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UNIVERSIDAD VERACRUZANA.
INSTITUTO DE MEDICINA FORENSE.
“ESTUDIO COMPARATIVO DE LA PREVALENCIA DE HELICOBACTER PYLORI PRESENTE EN EN ALUMNOS DE ODONTOLOGIA Y CONTADURIA”
ANTEPROYECTO
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN MEDICINA FORENSE
DIRECTOR: Ángel Augusto Aguirre Gutiérrez
PRESENTA
(Iván Arturo Quijano García)
BOCA DEL RÍO, VER. 15 de octubre del 2014
2
INDICE
1.- Introducción……………………………………………...….. 3
1.1.- Helicobacter Pylori……………………………………….. 3
1.1.1.- Historia…………………………………………………… 3
1.1.2.- Características………………………………………….. 4
1.1.3.- Sangre………………………..…………………………… 5
1.1.4.- Papel del helicobacter pylori en la enfermedad
ácido péptica…………………….……………………………… 7
1.1.5.- Técnicas de detección de helicobacter pylori……. 8
1.1.5.1.- Técnicas invasivas………………………………….. 9
1.1.5.2.- Técnicas no invasivas……………………………… 11
1.1.6.- Helicobacter pylori y enfermedad laboral………… 12
2.- Planteamiento del Problema…………………………….. 13
3.- Justificación………………………………………………… 14
4.- Objetivo general…………………………………………… 14
5.- Objetivos específicos……………………………………… 15
6.- Hipótesis…………………………………………………..… 15
7.- Criterios de inclusión…………………………………….. 16
8.- Criterios de exclusión……………………………………. 16
9.- Criterios de eliminación……………………………….... 16
10.- Flujo grama……………………………………………….. 17
11.- Universo del trabajo y toma de muestra…………….. 18
12.- Análisis estadístico……………………………………… 20
13.- Cronograma………………………………………………. 21
14.- Bibliografía……………………………………………….. 22
3
1. INTRODUCCIÓN.
1.1 HELICOBACTER PYLORI.
1.1.1 HISTORIA
Las enfermedades infecciosas de etiología bacteriana constituyen una
problemática importante en el campo de la salud pública. El Helicobacter Pylori, es
un microorganismo que ha sido intensamente estudiado por su relación directa
con las enfermedades gastroduodenales y cuyo descubrimiento ha llegado a
ocupar un lugar importante en el quehacer médico y científico internacional.
En 1981. Marshall y Warren hicieron un estudio prospectivo en pacientes
sometidos a endoscopia oral. En ese trabajo, realizado en el Royal Perth Hospital
de Australia, probaron la presencia de bacterias helicoidales en la superficie de la
mucosa gástrica en el 98 % de las gastritis crónicas y en el 80 % de los pacientes
con úlcera gástrica, mediante frotis teñido con tinción de plata de Warthin-Starry
(Warren 1983, Marshall 1984a).
En un principio Marshall sugirió al género Spirillum y posteriormente propuso
el nombre formal de Campylobacter pyloridis. En 1987 el nombre se modificó a
Campylobacter pylori (Marshall, 1987).
Posteriormente estudios de secuenciación de la región 16S del RNA
ribosómico demostraron que la especie denominada Campylobacter pylori era
distinta de las especies de Campylobacter descritas hasta entonces. En 1989 se
adoptó la nueva denominación de Helicobacter, pasando a denominarse
Helicobacter pylori (Goodwin, 1989).
4
1.1.2 CARACTERISTICAS.
El género Helicobacter junto con Campylobacter, Arcobacter, Sulfurospirillum
y Wollinella forma parte de la clase Epsilobacteria en la subdivisión Thiobacteria
de la división Proteobacteria (Cavalier-Smith, 2002). El género fue propuesto por
primera vez en 1989 e incluyó a las especies Helicobacter pylori y Helicobacter
mustelae, primeras bacterias aisladas de la mucosa gástrica humana y de los
hurones, respectivamente (Goodwin, 1989).
