Upload
others
View
3
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Isolasi, Pemurnian, dan Karakterisasi Kolagen dari Kulit Babi serta Analisis Kandungan Glisin, Prolin, dan Hidroksiprolin secara
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi - Fluoresensi
Ayu Aditya Andayani, Harmita, dan Baitha Palanggatan Maggadani
Fakultas Farmasi, Universitas Indonesia, Kampus UI, Depok, 16424, Indonesia
E-mail: [email protected]
Abstrak
Kolagen merupakan bahan baku tinggi protein, dimana hampir semua asam amino terkandung didalamnya dengan kandungan terbesarnya adalah glisin, prolin, dan hidroksiprolin. Pada penelitian ini, kolagen diisolasi, dimurnikan, dan dikarakterisasi dari kulit babi (Sus scrofa domesticus), kemudian dilakukan pencarian kondisi analisis optimum untuk mendapatkan metode penetapan kadar asam amino glisin, prolin, dan hidroksiprolin pada sampel kolagen kulit babi. Metode terbaik untuk mengisolasi kolagen dari kulit babi menggunakan perendaman dalam NaOH 0,1 M dan diekstraksi dengan asam asetat 0,5 N, dipresipitasi dengan NaCl 0,9M kemudian disentrifugasi, dialisis sebagai proses pemurnian, dan terakhir di freeze-drying untuk memperoleh bentuk padatnya. Karakterisasi yang dilakukan meliputi uji organoleptis, pH, analisis gugus fungsi, kadar air, kadar abu, viskositas, dan pewarnaan Casson’s trichrome pada jaringan kolagen. Selanjutnya kolagen dihidrolisis dengan HCl 6N selama 24 jam lalu diderivatisasi menggunakan pereaksi 9-Fluorenilmetoksikarbonil klorida (FMOC-Cl). Sampel selanjutnya dianalisis menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dengan kolom C-18® dan detektor fluoresensi pada panjang gelombang eksitasi 265 nm dan panjang gelombang emisi 320 nm. Fase gerak yang digunakan dapar asetat (pH 4,2)-asetonitril (55:45) dengan laju alir 0,8 mL/menit. Hasil menunjukkan kadar rata-rata glisin, prolin, hidroksiprolin berturut-turut adalah 33,663% ± 0,215%; 12,333% ± 0,128% ; dan 11,303% ± 0,354%.
Isolation, Purification, and Characterization of Porcine Skin Collagen and Analysis Component of Glycine, Proline, and Hydroxyproline by High Performance Liquid
Chromatography - Fluorescence
Abstract Collagen is a high protein feedstock with almost all amino acids are contained in it, but the greatest content of all
are glycine, proline, and hydroxyproline. In this study, collagen was isolated, purified, and characterized from porcine skin (Sus scrofa domesticus), then determination of the optimum conditions analysis on amino acid in
collagen were performed to obtain a method for determination of glycine, proline, and hydroxyproline content in porcine skin collagen samples. The best method to isolate collagen was using 0.1 M NaOH, extracted with 0.5 N Qacetic acid, precipitated with 0.9M NaCl, then collagen was centrifuged, dialysed to purification, and freeze-dryed to get the solid form. The characterization tests includes organoleptic, pH, Fourier Transform Infra Red
analysis, moisture content, ash content, viscosity, and Casson's trichrome staining on collagen tissue. After that, collagen was hydrolized using HCl 6N for 24 hours then derivatized using 9-Fluorenylmethylcarbonyl chloride.
Collagen was analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC) with C-18® column and fluorescence detector at excitation wavelength of 265 nm and emission wavelength of 320 nm. Mobile phase used was acetic buffer (pH 4.2)-acetonitrile (55:45) with flow rate 0.8 mL/min. The results showed average
contents of glycine, proline, and hydroxyproline were 33,663% ± 0,215%; 12,333% ± 0,128% ; and 11,303% ± 0,354%.
Keywords:porcine skin collagen, amino acid, glycine, proline, hydroxyproline, derivatization, HPLC, fluorescence, optimization, component
Isolasi, Pemurnian ..., Ayu Aditya Andayani, FFAR UI, 2017
Pendahuluan
Selama ribuan tahun, sebelum polimer sintetis berbasis minyak ditemukan, kolagen
merupakan material organik yang dominan digunakan untuk membuat sepatu, pakaian, lem,
pengikat, filamen, benang bedah, dan aplikasi lainnya secara universal. Hingga saat ini,
permintaan terhadap kolagen dan bentuk terdenaturasinya, yaitu gelatin semakin meningkat.
Produksi kolagen kini dianggap sebagai salah satu biomaterial yang sangat bermanfaat karena
berperan pada berbagai aplikasi industrial yang digunakan secara luas pada industri makanan,
pakaian, kosmetik, farmasi, kesehatan, dan biomedik (Meyer, M., Schröpfer, M., 2013).
Kolagen adalah satu-satunya protein yang paling berlimpah jumlahnya yang dapat
ditemukan pada hewan dan meliputi hampir 30% dari total protein pada jaringan dan organ.
Tingginya peminatan dan permintaan terhadap kolagen terutama pada industri makanan
dikarenakan tingginya kadar protein yang terkandung dan karakteristik fungsional kolagen
mulai dari kapasitas absorbsinya terhadap air, kemampuannya dalam membentuk gel, dan
kemampuannya dalam membentuk dan menstabilisasi emulsi. Pada industri farmasi dan
biomedik, kolagen memiliki beberapa pengaplikasian yaitu sebagai transpor suatu obat,
protein, gen, dan sebagai pengganti pada kulit manusia, pembuluh darah, dan ligamen
(Gómez-Guillén et al., 2011).
Pada prinsipnya penggunaan bahan mentah dalam produksi kolagen dapat diperoleh
dari beberapa sumber hewani seperti dari tulang, kulit, tendon, jaringan ikat mamalia, ikan,
dan unggas. Kolagen dari sapi dan babi merupakan sumber kolagen yang paling banyak
digunakan karena harganya yang murah, lebih mudah didapat, dan jumlah kandungannya
yang sangat besar.
