Ispitivanje mogućnosti formulacije preparata za inhibiciju rasta … · 2007. 8. 14. · Milomir Varja čić§ ... (tabela 1) predstavlja apsorpcionu bazu iz koje se, u konta-ktu

Број 6 ВОЈНОСАНИТЕТСКИ ПРЕГЛЕД Страна 453

Toskić-Radojičić M, et al. Vojnosanit Pregl 2005; 62(6): 453−459.

UDC: 616.314.17–008.1–08:[577.182.54:615.015.8

Ispitivanje mogućnosti formulacije preparataza inhibiciju rasta sojeva izolovanih izperiodontalnih džepova rezistentnih na

metronidazol

Marija Toskić-Radojičić*, Zorka Nonković†, Irma Lončar‡,Milomir Varjačić§

Vojnomedicinska akademija, *Institut za farmaciju, †Zavod za preventivnu medicinu,§Klinika za stomatologiju, Beograd; ‡Vetprom hemikalije, Beograd

Uvod. Lek izbora u lečenju anaerobnih infekcija periodontalnih džepova su lokalni prepa-rati metronidazola, odnosno metronidazol-benzoata koji se aplikuju direktno u prostor iz-među zuba i periodontalnog tkiva. U prethodno sprovedenim testiranjima razvili smo oleo-gele i hidrogele kao biomukoadhezivne podloge za izradu ovih preparata. Cilj. Najnovijaistraživanja su usmerena na razvoj preparata kojim će se rešiti problem prirasta anaerob-nih mikroorganizama u periodontalnim džepovima, rezistentnih na metronidazol. Metode.Iz briseva iz periodontalnih džepova klasičnim antibiogramom izdvojeni su sojevi rezistent-ni na metronidazol. Dalja testiranja antimikrobne aktivnosti pripremljenih formulacija ra-đena su bezmembranskom difuzionom metodom u agar-gelu. Testirani su oleo i hidrogelisa: tetraciklinom (2,5%), metronidazolom (25%) i metronidazol-benzoatom (40%), kao ioleo i hidrogeli sa kombinacijom 2,5% tetraciklina i 40% metronidazol-benzoata. Rezulta-ti. Dobri rezultati postignuti su oleogel preparatom koji je, pored metronidazol-benzoata,sadržao 2,5% tetraciklina. Bitan podatak do koga se došlo navedenim in vitro testovima jeda nema izraženog sinergizma u aktivnosti tetraciklina i metronidazol-benzoata ako je sojosetljiv na oba aktivna principa. Zaključak. Najbolji rezultati u inhibiciji rasta anaerobnihbakterija rezistentnih na metronidazol postignuti su preparatima koji su, pored metronida-zol-benzoata, sadržali i 2,5% tetraciklina u oleogel podlozi.

K lj u č n e r e č i : tehnologija, farmaceutska; metronidazol; tetraciklin; geli;periodontalni džep; lekovi, rezistencija mikroorganizama.

Uvod

U dugogodišnjoj saradnji sa stomatolozima u razvojupreparata za inhibiciju rasta anaerobnih bakterija u perio-dontalnim džepovima razvijen je niz magistralnih preparatau kojima je, kao aktivni princip, korišćen metronidazol ukoncentraciji 25%, odnosno metronidazol-benzoat u kon-centraciji 40% (= 25% metronidazola).

Metronidazol se smatra lekom izbora u lečenju perio-dontalnih džepova (1–5) što smo potvrdili brojnim ispitiva-njima u našim prethodnim radovima (6–8). Koristeći se in vit-ro metodom zasejavanja brisa iz periodontalnog džepa, izolo-vali smo anaerobne sojeve (Eubacterium spp., Peptostrepto-coccus spp., Bifidobacterium spp., Bacteroides spp., Prevo-tella melaninogenica, Veillonella parvula, Peptococcus anae-

