LAPORAN

KULTUR JARINGAN

ISOLASI, KULTUR PROTOPLAS, DAN HIBRIDISASI

Oleh:Lazuardi Cahya Abadi, S.P

131520101002

MAGISTER AGRONOMI

PROGRAM STUDI PASCASARJANA

UNIVERSITAS JEMBER

2013

ISOLASI DAN KULTUR PROTOPLAS

Salah satu cara untuk mengatasi masalah dalam pengembangan tanaman

padi unggul adalah dengan merakit varietas baru yang berproduksi tinggi dan

tahan terhadap hama, penyakit serta cekaman abiotik. Beberapa cara yang dapat

diterapkan untuk mendapatkan varietas baru antara lain melakukan persilangan

dengan spesies tertentu, melakukan mutasi buatan, penerapan metode transformasi

atau melakukan fusi protoplas (Anonim, 2012).

Protoplas adalah sel telanjang tanpa dinding yang hanya dilindungi oleh

membran plasma. Isolasi protoplas pertama kali dilakukan oleh Klercher pada

tahun 1892. Protoplas dapat diisolasi dari hampir semua bagian tanaman, seperti

akar, daun, nodul akar, koleoptil, kultur kalus dan daun in vitro (Husni et al.

2003).

Bahan tanaman yang biasanya digunakan sebagai sumber protoplasma

adalah daun muda, kalus, atau agregat sel dalam kultur suspensi sel. Jaringan

mesofil pada daun merupakan jaringan yang paling mudah diisolasi karena sel-

selnya tersusun secara renggang sehingga enzim-enzim mudah mencapai dinding

sel. Daun muda atau pucuk dari biakan in vitro merupakan sumber yang lebih

disukai karena sudah dalam keadaan steril. Kultur sel yang akan digunakan

sebagai sumber protoplasma harus berasal dari kultur yang berumur muda antara

3-5 hari. Protoplasma membutuhkan tekanan osmotik yang sesuai sampai dinding

selnya terbentuk kembali baik dalam proses isolasi maupun selama periode kultur

(Deden Sukmadjaja, 2008).

Kultur protoplas dapat dilakukan dengan cara menggabungkan seluruh

genom dari spesies yang sama (intra-spesies), atau antarspesies dari genus yang

sama (inter-spesies), atau antargenus dari satu famili (inter-genus). Penggunaan

fusi protoplas memungkinkan diperolehnya hibrida-hibrida dengan tingkat

heterosigositas yang tinggi walaupun tingkat keberhasilannya sangat ditentukan

oleh genotipenya. Teknologi kultur protoplas juga dapat dilakukan untuk

mendapatkan sifat-sifat tertentu seperti sifat ketahanan terhadap hama dan

penyakit serta cekaman abiotik.

Prosedur Kultur Protoplasma

Kultur ptotoplasma dilakukan melalui secara bertahap mulai dari persiapan

eksplan dan isolasi protoplasma diikuti dengan penanaman. Mutasi protoplasma

dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa mutagen ke dalam media tanam

atau dengan memperlakukan protoplasma dengan senyawa mutagen tersebut.

Silangan somatik dilakukan dengan cara penggabungan dua buah protoplama

segera setelah isolasi kemudian ditumbuhkan. Prosedur kultur protoplasma secara

umum adalah sebagai berikut (fatihah, 2012):

1. Persiapan eksplan

Jaringan tanaman yang digunakan untuk isolasi protoplasma ini beragam,

umumnya jaringan yang lebih muda dan berasal dari tanaman yang mempunyai

umur fisiologis muda, seperti pucuk muda (seperti dari kecambah, bibit, plantlet),

pucuk adventif hasil pangkasan. Protoplasma dari sel jaringan tersebut lebih

mudah diisolasi protoplasmanya karena dinding selnya masih sederhana dan

hanya terdiri dari dinding sel primer saja dan jaringannya masih memiliki sel-sel

parenchyma (dindingnya belum berlignin). Selain itu, ada juga yang

menggunakan jaringan yang telah dewasa, namun media untuk isolasi

protoplasma dari jaringan ini lebih kompleks karena dinding selnya telah

berlignin, telah memiliki dinding sel primer dan dinding sel sekunder.