Sejak tahun 2010, peminatan dan permintaan terhadap kolagen babi semakin
meningkat di industri kosmetik dan kecantikan sebagai sediaan krim wajah dan sleeping
packs yang memiliki khasiat tinggi dalam menghidrasi kulit, menjaga kelembapan kulit, dan
menghilangkan garis-garis halus yang disebabkan oleh penuaan dan kekeringan (Yang, H. &
Shu, Z., 2014).
Hal ini menjadi dasar peneliti untuk melakukan produksi terhadap kolagen babi
melalui ekstraksi dan isolasi dari kulit babi. Pada penelitian ini, isolasi dan pemurnian
kolagen mengacu pada metode yang dilakukan Lestari tahun 2007 dengan modifikasi. Mula-
mula dilakukan tahap pre-treatment bahan baku dengan perendaman pada NaOH 0,1N,
kemudian diekstraksi dengan asam asetat 0,5M dan dilanjutkan salting out dengan NaCl 0,9N
dan sentrifugasi. Tahap pemurnian dilakukan melalui dialisis dan diikuti freeze-dry untuk
memperoleh bentuk padat kolagen. Kolagen yang telah diisolasi dikarakterisasi melalui uji
Isolasi, Pemurnian ..., Ayu Aditya Andayani, FFAR UI, 2017
organoleptis, kadar air, kadar abu, pH, viskositas, analisis gugus fungsi, dan pewarnaan
casson’s trichrome.
Selanjutnya dilakukan analisis terhadap kadar asam amino utama glisin, prolin, dan
hidroksiprolin yang terkandung dalam kolagen babi. Prolin dan hidroksiprolin yang
terkandung pada kolagen merupakan jenis asam amino sekunder yang tidak memiliki gugus
kromofor, sehingga perlu diderivatisasi dengan pereaksi fluorogenik agar dapat membentuk
senyawa berfluoresensi pada daerah sinar ultraviolet/tampak (UV/Vis). Pada penelitian ini
dipilih pereaksi 9-Fluorenilmetoksikarbonil klorida (FMOC-Cl) yang mampu menderivatisasi
asam amino primer dan sekunder sekaligus. Selanjutnya dilakukan penelitian lebih lanjut
menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi yang lebih efektif dan selektif dalam
pemurnian dan kuantifikasi asam amino yang dilengkapi dengan detektor fluoresensi.
Tinjauan Teoritis
Kolagen
Kolagen merupakan suatu jenis protein fibrosa struktural yang terdapat pada matriks
ekstraseluler dan jaringan ikat hewan (Ramshaw, et al., 2009). Pada mamalia, burung, dan
ikan, kolagen merupakan protein utama penyusun jaringan kulit, tendon, ligamen, tulang
rawan, dan jaringan ikat pada umumnya. Molekul dasar pembentuk kolagen disebut
tropokolagen dimana unit strukturalnya terdiri dari tiga rantai polipeptida yang tersusun dalam
bentuk triple helix. Urutan triple helix sering digambarkan sebagai pola berulang Gly-X-Y,
dimana X adalah prolin dan Y adalah hidroksiprolin.
Kolagen pada Babi
Pada babi, kolagen banyak bersumber dari kulit, tulang, dan tendonnya, dimana
ketiga sumber tersebut kerap digunakan sebagai sumber kolagen tipe I dan tipe III, sementara
kolagen tipe IV dapat diperoleh dari villi plasenta babi dan kolagen tipe II dapat diperoleh
dari kartilago artikulernya (Silvipriya et al., 2015). Kolagen pada kulit babi terkandung di
lapisan dermis bersamaan dengan serat elastin didalam sebuah matriks amorf di
mukopolisakarida (Summerfield, Meurens, Ricklin, 2015).
Kolagen pada babi sering digunakan untuk keperluan industri kosmetik dan makanan,
karena kolagen dari babi memiliki komponen yang hampir sama dengan kolagen yang berasal
dari manusia sehingga kolagen babi tidak menimbulkan reaksi alergi maupun iritasi ketika
digunakan. Berdasarkan penelitian yang dilakukan Chang, P., Chang, S., Chen, H., & Ho, Y.
(2003), menunjukkan bahwa terdapat perbedaan komposisi kandungan kolagen yang
Isolasi, Pemurnian ..., Ayu Aditya Andayani, FFAR UI, 2017
bersumber dari babi dengan kolagen dari hewan lainnya seperti sapi dan ayam, dimana pada
babi memiliki kandungan kolagen yang lebih tinggi dari yang terkandung pada sapi dan ayam.
Asam Amino pada Kolagen
Komposisi kolagen yang diisolasi dari sumber hewani seperti dari tulang dan kulit
babi didominasi oleh asam amino glisin, prolin,dan hidroksiprolin (McCullaugh, et al., 2010).
Ketiga asam amino tersebut memiliki kadar masing-masing glisin 33%, prolin 12%, dan
hidroksiprolin 10% (Szpak&Paul, 2011).
Pada kolagen, glisin dan prolin berfugsi menjaga integritas struktural kolagen.
Sementara gugus OH pada hidroksipolin akan berpartisipasi dalam pembentukan ikatan
hidrogen antar rantai pada triple helix kolagen yang memperkuat stabilitas struktur kolagen.
Tingginya kandungan glisin, prolin, dan hidroksiprolin akan mencegah konformasi α-helix
dan β-sheet, sehingga kandungan ketiganya sangat penting dan sangat berperan dalam
meningkatkan stabilitas kolagen. Kolagen dengan kandungan asam amino tinggi sangat baik
digunakan sebagai bahan baku dalam industri karena memiliki kestabilan suhu yang tinggi
(Jamilah et al., 2013).
Proses Ektraksi dan Isolasi
Ekstraksi untuk kolagen dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu ekstraksi
konvensional menggunakan solvent dan ekstraksi enzimatis. Ekstraksi konvensional biasanya
dilakukan dengan cara maserasi, yaitu proses perendaman suatu bahan baku selama beberapa
waktu, umumnya 24 jam dengan menggunakan satu atau campuran pelarut (Hartati, 2010).