El Helicobacter Pylori es un bacilo gramnegativo, curvado y microaerofílico
que se encuentra en la mucosa gástrica del estómago humano. Tiene una
morfología espiral en forma de sacacorchos cuando se encuentra en la mucosa
gástrica y menos espiral cuando crece en medios artificiales. Esta forma se puede
perder en los cultivos más viejos o sometidos a situaciones no favorables para su
crecimiento adoptando forma cocoide. Presenta un tamaño de 0,5 a 1,0 micras de
ancho y de 3 micras de largo. Tiene de 2 a 6 flagelos monopolares, fundamentales
para su movilidad, y que están recubiertos por una vaina de estructura lipídica,
igual que la membrana externa, que parece tener la misión de proteger a los
flagelos de su degradación del medio ácido (Amieva, 2008).
Su temperatura óptima de crecimiento se produce a 37 ºC, aunque puede
desarrollarse en un rango de 35 a 39 ºC en microaerofilia, y para su cultivo se
requieren medios suplementados con suero o sangre entre el 5% y 10%, los
cuales pueden actuar como fuentes adicionales de nutrientes y la protegen de
efectos tóxicos de los ácidos grasos de cadena larga. El efecto de estos ácidos
grasos también puede ser evitado por la adición de suplementos como β-
ciclodextrinas, IsoVitaleX o por la adición de carbón activado en el medio de
cultivo (Mégraud et al., 1995).
Aunque el Helicobacter Pylori es homogéneo en cuanto a sus características
bioquímicas, presenta una importantísima variabilidad antigénica. Esto es debido a
5
que existen muchos genes que codifican proteínas de membrana y además entre
ellas pueden darse distintos procesos de recombinación.
La bacteria se presenta en todo el mundo y en individuos de todas las
edades. Estimaciones conservadoras sugieren que aproximadamente la mitad de
la población mundial se encuentra colonizada por esta bacteria. En este sentido,
dicho microorganismo está vinculado a la alta incidencia mundial de las patologías
mencionadas con un promedio de Hp del 60%, siendo una de las infecciones de
mayor propagación a nivel mundial (Kabris, 2004).
Ahora bien el contagio por Helicobacter Pylori se puede dar de dos maneras:
Oral-Oral y Fecal-Oral. En la vía oral pudiera ser encontrada en placa dental
(Dowsett et al., 1999). Es por eso que bajo esta premisa se afirma que la placa
dental constituye un reservorio de reinfecciones pos-tratamiento en sujetos con
gastritis crónica (Manson et al., 1993). Por ello, diversos autores se han abocado
a estudiar la presencia de dicho microorganismo en la cavidad bucal,
principalmente en placa dentobacteriana como reservorio de Helicobacter pylori.
1.1.3 SANGRE.
La sangre es un tejido conectivo líquido, que circula por capilares, venas,
arterias, aurículas y ventrículos de todos los vertebrados. Su color rojo
característico es debido a la presencia del pigmento hemoglobínico contenido en
los eritrocitos.
Es un tipo de tejido conjuntivo especializado, con una matriz coloidal líquida y
una constitución compleja. Tiene una fase sólida (elementos formes), que incluye
a los eritrocitos (o glóbulos rojos), los leucocitos (o glóbulos blancos) y las
plaquetas, y una fase líquida, representada por el plasma sanguíneo. Estas fases
son también llamados componentes sanguíneos, los cuales se dividen en
componente sérico (fase líquida) y componente celular (fase sólida).
6
Su función principal es la logística de distribución e integración sistémica,
cuya contención en los vasos sanguíneos (espacio vascular) admite su
distribución (circulación sanguínea) hacia prácticamente todo el organismo.
La sangre consta de una parte líquida, el plasma sanguíneo, en el que se
encuentran elementos formes (las células sanguíneas) en suspensión.
La sangre es de color rojo debido a la presencia de hemoglobina en los
hematíes. Su viscosidad y su densidad están relacionadas con la cantidad de
hematíes y su presión osmótica, sobre todo, con su contenido en proteínas. Su pH
se encuentra entre 7.35-7.45.
El volumen de sangre circulante o volemia es la cantidad total de sangre que
tiene un individuo y representa aproximadamente el 8% del peso corporal (5.5 L
en un hombre de 70 Kg y 250 ml en un recién nacido que pese 3.2 Kg). Del
volumen sanguíneo total, alrededor de 1 litro se encuentra en los pulmones, 3
litros en la circulación venosa sistémica y el litro restante se reparte entre el
corazón, las arterias sistémicas, las arteriolas y los capilares.