robius) i odredili njihovu osetljivost na metronidazol. U da-ljim testovima, takođe in vitro metodom, proverili smo razlikeu efikasnosti metronidazola i metronidazol-benzoata i dobilismo da je minimalna doza za postizanje zadovoljavajuće in-hibicije rasta anaeroba (testirano na sojevima Bifidobacteriumspp. i Bacteroides spp.) veća za metronidazol-benzoat nego zametronidazol u obliku čiste baze. To je i očekivani rezultat,pošto je koncentracija metronidazola u metronidazol-benzoatusmanjena za masu benzoatnog jona. S obzirom na to da jemetronidazol u obliku čiste baze izuzetno gorak, a da metro-nidazol-benzoat ima prihvatljiv ukus (9), ta razlika u inicijal-noj koncentraciji još uvek nije razlog da se metronidazolsmatra efikasnijim od svoje benzoatne soli. Pored toga, bitnačinjenica je da je metronidazol-benzoat prekursor metronida-zola i da u fiziološkim uslovima dolazi do oslobađanja metro-

Страна 454 ВОЈНОСАНИТЕТСКИ ПРЕГЛЕД Број 6

nidazola (9), kao aktivnog oblika u potrebnoj koncentraciji izadovoljavajućem vremenu (10).

Najnoviji rezultati naših istraživanja ukazali su da semetronidazolom, odnosno metronidazol-benzoatom, ne mo-že inhibisati rast svih anaerobnih sojeva koji se mogu izolo-vati iz periodontalnih džepova, pa je predmet ovih ispitiva-nja izrada i ispitivanje formulacija kojima će se postići inhi-bicija rasta anaerobnih sojeva rezistentnih na metronidazol.

Na osnovu podataka iz literature (11–13) i naših pret-hodnih ispitivanja kombinacija metronidazol – tetraciklin imetronidazol-benzoat – tetraciklin zaključili smo da bi sedodatkom tetraciklina, kao dopunskog antibiotika, dobioefikasniji preparat za lečenje periodontalnih džepova.

S obzirom na to da smo godinama istraživali problem iz-bora biomukoadhezivnih podloga za preparate koji će se apli-kovati u periodontalne džepove (6, 7), kao i problem stabilnostimetronidazola u formulisanim podlogama (8), cilj ovoga radaje bio: 1. izbor optimalne podloge za izradu preparata u čiji sa-stav će kao kombinacije ući tetraciklin i metronidazol-benzoati 2. in vitro ispitivanje efikasnosti ove kombinacije na sojevimaanaerobnih bakterija, rezistentnih na metronidazol.

Metode

Formulacije podloga i preparata

Izradili smo dve vrste podloga: oleogele i hidrogele. Uveć pripremljene podloge, metodom izrade masti tipa sus-penzije (14), primešali smo aktivne principe, prethodno pro-sejane kroz sito 0,15 (15).

Izbor podloge

Testiranje smo obavili bezmembranskom in vitro me-todom – difuzijom u agar-gelu. Kao medijum za inokulaciju

soja Lactobacillus fermentatum koristili smo krvni agar saheminom i vitaminom K. Gustina inokulata bakterija je sta-ndardizovana na 106 ml-1 poređenjem sa Mc Farland sta-ndardom br. 25. Kao nosač podloge korišćene su Petrijevešolje prečnika 6 cm. Pripremljenu suspenziju soja Lactoba-cillus fermentatum ravnomerno smo zasejali po površini, azatim smo u centru zasejane površine, sterilnim plastičnimšpricem, napravili kružni isečak u agaru prečnika 4 mm i udobijeni prostor smo odvagali 25 mg (Mettler AC-100) pre-parata (tačnost merenja ± 2%). Petrijeve šolje su 24 sata,bez okretanja, inkubirane na 37 ºC u anaerobnim uslovima.Nakon toga prečnik zone inhibicije jasnog rasta soja Lacto-bacillus fermentatum merili smo milimetarskim meračem.

Testiranje oleogela

Rutinskim postupkom (uz upotrebu autotransportnekulturete) uzeti su brisevi bolesnicima sa periodontalnimdžepovima koji u tri prethodna meseca nisu tretirani. Sojeveanaerobnih bakterija kultivisali smo na podlogama do tipi-zacije vrste. Klasičnim antibiogram testom izdvojeni su so-jevi rezistentni na metronidazol. Dalje testiranje identično jepostupku opisanom u poglavlju „Metoda izbora podloge“.Ista metodologija rada primenjena je i za testiranje kultureClostridium perfringens, koja se pokazala osetljivom i nametronidazol i na tetraciklin.

