17

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI Leuconostocmesenteroides PENDEGRADASI SIANIDA

Abstrak

Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi bakteriLeuconostoc mesenteroides dari umbi singkong fermentasi yang berfungsi sebagaipendegradasi sianida. Menggunakan umbi singkong yang sudah diparut dandiinkubasi dalam kondisi anaerob selama tujuh hari pada suhu kamar. Identifikasidilakukan terhadap ciri-ciri morfologis, fisiologis dan sifat-sifat biokimiawi isolat,selanjutnya isolat diuji aktivitas β-glukosidase dan konsentrasi sianida. Hasilpengamatan terdapat 4 isolat (A, B, C dan D) sebagai bakteri Leuconostocmesenteroides yang mampu menurunkan sianida dibandingkan dengan kontrol.Kesimpulan dari penelitian ini adalah isolat C mempunyai kemiripan terbesardengan bakteri Leuconostoc mesenteroides dengan akvititas enzim β-glukosidaseyang tinggi dan konsentrasi sianida yang rendah.

Kata kunci: isolat, identifikasi, β-glukosidase, Leuconostoc mesenteroides, sianida

Abstract

The research was conducted to isolate and indentify Leuconostocmesenteroides bacteria from fermented cassava tuber, which can degrade cyanide.The ground cassava tubers were incubated in anaerob condition for seven days inroom temperature. Identification was done based on morphology, phisiology andbiochemistry characteristics of isolates, and then the isolates were examined theirβ-glukosidase activity and cyanide degradation. The results showed that therewere 4 isolates (A, B, C and D) as Leuconostoc mesenteroides bacteria that hadability to reduce cyanide in cassava tuber. The conclusion of this research was thatC isolate had the biggest similiarity with Leuconostoc mesenteroides bacteria andhad the highest enzyme β-glukosidase activity as well as the lowest cyanideconcentration.

Keywords: isolate, identification, β-glukosidase, Leuconostoc mesenteroides,cyanide

Pendahuluan

Pemecahan glukosida sianogenik terjadi apabila jaringan tanaman rusak,

sehingga enzim β-glukosidase atau linamarase yang terdapat pada jaringan

tersebut dibebaskan dan bekerja menghidrolisis senyawa glukosida tersebut dan

pada akhirnya dihasilkan sianida bebas.

Sianida bebas yang dihasilkan dari glukosida sianogenik ini dikenal

sebagai racun yang amat kuat. Pada dosis yang besar menyebabkan keracunan

akut yang mematikan. Pada dosis yang rendah sekali kemungkinan dijumpai

18

gejala keracunan yang kronik. Keadaan ini menjadikan faktor pembatas dari

singkong untuk dipakai secara langsung baik untuk ternak maupun manusia.

Bakteri yang diisolasi dari fermentasi umbi singkong akan lebih efektif

untuk menurunkan kadar sianida, karena bakteri tersebut mudah beradaptasi

dibandingkan bakteri yang diisolasi dari produk lain. Leuconostoc mesenteroides

merupakan salah satu dari kelompok bakteri asam laktat dan dapat diisolasi dari

fermentasi umbi singkong (Amoa-Awua et al. 1996). Presentase bakteri ini

sebesar 14.5% dari bakteri asam laktat dan menghasilkan enzim β-glukosidase,

yang berperan dalam menghidrolisis glukosida sianogenik (Obilie et al. (2004).

Hasil penelitian Gueguen et al. (1997) menunjukkan bahwa aktivitas enzim β-

glukosidase dari bakteri Leuconostoc mesenteroides yang diisolasi dari singkong

mampu menghidrolisis glukosida sianogenik. Glukosida sianogenik yang terdapat

pada singkong dihidrolisis dengan bantuan enzim β-glukosidase menjadi

sianohidrin dan glukosa. Enzim hidroksinitril liase akan mengubah sianohidrin

menjadi aseton dan sianida. Semakin tinggi aktivitas β-glukosidase yang

dihasilkan oleh bakteri Leuconostoc mesenteroides maka semakin sedikit sianida

yang dihasilkan untuk proses detoksifikasi. Berdasarkan hal diatas dilakukan

penelitian isolasi dan identifikasi bakteri Leuconostoc mesenteroides dari umbi

singkong fermentasi pendegradasi sianida.

Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan isolat bakteri

Leuconostoc mesenteroides dari umbi singkong fermentasi. Manfaat penelitian

ini diharapkan dapat menghasilkan galur bakteri Leuconostoc mesenteroides yang

mampu mendegradasi sianida.

Bahan dan metode

Waktu dan Tempat

Penelitian dilakukan dari bulan Juni sampai Oktober 2007 di

Laboratorium Mikrobiologi Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi

Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Nutrisi Ternak Perah Fakultas

Peternakan Institut Pertanian Bogor.

19

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan adalah umbi singkong varietas pahit diperoleh dari

industri tapioka Kedung Halang Bogor. Medium yang digunakan antara lain

MRSB (de man rogosa shape broth), MRSA (de man rogosa shape agar), bakto

agar, pewarnaan gram, gibson semi solid, ekstrak khamir, trypton, pepton, L-

arginin monokhlorida, dan beberapa medium penunjang seperti sukrosa,

galaktosa, rafinosa, fruktosa, arabinosa, laktosa, xilosa, maltosa, mannitol, dan

selulosa. Untuk pengujian konsentrasi sianida digunakan media MRSB, KCN,

buffer CN, kloramin t, asam barbiturik dan piridin.