2. Sterilsasi eksplan

Bagian tanaman yang akan digunakan sebagai eksplan terlebih dahulu

dicuci kemudian disterilakan, umumnya menggunakan sodium hypoklorit 1 – 2 %

selama 10 – 30 menit tergantung jenis eksplan yang digunakan. Eksplan tersebut

selanjutnya dicuci dengan air steril (3 – 4 kali) untuk mencuci sisa sodium

hipoklorit pada eksplan.

3. Isolasi Protoplasma

Isolasi protoplasma dapat dilakukan dengan dua cara:

3.1 Metode mekanikal

Isolasi protoplasma menggunakan metode ini dikenalkan pertama kali oleh

Klercker pada tahun 1892. Isolasi protoplasma dilakukan dengan cara mengupas

dinding sel menggunakan alat bedah mikro. Metode ini telah berhasil mengisolasi

protoplasma dari daun Saintpaulia ionantha dan dikulturkan hingga tumbuh kalus.

Kelebihan dari metode ini adalah bila sel yang digunakan mempunyai vakuola sel

yang relatif besar sedangkan kelemahannya adalah: 1) Keberhasilannya rendah; 2)

Pekerjaan yang membutuhkan tenaga banyak dan membosankan; 3) Viabilitas

protoplasma rendah, karena sering terjadi kerusakan protoplasma selama proses

pengupasan dinding sel.

3.2 Metode enzimatik

Isolasi protoplasma dilakukan dengan menggunakan enzim yang dapat

mengahancurkan dinding sel. Enzim yang digunakan bervariasi jenis dan

konsentrasinya tergantung kondisi fisologis eksplan, terutama umur jaringan yang

erat kaitannya dengan komposisi dinding selnya. Enzim yang digunakan untuk

mengancurkan dinding sel tumbuhan umumnya ada 3 yaitu: Cellulase untuk

menghancurkan sellulose, Hemicellulase untuk menghancurkan hemisellulose,

Pectinase untuk menghancurkan pektin.

Alat dan Bahan Isolasi Kultur Protoplasma

Alat yang digunakan untuk isolasi dan kultur ptotoplasma adalah sebagai

berikut :

1. Laminar air flow cabinet

2. Centrifuge

3. Inverted microscope

4. Gyratory shaker

5. Magnetic stirrer + hot plate

6. pH meter

7. Saringan stainless stell (lubang 60 - 70 m)

8. Bacterial filter

9. Nalgene filter unit 0,22 m

10. Millex filter unit 0,45 m

11. Spet dan jarum

12. Piset dg ujung runcing + pisau kultur

13. Pipet 5 ml berujung lebar

14. Pipet pastur 2 ml

15. Petri dish

16. Gelas beker

17. Parafilm/plastic wrapp

Bahan- bahan yang digunakan untuk isolasi protoplasma adalah sebagai berikut:

1.Eksplan

Protoplasma yang telah berhasil diisolasi berasal dari organ-organ seperti:

daun, tangkai daun, pucuk, akar, buah, koleoptil, embrio dan mikrospora. Diantara

organ tersebut sel yang paling mudah dan bagus untuk diisolasi protoplasmanya

adalah berasal dari jaringan mesofil daun, karena: Bentuk selnya relatif seragam,

tidak perlu membunuh tanamannya, dinding sel mudah terkelupas oleh enzim.