El plasma sanguíneo es un líquido amarillento claro constituido por un 95%
de agua y el 5% restante por diversas sustancias en solución y suspensión. Estas
sustancias incluyen: iones minerales (sodio, potasio, calcio, cloro.....), pequeñas
moléculas orgánicas (aminoácidos, ácidos grasos y glucosa) y proteínas
plasmáticas (albúminas, fibrinógeno....). En condiciones normales, las proteínas
del plasma constituyen el 7-9% del plasma (6-8 g/100 ml), destacando tres
grandes grupos de proteínas: albúminas, globulinas y factores de la coagulación
como el fibrinógeno y la protrombina.
Las albúminas son las más pequeñas y abundantes y representan el 60% de
las proteínas del plasma. Las sintetiza el hígado y actúan como transportadoras de
lípidos y hormonas esteroides en la sangre, siendo responsables de la mayor
7
parte de la presión osmótica (presión oncótica) que regula el paso de agua y
solutos a través de los capilares.
Las globulinas representan el 40% de las proteínas del plasma. Se dividen en
α-globulinas, β-globulinas y γ-globulinas. Las α y β-globulinas se sintetizan en el
hígado y transportan lípidos y vitaminas liposolubles en la sangre. Las γ-globulinas
(Gammaglobulinas) son anticuerpos producidos por las células plasmáticas y
resultan fundamentales en la defensa del organismo frente a las infecciones.
El fibrinógeno es un importante factor de la coagulación. Es sintetizado por el
hígado y representa el 2-4% de las proteínas del plasma.
Normalmente, la composición del plasma se mantiene siempre dentro de unos
límites seguros desde un punto de vista biológico, gracias a diversos mecanismos
homeostáticos (homeostasia = equilibrio).
Distinguimos entre plasma y suero:
• El plasma es la parte líquida de la sangre sin coagular.
• El suero es el líquido sobrenadante que queda cuando la sangre total se coagula,
por lo que tiene una composición similar a la del plasma, aunque sin fibrinógeno ni
otros factores de la coagulación.
Existen 3 tipos de células en la sangre:
• Glóbulos rojos o eritrocitos o hematíes
• Glóbulos blancos o leucocitos: Granulocitos o leucocitos granulares
(neutrófilos, eosinófilos y basófilos). Agranulocitos o leucocitos agranulares
(linfocitos y monocitos)
• Plaquetas o trombocitos.
8
1.1.4 PAPEL DEL HELICOBACTER PYLORI EN LA ENFERMEDAD ACIDO PEPTICA.
El helicobacter pylori (H. pylori), es un bacilo gramnegativo y microaerofílico
que coloniza la mucosa gástrica humana (Marshall et al., 1984). Esta bacteria es
el principal factor etiológico para el desarrollo de la gastritis crónica, la úlcera
péptica y el adenocarcinoma gástrico y se estima que infecta a casi la mitad de la
población mundial (Go MF et al., 2002).
Los pacientes infectados por H. pylori presentan una gastritis histológica, la
cual está presente también en el 95% de los pacientes con una úlcera duodenal y
en el 80% de los pacientes con una úlcera gástrica (Kuipers EJ et al., 1995). Se
calcula que el 15% de los pacientes con una gastritis desarrollan una enfermedad
ulcerosa a lo largo de su vida.
Estudios epidemiológicos describen que prácticamente el 100% de las úlceras
duodenales y el 70-80% de las úlceras gástricas están producidas por H. pylori. En
el caso de la úlcera gástrica, si se excluye aquellas producidas por la ingesta de
AINES, el porcentaje es también cercano al 100% (Kuipers EJ et al., 1995).
La gastritis puede desarrollarse sin manifestaciones o bien originar la
expresión clínica propia de gastritis aguda como son dolor epigástrico, náuseas y
vómitos entre otros.
Algunos estudios sugieren que el helicobacter pylori esté presente en la
cavidad bucal como consecuencia del reflujo gástrico; ocasionado por la gastritis,
y por ello se encuentre como parte de la microbiota transitoria, que como un
residente normal (Madinier et al., 1997).
