 H2O

+

Vznik peptidové vazby:

helikální struktura (α-helix)

extendovanástruktura (β-sheet)

náhodné klubko (random coil)

Struktura proteinůU proteinů rozlišujeme čtyři pojmy: primární, sekundární, terciární a kvartérní

struktura.

● Primární struktura udává pořadí aminokyselin v řetězci (sekvence). Píšeme vždy ve směru od N k C konci.

● Sekundární struktura udává konformaci hlavního řetězce v určitém úseku. Nejčastějšími prvky pravidelné sekundární struktury jsou helikální a extendovanástruktura, které jsou stabilizovány sítí vodíkových vazeb.

● Terciární struktura je prostorové uspořádání všech atomů proteinu.

● Kvartérní struktura popisuje strukturu nadmolekulového uspořádání více proteinů.

Zdroje Proteinů• Původní organismus• + přirozená forma včetně všech modifikací• - malé množství, drahé, nemožnost izotopového značení, etické problémy,

složitá izolace,….• Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris)• + levné, velký výtěžek proteinu, snadné uniformní izotopové značení• - možné problémy s modifikacemi postranních řetězců• Chemická syntéza• + velké možnosti izotopového značení, rychlé, vhodné pro toxické proteiny• - drahé, menší výtěžky, omezení maximální velikosti, problémy se

správným sbalením proteinu• In-vitro translace• + vhodné pro toxické proteiny, možnost selektivního izotopového značení• - drahé, posttranslační modifikace

Využívaná jádra v biomakromolekulách

+ vysoké přirozené zastoupení

+ vysoká citlivost (1,00)

− malá disperse chemických posunů (cca. 15 ppm)

+ velká disperse chemických posunů (cca. 210 ppm)

− nízké přirozené zastoupení (1,11 %)

− nízká citlivost (1,76.10−4); po 100% isotopovém obohacení 1,59.10−2

• střední disperse chemických posunů (cca. 30 ppm)

− nízké přirozené zastoupení (0,37 %)

− nízká citlivost (3,85.10−6); po 100% isotopovém obohacení 1,04.10−3

• speciální účely

1H

13C

15N

2H

Specifika řešení struktury proteinů pomocí NMR● měření ve fyziologickém prostředí, možnost úpravy fyzikálně-chemických vlastností

prostředí

● sledování průběhu biochemických dějů

● vysoce selektivní odezva na úrovni atomů

Čím jsme omezeni:

● velikost molekuly (ovlivnění T2)

– do 10 kDa (≡10 kg mol−1) [< 70 AA]

□ lze řešit přímo kombinací COSY, TOCSY a NOESY experimentů

– do 20 kDa [< 180 AA]

□ nutné 100% isotopové obohacení 13C a 15N

– do ~100 kDa

□ 100% isotopové obohacení 13C, 15N a částečné nebo úplné obohacení 2H (odstranění 1H jako hlavního zdroje rychlé relaxace 13C)

– větší proteiny

□ přístupný pouze hrubý „náhled“ na celkovou strukturu, sekundární struktura

● koncentrace vzorku

– alespoň 0,2 mM

● dlouhodobá stabilita vzorku

– několik týdnů

Vzorek proteinu pro NMR měření● nutno dosáhnout koncentrace proteinu alespoň 0,2–

0,5 mmol l−1 (obecně více = lépe)

– používá se filtrace přes membrány s mikropóry

(protein zadržen) nebo lyofilizace a opětovné

rozpuštění

● úprava pH pufrem (pH typicky 4–8)

– vyšší pH by způsobilo rychlou výměnu

amidických vodíků s molekulami vody a ztrátu

signálů

● přidání redukčních činidel (R–SH)

– zabránění oxidace cysteinů a následného

vysrážení vzorku

● přidání 5–10 % D2O

– referenční jádro pro spektrometr (lock) roztok vzorku

250–300 µl

Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR

příprava vzorkunaměření NMR

spekter

přiřazení signálů atomům v molekule

přiřazení NMRparametrů

pro výpočetstruktury

obecné informace o molekule (primární

struktura, S–S vazby,...)výpočet souboru

počátečních struktur

vyhodnoceníkvality struktur

oprava přiřazení

výpočetsouboru struktur

validace struktur

✓

1. publikované NMR spektrum proteinu

● spektrum proteinu RNasy A, měřeno

40 MHz spektrometrem, 1957

● 40 MHz CW spektrometr

Saunders M., Wishnia A. and Kirkwood

J.G. (1957) J. Am. Chem. Soc. 79, 3289.