2.Ethanol 70 %

3. Larutan isolasi protoplasma

Tahapan Pengerjaan Isolasi Protoplasma

a. Jaringan tanaman seperti daun tembakau disterilkan terlebih dahulu dengan cara

merendamnya dalam alkohol 70% selama 30 detik selanjutnya di rendam kedalam

larutan pemutih (misalnya bayklin) 20% yang ditambah beberapa tetes Tween

selama 15 menit. Selanjutnya daun tembakau tersebut dibilas menggunakan

aquadest steril sebanyak tiga kali.

b. Jaringan tanaman steril, diiris halus dan dikupas eidermis serta dihilangkan urat

daunnya dengan menggunakan mata skalpel runcing steril, untuk lebih

memudahkan isolasi protoplasmanya. Contoh campuran dan konsentrasi enzim

yang digunakan untuk isolasi protoplasma beragam dan tergantung dari jenis

jaringan yang digunakan sebagai eksplan, seperti:

1. Medium enzim untuk jaringan akar

a. 2 % rhozyme

b. 2 % meicellase

c. 0,03 % macerozyme R10

2. Medium enzim untuk daun Serealia

a. 2 % cellulysin

b. 0,2 % macerozyme R10

c. 0,5 % hemicellullase

d. 11 % mannitol

3. Medium enzim untuk Daun Tembakau:

a. 0,5 % Onozuka R10 cellulase

b. 0,1 % Onozuka R10 macerozyme R10

c. 13,0 Mannitol

d. pH 5,8

Untuk mengurangi daya tarik menarik (adhesi) antara sitoplasma dengan

dinding selnya, Larutan enzim biasanya ditambahkan senyawa osmoticum.

Senyawa osmoticum yang dapat digunakan antara lain: Mannitol, Sorbitol,

Glukosa, Fruktosa, Galaktosa, Sukrosa. Setelah dinding sel lepas, selanjutnya

eksplan direndam ke dalam 20 ml larutan media preplasmolisis selama 1-8 jam.

Komponen Medium Isolasi Protoplasma (MIP) adalah sebagai berikut:

a. CaCl2.H2O 1480,0 mg/l

b. KH2PO4 27,2 mgl

c. KNO3 101,0 mg/l

d. MgSO4.7H2O 246,0 mg/l

e. CuSO4.5H2O 0,025 mg/l

f. KI 0,16 mg/l

g. pH 5,8

Eksplan dipindah larutan medium enzim (komposisi media ini juga

berbeda-beda untuk setiap jenis eksplan yang digunakan) untuk daun tembakau

komponennya dapat dilihat di atas. Eksplan dipindah ke tabung steril dan dituangi

medium enzim sebanyak 10 ml, lalu tabung ditutup dengan aluminium foil steril

dan diisolasi menggunakan parafilm atau plastik wrap. Tabung berisi eksplan

tersebut digoyang pada shaker dengan kecepatan 40 rpm selama semalam atau 4-

16 jam.

Pemurnian protoplasma

1. Protoplasma dalam poin 5 disaring dengan filter steril, mess 63 μm,

masukkan ke dalam gelas piala volume 250 ml menggunakan pipet pastuer.

2. Medium pencuci (MIP ditambah + 10 %) sebanyak 3 ml ditambahkan ke

dalam cawan petri yang berisi debris dari daun, digoyang perlahan dan

kombinasikan dengan protoplas/ campuran enzim dalam gelas piala vol. 250

ml.

3. Protoplas yang diperoleh dicuci dengan medium pencuci dan saring.

Protoplas yang masih tercampur dengan larutan enzim disentrifuge dengan

kecepatan 50 x g selama 10 menit.

4. Pelet diresuspensi dalam medium pengapung (medium flotasi) 10 ml

ditambah medium pencuci 1 ml selanjutnya disentrifuge, protoplasma akan

melayang-layang diantara medium flotasi (MIP + 20%) dan medium pencuci.

5. Protoplasma yang melayang-layang dipindahkan ke dalam tabung ditambah

10 ml medium pencuci, selanjutnya disentrifuge maka protoplasma akan

mengendap sebagai pelet.