Debido a esto se ha informado que en algunos pacientes la colonización bucal
por la bacteria podría representar un factor de riesgo para la reinfección
9
gastrointestinal posterior a la terapia antibiótica provocando una nueva
colonización a nivel gástrico (Madinier et al., 1997).
Estudios han tratado de determinar la prevalencia de infección por H. pylori en
odontólogos de países en vías de desarrollo con mayores tasas de infección
comparados con la comunidad local por estar expuestos a secreciones gástricas y
a la saliva (Medina et al., 2005).
1.1.5 TECNICAS DE DETECCION DE HELICOBACTER PYLORI.
No existe un único método específico para diagnosticar a los pacientes
infectados por H. pylori, sin embargo; es importante a la hora de elegir el método
de detección emplear la estrategia más adecuada para cada paciente.
La elección de la técnica apropiada para diagnosticar la infección por H. pylori
depende de varios factores, como son: la sensibilidad y especificidad de la técnica,
el costo y disponibilidad de la misma. Existen dos tipos de técnicas; invasivas y no
invasivas, y cada una de ellas tiene varios métodos para detectar la presencia de
Helicobacter Pylori:
1.1.5.1 TECNICAS INVASIVAS.
a) Ureasa.- Es una prueba rápida de tipo cualitativa y que sirve para la
determinación de la enzima ureasa en una pequeña muestra de mucosa
gástrica. En un tubo que contiene un indicador de cambio de pH y urea, se
coloca la pieza de biopsia, si dicha muestra presenta actividad ureasica, se
hidroliza la urea y se forman iones de amonio, aumentando el pH y
produciendo cambio de color.
10
La especificidad de esta prueba es alta; además de su sencillez, rapidez y
bajo costo esta técnica es ideal para el diagnóstico inicial de la infección en
pacientes sometidos a endoscopia.
b) Histología.- Esta técnica consiste en observar a los microorganismos a
través de cortes histológicos con diferentes tinciones. Es un método
sencillo en donde se puede determinar la densidad de la colonización.
Existen diversos tipos de tinciones siendo los más utilizados los que son a
base de hematoxilina-eosina (Fawcett PT et al., 2004), la de Warthin-Starry
con nitrato de plata (Raica M et al., 1996), y la tinción con azul de metileno
la cual ha sido sustituida por la tinción de Giemsa (Trakarnvanich V et al.,
2007).
c) Cultivo.- Para el aislamiento de H. pylori se han utilizado cultivos que
contienen agar, como caldo cerebro-corazón, Columbia, Brucella, Wilkins-
Chalgren y Mueller-Hinton. Todos estos medios son suplementados con 5-
10 % de sangre de caballo, carnero o humana u otros aditivos, como la
hemina, isovitalex, ciclodextrina y almidón; además de una combinación de
al menos 4 antibióticos selectivos (Lee S.G et al., 2007).
La base de agar Columbia suplementada con 7 % de sangre y los
antibióticos trimetoprima, vancomicina, cefsulodina y anfotericina B, ha sido
la más empleada para el aislamiento de H. pylori (Chomvarin C et al.,
2006).
El cultivo microbiológico es necesario para la identificación definitiva del
microorganismo, además esta técnica es la única que permite obtener y
conservar cepas para la purificación de antígenos específicos y para
realizar estudios posteriores de genómica y proteómica.
11
Sin embargo; en nuestro país no se realizan cultivos de H. pylori de forma
regular y muy pocos estudios han incluido el cultivo microbiológico como
técnica para detectar la infección por H. pylori (Gutiérrez B et al., 2005).
d) Identificación del ADN bacteriano (PCR).- La tecnica consiste en sintetizar
muchas veces un pedazo o fragmento de ADN, en este caso el de el
helicobacter pylori, utilizando una polimerasa que puede trabajar a
temperaturas muy elevadas, ya que proviene de la bacteria Thermus
aquaticus que vive a altas temperaturas (79oC a 85oC), de ahi su nombre
comercial más conocido: taq polimerasa.