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi inkubator,

autoklaf, bunsen, spektrofotometer, mikroskop, cawan petri, ose, pH meter,

tabung reaksi, labu erlenmeyer, gelas ukur, gelas piala, vorteks, mikropipet,

koloni counter, jangka sorong, timbangan dan batang pengaduk.

Metode Penelitian

Persiapan Sampel

Umbi singkong yang sudah diparut, dimasukkan ke dalam plastik sampai

padat. Kemudian ditutup rapat dan diinkubasi dalam kondisi anaerob selama tujuh

hari pada suhu kamar.

Isolasi Bakteri (Aryanyata 1991)

Isolasi bakteri dilakukan dengan mensuspensikan sebanyak 10 g sampel

kedalam 90 ml larutan 0.85% NaCl (pengenceran 10-1). Kemudian dibuat

pengenceran berseri sampai 10-6 kedalam larutan garam fisiologis, tiga seri dari

pengenceran terakhir diplating sebanyak 1 ml kedalam cawan petri steril.

Tambahkan 15-20 ml media MRS agar untuk melihat pertumbuhan koloni.

Lakukan penggoyangan secara mendatar dan setelah agar membeku, diinkubasi

pada suhu 370C selama 24-48 jam.

Koloni yang diamati dengan penampakan rata dan berwarna kuning

disekitar koloni. Koloni dengan warna dan ukuran yang berbeda digoreskan

kembali ke medium yang sama dengan goresan kuadran (pemurnian). Inkubasi

dilakukan pada kondisi yang sama dengan diatas. Penggoresan dilakukan sampai

didapat koloni yang seragam, sebanyak empat koloni yang murni dipilih dan

20

dilakukan pewarnaan gram dan uji katalase. Sebagai pembanding untuk mendapat

koloni yang sama, dilihat juga koloni yang didapat dari isolat murni Leuconostoc

mesenteroides yang diperoleh dari UGM. Keempat isolat murni dibuatkan stok

kultur dalam media MRSA yang ditambah CaCO3 dan disimpan suhu pada 5-7oC

selama dua bulan.

Identifikasi Bakteri (Fardiaz 1989)

Keempat isolat diidentifikasi sampai tingkat species, langkah pertama

yang dilakukan adalah mempersiapkan kultur kerja dari stok kultur. Caranya

adalah dengan menginokulasikan sebanyak 3-4 ose stok kultur kedalam MRS

broth dan diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam. Identifikasi dilakukan

terhadap ciri-ciri morfologis, fisiologis dan sifat-sifat biokimiawi bakteri.

Ciri- Ciri Morfologis

Ciri morfologis yang diamati adalah pewarnaan gram, katalase, motilitas

dan spora. Metode pengamatan sebagai berikut:

Pewarnaan Gram (Hadioetomo 1993)

Sebanyak 1 lup penuh air steril diletakkan pada kaca objek, kemudian dengan

jarum ose steril pindahkan sedikit isolat keatasnya, campurkan dan sebarkan

hingga rata dan dibiarkan olesan kering udara. Kaca objek dilalukan diatas api

bunsen, dimana kaca objek harus terasa agak panas bila ditempelkan pada

punggung tangan, atau sekali-kali kering anginkan di udara hingga terbentuk

lapisan kultur yang tipis dan merata.

Pewarnaan gram dimulai dengan meneteskan pewarna primer (kristal violet)

secara merata diatas kultur pada kaca objek, dan dibiarkan selama 1 menit.

Miringkan kaca objek untuk membuang kelebihan kristal violet, lalu dibilas

dengan air dari botol pijit dan sisa air diserap dengan menggunakan kertas serap.

Olesan ditetesi dengan lugol selama 2 menit, miringkan kaca objek seperti diatas

dan kemudian bilas dengan air, sisa warna yang masih ada dihilangkan dengan

pemucat warna etanol 95%, tetes demi tetes selama 10-20 detik sampai zat warna

kristal tidak terlihat lagi mengalir dari kaca objek. Cuci kembali dengan air dari

botol pijit, lalu tiriskan dan selanjutnya ditetesi dengan larutan safranin selama 10-

21

20 detik. Miringkan kaca objek dan kembali dibilas dengan air dari botol pijit,

tiriskan dan sisa air yang masih ada diserap dengan kertas serap. Preparat siap

untuk diperiksa dengan mikroskop.

Pemeriksaan dengan mikroskop dilakukan dengan menggunakan lensa

objektif minyak imersi, dimulai dari pembesaran yang terendah dan berangsur-

angsur diganti dengan yang tertinggi. Pengamatan dilakukan terhadap bentuk, cara

pengelompokan (tunggal, berpasangan, berantai, bergerombolan). Reaksi gram

positif ditandai dengan warna sel ungu atau biru dan gram negatif bewarna merah

muda.

Uji Katalase (Hadioetomo 1993)

Sebanyak 2 tetes H2O2 3% diletakkan diatas kaca objek yang bersih,

kemudian dipindahkan dengan lup inokulasi satu ose kultur isolat keatasnya dan

campurkan hingga merata. Timbulnya gelembung-gelembung gas CO2

menunjukkan uji katalase positif.

Uji Motilitas (Fardiaz 1989)

Secara aseptis dengan jarum ose yang diluruskan bagian ujungnya.