První 1GHz NMR spektrometr● instalován firmou Bruker v Centre

de RMN à Très Hauts Champs,

Lyon, France

1H NMR spektrum proteinu měřené tímto spektrometrem

Nutný krok – potlačení signálu vody● jako rozpouštědlo se používá H2O, ne D2O z těchto důvodů:

– jde o fysiologické prostředí

– při použití D2O by došlo k výměně amidických vodíků za deuterium

● tím pádem je nutné potlačit dominantní signál H2O, protože její signál je 104–

105krát intensivnější než signály měřené látky

● spektrum proteinu bez potlačení H2O:

Potlačení signálu H2O – metoda presaturace

selektivní CW-ozařování H2O během relaxační periody

π/2

Δ

zbytkový signál H2O

1H NMR spektrum proteinu po presaturaci vody

● spinové echo s pulsními gradienty magnetického pole

Potlačení signálu H2O – metoda WATERGATE

(π/2)-y

1

H

Gz

Δ

πy(π/2)

x

sel. sel. Δ(π/2)-y

zbytkový signál H2O

1H NMR spektrum proteinu po WATERGATEexcitační profil selektivníhoπ/2 pulsu

● charakteristické oblasti výskytu jednotlivých typů 1H signálů aminokyselin

– kuřecí lysozym (129 AA, M = 14,6 kDa)

H alifatické

HN peptidické

H aromatické

HN

postranní Hα

CH3

Jednodimensionální 1H NMR spektrum proteinu

AA3AA2AA1

CCNC

NC

C

OH

HH R2

O

HR1

HR3

N

H

C

O

● 1H spinové systémy (3J) jednotlivých aminokyselin jsou odděleny C=O skupinami

● 1D 1H spektrum tedy obsahuje superposice spekter jednotlivých aminokyselin v daném proteinu a

● k sekvenčnímu propojení a přiřazení signálů se používají všechna jádra: 1H, 13C a 15N

Vícedimensionální NMR experimenty● rozlišení informací obsažených v 1D spektrech

– korelace chemických posunů 1H – 13C – 15N

– propojení spinových systémů jednotlivých aminokyselin

– pro dostatečnou citlivost experimentů je nutné použít isotopové obohacení

http://www.protein-nmr.org.uk

1H

(ppm)

1H

(ppm)

15N

(ppm

)

15N

(ppm

)1H-15N HSQC – „otisk palce“ proteinu

● ověření dobré terciární struktury proteinu, sledování lokálních

strukturních změn, interakcí s jinými molekulami, …

rozložený proteinsbalený protein

1H-15N HSQC – „otisk palce“ proteinu● Sledování skládání proteinu – intrinsically disordered proteins

Peptid po 2 dnech po přídavku interakčního partneraSamotný peptid

15N

(ppm

)

1H (ppm) 1H (ppm)

Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR

příprava vzorkunaměření NMR

spekter

přiřazení signálů atomům v molekule

přiřazení NMRparametrů

pro výpočetstruktury

obecné informace o molekule (primární

struktura, S–S vazby,...)výpočet souboru

počátečních struktur

vyhodnoceníkvality struktur

oprava přiřazení

výpočetsouboru struktur

validace struktur

✓ ✓

Interpretace NMR spekter – přiřazení resonancí● přiřazení NMR signálů jednotlivým atomům v molekule

● postup:

1.přiřazení hlavního řetězce (HN, N, Hα, Cα, CO)

2.přiřazení postranních řetězců (především 1H a 13C)

● Páteř proteinu postranní řetězce

● je nutné znát sekvenci aminokyselin daného proteinu

CO

Cα

O

HαCβ

N

HN

Hβ

označení jednotlivých atomů v

aminokyselině

Přiřazení resonancí – atomy hlavního řetězce● pro přiřazení 1H, 13C a 15N se používá soubor komplementárních

třídimensionálních korelačních experimentů

– přenos magnetizace pomocí skalárních inerakcí (1J, 2J)

● základní experimenty (je mnoho dalších kombinací):

CC

NC

C

OH

H C

O

HC

N

H

H

H

HNCA

CC

NC

C

OH

H C

O

H

C

N

H

H

H

HN(CO)CA

CC

NC

C

OH

H CO

H

C

N

H

H

H

CBCANH

CC

NC

C

OH

H C

O

H

C

N

H

H

H

CBCA(CO)NH

modrá: jádra excitovaná i detekovanázelená: jádra detekovaná vývojem magnetizace (chemického posunu)červená: jádra použitá pro přenos magnetizace, bez vývoje magnetizace

Přiřazení resonancí – experimenty HNCA a HN(CO)CA

13Cα

13C'15N

13Cα

13C'

15N

O

O1H

1H 13Cβ

13Cγ

1H

1H 13Cβ

13Cγ

90

11

15

7

55140

55

35

i − 1 i

< 1

13Cα

13C'15N

13Cα

13C'

15N

O

O1H

1H 13Cβ

13Cγ

1H

1H 13Cβ

13Cγ

90

11

15

7

55140

55

35

i − 1 i

< 1

interakční konstanty J v

Hz

HN(CO)CA

– po excitaci HiN je magnetizace je

přenesena na Ni (1JHN,N), dále na Ci−1

(1JN,C) a na Ci−1α (1JC,Cα)

– vývoj chemických posunů nastává pro HN, N a Cα

– každá H – N skupina dává jeden signál o frekvenci {ω(Hi

N), ω(Ni), ω(Cα

i−1)}

HNCA

– po excitaci HiN je magnetizace

přenesena na Ni (1JHN,N) a dále současně na Ci

α (1JN,Cα) a Cαi−1

(2JN,Cα)

– vývoj chemických posunů nastává pro HN, N a Cα

– každá H–N skupina dává dva signály o frekvencích {ω(Hi

N), ω(Ni), ω(Ci

α)} a {ω(HiN), ω(Ni),

ω(Cαi−1)}

Sekvenční propojení hlavního řetězce – HNCA a HN(CO)CA● 2D řezy spektry HNCA a HN(CO)CA v rovině H–C na frekvencích jednotlivých

amidických N

HNCA HN(CO)CA HNCA HN(CO)CA HNCAHN(CO)CAHNCAHN(CO)CA

někdy chybí pík…H

N

C

● různé implementace experimentů TOCSY a COSY

Přiřazení signálů postranních řetězců

Cα

C'

N

Cα

C'

N

O

OH

H Cβ

Cγ

H

H

Cβ

Cγ

H H

H

H H

H

HC(CCO)NH-TOCSY H(C)CH-COSY

Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR

příprava vzorkunaměření NMR

spekter

přiřazení signálů atomům v molekule

přiřazení NMRparametrů

pro výpočetstruktury

obecné informace o molekule (primární

struktura, S–S vazby,...)výpočet souboru

počátečních struktur

vyhodnoceníkvality struktur

oprava přiřazení

výpočetsouboru struktur

validace struktur

✓✓

✓

Interpretace NMR spekter –přiřazení strukturních parametrů

NOE ≡ meziatomová vzdálenost

skalární interakční konstanta ≡ dihedrální úhel

chemický posun ≡ chemické okolí

residuální dipolární interakce ≡ vzájemná orientace vazeb

vodíkové vazby ≡ detailní lokální struktura

Nukleární Overhauserův efekt (NOE)● přímá dipól-dipólová interakce mezi atomy I a S vlivem křížové relaxace