Rezultati

Kvalitativni sastav podloga tipa oleogela i hidrogela,koje su korišćene za izradu uzoraka za testiranje, dat je utabeli 1, a koncentracija aktivnih principa (tetraciklina, met-ronidazol-benzoata i metronidazola) u uzorcima data je utabeli 2.

Tabela 1Kvalitativni sastav podloga za izradu uzoraka

Vrsta gelaSupstancijaOleogel (o) Hidrogel I (c) Hidrogel II (p)

Ulje sezama + – –Oleiloleat + – –Kompleksni emulgator + – –Carbopol 974P NF – + –Pemulen® TR-1 NF – – +Prečišćena voda – + +

Tabela 2Koncentracija aktivnih principa u uzorcima

Aktivni princip u g / 100 g

TetraciklinMetronidazol-

benzoat MetronidazolUzorci

T2.5 2,5 – –TBB10 2,5 10 –TMB40 2,5 40 –MB – 40 –M – – 25


Na soju Lactobacillus fermentatum, koji je u klasič-nom postupku izrade antibiograma pokazao rezistenciju nametronidazol, testirali smo oleo i hidrogele sa tetraciklinom(2,5%), metronidazolom (25%) i metronidazol-benzoatom(40%), kao i oleo i hidrogele sa kombinacijom 2,5% tetraci-klina i 40% metronidazol-benzoata. Rezultati testiranja (kaosrednja vrednost iz pet merenja) dati su u tabeli 3.

Tabela 4 prikazuje rezultate (kao srednja vrednost izpet merenja) testiranja efikasnosti preparata u oleogel pod-lozi, u inhibiciji rasta sojeva rezistentnih na metronidazol, aosetljivih na tetraciklin (po klasičnom antibiogramu). Slika1 prikazuje fotografije agar podloga na kojima je rađeno te-stiranje za soj Lactobacillus fermentatum.

Posebno smo testirali efikasnost oleogel preparata nasoju Clostridium perfringens koji je pokazao dobru osetlji-vost i na metronidazol i na tetraciklin (tabela 5 i slika 2).

Diskusija

U prethodnim ispitivanjima razvili smo dva osnovnatipa biomukoadhezivnih podloga: oleogele i hidrogele. Dvasu osnovna principa koja smo poštovali u odabiru podloga:adhezivnost za vlažnu površinu (6, 7) i sposobnost protica-

nja kroz iglu 21G × 1/2, od 0,8 mm (6), kroz koju se prepa-rat unosi u periodontalni džep.

Oleogel podloga, razvijena kao tiksotropni sistem me-šavine sezamovog ulja, oleiloleta i kompleksnog emulgatora(tabela 1) predstavlja apsorpcionu bazu iz koje se, u konta-ktu sa pljuvačkom, formira ambifilni sistem, što usporava ikontroliše oslobađanje aktivnih principa.

Podloge tipa hidrogela razvili smo sa različitim tipo-vima gelirajućih agenasa, od derivata celuloze (natrijum-karboksimetilceluloza), preko homokarbomernih derivata(carbopol 974P NF), do heterokarbomernih derivata (Pe-mulen® TR-1 NF). U svim hidrogel podlogama bile su op-timalne koncentracije gelirajućih agenasa i sve su pokazalezadovoljavajuće kvalitete kao nosači metronidazola (6–8).

Određivanje koncentracije aktivnih principa za izraduuzoraka uradili smo u skladu sa rezultatima naših prethod-

nih ispitivanja (6–8) i u skladu sa podacima iz literature oupotrebi metronidazola, metronidazol-benzoata i tetracikli-na u lečenju periodontalne bolesti (1–5, 10–13). Osnovnicilj nam je bio da ispitamo da li je koncentracija od 2,5%tetraciklina dovoljna da inhibiše rast sojeva rezistentnih nametronidazol (odnosno metronidazol-benzoat) i zato smo iizrađivali uzorke koji su u različitim podlogama sadržali