Sebanyak satu ose kultur ditusuk dalam media motiliti medium (MM) 0.5%.

Media tersebut diinkubasi pada suhu optimum 30oC selama 24 jam. Bila

pertumbuhan koloni penyebar maka uji motilitas bersifat positif dan bila

pertumbuhan hanya berupa garis saja maka maka uji motilitas bersifat negatif.

Uji Spora (Fardiaz 1989)

Air steril sebanyak 1-2 lup penuh diletakan kedalam kaca objek. Jarum

inokulasi mengambil sedikit biakan dan diletakan diatas tetesan air steril pada

kaca objek. Kultur yang diletakan diatas tetesan air steril, dicampurkan dan

disebarkan hingga rata. Olesan dibiarkan kering oleh udara, kaca objek yang telah

berisi biakan tersebut dilalukan diatas api bunsen hingga terasa panas. Olesan

kultur ditetesi malacite green dan dipanaskan diatas api selama 10 detik. Olesan

dibilas dengan air dari botol akuades, setelah kelebihan air pada kaca objek

diserap menggunakan kertas serap. Olesan bakteri ditetesi dengan sapronin, kaca

22

objek dimiringkan untuk membuang kelebihan safronin, lalu olesan dibilas

dengan air dari botol akuades, setelah itu kelebihan air pada kaca objek diserap

menggunakan kertas serap. Isolat diamati dengan menggunakan mikroskop.

Ciri-Ciri Fisiologis

Ciri fisiologis yang diamati adalah pertumbuhan pada berbagai suhu, pH

dan penambahan etanol 10%. Metode pengamatan sebagai berikut:

Pertumbuhan pada Suhu Berbeda (Hayakawa 1993)

Satu lup kultur isolat diinokulasikan kedalam tabung yang berisi medium

MRSB (masing-masing duplo). Diinkubasikan selama 7-14 hari dengan mengatur

suhu satu seri tabung pada suhu 15oC, 30oC, 37oC dan 45oC. Adanya pertumbuhan

terlihat dengan adanya kekeruhan pada tabung.

Pertumbuhan pada pH Berbeda (Hayakawa 1993)

Satu lup kultur isolat diinokulasikan kedalam tabung yang berisi medium

MRSB (masing-masing duplo). Diinkubasikan selama 7-14 hari pada suhu 30oC

dengan mengatur pH satu seri tabung pada pH 6.5 dan 4.8. Adanya pertumbuhan

terlihat dengan adanya kekeruhan pada tabung.

Pertumbuhan pada Etanol (Hayakawa 1993)

Satu seri tabung yang berisi MRSB ditambahkan etanol dengan

konsentrasi 10%, satu seri tabung MRSB dibuat sebagai kontrol. Selanjutnya

diinokulasikan 1 lup penuh kultur isolat dan inkubasi dilakukan pada suhu 30oC

selama 7-14 hari. Pertumbuhan dilihat dengan membandingkan antara kontrol

dan perlakuan, bila terjadi kekeruhan maka dinyatakan adanya pertumbuhan.

Ciri-Ciri Biokimiawi

Ciri biokimia yang diamati adalah produksi CO2 dari glukosa, produksi

amonia dari arginin, produksi dekstran dari sukrosa, fermentasi karbohidrat

(selulosa, sukrosa, laktosa, rafinosa, arabinosa, fruktosa, manitol, maltosa,

xilosa,galaktosa). Metode pengamatan sebagai berikut:

Produksi CO2 dari Glukosa (Nuraida 1988)

Media agar semi padat gibson dicairkan dan diturunkan suhunya sampai

45oC, tambahkan kira-kira 0.5 ml isolat kultur yang telah ditumbuhkan dalam

MRSB, selanjutnya tuangkan agar cair diatasnya kira-kira 2-3 cm untuk

23

menciptakan kondisi anaerobik. Inkubasi dilakukan pada suhu 30oC selama 2-5

hari. Reaksi positif ditandai dengan terbentuk gas yang ditandai dengan pecahnya

agar.

Produksi Amonia dari Arginin (Nuraida 1988)

MRSB arginin (MRSB+0.3% arginin) diinokulasikan dengan 1 ose kultur.

Kultur kemudian diinkubasikan suhu 30oC selama 2-5 hari. Kultur isolat

sebanyak 0.5-1 ml dimasukkan kedalam tabung reaksi kosong dan ditambahkan

reagen nessler dengan volume yang sama. Reaksi positif ditandai warna orange

kecoklatan setelah penambahan reagen nessler.

Produksi Dekstran dari Sukrosa ( Harrigan & McCance 1976)

Sebanyak 0.1 ml kultur isolat berumur 24 jam diinokulasikan kedalam

cawan petri steril, pada bagian atasnya dituangkan medium sukrosa agar digoyang

hingga merata. Kemudian diinkubasikan pada suhu 30oC selama 5 hari. Reaksi

positif ditandai dengan pertumbuhan pada cawan.

Fermentasi Karbohidrat (selulosa, sukrosa, laktosa, rafinosa, arabinosa,fruktosa, manitol, maltosa, xilosa,galaktosa) (Harrigan & McCance 1976).