6. Supernatan dibuang dan pelet ditambah 10 ml medium pencuci dan diputar

lagi.

7. Supernatan dibuang sisakan suspensi protoplasma sebanyak 1 ml.

8. Kerapatan suspensi protoplasma yang dikulturkan untuk setiap spesies

tanaman berbeda-beda seperti tembakau suspensi protoplas kerapatannya

50.000 sel/ ml dan 25000 sel/ ml untuk protoplasma petunia, protoplasma

tersebut dikulturkan dalam cawan petri steril.

Perhitungan Konsentrasi dan Tes Viabilitas Protoplasma

Untuk menghitung kerapatan dapat dihitung dengan bantuan

haemocitometer: jumlah sel / grid x 10.000. Tes viabilitas protoplasma dilakukan

dengan menggunakan senyawa flourescent seperti fluresein diacetate (FDA).

Medium kultur diambil 25 tetes selanjutnya ditambah 1 tetes larutan pewarna

FDA dan 1 tetes protoplasma suspensi tersebut agar protoplas tercat dengan baik,

selanjutnya dilihat di bawah mikroskop. Protoplasma yang mati berwarna merah

dan yang viable tercat hijau.

Kultur Protoplasma

Protoplasma yang hidup diambil dalam jumlah memadai (frekuensi

protoplas viable 100 – 200 sel) selanjutnya ditanam pada media yang telah

disediakan dan dikulturkan dan disimpan tempat gelap pada temperatur 28oC

selama semalam. Kultur protoplasma dipindahkan pada cahaya rendah (10 – 20

μmol.detik-1m-2) dengan cahaya lampu putih yang dingin dan fotoperiode 16

jam, selama 2 hari (fatihah, 2012). Kultur dipindahkan pada intensitas cahaya

yang lebih tinggi (50 – 75 μmol.detik-1m-2).

Media yang digunakan untuk kultur protoplasma dapat berupa media

media cair yang diletakkan dalam cawan petri kecil atau media padat (dengan

pemadat agarose). Media yang digunakan untuk kultur protoplasma jauh lebih

kompleks dibandingkan dengan media untuk teknik kultur lainnya, karena

protoplasma belum memiliki dinding sel sehingga perlu ditanam pada media awal

yang diperkaya dengan osmotikum (misalnya sorbitol atau mannitol) untuk

menghindari plasmolisis. Salah satu contoh media kultur protoplasma tembakau.

Penanaman protoplama ke dalam media dilakukan dengan cara

mencampur protoplama dengan larutan agarose. Campuran disedot dengan pipet

pasteur steril kemudian diteteskan pada cawan petri steril (5 – 10 tetes per petri).

Cawan petri ditutup dengan parafilm selanjutnya kultur diletakkan pada ruang

kultur dengan suhu 250C dan diberikan 16 jam penyinaran. Setiap 2 minggu

ditambahkan media baru ke bagian tetesan protoplasma tersebut.

Teknik Kultur Protoplasma

Protoplasma yang telah dimurnikan biasanya dikulturkan dengan dalam

medium agar semisolid dan liquid. Protoplasma sering dikulturkan dalam media

liquid untuk meregenerasi dinding sel terlebih dahulu, sebelum dikulturkan ke

media agar. Media semisolid agar, agar yang digunakan untuk kultur protoplasma

adalah khusus: yaitu gel agar lunak, salah satunya agarose.

Teknik media liquid biasanya digunakan pada fase awal kultur, karena

mudah larut dan diserap, beberapa spesies, protoplasmanya tidak dapat membelah

dalam media agar, tekanan osmotik media direduksi secara efektif, kerapatan sel-

sel dapat direduksi setelah beberapa hari dikulturkan, kelemahan dari teknik ini

tidak boleh diisolasi dari turunan koloni tunggal yang berasal dari sel induk satu.