Tabela 3Izbor podloge in vitro metodom

Prosečna širina zone inhibicije rasta soja Lactobacillus fermentatum (u mm ± 1)(masa uzorka 25 mg)

Vrsta podlogeUzorci

Oleogel (o) Hidrogel I (c) Hidrogel II (p)T2.5 35 30 30TMB40 35 30 32MB 0 0 0M 0 14 12

Tabela 4Prosečna širina zone inhibicije rasta sojeva rezistentnih na

metronidazol u prisustvu oleogel preparataBakterijski soj

Lactobacillusfermentatum

LactobacillusacidophilusOleogeli

Prosečna širina zone inhibicije rasta soja (mm ± 1)T2.5 50 62TBB10 52 62TMB40 50 62MB 0 0M 0 15

Tabela 5Prosečna širina zone inhibicije rasta sojeva Clostridium perfringens

u prisustvu oleogel preparataOleogeli T2.5 TBB10 TMB40 MB M

Clostridium perfringensProsečna širina zone inhibicije rasta

soja (mm ± 1)55 57 57 50 70


2,5% tetraciklina (tabela 2). Drugi podatak, bitan za daljirazvoj preparata za lečenje periodontalne bolesti, je da li sekoncentracija metronidazol-benzoata sme smanjiti u prepa-ratu koji sadrži tetraciklin, a da se ne umanji efikasnost pre-parata u inhibiciji rasta sojeva osetljivih na metronidazol.Zato smo uradili preparate koji su sadržali 2,5% tetraciklinai 10% metronidazol-benzoata, kao i preparate koji su sadr-žali 2,5% tetraciklina i 40% metronidazol-benzoata (tabela2). I dalje smo nastavili da testiramo uzorke sa 40% metro-nidazol-benzoata, odnosno 25% metronidazola (tabela 2).

S obzirom na to da smo u prethodnim radovima izneli po-datke o upotrebljivosti različitih tipova podloga za izradu prepa-rata sa metronidazolom i metronidazol-benzoatom (6–8), daljatestiranja u izboru podloge bila su usmerena samo na proveru

aktivnosti tetraciklina u kombinaciji sa metronidazol-benzoatomna soju rezistentnom na metronidazol. Najširu zonu inhibicijena soju Lactobacillus fermentatum dobili smo sa preparatimaurađenim u oleogel podlozi (tabela 3), pa smo dalja testiranjaradili samo sa uzorcima rađenim u toj podlozi, a razvoj hidrogelpodloga ostavili smo za neka buduća istraživanja.

U postupku kultivisanja anaerobnih sojeva iz perio-dontalnih džepova izdvojili smo dva soja rezistentna nametronidazol: Lactobacillus fermentatum i Lactobacillusacidophilus. Tabela 4 prikazuje rezultate testiranja oleogelpreparata na ovim sojevim. Kao što se iz rezultata vidi,aktivnost tetraciklina ostaje konstantna bez obzira na kon-centraciju metronidazol-benzoata (10% ili 40%) u prepa-ratu. I u ovom testiranju potvrđena je rezistentnost testira-

a. (d1 + d2) : 2 = 50 mm b. (d1 + d2) : 2 = 52 mm

c. (d1 + d2) : 2 = 50 mm d. (d1 + d2) : 2 = 0 mm

e. (d1 + d2) : 2 = 0 mm

d2

d1

d2

d1

d1

d2

Sl. 1 − Agar podloge na kojima je rađeno testiranje efikasnosti oleogel preparata u inhibiciji sojaLactobacillus fermentatum:

a) preparat sa 2,5% tetraciklina; b) preparat sa 2,5% tetraciklina i 10% metronidazol-benzoata; c) preparat sa 2,5% tetraciklina i 40%metronidazol-benzoata; d) preparat sa 40% metronidazol-benzoata; e) preparat sa 25% metronidazol baze.


nih sojeva na metronidazol i na metronidazol-benzoat (ta-bela 4).

Soj Clostridium perfringens pokazao je dobru osetlji-vost kako na metronidazol, tako i na tetraciklin, pa nam jeposlužio da ispitamo ima li sinergizma u aktivnosti metro-nidazol-benzoata i tetraciklina. Neznatne promene u širinizone inhibicije rasta primenom preparata sa oba aktivnaprincipa, u odnosu na preparate sa po jednim aktivnim prin-cipom ukazuje na to da nema jasno definisanog sinergizma(tabela 5 i slika 1). Posebno iznenađujući je rezultat da nepostoji razlika između preparata koji uz 2,5% tetraciklinasadrži 10% ili 40% metronidazol-benzoata i da je u oba slu-čaja dobijena ista širina inhibicije rasta soja Clostridium

perfringens (tabela 5), tako da se ne može zaključiti kojiaktivni princip u ovoj kombinaciji ima veći udeo u inhibicijirasta ispitivanog soja. Drugi podatak koji smo dobili ovimtestiranjem je da je aktivnost preparata sa 40% metronida-zol-benzoata približno jednaka aktivnosti preparata sa 2,5%tetraciklina (tabela 5 i slika 2) kada je u pitanju soj Clostri-dium perfringens. Najbolji rezultati postignuti su sa metro-nidazol bazom. Jedini nedostatak ovog preparata je da bole-snici teško prihvataju njegov gorak ukus.

U dosadašnjem radu nismo uspeli da izolujeno soj re-zistentan na tetraciklin, pa nam i dalje ostaje bez odgovorapitanje da li se sme umanjiti koncentracija metronidazol-benzoata ispod 40% u kombinovanom preparatu.

a. (d1 + d2) : 2 = 55 mm b. (d1 + d2) : 2 = 57 mm

c. (d1 + d2) : 2 = 57 mm d. (d1 + d2) : 2 = 50 mm

e. (d1 + d2) : 2 = 70 mm

d2

d1 d1

d2

d1 d2d1

d2

d2

d2

Sl. 2 − Agar podloge na kojima je rađeno testiranje efikasnosti oleogel preparata u inhibiciji sojaClostridium perfringens:

a) preparat sa 2,5% tetraciklina; b) preparat sa 2,5% tetraciklina i 10% metronidazol-benzoata; c) preparat sa 2,5% tetraciklina i 40% me-tronidazol-benzoata; d) preparat sa 40% metronidazol-benzoata; e) preparat sa 25% metronidazol baze.


Zaključak

Najbolje rezultate u inhibiciji rasta sojeva izolovanihiz periodontalnih džepova postigli smo oleogel preparatom

u čiji sastav pored metronidazol-benzoata ulazi i 2,5% tetra-ciklina. Ovom kombinacijom inhibisan je rast i sojeva kojesmo prethodno ispitali i potvrdili da su rezistentni na metro-nidazol.

L I T E R A T U R A

1. Hirooka H. Metronidazole in the treatment of periodontaldisease [dissertation]. Gothenburg: Gothenburg Univer-sity, Department of periodontology, Faculty of Odontol-ogy; 1993.

2. Genco RJ. Antibiotics in the treatment of human perio-dontal diseases. J Periodontol 1981; 52(9): 545–58.

3. Schwach-Abdellaoui K, Vivien-Castioni N, Gurny R. Lo-cal delivery of antimicrobial agents for the treatment ofperiodontal diseases. Eur J Pharm Biopharm 2000; 50(1):: 83–99.

4. Noyan U, Yilmaz S, Kuru B, Kadir T, Acar O, Buget E. Aclinical and microbiological evaluation of systemic andlocal metronidazole delivery in adult periodontitis pa-tients. J Clin Periodontol 1997; 24(3): 158–65.

5. Needleman IG, Collins AM, Moles DR. Periodontal flapsurgery with 25% metronidazole gel. (1). Clinical out-comes. J Clin Periodontol 2000; 27(3): 187–92.

6. Jovanović I, Toskić-Radojičić M, Nonković Z. Formula-tion of mucoadhesive dental gel containing metronidazolefor application to periodontal pockets. In: Duchêne D,editor. Proceedings of the 2nd World Meeting; 1998 May25–28; Paris, France. Paris: APGI/APV; 1998. p. 1005–6.