Medium cair yang digunakan adalah MRSB tanpa gula dan meat ekstrak,

tambahkan 0.004% BCP (Brom Cresol Purple) sebagai indikator, kemudian

sterilisasi 121oC 15 menit. Siapkan larutan 10% gula-gula yang digunakan untuk

fermentasi karbohidrat dan sterilisasi dengan cara filtrasi dan tambahkan secara

aseptik hingga konsentrasi akhir 2%. Selanjutnya inokulasikan kultur yang telah

disegarkan dan inkubasi pada suhu 30oC selama 1-2 hari. Amati pertumbuhan

dengan terjadinya perubahan warna medium dari ungu menjadi kuning (reaksi

positif) dan jika didalam tabung terbentuk gas menunjukan isolat membentuk gas.

Uji Aktivitas β-glukosidase dan Konsentrasi Sianida

Keempat Isolat hasil identifikasi selanjutnya diuji untuk mengetahui

kemampuan aktivitas β-glukosidase dan konsentrasi sianida. Metode pengujian

adalah sebagai berikut:

24

Pengujian Aktivitas β-glukosidase

Substrat yang digunakan adalah p-NPG 0.1% (b/v). Ekstrak enzim, larutan

buffer sitrat pH 5.0 dan substrat diprainkubasi selama 10 menit pada suhu 50°C.

Setelah itu ekstrak enzim dengan pengenceran yang tepat sebanyak 0.5 ml

dicampurkan dengan 0.5 ml buffer sitrat dan 0.5 ml substrat. Larutan kemudian

diinkubasi pada suhu 50°C selama 60 menit. Setelah waktu inkubasi selesai,

ditambahkan larutan Na2CO

31M sebanyak 1.0 ml lalu divorteks dan diukur

spektrofotometer pada panjang gelombang 400 nm. Kontrol dibuat dengan

komposisi yang sama namun enzim dicampur setelah penambahan larutan

Na2CO

31M sebanyak 1.0 ml. Sebagai blanko digunakan 1 ml akuades, larutan

bufer 0.5 ml dan 1 ml Na2CO

3. Larutan standar dibuat dengan menggunakan

larutan p-nitrofenol. Kisaran konsentrasi standar adalah 0-30 μg/ml.

Satu unit (U) aktivitas enzim β-glukosidase adalah banyaknya enzim yang

dapat menghasilkan 1 μmol nitrofenol dalam 1 menit pada kondisi percobaan,

dengan perhitungan sebagai berikut :

Aktivitas β-glukosidase (U/ml) = (nitropenal sampel – kontrol) x faktor pengencer

waktu inkubasi x BM nitropenol

Pengujian Sianida

Isolat ditumbuhkan di tabung reaksi yang berisi 5 ml media MSB cair

yang telah ditambahkan larutan KCN dengan konsentrasi 50 ppm sebanyak 0.5 ml

dan inkubasi selama 24 jam pada suhu 30oC dengan kondisi anaerob untuk

dianalisis kandungan sianida. Koloni yang sudah ditumbuhkan disentrifugasi

dengan kecepatan 4 500 rpm selama 15 menit, sehingga terpisah supernatan dan

endapan. Sebanyak 0.1 ml supernatan diambil dengan menggunakan spuit dari

tabung perlakuan, lalu dimasukkan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan

akuades sebanyak 1.9 ml. Selanjutnya dimasukkan kedalamnya 2 ml buffer CN

dan 0.5 ml kloramin t 1%, divorteks dan didiamkan selama 2 menit. Setelah itu

ditambahkan 0.5 ml larutan asam barbiturik-piridin dan divorteks kembali serta

siap dibaca pada spektofotometer dengan panjang gelombang 578 nm.

Perhitungan dilakukan dengan membuat persamaan regresi dari larutan standar

KCN berdasarkan nilai absorbansi terhadap konsentasi KCN.

25

Analisis Data

Data yang diperoleh dari pengamatan morfologis, fisiologis, sifat

biokimiawi, aktivitas enzim β-glukosidase dan konsentrasi sianida dianalisis

secara deskriptif.

Hasil dan Pembahasan

Isolasi dan Identifikasi Bakteri Leuconostoc mesenteroides

Leuconostoc mesenteroides merupakan kelompok bakteri asam laktat yang

pertumbuhannya memerlukan nutrien yang lengkap dan ditemukan pada tanaman,

produk susu, daging dan berbagai produk fermentasi (Holzaptel & Schilinger

1992). Dalam penelitian ini telah berhasil diisolasi empat isolat bakteri yang

diduga Leuconostoc mesenteroides dari umbi singkong fermentasi dan satu isolat

bakteri Leuconostoc mesenteroides dari UGM. Identifikasi dilakukan terhadap

lima isolat berdasarkan pengamatan ciri morfologis, fisiologis dan sifat

biokimiawi bakteri. Data hasil identifikasi ini (Tabel 4) kemudian dicocokkan

dengan kunci identifikasi bakteri Bergey’S Manual of Determinative Bacteriology

( Holt et al. 1996).

Isolat A Isolat B Isolat C

Isolat D Isolat L

Gambar 2 Bentuk morfologis isolat umbi singkong fermentasi (pembesaran 40x)

Secara morfologis kelima isolat (A,B,C,D dan L) termasuk kelompok

bakteri Leuconostoc, hal ini terlihat dari bentuknya oval berantai (Gambar 2) dan

pewarnaan gram positif yang ditandai warna ungu. Ciri–ciri genus Leuconostoc

adalah reaksi gram positif dan bentuk selnya oval berpasangan dan kadang-

kadang terlihat oval berantai ( Holt et al. 1996; Lore et al. 2005; Santos et al.