● rychlostní konstanta křížové relaxace mezi dvěma jádry 1H, σIS:

γH ... gyromagnetická konstanta 1H

τc ... korelační čas molekulyω ... Larmorova frekvencerIS ... vzdálenost interagujících jader

H H

dosah interakce do 5–6 Å

●NOE je hlavní zdroj informace o struktuře proteinu. Cílem je nalézt co největší počet NOE interakcí a jednoznačně je přiřadit dvojicím konkrétních vodíkových atomů v molekule.●Pravidelné prvky sekundární struktury tvoří charakteristické sítě NOE kontaktů.●Z NOE se nepočítají přesné vzdálenosti vodíků, ale rozdělí se do pásem podle intenzity.●Např. (1,8–2,5) Å; (1,8–3,5) Å; (1,8–5) Å.

X-editované NOESY experimenty● excitace pouze 1H atomů vázaných

na atomy 15N nebo 13C, přenos

magnetizace vlivem NOE na blízké

atomy 1H, detekce

1HN

1

H

řez 3D spektrem v rovině 1HN–1H na pozici 122 ppm v 15N doméně = signál Tyr66

Skalární interakce – zjištění dihedrálních úhlů● peptidová vazba tvoří rovinu definovanou

atomy O–Cα–N–HN

● vzájemná orientace dvou sousedních peptidových vazeb, a tedy i konformacepáteře proteinu je určena dihedrálními úhly φ a ψ– φ (C–N–Cα–C) a ψ (N–Cα–C–N)

● Karplusova rovnice

– závislost velikosti interakce 3J na

dihedrálním úhlu (θ)

– konstanty A a B zjištěny pro různé

kombinace interagujících jader

● problém: jedné hodnotě 3J mohou

odpovídat až čtyři hodnoty dihedrálního

úhlu

N

C'

C

N

C'

3J

[Hz]

10

8

6

4

2

0-120 600 120

H–N–Cα–H

CO–N–Cα–H

H–N–Cα–CβH–N–Cα–CO

θ [deg]

Chemický posun● chemický posun některých jader je

charakteristicky závislý na

sekundární struktuře

přiřazení resonancí

hlavního řetězce(Hα, Cα a C')

výpočet indexů chemického posunu (CSI)

odhad sekundární struktury podle

lokální hustoty CSI

náhodnéklubko

δ(Hα)

α-helix β-sheet

klesá roste

chemický posun

Histogram indexu chemického posunu jader Hα, Cα a C'

CN

−1

0+1

sekvence proteinu

helixI

helixII

helixIII

helixIV

Residuální dipolární interakce (RDC)● přímá dipól–dipólová interakce dvou jader

– v isotropním roztoku nedetekovatelná

– pozorovatelná v neisotropním prostředí u

molekul částečně orientovaných vůči

magnetickému poli

● tvorba neisotropního prostředí

– kapalné krystaly [fosfolipidy, PEG, proteiny

(virové částice, bakteriorhodopsin)], zmáčknutý

polyakrylamidový gel

– samotné vnější magnetické pole

● příspěvek ke skalární interakci ⇒ snadná

měřitelnost

● velikost interakce DIS závisí na orientaci vazby

vůči směru B0

I

S

rIS

Θ Θ...úhel mezi vektorem I–S a B0

fosfolipidové bicely

orientované v magnetickém

poli

Vodíkové vazby● identifikace:

– výměnné experimenty H ↔ D

– teplotní závislosti chemických posunů

● charakterizace:

– měření skalární interakce (J) přes H-vazbu

● stabilizace pravidelných sekundárních struktur vodíkovými vazbami

Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR

příprava vzorkunaměření NMR

spekter

přiřazení signálů atomům v molekule

přiřazení NMRparametrů

pro výpočetstruktury

obecné informace o molekule (primární

struktura, S–S vazby,...)výpočet souboru

počátečních struktur

vyhodnoceníkvality struktur

oprava přiřazení

výpočetsouboru struktur

validace struktur

✓✓

✓

✓

Přiřazení resonancía) páteřb) postranní řetězce

Strukturní omezení z NMR parametrů

✔vzdálenosti z NOE kontaktů (intra- a interresiduální)

✔dihedrální úhly ze skalárních interakčních konstant

✔relativní orientace vazeb z dipolárníchkaplingů

✔případně další omezení

Výpočet trojrozměrné struktury

molekulová mechanika

+ simulované žíhání

Identifikace prvků sekundární struktury

Výpočet struktury proteinu● Přímý výpočet energie všech možných konformací proteinu je příliš

výpočetně náročný

● molekulová mechanika v prostoru kartézských souřadnic (Newtonovy

pohybové rovnice) nebo torsních úhlů (Lagrangeovy rovnice)

energetická plocha v závislosti na dvou dihedrálních úhlech v disacharidu

V případě proteinu se jedná o plochu

závislou na n proměnných (n je počet

optimalizovaných souřadnic/úhlů).

–použití všech dostupných

experimentálních omezení,

minimalizace celkové energie systému

–simulované žíhání: molekula se ohřeje

na vysokou teplotu (103 K) a nechá se

postupně chladnout. Po každém

ochlazení se vypočítá nová energie

systému. Cílem je překonat lokální

energetická minima a najít (nejlépe) to

globální.

–přidáme nové energetické členy pro

experimentální omezení: čím bližší

bude shoda vypočítané struktury s

experimentálními údaji, tím nižší bude

celková energie

Molekulová dynamika

Vypočítané struktury● obdržíme soubor velice podobných struktur s minimálními energiemi

– Nejedná se o jedinou strukturu jako v případě rentgenové krystalografie, ale

o soubor struktur. NOE omezení se totiž nezadává jako fixní vzdálenost, ale

jako interval vzdálenosti. Souboru NOE tedy bude vyhovovat více struktur,

které by se ovšem měly lišit jen nepatrně.

– Větší rozptyl struktur v určité oblasti může být způsoben nedostatkem

experimentálních dat nebo zvýšenou pohyblivostí dané části proteinu.

● struktura matrixového proteinu Masonova-Pfizerova opičího viru

soubor strukturvybraná reprezentativní strukturaRMSD = 1,3 Å (jen helikální oblasti)

Interakce proteinu s ligandem• Protein-protein, protein-NK, protein-malá molekula, oligomerace• Interaguje specificky?• Kde interaguje?• Síla interakce (vhodné i pro slabší interakci)

• Farmaceutický průmysl• Proteomické studie

• Metody pro měření interakce pomocí NMR• Sledování změn chemických posunů• Intermolekulární NOE• Transferred NOESY• Mapování H-D chemické výměny NH skupin• Mapování pomocí paramagnetické látky• Sledování změny dynamiky proteinu

Změny chemických posunů• Titrace proteinu ligandem• Sledování změn chemických posunů skupin

(nejčastěji HN)• Interakční povrch• Disociační konstanta

STD – Saturation transfer difference• Interakce protein-malá molekula• Ozáření proteinu a přenos magnetizace na ligand během interakce• Přebytek ligandu• Zjistíme, která část ligandu interaguje• Odhad KD

koff

kon

protein

ligand ligand

STD-NMR princip

1H NMR (off-resonance)

© Lukáš Vrzal

koff

kon

ligand ligand

Excitace

protein

on-resonance

koff

kon

ligand ligand

protein

Přenos magnetizace

koff

kon

ligand ligand

protein

Přenos magnetizace

koff

kon

ligand

1H NMR (off-resonance) on-resonance

Relaxace signálů proteinu

protein

on-resonance off-resonance

STD-NMR (diferenční spektrum)

93%

73%

91%100%

1H NMR STD-NMR (difference spectrum)

STD – Saturation transfer difference

Intermolekulární NOE

• NOE efekt mezi dvěma molekulami

• U složitějších systémů vhodné odfiltrovat intermolekulární NOE

• Rozdílné izotopové značení

• 13C filtrované 13C editované NOESY

Studium dynamického chování molekul● molekuly nejsou statické, pohybují se v různých časových škálách