7. Toskić-Radojičić M, Jovanović I, Varjačić M, Nonković Z.Preparation and testing of mucoadhesive gels with metro-nidazole in cellulose carriers. In: Zhang Li-He, DuchêneD, Nagai T, editors. Proceedings of the Symposium on"Natural Origin Substances in Drug Formulation", 1998

November 4–6; Beijing, China. Beijing: Capsugel® andNagai foundation; 1998. p. 107–8.

8. Jovanović I, Toskić-Radojčić M, Nonković Z, Varjačić M. Invitro testing of the metronidazole stability in sodium car-boxymethyl cellulose gel. Arh Farm 1998; 48(6): 770–1.

9. Sweetman S, editor. Martindale: The complete drug refer-ence. 33rd ed. London: Pharmaceutical Press; 2002.

10. Norling T, Lading P, Engstrom S, Larsson K, Krog N,Nissen SS. Formulation of a drug delivery system basedon a mixture of monoglycerides and triglycerides for usein the treatment of periodontal disease. J Clin Periodontol1992; 19(9 Pt 2): 687–92.

11. Ciancio SG. Site specific delivery of antimicrobial agentsfor periodontal disease. Gen Dent 1999; 47(2): 172–8,181.

12. Lie T, Bruun G, Boe OE. Effects of topical metronidazoleand tetracycline in treatment of adult periodontitis. J Peri-odontol 1998; 69(7): 819–27.

13. Greenstein G, Polson A. The role of local drug delivery inthe management of periodontal diseases: a comprehensivereview. J Periodontol 1998; 69(5): 507–20.

14. Yugoslav Pharmacopoeia 2000. Belgrade: Federal Insti-tute of Public Health & Contemporary Administration;2000. (Serbian)

15. Pharmacopoeia SFRJ 1984. Belgrade: Federal Institute ofPublic Health; 1984. (Serbian)

Rad je primljen 30. IX 2004. god.

A b s t r a c tToskić-Radojičić M, Nonković Z, Lončar I, Varjačić M. Vojnosanit Pregl 2005; 62(6):

: 453−459.

ASSESSMENT OF THE FEASIBILITY OF THE FORMULATION OFPREPARATION FOR THE GROWTH INHIBITION OF METRONIDAZOLE-RESISTANT STRAINS ISOLATED FROM THE PERIODONTAL POCKETS

Introduction. Topical metronidazole benzoate preparations, applied directly intothe space between the teeth and periodontal tissue, are the treatment of choice forperiodontal pockets. Oleogels and hydrogels, as the biomucoadhesive bases forthe manufacturing of these preparations, were developed in our previous trials. Theaim of our latest research was to develop a preparation that would solve the prob-lem of inhibiting the metronidazole-resistant anaerobic strains, isolated from theperiodontal pockets. Methods. Metronidazole-resistant strains were isolated fromthe periodontal pocket swabs, using the established susceptibility testing. Furthertesting of the antimicrobial activity of the prepared formulations was performed bythe membrane-free diffusion method in agar gel. Oleogels and hydrogels weretested with: tetracycline (2.5%), metronidazole (25%), and metronidazole benzoate


(40%), as well as with oleogels and hydrogels containing the combination of 2.5%tetracycline and 40% metronidazole benzoate. Results. Satisfying results wereachieved with the preparation containing 2.5% tetracycline along with metronida-zole benzoate. The main fact revealed by this study was that there was no syner-gism in tetracycline and metronidazole benzoate activities, if the strain was sus-ceptible to both active substances. Conclusion. The best results in the inhibition ofthe growth of metronidazole-resistant anaerobic strains were obtained by 2.5% tet-racycline and metronidazole benzoate preparations in oleogel base.

K e y w o r d s : technology, pharmaceutical; metronidazole;tetracycline; gels; periodontal pocket; drugresistance, microbial.

Correspondence to: Marija Toskić-Radojičić, Vojnomedicinska akademija, Institut za farmaciju, Crnotravska 17, 11 040Beograd, Srbija i Crna Gora, Tel: +381 11 3609 211.

Documents

Ispitivanje mogućnosti formulacije preparata za inhibiciju rasta … · 2007. 8. 14. · Milomir Varja čić§ ... (tabela 1) predstavlja apsorpcionu bazu iz koje se, u konta-ktu