Sementara, isolasi merupakan proses pemisahan dan pemurnian suatu substansi menjadi
komponen-komponen secara kimiawi serta menghilangkan pengotornya. Proses isolasi
kolagen dari bahan baku meliputi tiga tahapan utama, yaitu tahap pre-treatment pada bahan
baku, tahap ekstraksi, dan tahap pemurnian kolagen (Lestari, 2007).
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi adalah suatu metode pemisahan komponen-komponen campuran
diantara dua fase yang didasarkan pada perbedaan distribusi, yaitu fase diam dan fase gerak.
Berdasarkan fase gerak yang digunakan, kromatografi dibedakan menjadi dua golongan besar
yaitu kromatografi gas dan kromatografi cair (McNair dan Miller, 1998; Braithwaite dan
Smith, 1999).
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan tipe kromatografi cair yang dapat
memisahkan dan menganalisis suatu senyawa secara kualitatif dan kuantitatif dalam suatu
senyawa yang terlarut. KCKT merupakan metode yang tidak desktruktif dan memiliki
kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi (T.Kupiec, 2004). Secara umum instrumentasi
Isolasi, Pemurnian ..., Ayu Aditya Andayani, FFAR UI, 2017
dalam KCKT meliputi pompa, injektor, kolom, detektor, integrator dan sistem pengumpul
data.
Detektor memiliki fungsi mendeteksi atau mengidentifikasi komponen yang ada
dalam eluat dan mengukur jumlahnya. Jenis detektor yang biasa digunakan dalam KCKT
adalah detektor fluoresensi, detektor UV, detektor indeks bias (RID), detektor ionisasi nyala
(FID), detektor elektrokimia (ECD), detektor evaporation light scattering (ELSD) dan
detektor radioaktif (Harmita, 2006). Detektor fluoresensi merupakan detektor yang paling
sensitif dan selektif, dimana ia 100 kali lebih sensitif daripada detektor UV. Namun detektor
fluoresensi hanya dapat digunakan pada senyawa yang dapat berfluoresensi pada daerah sinar
ultraviolet/tampak.
Metode Penelitian
Alat
Kromatografi cair kinerja tinggi LC 20AT (Shimadzu, Japan) yang dilengkapi dengan
pompa, kolom YMC-Triart®C18, detektor fluoresensi RF 20A (Shimadzu, Japan), injektor
manual, dan pemroses data (LC-Solution), syringe KCKT (SGE, Australia), Spektrofotometer
UV-Vis (Shimadzu, UV-1601), FTIR (Shimadzu 8400S yang dilengkapi dengan DRS-
8000),Ultrasonic (LC 20 H), Oven (Heraeus), Tanur (Cole-Parmer, Chemoscience),
Sentrifugator (NF 400R), pH meter (Eutech Instruments pH 510), Freeze-dryer (Eyela FDU
1200), Vortex (WiseMix VM-10), pipet mikro (Propete), Viskometer Ostwald (Schott
Gerate), Milipore 45 µm (Whatman), timbangan analitik, ultrasonic (LC 20 H), labu ukur,
dialisis tubing (cellulose membrane) 12 kDa (Sigma), dan alat-alat gelas kimia yang umum
digunakan dalam analisis kuantitatif.
Bahan
Kulit Babi yang diperoleh dari Pasar tradisional, Pasar Agung, Depok, Undenaturated
Collagen-II (Inter Health, Nutraceuticals Incorporated), Standar Asam Amino Glisin, Prolin,
dan Hidroksiprolin (Sigma-Aldrich), 9-Fluorenilmetoksikarbonil klorida (FMOC-Cl)
(Hangzhou Dingyan Chem Co. Ltd), pewarna Casson’s trichrome (Laboratorium Patologi,
PSSP IPB), Reagen pro HPLC: asetonitril, metanol, NaOH, asam borat, asam asetat glasial,
natrium asetat anhidrat, HCl, NaCl (Merck), Aqua Pro Injection (Ikapharmindo Putramas),
Aquadest (Brataco).
Isolasi, Pemurnian ..., Ayu Aditya Andayani, FFAR UI, 2017
Pembuatan Larutan Standar Kolagen
Ditimbang 50 mg standar kolagen kemudian dilarutkan dalam 5 ml HCl 6N dan
dihidrolisis dalam oven pada suhu 110°C selama 22, 23, 24, dan 25 jam. Selanjutnya
dilarutkan dalam dapar asetat (pH 4,2) dan diencerkan hingga konsentrasi 10 µg/mL.
Pembuatan Larutan Stok Asam Amino
Ditimbang standar asam amino glisin, prolin, dan hidroksiprolin masing-masing 50
mg kemudian dilarutkan dalam 100 mL HCl 0,1 M. Selanjutnya masing-masing larutan
diencerkan hingga diperoleh konsentrasi 10 µg/mL.
Pembuatan Larutan 9-Fluorenilmetoksikarbonil klorida (FMOC-Cl)
Larutan 15 mM FMOC-Cl dibuat dengan menimbang 39 mg FMOC-Cl (BM 258,7
g/mol), kemudian dilarutkan dengan 10 ml asetonitril, encerkan hingga diperoleh konsentrasi
1,5 mM.
Pembuatan Dapar Borat pH 9
Dapar borat 100 mM disiapkan dengan menimbang 0,0618 gram asam borat lalu
ditambahkan 100 mL aquabidest. Selanjutnya dilakukan pengenceran hingga diperoleh
konsentrasi 10 µg/mL, kemudian cek pH hingga mencapai pH 9 dengan menambahkan NaOH
6N tetes demi tetes.
Pembuatan Dapar Asetat
Larutan dapar asetat 15 mM dibuat dengan menimbang 1,6 gram natrium asetat
anhidrat kemudian dilarutkan dalam 400 ml aquadest. Selanjutnya dilakukan adjust pH
dengan asam asetat glasial P hingga diperoleh pH 4,2. Dapar asetat yang telah jadi disaring
dengan kertas saring Whatman No. 45.
Langkah Kerja
Pre-treatment Bahan Baku
Bahan baku kulit babi dicuci dalam air dan dibersihkan lemaknya dengan pisau secara
manual kemudian dipotong kecil-kecil dengan ukuran ± 1x1 cm2. Selanjutnya direndam
dalam NaOH 0,1 N dengan perbandingan 1:5 selama tiga hari dengan dilakukan penggantian
pelarut setiap harinya.