– různě rychlé pohyby se vzájemně doplňují

● funkce mnoha biomolekul závisí na jejich flexibilitě

– regulace dějů, interakce molekul, oligomerizace

● vypočítaná struktura je někdy průměrem více konformerů – možnost

charakterizace

časové škály pohybů

– různé relaxační mechanismy postihují různé časové škály molekulárních

pohybů

ps ns μs ms s > s

relaxaceR1, R2, het. NOE

relaxaceR1ρ, CPMG

analýza tvaru signálu

saturation transfer, NOESY

výměna H/D

pohyb N–Hrotace CH3

pohyb smyček

pohybdomén

transport,katalýza, další biologické děje...příklady

jevů

metodystudia

lokální pohyby globální pohyby

Analýza směsí, kvantitativní NMR spektroskopie a využití NMR spektroskopie ve forenzní analýze

Analýza směsí a kvantitativní NMR● NMR spektrum čisté látky je lineární kombinací spekter jejích

jednotlivých atomových skupin

– navíc pozorujeme vzájemné interakce atomů/skupin

● NMR spektrum směsi látek je lineární kombinací spekter jednotlivých látek

● integrální intenzity NMR signálů ve spektru jsou přímo úměrné zastoupení jednotlivých měřených entit

– u čisté látky integrály odpovídají počtu ekvivalentních jader ve skupině

– u směsi integrály odpovídají molárnímu zastoupení složek

• Absolutní plocha píku v NMR spektroskopii je závislá na mnoha faktorech, není tedy možné měřit koncentraci absolutně

počet bodů

d1

90y

akvizice

d1

90y

akvizice13C

ozařování dekapling1H

Požadavky na měření spekter pro kvantitativní NMR (qNMR)

● úplná relaxace všech spinů před začátkem měření (čekací perioda d1 = 5–10x T1)

● stejnoměrná excitace celého spektra (dostatečně tvrdé pulsy, dobrá kalibrace π/2-pulsů)

● zamezení změn intenzit signálů vlivem interakcí (DD-interakce–NOE, J-interakce); dekapling může být použit jen po dobu akvizice, jinak vypnutý

● dostatečný počet naměřených bodů (u starších přístrojů)

● dostatečný poměr signál/šum

● konstantní objem vzorku (nejlépe využití celé délky excitační a měřící cívky)

k konstanta přístroje

c koncentrace vzorku (měřených jader)B90 délka π/2-pulsu

T teplota

integrální intenzita NMR signálu, S

● pečlivé zpracování spekter (korekce fáze), výběr integrovaných signálů a integračních mezí

– hlavní slabina kvantitativní NMR (lidský faktor), lze zlepšit praxí

– pokud možno, volit dostatečně široké integrační meze

● překryv signálů

– dekonvoluce

– integrace celé skupiny signálů

Zpracování a vyhodnocení spekter

Zpracování a vyhodnocení spekter● při porovnávání integrálních intenzit je nutné uvažovat počty jader přispívajících

k signálu

● koncentrační standardy

– bez přidaného standardu

o poměr intenzit signálů dvou látek měřených ve směsi odpovídá poměru jejich koncentrací

o zjištění relativního zastoupení složek

– vnější standard

o zatavená kapilára s referenční látkou

– vnitřní standard

o referenční látka je rozpuštěna spolu se vzorkem

● lze dosáhnout přesnosti stanovení přibližně 1 % (v oblasti 5–20 mM)

Analýza směsí na základě rozdílné pohyblivosti složek● Velké překryvy spekter měřených látek, přímé měření difuzního koeficientu

● molekuly v roztoku vykonávají rotační a translační pohyb

● translační pohyb (volná difuse) charakterizován difusním koeficientem, D

– Stokesova-Einsteinova rovnice

– platí pro kulové částice (molekuly), lze ale využít pro odhad velikosti částic obecně