26

2005). Bibiana (1988) menyatakan bahwa pewarnaan gram positif ditandai

dengan sel warna biru atau ungu dan gram negatif warna merah. Dinding sel

bakteri gram positif mengandung lipida yang rendah sehingga sewaktu

penambahan alkohol terjadi dehidrasi dan pengecilan lubang pori-pori, keadaan

ini menyebabkan zat warna tetap terikat dan tetap warna biru.

Tabel 4 Karakteristik morfologis, fisiologis dan biokimiawi isolat pada umbisingkong fermentasi

Karakteristik Isolat

A B C D L

Bentukovalberantai

ovalberantai

ovalberantai

ovalberantai

ovalberantai

Pewarnaan gram + + + + +Katalase - - - - -Motilitas - - - - -Spora - - - - -Pertumbuhan pada suhu

150C + + + + -

300C + + + + +

370C D d d d d

450C + - - + -Pertumbuhan padapH 4.8 dan 6.5 +/+ +/+ -/+ -/+ -/+etanol 10% - - - - -

Produksi CO2 dari glukosa + + + + +

Produksi NH3 dari arginin - - - - -Produksi dektran darisukrosa + + + + +Fermentasi karbohidratSukrosa + + + + +Selulosa + d + - dXilosa + + d - +Laktosa + - - d dRafinosa + - d + dMaltosa + + + d +Fruktosa + + + + +Mannitol - - + d -Arabinosa + + + + +Galaktosa + + + + +

(+) = >90% atau lebih strain positif (keruh); (-) = 90% atau lebih negatif (jernih); (d) = 10-90% strain positif(samar)

27

Katalase adalah enzim yang mengkatalisasikan penguraian hidrogen

peroksida (H2O2) menjadi air dan oksigen. Hidrogen peroksida bersifat toksik

terhadap sel karena bahan ini menginaktivasikan enzim dalam sel. Enzim ini

terdapat pada sel-sel yang mempunyai metabolisme aerobik. Bakteri anaerob tidak

mempunyai enzim katalase. Hasil pengamatan kelima isolat (A, B, C, D dan L)

menunjukkan katalase negatif (-) karena tidak terbentuknya gelembung udara

setelah isolat tersebut ditetesi H2O2 3%. Marlina (2008) melaporkan katalase

positif ditandai terbentuknya gelembung udara pada kaca objek sedangkan

katalase negatif tidak terbentuknya gelembung udara. Hemme et al. (2004)

menyatakan Leuconostoc merupakan bakteri fakultatif anaerob dengan ciri-ciri

adalah katalase negatif, yang ditandai tidak ada aktivitas enzim katalase dalam

mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen (Jay 1996).

Motilitas dari kelima isolat menunjukkan non motil. Menurut Hemme et

al. (2004), genus Leuconostoc bersifat non motil. Isolat non motil menunjukkan

bahwa bakteri tersebut tidak mempunyai flagella sebagai organ untuk bergerak.

Flagella adalah salah satu struktur utama diluar sel bakteri yang menyebabkan

terjadinya pergerakan (motilitas) pada sel bakteri. Flagella terbuat dari sub unit-

sub unit protein yang disebut flagelin. Bacillus dan Spirilum merupakan sebagian

besar spesies bakteri yang memiliki flagella sebagai alat geraknya, tetapi jarang

ditemukan pada bakteri yang berbentuk kokus (Pelczar & Chan 2005).

Kelima isolat dengan penambahan etanol 10% menunjukkan bahwa isolat

tersebut tidak mampu tumbuh yang ditandai reaksi negatif (-), selain itu juga

kelima isolat tidak berspora yang ditanda reaksi negarif (-). Menurut Holt et al.

(1996), Leuconostoc tidak mampu tumbuh dengan penambahan etanol 10% dan

tidak berspora (Hemme et al. 2004). Bibiana (1988) menyatakan bahwa spora

bersifat tahan terhadap kondisi lingkungan yang ekstrim dan adanya bahan kimia

beracun. Spora dibentuk oleh spesies bakteri yang mampu mengatasi lingkungan

yang tidak menguntungkan bakteri. Biasanya spesies bakteri yang termasuk dalam

genus Clostridium dan Bacillus memiliki spora. Spora yang terdapat didalam sel

disebut endospora. Pada sel bakteri ini hanya terdapat satu spora. Jika sel semakin

tua, maka sel vegetatif akan pecah sehingga endospora akan melepaskan dari sel

dan membentuk spora bebas. Spora bersifat tahan terhadap pewarnaan, akan tetapi

28

sulit untuk melepaskan zat warna yang terserap kedalamnya, sehingga tidak dapat

mengikat zat warna lain yang diberikan berikutnya. Zat warna yang sering

digunakan untuk warna spora dalah malachite green yang akan tetap terikat oleh

spora setelah pencucian dengan air.

Kelima isolat mampu tumbuh pada suhu 30oC yang ditandai reaksi positif

(+) dan kelihatan samar (d) pada suhu 37oC. Menurut Batt (1999) genus

Leuconostoc dapat tumbuh pada suhu 30oC dan terlihat masih samar pada suhu

37oC (Holt et al.1996). Leuconostoc merupakan kelompok bakteri mesofil yang

tumbuh pada kisaran suhu 20-45oC, dimana suhu optimum untuk pertumbuhannya

berkisar 20-30oC (Kusmiati & Malik 2002). Namun ada juga genus Leuconostoc

yang tidak tumbuh pada suhu 45oC (Elida 2002).