Ekstraksi Kolagen dari Kulit Babi
Ekstraksi sampel dilakukan dengan merendam kulit babi yang telah dipotong kecil-
kecil ke dalam asam asetat 0,5 M selama 3 hari, selanjutnya filtrat diambil (filtrat 1). Residu
kulit babi direndam kembali dalam larutan asam asetat 0,5M baru selama 3 hari dan filtrat
diambil kembali (filtrat 2). Filtrat 1 dan Filtrat 2 disimpan dalam lemari pendingin selama 1
Isolasi, Pemurnian ..., Ayu Aditya Andayani, FFAR UI, 2017
hari kemudian dicampur dan dilakukan salting out dengan NaCl 0,9 M selama semalam.
Selanjutnya larutan disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 20 menit pada suhu
4°C. Endapan yang terbentuk diambil kemudian dilarutkan pada asam asetat 0,5 M.
Pemurnian Kolagen
Proses pemurnian dilakukan dengan mendialisis kolagen dalam membran selofan
dengan asam asetat 0,1 M pada perbandingan 1:10 dari volume larutan kolagen selama 1 hari,
kemudian dilanjutkan penggantian pelarut setiap hari selama dua hari dengan aquadest.
Kolagen hasil dialisis kemudian diliofilisasi (freeze-dry) untuk memperoleh bentuk padatnya.
Karakterisasi Kolagen Kulit Babi
Organoleptis
Uji organoleptis dilakukan dengan memeriksa penampilan, warna dan bau dari
kolagen yang diisolasi dari kulit babi.
Analisis Gugus Fungsi dengan FTIR
Ditimbang 200 mg KBr dan 2 mg kolagen, campur keduanya dan digerus hingga
homogen. Campuran diletakkan pada disk. Disk diletakkan pada DRS-8000 alat FTIR dan
diukur pada bilangan gelombang 4000-400 cm-1, selanjutnya spektrum IR akan muncul.
Uji pH (AOAC 2005)
Sampel dan standar kolagen masing-masing ditimbang 1 gram dan dilarutkan dalam
aquadest 70 ml. Nyalakan alat pH meter, elektroda dicelupkan ke dalam masing-masing
larutan hingga diperoleh nilai pH yang stabil.
Pewarnaan Casson’s trichrome
Kolagen hasil isolasi diletakkan pada gelas obyek kemudian direndam dalam larutan
Cassons trichrome selama 5 menit, dicuci dengan air selama 3-5 detik dan air diserap dengan
kertas saring hingga kering. Selanjutnya dilakukan dehidrasi cepat dalam alkohol 100%,
dijernihkan dalam silol, kemudian dilekatkan dengan kaca penutup. Pengamatan dilakukan
dengan mikroskop cahaya perbesaran obyektif 10x.
Uji kadar air (AOAC 2005)
Botol timbang kaca ditimbang kemudian dikeringkan dalam oven 105°C selama 1
jam. Botol dimasukkan dalam desikator 5 menit dan ditimbang kembali hingga bobot tetap
(A). Masukkan 1 gram sampel ke dalam botol, lalu timbang (B). Botol timbang berisi sampel
dioven pada suhu 105°C selama 5-6 jam, kemudian masukkan desikator, dan ditimbang
kembali (C). Kadar air (%) dihitung berdasarkan rumus : !!!!!!
x 100%
Isolasi, Pemurnian ..., Ayu Aditya Andayani, FFAR UI, 2017
Uji kadar abu (AOAC 2005)
Cawan ditimbang lalu dikeringkan dalam oven pada suhu 105°C selama 30 menit.
Cawan dimasukkan dalam desikator 5 menit dan ditimbang kembali hingga bobot tetap.
Masukkan 1 gram sampel ke cawan lalu dibakar diatas kompor listrik sampai tidak berasap.
Selanjutnya masukkan tanur pengabuan dengan suhu 600°C selama 7 jam. Setelah itu cawan
dan sampel dimasukkan ke dalam desikator lalu ditimbang dan dihitung kadar abunya.
Uji viskositas
Larutan sampel kolagen dibuat pada konsentrasi 0,5% dalam aquadest lalu dilarutkan
dalam air panas. Lakukan pengukuran menggunakan Viskometer Ostwald. Pengujian
dilakukan tiga kali pada sampel yang sama.
Proses Derivatisasi Asam Amino
Proses derivatisasi asam amino dilakukan pada suhu ruang menggunakan prosedur
pre-kolom. Diambil 300 µL larutan kolagen lalu ditambahkan 300 µL dapar borat 10 mM pH
9 dan 300 µL FMOC-Cl 1,5 mM. Larutan uji disuntikkan sebanyak 20 µL ke alat KCKT.
Penentuan Kondisi Analisis Optimum
Penetapan panjang gelombang optimum analisis
Larutan standar kolagen yang sudah diderivatisasi dilakukan percobaan untuk
menentukan panjang gelombang emisi pada 320, 325, dan 330 nm. Sedangkan penentuan
panjang gelombang eksitasi dilakukan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada larutan
standar asam amino hidroksiprolin, glisin, dan prolin.
Pemilihan komposisi fase gerak
Komposisi fase gerak yang diuji coba adalah dengan dapar asetat (pH 4,2)-asetonitril
pada perbandingan (55:45); (60:40); dan (65:35).
Pemilihan laju alir fase gerak untuk analisis
Variasi laju alir fase gerak (pada komposisi fase gerak terpilih) yang akan diuji coba
adalah pada 0,8 mL/menit, 1,0 mL/menit dan 1,2 mL/menit.
Uji Kesesuaian Sistem
Larutan standar kolagen yang telah diderivatisasi disuntikkan sebanyak 20 µL ke alat KCKT
dengan komposisi fase gerak dan laju alir terpilih. Kemudian dilihat parameter waktu retensi,
faktor ikutan, resolusi,efisiensi kolom, dan koefisien variasi pada enam kali penyuntikkan.
Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas
Larutan uji kurva kalibrasi dibuat dari campuran larutan standar asam amino prolin,
glisin, dan hidroksiprolin pada rentang konsentrasi 1, 2, 4, 5, 10, dan 20 µg/ml. Masing-
masing larutan tersebut disuntikkan 20,0 µL ke alat KCKT pada kondisi analisis terpilih. Dari
Isolasi, Pemurnian ..., Ayu Aditya Andayani, FFAR UI, 2017
hasil yang diperoleh, dianalisis regresi luas puncak (y) terhadap konsentrasi analit (x) dan
dibuat kurva kalibrasinya. Koefisien korelasi (r) dari persamaan garis regresi linear dihitung.
Penentuan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)
Dari kurva kalibrasi yang diperoleh, dihitung konsentrasi terkecil yang masih dapat
dideteksi (LOD) dan terdeteksi secara kuantitatif (LOQ) menggunakan perhitungan statistik
dari regresi linear kurva kalibrasi.
Penetapan Kadar Asam Amino dari Kolagen yang diisolasi dari Kulit Babi
Ditimbang ±50 mg kolagen padat hasil isolasi lalu dilarutkan dalam 5 ml HCl 6N.
Campuran dihidrolisis dalam oven pada suhu 110°C selama 22 jam, 23 jam, 24 jam, dan 25
jam. Setelah itu dilarutkan dalam dapar asetat pH 4,2 dan diencerkan hingga diperoleh
konsentrasi 10 µg/mL. Larutan kolagen diderivatisasi dengan FMOC-Cl dan dapar borat lalu
dianalisis pada alat KCKT pada kondisi analisis terpilih. Catat luas puncak yang diperoleh,
ulangi percobaan 3 kali. Kadar dihitung dengan menggunakan persamaan kurva kalibrasi.
Hasil dan Pembahasan
Ekstraksi dan Isolasi Kolagen dari Kulit Babi
Pada penelitian ini dilakukan ekstraksi dan isolasi kolagen dari kulit babi segar yang
memiliki bobot rata-rata 1000 gram secara tiga tahap. Pada tahap pre-treatment, kulit babi
dicuci dalam air, dibersihkan dari pengotor dan lemak, dan dipotong kecil-kecil dengan
ukuran ± 1x1 cm2 untuk memperoleh luas permukaan yang besar. Selanjutnya direndam
dalam NaOH 0,1 N untuk menghilangkan protein nonkolagen dan kontaminan mineral dan
pigmen yang terkandung dalam sampel. Penampakan kulit babi setelah perendaman NaOH
adalah kulit babi menjadi lebih putih dan kesat dibandingkan dengan sebelum direndam
NaOH, hal ini disebabkan NaOH mengikat kotoran dan protein nonkolagen sehingga warna
kulit babi yang tadinya merah muda akan menjadi putih. Selain itu, kulit babi juga
mengabsorbsi larutan NaOH tersebut sehingga beratnya pun akan bertambah dari berat
awalnya (Rahadini, 2007).
Ekstraksi dilanjutkan dengan proses perendaman kulit babi ke dalam asam asetat 0,5
M selama 3 hari. Filtrat gabungan selanjutnya di salting out dengan NaCl 0,9M selama
semalam. Hasil salting out akan terlihat endapan-endapan putih di bagian bawah larutan.
Salting-out bertujuan agar protein kolagen yang terlarut pada asam asetat dapat dikeluarkan
menjadi protein yang tak larut (Rahadini, 2007). Selanjutnya kandungan kolagen yang tak
larut dipisahkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm selama 20 menit pada suhu
4°C. Temperatur saat sentrifugasi harus dipertahankan pada suhu rendah agar protein kolagen
Isolasi, Pemurnian ..., Ayu Aditya Andayani, FFAR UI, 2017
tidak terdenaturasi akibat kecepatan putaran yang dapat menimbulkan panas. Endapan putih
akan terbentuk di bawah tube sentrifugasi, endapan diambil kemudian dilarutkan pada asam
asetat 0,5 M.
Tahap pemurnian dilakukan dengan mendialisis endapan putih kolagen hasil
sentrifugasi melewati asam asetat 0,1 M dan aquadest dalam cellophane membrane 12 kDa.
Prinsip kerja dialisis adalah difusi dimana pelarut dan NaCl dalam kolagen dapat berdifusi
keluar membran, sedangkan kolagen yang bermolekul besar akan tertahan di dalam membran.
Berikutnya, kolagen hasil dialisis diliofilisasi (freeze-dry) untuk memperoleh bentuk
padat atau keringnya.
Karakterisasi Kolagen Kulit Babi
Organoleptis
Hasil akhir kolagen yang diperoleh adalah berupa kolagen kering berserat seperti
kapas, berwarna putih, dan berbau amis.
Gambar 1. Kolagen setelah di freeze-drying
Analisis gugus fungsi
Hasil analisis spektra FTIR pada sampel dan standar kolagen menunjukkan puncak-
puncak serapan pada wilayah serapan amida A pada 3200-3400 cm -1, amida B pada 2935-
2915 cm -1, amida I pada 1600-1690 cm -1, amida II pada 1480-1575 cm -1, dan amida III pada
1229-1301 cm -1 yang masing-masing merupakan serapan khas pada kolagen. Amida A
sendiri merupakan daerah gugus fungsi vibrasi ulur gugus NH, amida B daerah CH2 ulur
asimetris, amida I merupakan daerah vibrasi ulur gugus C=O, amida II adalah daerah NH
tekuk yang berikatan dengan CN ulur, dan amida III merupakan gugus CN ulur dengan NH
tekuk (Sai dan Babu, 2001; Coates, 2010; Kong dan Yu, 2007).
Isolasi, Pemurnian ..., Ayu Aditya Andayani, FFAR UI, 2017
Keterangan :A (merah) : spektrum serapan standar kolagen
B (biru) : spektrum serapan sampel kolagen Gambar 2. Overlay spektrum serapan standar kolagen dan sampel kolagen hasil
isolasi dari kulit babi
Uji pH
Uji pH dilakukan dengan membandingkan pH sampel dan pH standar kolagen. pH
yang diperoleh pada larutan standar adalah 6,70 sementara pH pada larutan sampel kolagen
adalah 6,87. Nilai pH standar dan sampel kolagen pada penelitian ini sesuai dengan syarat
mutu kolagen yang ditetapkan oleh Badan Standardisasi Nasional (2014) yaitu antara 6,5 – 8.