– nepřímá úměra mezi velikostí (hmotností) molekuly a jejím difusním koeficientem

● vliv velikosti difusního koeficientu (= velikosti) molekuly na intenzitu jejího NMR signálu lze sledovat po aplikaci gradientů magnetického pole

– metoda spinového echa s pulsními gradienty magnetického pole(PGSE, pulse gradient spin echo)

● aplikace

– rozlišení molekul ve směsi

– oligomerizace molekul (proteiny)

– výpočet translačního difusního koeficientu

k Boltzmannova konstanta

T termodynamická teplotaη visozita rozpouštědla

RH hydrodynamický poloměr molekuly

Spinové echo s pulsními gradienty magnetického pole, PGSE

90

y

180

y

excitace

kódování molekul podle pozice v ose z dekódování

vývoj, volná difuse akvizice

g

z

1

H

τ τ

B = B0+ g

zz

z

Δ

D

2

úbytek (kódované)

magnetizace v jednotlivých z-

vrstvách vlivem difuse

ztráta koherence

vlivem gradientu magnetického pole v

ose z

koherentní

magnetizace všech spinů

obnovení koherence

aplikací stejného gradientu po spinovém echu

D

1

D

3

D3 > D1 >

D2

intenzita signálů:

měření série spekter za různých intenzit gz

δ δ

1H (ppm)

1.3

4.7

7.9

g

z

Analýza naměřených spekter – metoda DOSY● Diffusion Ordered SpectroscopY, DOSY

– série PGSE spekter změřených s měnící se intenzitou gradientu gz

– pro každý bod spektra se vypočítá difusní koeficient a bod se zobrazí v pseudo-2D spektru na příslušné pozici D

©C

arlo

sC

obas, h

ttp://n

mr-

analy

sis

.blo

gspot.c

om

10−4

10−5

10−6

10−7

10−802468

1H (ppm)

D(c

m2

s−

1)

Inverzní laplaceovatransformace

DOSY – náhradní sladidlo CanderelM

-A

.Dels

uc

(2008) 2

3rd

NM

R V

altic

e

Překryv signálů vede k jejich

špatnému rozlišení podle difusního koeficientu.

K rozlišení je nutné pokročilejší zpracování.

LC-NMR● propojení kapalinové chromatografie (HPLC, GPC) a NMR spektroskopie

– Vzorek směsi je nanesen na LC, kde je rozdělen na vhodné stacionární fázi. Jednotlivé frakce jsou pak kapilárou vedeny z výstupu LC přímo do měřící sondy NMR spektrometru.

– speciální průtočná měřící sonda s malým aktivním objemem (60 μl), detekce μg množství látek

– Je nutné potlačit signál rozpouštědla. Případně se po optimalizaci pro daný vzorek dá použít deuterované rozpouštědlo.

– dvě možnosti měření spekter: během průtoku, nebo vždy po zastavení průtoku

– měří se 1H spektra (především), která se zaznamenají v pseudo-2D formě

1H

[ppm]ča

s

[min

]

LC-NMR – analýza oleje ze semínek černého rybízu

k. stearová

k. palmitová

k. olejová

k. linolová

k. γ-linolenová

k. α-linolenová

kolona C8+C18; zapojení v serii; 0,5

ml/min

CH3CN–CDCl3 90:10 (v/v); 1–28 min

AQ = 1s; NS = 4; D1 = 0s

Jan S

ýkora

, ÚC

HP, A

V Č

R,

v.v

.i.

Průmyslové aplikace – obsah vody/oleje – NMR relaxometrie● Využívá výrazně odlišné doby

relaxace/rychlosti difuze dvou látek ve směsi

● Není potřeba vysoké rozlišení – stačí levný spektrometr s trvalým magnetem

● Použitelné na veškeré potraviny s vlhkostí pod 15%

● Odečítá se z kalibrační křivky (uložená v paměti přístroje, pro různé systémy různá)

● emulze „olej ve vodě“

– Relaxační čas T2 volného oleje je mnohem kratší než T2 volné vody. Metoda mnohonásobného spinového echa (CPMG),

– Po odečtení převažující dlouhorelaxujícíkomponenty (H2O) se získá obsah oleje extrapolací křivky (b) do t = 0. Pro získání hmotnostního zlomku je ještě nutný kalibrační faktor.