Cuando hacemos una reacción de PCR simulamos lo que sucede en una
célula cuando se sintetiza el ADN y en el tubo se mezclan todos los
ingredientes necesarios para hacerlo: la polimerasa, el ADN del
microorganismo, los oligonucleótidos, llamados también primers y de los
cuales se utilizan diferentes iniciadores de secuencia para amplificar varios
genes como: el gen urea que codifica la enzima ureasa (Clayton C et al.,
1991), el gen glmM que codifica para una fosfoglucosamina mutasa entre
otros; sin embargo, el gen glmM es el más empleado para el diagnóstico de
H. pylori. (Lu JJ et al., 1999).
La mayoría de los métodos tienen 100 % de sensibilidad, y estudios
sugieren que la PCR es válida para confirmar la erradicación del
microorganismo y para detectar los fallos de las múltiples terapias
empleadas en la erradicación de este patógeno (Lottspeich C et al., 2007).
1.1.5.2 TECNICAS NO INVASIVAS.
a) Serología.- La serología se basa en la detección de anticuerpos séricos de
clases IgG o IgA contra antígenos específicos (Sabbi T et al., 2005). Es
una técnica de elección para detectar la infección por H. pylori en un
12
número grande de individuos, en cualquier país, si se tienen en cuenta su
buen desempeño, su sencillez y su costo. Sin embargo, se debe tener en
cuenta que esta técnica no es útil para evaluar la erradicación de la
bacteria después de realizada la terapia específica y, además, cualquier
prueba serológica deberá siempre ser validada en la población donde se
piensa hacer extensivo su uso.
b) Detección de antígenos en heces fecales.- Se realiza mediante técnicas
inmunoenzimaticas de los antígenos del H. pylori en las heces y poder asi
dar un diagnóstico inicial de la bacteria y confirmar la erradicación de la
misma después del tratamiento. Existen diversos juegos comerciales
basados en la detección de antígenos en heces fecales, recientemente, un
juego inmunocromatográfico que detecta a la enzima catalasa, en su
estado nativo en heces fecales, fue desarrollado y empleado en el
diagnóstico de la infección por H. pylori en niños asintomáticos y personas
de edad avanzada (Cárdenas VM et al., 2008).
c) Detección de H. pylori en placa dental.- Estudios han evaluado la saliva y la
placa dental como posibles muestras no invasivas para el diagnóstico de H.
pylori empleando diversas técnicas. El cultivo de la bacteria pocas veces
ha sido positivo; sin embargo, la PCR ha reportado buenos resultados
cuando se han empleado la saliva y la placa dental como muestras (Kignel
S et al., 2005).
El análisis de la placa dental puede ser otra opción, para el diagnóstico
temprano de infección y el seguimiento de casos con reflujo
gastroesofágico. Otro beneficio de esta prueba es que no requiere de
endoscopia o algún procedimiento quirúrgico.
La elección de la técnica apropiada para diagnosticar la infección por H.
pylori en la placa dentobacteriana depende de varios factores, como son: la
13
sensibilidad y especificidad de la técnica, el costo y disponibilidad de la
misma, así como la estrategia que se vaya a seguir con los pacientes.
1.1.6. H. PYLORI Y ENFERMEDAD LABORAL.
B. W. Loster demostró cómo los dentistas con más de 15 años de profesión
sufrían un aumento significativo de la presencia de la bacteria HP en el surco
gingival, en comparación con los dentistas cuya experiencia laboral era menor,
(Loster et al., 2009).
Aun así, existe menor prevalencia de infección por Helicobacter pylori en
odontólogos en comparación con gastroenterólogos, en el momento en el que
ambos superan los 11 años de ejercicio profesional (Konturek SJ et al., 2006).
Parece ser que la exposición a secreciones gástricas de pacientes Helicobacter
pylori positivo es una causa más importante de transmisión persona a persona que
el contacto con la saliva.
En cuanto a la relación entre el Helicobacter pylori presente en la cavidad bucal
y el del estómago, gracias a los recientes estudios realizados mediante el análisis
por PCR, se ha observado una estrecha relación en pacientes que presentan
gastritis e infección por Helicobacter pylori y la presencia de éste en la cavidad
bucal (Izzeddin R et al., 2010).