Pewarnaan Casson’s trichrome
Uji pendeteksian kolagen menggunakan casson’s trichrome solution yang terdiri dari
aquadest (200 ml), phosphotungistic acid (1 gram), orange G (2 gram), anilin blue (1 gram),
dan acid fuchsine (3 gram). Pewarnaan kolagen dengan menggunakan Casson’s trichrome
menunjukkan jaringan kolagen babi hasil isolasi terwarnai biru dan merah. Warna biru berasal
dari pewarna anilin blue yang menunjukkan adanya jaringan kolagen, sedangkan warna
merah berasal dari phosphotungistic acid dan orange G yang mewarnai sitoplasma, otot, dan
inti sel (Kiernan, 1990).
Gambar 3. Pewarnaan sampel kolagen babi dengan Casson’s trichrome
A
B
Isolasi, Pemurnian ..., Ayu Aditya Andayani, FFAR UI, 2017
Analisis kadar air
Berdasarkan hasil uji dari sampel kolagen hasil isolasi kulit babi, angka kadar air yang
diperoleh adalah 1,186% pada uji I dan 1,662% pada uji II. Angka rata-rata yang diperoleh
adalah 1,424%. Hal ini menunjukkan angka kadar air sampel sudah memenuhi syarat BSN
(2014) yaitu ≤12.
Analisis kadar abu
Analisis kadar abu dilakukan untuk mengetahui apakah di dalam sampel masih
terkandung mineral lain seperti silikat, kalsium, kalium, dan sebagainya. Jika nilai kadar abu
masih tinggi,berarti proses ekstraksi tidak berjalan sempurna. Pada uji kadar abu sampel
kolagen yang dilakukan secara 2 siklus diperoleh nilai sebesar 0,23% dan 0,49% . Nilai kadar
abu sudah memenuhi kriteria syarat mutu kolagen berdasarkan BSN (2014) yaitu ≤ 1,0.
Uji viskositas
Pengukuran menggunakan viskometer Ostwald dengan tiga kali pengukuran terhadap larutan
sampel diperoleh nilai 0,9121 cP; 1,1121 cP; dan 1,022 cP. Nilai viskositas yang rendah
menunjukkan fluida cair (encer), hal ini disebabkan karena pelarutan sampel menggunakan
air panas, sehingga kemungkinan terjadi degradasi ikatan hidrogen pada kolagen.
Optimasi Waktu Hidrolisis
Hidrolisis dilakukan melalui proses deaminasi gugus amin pada kolagen dengan HCL
6N yang disertai pemanasan pada suhu 110°C untuk memutus rantai ikatan peptida pada
kolagen agar terbentuk senyawa-senyawa tunggal asam amino. Waktu hidrolisis yang diuji
adalah pada 22, 23, 24, dan 25 jam. Hidrolisis dengan waktu 24 jam memberikan luas puncak
yang paling besar dan paling sesuai dengan pustaka yang diacu yaitu Schrieber & Gareis
(2007) dibandingkan hasil hidrolisis 22, 23, dan 25 jam. Pada kromatogram 22,23, dan 25 jam
asam amino tidak terpisah secara sempurna. Sehingga waktu paling optimal untuk
menghidrolisis kolagen adalah 24 jam.
Tabel 1. Data variasi waktu hidrolisis terhadap luas puncak senyawa derivat yang terbentuk Waktu Hidrolisis
(jam) Luas Puncak (mV/s)
Hidroksiprolin Glisin Prolin 22 94073 203781 365141 23 57014 156464 201178 24 63202 238078 141636 25 24087 155995 80549
Isolasi, Pemurnian ..., Ayu Aditya Andayani, FFAR UI, 2017
Pembentukan Senyawa Derivat
Proses derivatisasi asam amino dilakukan pada suhu ruang dengan prosedur pre-kolom
dan menggunakan penderivat FMOC-Cl (9-Fluorenilmetoksikarbonil-klorida). Reaksi
derivatisasi yang terjadi merupakan reaksi substitusi dimana gugus Cl yang dimiliki FMOC-
Cl akan digantikan oleh gugus amin primer dan sekunder asam amino. Derivatisasi asam
amino dengan FMOC-Cl membutuhkan pH alkali basa (pH ≥ 8), sementara larutan uji
kolagen memiliki pH berkisar antara 6,5–8 akibat proses pelarutan dalam dapar asetat. Oleh
karena itu diperlukan penambahan dapar basa untuk menaikkan pH larutan uji. Pada proses
derivatisasi ini, digunakan dapar borat pH 9 untuk mengalkalikan kolagen.
Pemilihan volume pereaksi dilakukan melalui perhitungan stokiometri terlebih dahulu
untuk mengetahui berapa volume pereaksi yang dibutuhkan untuk menghasilkan derivat yang
optimum dan stabil. Pada penelitian ini dengan 300 µL larutan uji kolagen yang digunakan
maka dibutuhkan 300 µL penderivat FMOC-Cl dan 300 µL dapar borat.
Penetapan Panjang Gelombang Analisis
Pemilihan panjang gelombang analisis yang optimum sangat penting dilakukan dalam
analisis menggunakan KCKT detektor fluoresensi, hal ini bertujuan untuk meningkatkan
selektivitas dan sensitivitas senyawa yang akan dianalisis. Pada panjang gelombang eksitasi
dilakukan penyesuaian dengan spektrofotometer UV-Vis dan panjang gelombang emisi
dengan detektor fluoresensi. Hasil optimasi panjang gelombang menunjukkan pada panjang
gelombang eksitasi 265 dan emisi 320 nm memberikan luas puncak yang paling besar
dibandingkan kromatogram emisi 325 dan 330 nm.