Relaxometr fi. Bruker

Průmyslové aplikace – kvalita džusu● současné sledování mnoha ukazatelů

● identifikace a kvantifikace

– cukrů (glukosa, fruktosa, sacharosa…)– kyselin (citronová, jablečná…)

– indikátorů rozkladu (ethanol, k. fumarová, mléčná)

– způsobu zpracování

§ phlorin (3,5-dihydroxyfenyl-β-D-glukopyranosid) obsažen v kůře, indikátor lisování celých pomerančů

● ověření země původu

– viz SNIF-NMR

http://www.bruker-biospin.com

x

y

z

NMR spektroskopie jako nástroj forenzní analýzy

● Použití NMR spektroskopie ve forenzní analýze je limitováno nízkou citlivostí metody a finanční náročností nákupu a provozu NMR spektrometru (národní referenční laboratoře)

● Hlavní využití:

– Průkaz zakázané látky

§ Návykové látky

§ Často je nutné prokázat, že se jedná přesně o zakázanou látku (MS/IČ nestačí)

§ Problém „legálních drog“ (látky účinné, ale dosud nezakázané)

– Průkaz falšování potravin

§ Ověření původu

§ Přítomnost zakázané/jiné než deklarované látky

Průkaz zakázaných látek● Použití NMR spektroskopie ve forenzní analýze je limitováno nízkou citlivostí

metody a finanční náročností nákupu a provozu NMR spektrometru (národní referenční laboratoře)

● Prokázání přítomnosti látky

● Určení čistoty/nečistot, optické čistoty, zda se jedná o sůl

§Použití při vyšetřování původu látky

● Klasické experimenty 1H, 13C, vícerozměrné experimenty, posunová činidla

● Knihovny spekter známých látek

Fencyklidin

Specific site Natural Isotope Fractionation – SNIF-NMR

● sledování rozdílného izotopického zastoupení na jednotlivých místech molekuly

● Izotopické rozdělení závisí na původu příslušné molekuly. Např. D/H vody v Nantes (Francie) je 150 ppm, v Antarktidě 89 ppm. Je rozdíl např. v odpařování H2O a HDO.

● SNIF-NMR: určení poměru D/H

● odchylka isotopů (isotope deviation), δ

● alternativní metoda: hmotnostní spektrometrie (v praxi se tak měří zastoupení 13C/12C)

● použití: ověření pravosti a původu potravin

V.SMOW = Vienna

Standard Mean OceanWater

Materiály a obrázky laskavě poskytli J. Mazáč a P. Havelec z Celní laboratoře MF ČR.

Distribuce isotopů 13C a 2H v přírodě

Specific site Natural Isotope Fractionation – SNIF-NMR● Metoda schválena pro (H/D):

– Ovocné šťávy

§ Obvykle před měřením jsou cukry fermentačně převedeny na ethanol

§ Jediná metoda pro průkaz cukru z C3 nebo C4 rostlin

– Víno

– Vanilin

– Kyselina octová

• V kombinaci s 13C/12C je možné odlišit i cukry z C4 od CAM rostlin (falšování tequilly)

• Měření 2D spektra a integrace jednotlivých píků vůči standardu

• Při zjišťování zastoupení 13C/12C integrace satelitů okolo signálů v 1H spektru

• Alternativa – MS spektroskopie (hlavně 13C/12C), výhodnou NMR je zjištění poměrů v jednotlivých skupinách atomů - přesnější

Specific site Natural Isotope Fractionation – SNIF-NMR

• Příklad 2D spektra ethanolu

• Při zjišťování zastoupení 13C/12C integrace satelitů okolo signálů v 1H spektru