Dado que las cepas aisladas en saliva y placa dental son idénticas a las del
estómago, la boca podría ser un foco de reinfección para el , y de contagio para el
odontólogo (Czesnikiewicz-Guzik M et al., 2005); por ello, como bien dice D. Y.
Graham: «El único Helicobacter pylori bueno es un Helicobacter pylori muerto»
(Graham DY et al., 1988).
Diferentes trabajos concluyen que la infección por Helicobacter pylori en
profesionales de la Odontología que trabajan en la cavidad bucal es infrecuente.
No hallándose una mayor prevalencia de infección en dentistas, enfermeras ni
14
estudiantes de Odontología en comparación con sus controles (Peters C et al.,
2011). Pero los estudios fueron realizados con muestras pequeñas,
estadísticamente no significativas. Por tanto, la relación entre la colonización de
Helicobacter pylori en la cavidad oral y la patología digestiva descrita en los
dentistas ha sido pobremente investigada (Feldman et al., 1998).
2.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA:
La bacteria Helicobacter pylori es un bacilo gram negativo, flagelado, ureasa
positiva, que reside bajo la mucosa gástrica. Gracias a su actividad ureasa
metaboliza la urea produciendo dióxido de carbono y amoníaco que le permite
anidar en el tubo digestivo.
El Helicobacter pylori está presente en cavidad bucal como consecuencia del
reflujo gástrico; la placa dental vendría a ser reservorio de dicho microorganismo,
sugiriendo que el ambiente bucal podría constituir una vía potencial para su
transmisión.
Igualmente algunos pacientes con colonización bucal por la bacteria, podrían
representar un factor de riesgo para la reinfección gastrointestinal posterior a la
terapia antibiótica.
Este microorganismo a nivel de la placa dental podría representar un riesgo
para la reinfección posterior a la terapia antibiótica. Tras curas erradicadoras, el
Helicobacter pylori desaparecería del estómago y persistiría en sarro y faringe.
El Helicobacter pylori es un patógeno habitual en sarro, por lo que se sugiere que
pueda ser causa de enfermedad profesional en odontólogos. Los
gastroenterólogos y odontólogos en su rutina diaria están expuestos a esta
bacteria.
15
3.- JUSTIFICACIÓN:
Son pocos los estudios existentes sobre el tema que demuestren una mayor
prevalencia relacionada con el Helicobacter pylori en los profesionales de la
Odontología como riesgo profesional.
En nuestro estado se presentan altos índices de enfermedades
gastrointestinales, y deben relacionarse en parte, a la infección producida por esta
bacteria, la cual puede residir de forma habitual en cavidad oral o bien encontrarse
de forma transitoria en placa dental debido al reflujo gástrico.
Dada la gravedad del tema, es necesario realizar más estudios basados en la
evidencia científica, que demuestren o desmientan la asociación entre el contagio
de helicobacter pylori y el ejercicio de nuestra profesión odontológica.
El objetivó fundamental de dicho estudio será determinar el grado de
prevalencia de Helicobacter Pylori presente en estudiantes de odontología y de
contaduría como fuente de infección o de riesgo profesional.
4.- OBJETIVO GENERAL: Comparar la prevalencia de Helicobacter Pylori entre
los estudiantes de 1° y 9° semestre de Odontología y los estudiantes de 1° y 9°
semestre de contaduría.
5.- OBJETIVOS ESPECIFICOS: -Clasificar los sujetos de muestra de acuerdo al semestre que cursan; grupo 1 y
grupo 2.
-Determinar la prevalencia de Helicobacter en la placa dentobacteriana en el
grupo de primer semestre.
16
-Determinar la prevalencia de Helicobacter en la placa dentobacteriana en el
grupo de noveno semestre.
-Comparar la prevalencia de ambos grupos.
-Comparar la prevalencia por sexo y grupo
-Determinar el número de individuos del primer y noveno semestres con síntomas
de gastritis y presencia de H. Pylori en placa dentobacteriana..
- Determinar el número de individuos del primer y noveno semestres con síntomas
de gastritis y sin presencia de H. Pylori en placa dento-bacteriana.