Tabel 2. Data variasi panjang gelombang emisi terhadap luas puncak senyawa derivat yang terbentuk
Panjang Gelombang Luas Puncak (mV/s) Eksitasi (nm) Emisi (nm) Hidroksiprolin Glisin Prolin
265 320 63202 238078 141636 325 16392 16196 9343 330 - 14817 3902
Pencarian Kondisi Analisis Optimum
Asam amino yang diderivatisasi dari kolagen merupakan senyawa polar sehingga
diperlukan fase gerak yang polar juga. Oleh karena itu, pada penelitian ini digunakan fase
gerak dapar asetat-asetonitril yang bersifat polar, dengan begitu akan diperoleh pemisahan
yang baik dengan waktu retensi yang tidak lama.
Pada fase gerak dapar asetat (pH 4,2)-asetonitril (55:45) ketiga senyawa asam amino
yaitu glisin, prolin, dan hidroksiprolin muncul dan terjadi pemisahan yang paling baik
Isolasi, Pemurnian ..., Ayu Aditya Andayani, FFAR UI, 2017
dibandingkan dengan kromatogram fase gerak (60:40) dan (65:35). Hal ini dikarenakan pada
komposisi 60:40 dan 65:35 fase gerak kurang polar karena memiliki komposisi dapar asetat
yang lebih besar, sehingga senyawa memiliki afinitas yang kecil terhadap fase gerak dan
menyebabkan komponen asam amino tidak terpisah secara baik.
Setelah itu dilakukan optimasi terhadap laju alir dengan variasi 0,8 mL/menit; 1,0
mL/menit; dan 1,2 mL/menit. Hasil optimal yang diperoleh adalah dengan laju alir 0,8
mL/menit karena menghasilkan resolusi paling besar (> 1,5) sehingga menunjukkan
terjadinya pemisahan yang baik serta memberikan nilai HETP yang lebih kecil dan jumlah
lempeng teoritis lebih besar yang menunjukkan adanya efisiensi kolom.
Uji Kesesuaian Sistem
Uji kesesuaian sistem yang dilakukan 6 kali berturut-turut pada penyuntikan larutan
standar kolagen dengan kondisi analisis optimum terpilih dihasilkan nilai koefisien variasi
untuk asam amino hidroksiprolin, glisin, dan prolin masing-masing adalah 0,88% ; 0,49% ;
dan 1,40%. Berdasarkan percobaan tersebut memberikan hasil yang sesuai dengan
persyaratan yaitu koefisien variasi (KV) tidak lebih dari 2,0%. Selain itu ke-6 hasil
penyuntikkan memiliki nilai efisiensi kolom yang baik dan resolusi yang lebih besar dari 1,5.
Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas
Berdasarkan hasil perhitungan statistik regresi linear diperoleh persamaan garis kurva
kalibrasi untuk hidroksiprolin adalah y=1655,4x + 26980, untuk glisin adalah y=9351,2x +
30431, dan untuk prolin adalah y=5824,4x + 38859. Dari pengujian linearitas menghasilkan
nilai koefisein korelasi (r) untuk hidroksiprolin, glisin, dan prolin berturut-turut adalah
0,9981; 0,9979; dan 0,9985.
Dari hasil tersebut menunjukkan bahwa nilai koefisien korelasi tidak ≥ 0,999 hal ini
disebabkan pada saat pembuatan larutan kurva kalibrasi ketiga larutan asam amino dicampur
sekaligus, tidak dilakukan terpisah, selain itu pengaruh dari proses derivatisasi juga dapat
menyebabkan nilai koefisien korelasi kurang dari 0,999.
Penentuan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ)
Berdasarkan hasil uji linearitas hidroksiprolin, glisin, dan prolin memberikan nilai
batas deteksi (LOD) berturut-turut sebesar 0,900 µg/mL; 0,990 µg/mL; dan 0,998 µg/mL.
Sementara, nilai batas kuantitasi (LOQ) untuk hidroksiprolin, glisin, dan prolin berturut-turut
sebesar 3,001 µg/mL; 3,301 µg/mL; dan 3,327 µg/mL. Berdasarkan hasil tersebut, nilai LOQ
tidak memasuki rentang konsentrasi yang digunakan pada uji kurva kalibrasi. Nilai LOQ
sendiri memiliki hubungan dengan hasil uji linearitas, dimana dari hasil uji linearitas yang
Isolasi, Pemurnian ..., Ayu Aditya Andayani, FFAR UI, 2017
sudah dilakukan tidak memenuhi persyaratan sehingga mempengaruhi pula terhadap hasil
LOD dan LOQ yang diperoleh.
Penetapan Kadar Asam Amino Glisin, Prolin, dan Hidroksiprolin pada Sampel Kolagen
Hasil Isolasi dari Kulit Babi
Penetapan kadar dihitung berdasarkan persamaan regresi linear masing-masing asam
amino. Berdasarkan hasil yang diperoleh, kadar rata-rata asam amino hidroksiprolin, glisin,
dan prolin berturut-turut adalah 11,303% ± 0,354%; 33,663% ± 0,215%; dan 12,333% ±
0,128%. Rata-rata kadar asam amino hidroksiprolin, glisin, dan prolin yang diperoleh
mendekati nilai kadar kolagen berdasarkan Schrieber & Gareis (2007) yaitu kadar glisin 33%,
prolin 11%, dan hidroksiprolin 10%. Adanya peningkatan kadar kolagen hasil isolasi
disebabkan karena sampel yang digunakan adalah kulit babi, yang memiliki kadar protein yang
memang lebih tinggi.
Kesimpulan
Diperoleh ekstrak dan isolat kolagen yang di isolasi dari kulit babi dengan nilai
rendemen sebesar 0,974% (bb) yang dikonfirmasi dengan analisis gugus fungsi menggunakan
FTIR dan pewarnaan Casson’s trichrome.
Kondisi optimum untuk analisis penetapan kadar asam amino glisin, prolin, dan
hidroksiprolin dari kolagen yang diisolasi dari kulit babi menggunakan KCKT dengan
detektor fluoresensi pada λex = 265 nm dan λem = 320 nm, Kolom YMC-Triart®C18 (panjang
kolom 250 nm, ukuran diameter dalam 4,6 mm, ukuran partikel 5 µm) adalah dengan fase
gerak dapar asetat (pH 4,2)-asetonitril (55:45) dan laju alir 0,8 ml/menit. Kondisi optimum
untuk hidrolisis kolagen dengan HCl 6N disertai pemanasan pada suhu 110°C selama 24 jam.