Suhu berpengaruh terhadap kehidupan bakteri dalam hal reaksi dan

metabolisme sel (Pirt 1975). Suhu yang terlalu tinggi dapat menyebabkan

denaturasi protein yang mengakibatkan kematian sel. Suhu yang terlalu rendah

akan mengurangi aktivasi enzim, sehingga pertumbuhan bakteri terganggu

(Cortezi et al. 2005). Suhu ekstrim diluar suhu optimum untuk pertumbuhan

organisme akan berakibat inaktifnya enzim atau fungsi struktur sel seperti

membran sel (Moat & Foster 2002). Peningkatan suhu 5-10oC diatas suhu

optimum dapat menyebabkan lisis dan kematian sel mikroorganisme (Lay 1994).

Kelima isolat mampu tumbuh pada pH 6.5 yang ditandai reaksi positif (+),

sedangkan pada pH 4.8 isolat A dan B dapat tumbuh yang ditandai reaksi positif

(+) dan isolat C, D dan L tidak tumbuh yang ditandai reaksi negatif (-).

Leuconostoc mampu tumbuh pada pH 6.5 (Drosinos et al. 2006), serta dapat dan

tidak tumbuh pada pH 4.8 tergantung spesies Leuconostoc (Holt et al.1996).

Derajat keasaman (pH) minimum dan maksimum bagi kebanyakan bakteri

berkisar antara pH 4 dan 9 (Schlegel 1994). Besarnya pH media pertumbuhan

memberikan pengaruh langsung pada permeabilitas sel dan aktivitas fisiologis

lainnya. Bila terjadi penyimpangan pH, pertumbuhan dan metabolisme bakteri

dapat terhenti. Pada umumnya bakteri asam laktat dapat bertahan pada pH 3.2,

beberapa diantaranya hanya mampu tumbuh pada kisaran pH 4.0-4.5 (Jay 1996).

Pengujian produksi CO2 dari glukosa yang bertujuan untuk membedakan

antara bakteri asam laktat homofermentatif dan heterofermentatif. Kelima isolat

29

tersebut menunjukkan reaksi positif (+) yang ditandai terbentuknya gas dengan

pecahnya agar. Menurut Jay (1996) bakteri heterofermentatif dapat menghasilkan

asam laktat, etanol dan CO2, sedang bakteri homofermentatif mengubah 95 %

glukosa atau heksosa lain menjadi asam laktat dan sejumlah kecil CO2 serta asam-

asam volatil, hal inilah yang menyebabkan golongan homofermentatif mampu

menghasilkan asam laktat dalam jumlah yang lebih besar dibandingkan dengan

golongan heterofermentatif. Leuconostoc mesenteroides termasuk dalam

kelompok bakteri heterofermentatif yang dapat memproduksi gas dari glukosa

(Ogier et al. 2008; Kihal et al. 2007).

Pengujian produksi amonia dari arginin bertujuan untuk membedakan

Lactobacilus dan Leuconostoc. Hasil pengamatan kelima isolat tersebut tidak

mampu menghasilkan NH3 dari arginin yang ditandai reaksi negatif (-). Keluarga

Leuconostoc mesenteroides tidak menghasilkan amonia dari arginin dan hanya

menghasilkan D isomer dari asam laktat (Tamang et al. 2008; Sengeun et al.

2009). Sedangkan pengujian produksi dekstran dari sukrosa bertujuan untuk

membedakan species dari genus Leuconostoc. Kelima isolat mampu menghasilkan

dekstran dari sukrosa yang terlihat adanya pertumbuhan pada cawan yang ditandai

reaksi positif (+). Menurut Sarwat et al. (2008) bakteri Leuconostoc

mesenteroides dapat memproduksi dekstran.

Berdasarkan kunci identifikasi bakteri Bergey’s Manual of Determinative

Bacteriology (Holt 1996), menunjukkan bahwa persentase pengujian fermentasi

karbohidrat yang secara berturut–turut isolat L (80%), Isolat isolat C (70%),

isolat B dan isolat D (60%) serta isolat A (50%) mendekati kategori kelompok

bakteri Leuconostoc mesenteroides. Menurut Zavaglia et al. (1998) terdapat

sedikit kesulitan dalam mengidentifikasi spesies bakteri asam laktat berdasarkan

fermentasi gula-gula, dimana terdapat hasil-hasil yang meragukan karena diamati

dengan kasat mata.

Aktivitas Enzim β-glukosidase dan Konsentrasi Sianida

Bakteri asam laktat seperti Leuconostoc mesenteroides dapat

memproduksi β-glukosidase yang berperan dalam proses hidrolisis glukosida

sianogenik. Hasil pengukuran aktivitas enzim β-glukosidase dan kemampuan

isolat dalam menurunkan sianida tertera pada Tabel 5.