-Determinar el número de individuos del primer y noveno semestres sin síntomas
de gastritis y sin presencia de H. Pylori en la placa dento-bacteriana.
6.- HIPOTESIS: Si existe una mayor prevalencia de Helicobacter Pylori en
alumnos que cursan el noveno semestre y que han estado en mayor contacto con
pacientes, que en alumnos que cursan el primer semestre y aun no tienen
contacto con pacientes, entonces la profesión odontológica es un factor de riesgo
para el contagio con Helicobacter Pylori.
7.- CRITERIOS DE INCLUSION.
v Alumnos de 1° semestre de la Facultad de Odontología de la Universidad
Veracruzana Región Veracruz.
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v Alumnos de 9° semestre de la Facultad de Odontología de la Universidad
Veracruzana Región Veracruz.
8.- CRITERIOS DE EXCLUSION.
v Estudiantes de la Facultad de Odontología de la Universidad Veracruzana
Región Veracruz que no sean de 1° y 9° semestre. v Estudiantes de 1° semestre con tratamiento con antibióticos y compuestos
que contuviesen bismuto u omeprazol, durante dos semanas previas al
examen.
v Estudiantes de 9° semestre con tratamiento con antibióticos y compuestos
que contuviesen bismuto u omeprazol, durante dos semanas previas al
examen.
9.- CRITERIOS DE ELIMINACION.
v Los estudiantes que no estén de acuerdo en participar en el estudio. v Los estudiantes que no estén de acuerdo en firmar el consentimiento
informado.
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METODOLOGIA. FLUJOGRAMA
ESTUDIO COMPARATIVO DE LA PREVALENCIA DE HELICOBACTER PYLORI PRESENTE EN PLACA
DENTOBACTERIANA EN ALUMNOS DE PRIMERO Y NOVENO SEMESTRE DE LA FACULTAD DE
ODONTOLOGIA
GRUPO 1 1° sem
CuesNonario Obtencion de la muestra de placa dentobacteriana
Extraccion de ADN PCR
% de prevalencia de Helicobacter Pylori en alumnos
de 1° sem.
Tincion de Giemsa
GRUPO 2 9° sem
CuesNonario Obtencion de
placa dentobacteriana
Extraccion de ADN PCR
% de prevalencia de Helicobacter Pylori en alumnos
de 9° sem.
Tincion de Giemsa
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11.- Universo del trabajo y toma de muestra.
• Estudio de tipo descriptivo.
• Muestra por conveniencia. Estudiantes de la Facultad de Odontología de la Universidad Veracruzana Región
Veracruz de 1° semestre y 9° semestre.
• Sujetos de estudio:
Estudiantes de 1° semestre: 120
Estudiantes de 9° semestre: 100
Las muestras de placa dentobacteriana serán obtenidas de los estudiantes de
1° y 9° semestre (grupo 1 y grupo 2) de la Facultad de Odontología de la
Universidad Veracruzana, Región Veracruz, previo consentimiento por escrito para
ser incluidos en el estudio.
ü Se les realizara un cuestionario sobre aspectos de su higiene oral, así
como aspectos relacionados datos de gastritis que padezcan, número
de pacientes explorados (solo 9 ° sem), medidas preventivos en el
manejo de pacientes e instrumental (solo 9 ° sem).
ü Luego se les hará un examen clínico para determinar el índice de placa
mediante pastillas reveladoras (eritrosina al 0,5% Plac-Control®,
Dentaid).
ü Finalmente se procederá a la toma de muestra de placa dental de
ambos grupos mediante raspado con cureta estéril de Gracey de áreas
diferentes de la superficie dental, tanto interdentales como
subgingivales por no estar barrida por el fluido salival y por ser un medio
20
básicamente anaerobio, y supragingivales correspondiente a la
superficie dentaria de zonas vestibulares posteriores (molares y
premolares) y linguales anteroinferiores por tener menos tensión de
oxígeno.
ü Las muestras serán depositadas en un tubo con 0.3ml de solución
Buffer TAE (Tris ácido acético EDTA ph 8) para su traslado y
congeladas a -20°C.
ü Una vez que se tengan las muestras se procederá a realizar un frotis de
placa dentobacteriana a base tinción de giemsa.