Larutan kolagen kemudian ditambahkan dapar borat pH 9 dan diderivatisasi dengan FMOC-
Gambar 4. Kromatogram standar kolagen 10 µg/mL
dengan waktu hidrolisis 24 jam yang telah diderivatisasi
dengan FMOC-Cl pada optimasi fase gerak dapar asetat-
asetonitril (55:45) dan laju alir 0,8 ml/menit
Gambar 5. Kromatogram sampel kolagen hasil isolasi
dari kulit babi yang telah diderivatisasi dengan FMOC-
Cl pada kondisi analisis optimum terpilih
Isolasi, Pemurnian ..., Ayu Aditya Andayani, FFAR UI, 2017
Cl masing-masing sebanyak 300 µL, selanjutnya disuntikkan ke alat KCKT dengan volume
penyuntikkan 20,0 µL.
Berdasarkan hasil analisis, asam amino pada kolagen hasil isolasi dari kulit babi
diperoleh kadar rata-rata asam amino hidroksiprolin, glisin, dan prolin berturut-turut adalah
11,303% ± 0,354%; 33,663% ± 0,215%;dan 12,333% ± 0,128%.
Saran
Untuk penelitian selanjutnya perlu dilakukan analisis terhadap asam amino alanin
yang terkandung pada kolagen babi, serta perlu dilakukan validasi metode analisis terhadap
metode yang telah diperoleh, dan pengembangan metode analisis kadar asam amino utama
dalam kolagen babi dengan menggunakan penderivat lain.
Daftar Acuan
[AOAC] Association of Official Analytical Chemyst. (2005). Official Methods of Analysis
(18 Edn). Maryland (US): Published by The Association of Official Analytical Chemist Inc.
Braithwaite, A., dan Smith, F.J. (1999). Chromatographic Methods (5th ed.). Dordrecht:
Kluwer Academic Publishers. [BSN] Badan Standardisasi Nasional. (2014). Kolagen Kasar dari Sisik Ikan – Syarat Mutu
dan Pengolahan: SNI 8076-2014 (id): Badan Standardisasi Nasional. Chang, P., Chang, S., Chen, H., & Ho, Y. (2003). Quantification of Collagen in Tissues Using
Stable Isotope Labeling and LC-MS, 1-9. Retrieved from http://www.rdoffice.ndhu.edu.tw/ezfiles/5/1005/form/275/form_69_5366939_38609.pdf
Gómez-Guillén, M., Giménez, B., López-Caballero, M., Montero, M. (2011). Functional and
Bioactive Properties of Collagen and Gelatin from Alternative Sources. A review. Food Hydrocoll. 25 : 1813-1827.
Harmita. (2006a). Buku Ajar Analisis Fisikokimia. Depok: Departemen Farmasi FMIPA
Universitas Indonesia. Hartati, I. (2010). Kajian Produksi Kolagen dari Limbah Sisik Ikan secara Enzimatis.
Semarang: Skripsi Fakultas Teknik, Universitas Wahid Hasyim. Jamilah B, Hartina MRU, Hashim M, Sazili AQ. (2013). Properties of collagen from
barramundi (Lates calcarifer) skin. International Food Research Journal, 20(2):835-842.
Isolasi, Pemurnian ..., Ayu Aditya Andayani, FFAR UI, 2017
Kiernan, J.A. (1990). Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. Great Britain: Pergamon Pr.
Kupiec, T. (2004). Quality-Control Analytical Methods: High-Performance Liquid
Chromatography. International Journal of Pharmaceutical Compounding, 8(3): 223-227.
Lestari, Tiska. (2007). Isolasi dan Karakterisasi Kolagen dari Tulang Ikan Tuna (Thunnus
albacares) sebagai Bahan Baku Industri Farmasi. Depok: Skripsi Fakultas Farmasi, Universitas Indonesia.
McCullagh, J., Marom, A., & Hedges, R. (2010). Radiocarbon Dating of Individual Amino
Acids from Archeological Bone Collagen, Proceedings of the 20th International Radiocarbon Conference, 52(2), 620-634.
McNair, H.M., dan Miller, J.M. (1998). Basic Gas Chromatography. New York: John Willey
& Sons. Meyer, M. & Schropfer, M. (2013). Collagen Materials - Collagen Processing.Technical
Freedom and Scientific Challenges when Transforming Collagen into Final Materials. Rahadini, I.R. (2007). Isolasi dan Karakterisasi Kolagen dari Gelembung Renang Ikan Mas
(Cyprinus carplo) sebagai Bahan Baku Industri Farmasi. Depok: Skripsi Fakultas Farmasi, Universitas Indonesia.
Ramshaw JA., Peng Y., Glattauer V., Werkmeister JA. (2009). Collagens As Biomaterials. J.
Mater. Sci. Mater. Med, 20 (1) : S3-S8 Schrieber, R., Gareis, H. (2007). Gelatine Handbook Theory and Industrial Practice. Whiley :
VCH, Weinheim. Silvipriya, K., Kumar, K., Bhat, A., Kumar, B., John, A., & Lakshmanan, P. (2015).
Collagen: Animal Sources and Biomedical Application. Journal Of Applied Pharmaceutical Science, 5(03), 123-127. http://dx.doi.org/10.7324/japs.2015.50322
Summerfield, A., Meurens, F., & Ricklin, M. (2015). The Immunology of The Porcine Skin
and Its Value as a Model for Human Skin. Molecular Immunology, 66(1), 14-21. http://dx.doi.org/10.1016/j.molimm.2014.10.023
Szpak., Paul. (2011). Fish Bone Chemistry and Ultrastructure Implications for Taphonomy
and Stable Isotope Analysis. Journal of Archaelogical Science, 38 (12): 3358-3372. Yang, H. & Shu, Z. (2014). The Extraction of Collagen Protein from Pig skin. Journal of
Chemical and Pharmaceutical Research, 6(2), 683-687. http://dx.doi.org/0975-738. .
Isolasi, Pemurnian ..., Ayu Aditya Andayani, FFAR UI, 2017