30

Tabel 5 Rataan aktivitas enzim β-glukosidase dan konsentrasi sianida tanpa dandengan penambahan isolat yang diinkubasi selama 24 jam

No Isolat β-glukosidase (Unit/ml Konsentrasi Sianida (ppm)1 Kontrol 0.00 37.992 A 0.19 15.633 B 0.21 13.634 C 0.23 13.295 D 0.20 13.406 L 0.21 13.57

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa konsentrasi sianida dari kelima

isolat (A, B, C, D, dan L) lebih rendah dibandingkan dengan kontrol (tanpa isolat)

setelah diinkubasi selama 24 jam. Konsentrasi sianida yang rendah tersebut terjadi

karena adanya aktivitas enzim β-glukosidase yang dihasilkan oleh kelima isolat.

Pada penelitian ini aktivitas enzim β-glukosidase secara berturut-turut yaitu isolat

A (0.19 unit/ml), isolat B (0.21 unit/ml), isolat C (0.23 unit/ml), isolat D (0.20

unit/ml) dan isolat L (0.21 unit/ml), dan ada kecenderungan semakin tinggi

aktivitas enzim β-glukosidase pada penelitian ini maka semakin rendah

konsentrasi sianida yang dihasilkan oleh kelima isolat terutama pada isolat C,

dimana secara morfologis, fisiologis dan biokimiawi (Tabel 4) isolat tersebut

mempunyai kemiripan terbesar dengan bakteri Leuconostoc mesenteroides setelah

dicocokkan dengan kunci identifikasi bakteri Bergey’s Manual of Determinative

Bacteriology. Kobawila et al. (2005) menyebutkan bahwa bakteri asam laktat

seperti Leuconostoc mesenteroides dan Lactobacillus dapat memproduksi β-

glukosidase yang berperan dalam proses hidrolisis glukosida sianogenik. Lei et al.

(1999) melaporkan bahwa strains Lactobacilus plantarum, Leuconostoc

mesenteroides, Candida tropicalis dan Penicillium sclerotiorum mampu

mendegradasi glukosida sianogenik. Dimuth et al. (2004) menjelaskan bahwa

enzim β-glukosidase berperan dalam proses hidrolisis glukosida sianogenik dalam

bentuk linamarin akan dihidrolisis oleh enzim β-glukosidase membentuk B-D

glukopironase dan aseton sinohidrin. Kemudian sianohidrin dengan bantuan

enzim hidroksinitril liase akan diubah menjadi aseton dan sianida (Yusuf et al.

2006; Santana et al. 2002). Selanjutnya sianida dengan bantuan beberapa enzim

yaitu sianase, sianida hidrotase dan sianida dihidrotase akan diubah menjadi

CO2, amonia dan asam format yang berperan dalam aktivitas metabolisme untuk

31

pertumbuhan bakteri (Gufta et al. 2009). Semakin tinggi aktivitas β-glukosidase

yang dihasilkan oleh bakteri Leuconostoc mesenteroides maka semakin sedikit

sianida yang dihasilkan untuk proses detoksifikasi (Gueguen et al. 1997).

Gambar 3 Hidrolisis linamarin (Yusuf et al. 2006)

Simpulan

Isolat C mempunyai kemiripan terbesar dengan bakteri Leuconostoc

mesenteroides dengan akvititas enzim β-glukosidase yang tinggi dan konsentrasi

sianida yang rendah.

Daftar Pustaka

Amoa-Awua WKA, Appoh F, Jakobsen M. 1996. Lactic acid fermentation ofcassava into agbelima. Int. J. Food Microbiol.31, 87– 98.

Aryanyata RW, Fleet GH, Buckle KA. 1991. The accurrence and growth ofmicroorganism during the fermentation of fish sausage. J food Microbial.13.45-50.

Batt CA. 1999. Lactococcus. Didalam Robinson RK, Batt CA, Patel PD. Editor.Encyclopedia of Food Microbiology II. London. Academic Pr.

Bibiana. WL, Sugyo H. 1988. Mikrobiologi. Pusat Antar Universitas BioteknologiInstitut Pertanian Bogor. Bogor.

Cortezi M, Monti R, Cortiero J. 2005. Temperature effect on dextransucraseproduction by Leuconostoc mesenteroides FT 045 B isolated from Alcoholand Sugar Mill Plant. Afr J of Biotechnol.4(3): 279-285.

Dimuth S, Garzaon DA, White W, Sayre RT. 2004. Over –expression ofhyroxynitrile lyase in transgenic cassava roots accelerates cyanogenesisand food detoxification. J. Plants Biotec.2:37-43.

Drosinos EH, Mataragas M, Metaxopoulos J. 2006. Modeling of growth andbacteriocin production by Leuconostoc mesenteroides E131. Meat Sci. 74:690–696.

32

Elida M. 2002. Propil Bakteri asam laktat dari dadih yang difermentasi dalamberbagai jenis bambu dan potensinya sebagai probiotik. [Tesis]. ProgramPascasarjana. Institut Pertanian Bogor.

Fardiaz S. 1989. Mikrobiologi Pengolahan Pangan. Institut Pertanian Bogor.Bogor.

Gueguen YPC, Labrot P, Arnoud P, Galzy. 1997. Purification and characterizationof an intracellular β-glukosidase from a new strain of Leuconostocmesenteroides isolated from cassava. J Appl Microb. 82:469-476.

Hadioetomo RS .1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta. PenerbitGramedia.

Harigan WF, McCane. 1976. Laboratory Methods in Food and DairyMicrobiology. London: Academic Pr.

Hayakawa K.1993. Classification and actions af food microorganism withparticular reference to fermented foods and lactic acid bacteria. Di dalam :Nakazawa Y, Hosono A, editor. Functions of Fermented Milk Challengesfor the Health Science. London.: Elsevier Science.

Hemme D, Catherine, Scheunemann F. 2004. Leuconostoc, characteristics, use indairy technology and prospects in functional foods. Int Dairy J.14: 467–494.

Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT, Williams ST. 1996. Bergey’s Manualof Determiantive Bacteriology. Edisi ke-9 Baltimore, Maryland: Williamand Wilkins Campany.

Holzapfel WH, Schillinger U. 1992. The genus Leuconostoc. In: Barlows, A.,Truper HG, Dworkin M, Harder W, Schleifer KH (Eds.). The ProkaryotesVol. 2. Springer. Berlin.1509–1534.

Gupta N, Balomajumder C, Agarwal CK. 2009. Enzymatic mechanism andbiochemistry for cyanide degradation: A review. Journal of HazardousMaterials. xxx xxx–xxx

Jay JM.1996. Modern Food Microbial. Chapman and Hill. New York. USA.

Kihal M, Prevost H, Henni DE, Benmechernene Z, Diviès C. 2007. CarbonDioxide Production by Leuconostoc mesenteroides Grown in Single andMixed Culture with Lactococcus lactis in Skimmed Milk. World J ofDairy & Food Sci. 2(2): 62-68.

Kobawila SC, Louembe D, Keleke S, Hounhouigan J, Gamba G. 2005, Reductionof the cyanide during fermentation of cassava roots and leaves to producebikedi and ntoba, Two Food Products From Kongo. Afr J Biotech.4(7):689-696.

Kusmiati, Malik A. 2002. Aktivitas bakteriosin dari bakteri Leuconostocmesenteroides pbac1 pada berbagai media. Makara Kesehatan. 6(1):1-7.

Lay BW. 1994. Analsisis mikroba di laboratorium. Rajawali Grafindo Persada.Jakarta.

33

Lei V, Amoa-Awua WKA, Brimer L. 1999. Degradation of cyanogenicglycosides by Lactobacillus plantarum strains from spontaneous cassavafermentation and other microorganisms. Int J of Food Microbiol. 53:169–184.

Lore TA, Samuel K. Mbugua, Wangoh J. 2005. Enumeration and identificationofmicroflora in suusac, a Kenya traditional fermented camel milkproduct. Lebensm.-Wiss. u.-Technol. 38: 125–130.

Marlina 2008. Identifikasi bakteri Vibrio parahaemolitycus dengan Metodebiologi dan deteksi gen ToxR secara PCR. J Sains dan Teknol Farm.13(1): 1-7.

Moat A, Foster GJW. 2002. Microbiology Physiology. John Willey and Sons Inc.

Nuraida L. 1988. Studies on microorganism isolated from pozol, a Mexicanfermented maize dough. University of Reading : Fakulty of Agricultureand Food Departement of Food science and Technology.

Obilie EM, Tano-Debraha K, Amoa-Awuab WK. 2004. Souring and breakdownof cyanogenic glucosides during the processing of cassava into akyeke. IntJ of Food Microbiol. 93 : 115– 121.

Ogier JC, Casalta E, Farrokh, Saihi A. 2008. Safety assessment of dairymicroorganisms: The Leuconostoc genus. International Journal of FoodMicrobiology. 126: 286–290.

Pelczar MJ dan Chan ECS. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. R.S. Hadioetomo,T. Imas, SS Tjitrosomo dan SL Angka (pen.). UI Press. Jakarta.

Pirt SJ. 1975. Principles of microbe and cell cultivation. Black well ScientistPublication.

Sarwat F, Qader SAU, Aman A, Ahmed N. 2008. Production & Characterizationof a Unique Dextran from an Indigenous Leuconostoc mesenteroidesCMG713. Int J Bio Scs. 4(6):379-386.

Santos EM, Jaimeb I, Rovirab J, Lyhsc U, Korkealac H, Bjorkrothc J.2005Characterization and identification of lactic acid bacteria in morcilla deBurgos’’. Int J Food Microbiol. 97: 285–296.

Santana MA, Valeria V, Juan M, Rafael RA. 2002. Linamarase Expression inCassava Cultivars with Roots of Low- and High-Cyanide Content. PlantPhysiol. 129(4): 1686–1694.

Schlegel HG. 1994. Mikrobiologi Umum. Terjemahan Gama Unversity Press.Yogyakarta.

Sengun IY, Nielsen DS, Karapinar M, Jakobsen M. 2009. Identification oflactic acid bacteria isolated from Tarhana, a traditional Turkish fermentedfood Int J Food Microbiol 135:105–111.

Tamang B et al. 2008. Phenotypic and genotypic identification of lactic acidbacteria isolated from ethnic fermented bamboo tender shoots of NorthEast India Int J Food Microbiol. 121: 35–40.

34

Yusuf UF et al. 2006. An in vitro inhibition of human malignant cell growth ofcrude water extract of cassava (Manihot esculenta Crantz) andcommercial linamarin. Jl Sci Technol.28 (Suppl.1): 146-155.

Zavaglia AG, Kociubinski G, Perez P, De-Antoni G. 1998. Isolation danCharacterization of Bifidobacterium strain for probiotic formulation. JlFood Protect. 61(7):865-873.