ü Se realizará la extracción de ADN de H. pylori para la realización de la
técnica de PCR a partir de las muestras de placa dentobacteriana.
Descripción:
El diseño de los oligonucleótidos se realizará tomando en cuenta como base la
secuencia del gen que codifica para el RNAr 16 s de Helicobacter pylori y se
realizará comparación múltiple con algunos organismos relacionados tanto
filogénicamente como en la enfermedad.
La placa recogida se colocó en un recipiente tipo eppendorf que contendrá
solución salina (NaCl) al 0,9%. El material se conservara congelado en el
laboratorio, para la posterior extracción del ADN bacteriano.
Una vez descongelada la muestra de cada paciente, se realizara la
centrifugación durante diez minutos a 7.000 rpm, seguido de suspensión del pellet
celular con 600µL de solución de lisis, conteniendo 3µL de proteinasa K. En una
segunda etapa, las muestras se colocaran en baño María a 55ºC durante 3 horas.
Tras estas fases, se procedera a la extracción del ADN, añadiendo 600µL de
fenol, se agitara durante 1 minuto y centrifugara durante 1 minuto. La fase acuosa
se transferira a otro tubo, y enseguida se realizara la extracción clorofórmica,
añadiéndose (600µL) al recipiente, que se agitó durante 1 minuto y se centrifugó
21
durante 1 minuto. Se transferira la fase acuosa a otro tubo y se continuara con la
extracción clorofórmica, añadiendo 600µL de cloroformo al recipiente, que se
agitara durante 1 minuto y se centrifugara el mismo período de tiempo. Una vez
pasada la fase acuosa a otro recipiente, se añadiran 300µL de isopropanol frío y
sera congelado a una temperatura de -20ºC. En otra sesión, el contenido del
recipiente se centrifugara durante 20 minutos a 12.000 rpm y 4ºC. A partir de esta
etapa se descartara el líquido, se suspendera en 50µL de H20 de Milli-Q estéril y,
finalmente, se pasara a un gel de agarosa al 0,8%.
PCR. Para a identificar a H. pylori se ampliara una región específica del ADN
ribosomal 16S de la bacteria. Para eso se utilizara un par de iniciadores (primers)
denominados HP01 y HP02, cuyas secuencias seran HP01: CTG GAG AGA CTA
AGC CCT CC, HP02: ATT ACT GAC GCT GAT TGT GC. Estos iniciadores
amplifican un fragmento de bajo peso molecular (109 pares de bases). Para todas
las muestras de ADN, provenientes de la placa, se preparara una mezcla que
contendrá cerca de 200mg de ADN total, 50pmol de cada iniciador, el tampón de
la Taq polimerasa (Gibco, NY, USA) con concentración final de Tris-HCl 10 mM,
pH 8,4, KCl 50mM y MgCl2 3,0 mM, 200µM de cada desoxinucleótido trifosfatado
y 2 unidades de Taq polimerasa (Gibco, NY, USA). Las amplificaciones se
realizaran con el termociclado, utilizando un ciclaje de 30 ciclos con 1 minuto a
92o C, como paso de desnaturalización, 1 minuto a 57oC para unir el primer al
ADN y 2 minutos a 72o C como paso de extensión. Tras el ciclaje, los productos
amplificados se pasaran a un gel de agarosa al 2%, se someterán a eletroforesis
con 100V, durante aproximadamente 1-2 horas en tampón Tris-Borato, a pH 8,0,
en presencia de bromuro de etidio. Tras la eletroforesis, el gel se analizara con luz
ultravioleta, para visualizar las bandas cromosómicas amplificadas.
22
12.- ANALISIS ESTADISTICO. El análisis estadístico se llevara a cabo mediante la prueba de Pearson
para ambos grupos a fin de determinar en cuál de los dos grupos hay
mayor presencia de helicobacter pylori.
23
CRONOGRAMA
FECHA ACTIVIDAD
Agosto 2013 – Abril 2013 Conclusión del anteproyecto
Mayo 2014 – Agosto 2014 Muestreo
Julio 2014 - Diciembre 2014 Análisis de resultados
Enero 2015 - Julio 2015 Integración de Tesis
.
24
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