Teknik media liquid dapat dibedakan menjadi dua metode (fatihah, 2012):

a. Metode liquid tetes

Dengan menggunakan pipet ukuran 100-200 μl, suspensi protoplasma

dalam media diteteskan pada cawan petri ukuran 60mx15m sebanyak 5-7 tetes.

Cawan petri ditutup dan direkatkan dengan parafilm atau plastik wrap selanjutnya

diinkubasikan. Setiap 5-7 hari tambahkan medium segar baru dengan cara

meneteskan langsung pada tetesan suspensi protoplasma yang telah mengalami

pertumbuhan. Metode ini biasanya baik untuk keperluan pengamatan dengan

mikroskop. Kelemahan dari metode ini adalah tetesan-tetesan suspensi menyatu

menjadi satu tetesan di pusat.

b. Metode tetes menggantung

Dengan menggunakan pipet volume 40-100 μl, suspensi protoplasma

diteteskan di dalam tutup cawan petri, selanjutnya cawan petri, ditutup dengan

menggunakan tutup yang telah ditetesi suspensi protoplasma, sehingga tetesan

suspensi tersebut akan menggantung di dalam tutup cawan petri tersebut.

Proses yang terjadi setelah kultur protoplas dilakukan:

1. Fusi protoplasma

Peleburan protoplasma dari 2 genom yang berbeda dapat diperoleh baik

secara spontan ataupun dengan teknik pemacuan peleburan.

a. Metode peleburan spontan

Peleburan protoplasma secara spontan biasanya terjadi karena membran

protoplas yang sangat tipis dan lunak sehingga mudah sobek atau pecah yang

dapat mengakibatkan peleburan protoplasma. Biasanya terjadi pada protoplasma

yang diisolasi dari kalus. Perleburan protoplasma dengan teknik ini biasanya

terjadi pada protoplasma yang mempunyai asal tanaman yang sama sehingga tidak

bernilai untuk perbaikan tanaman.

b. Metode pemacuan peleburan

Untuk mencapai peleburan protoplasma diperlukan adanya agensia untuk

memacu terjadinya peleburan protoplasma (dikenal sebagai fusagen) yang

berbeda jenis tanamannya.

2. Pembentukan Dinding Sel

Perkembangan protoplasma diawali dengan regenerasi atau terbentuknya

dinding sel diikuti terbentuknya koloni sel menyerupai kalus. Pada beberapa

spesies, protoplasma membentuk kalus dan beregenerasi melalui organogenesis

atau embriogenesis.

3. Regenerasi Protoplasma

Regenerasi protoplasma membentuk koloni sel kemudian tanaman lebih

sulit dibandingkan dengan teknik kultur jaringan jaringan lain. Salah satu teknik

yang digunakan untuk merangsang regenerasinya adalah menggunakan sel-sel lain

(sebagai perawat) sehingga tekniknya disebut dengan teknik “Nurse Culture”.

Untuk kultur satu protoplasma, “nurse cells” diletakkan berdekatan dengan kultur

protoplasmanya untuk mendukung pertumbuhan dan perkembangan protoplasma.

Sumber:

Anonim. 2012. Kultur Protoplasma. http:// apotikmakassar .wordpress.com/ 2012/01/13/ kultur-protoplasma/. Diakses tanggal 23 September 2013.

Fatihah. 2012. Teknik Kultur Jaringan Melalui Protoplasma. http://fatihahfiqia. blogspot.com/2012/01/kultur-jaringan.html. diakses tanggal 25 September 20113.

Husni A., I. Mariska, G.A. Wattimena, dan A. Purwito. 2003. Keragaan Genetik Tanaman Terung Hasil Kultur Protoplas. Jurnal Bioteknologi Pertanian.

Sukmadjaja, Deden dan Ika Mariska. 2008. Perbanyakan Bibit Jati Melalui Kultur Jaringan. Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian.