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MODELO FÍSICO DE LOS PARÁMETROS Y EFECTOS HIDRODINÁMICOS
INVOLUCRADOS EN UNA SEPARACIÓN ÓPTIMA DE CÉLULAS USANDO
UNA TÉCNICA CAMPO-FLUJO (S-SPLITT)
Iván Camilo Navarrete Quecano
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Física
Bogotá, Colombia
2013
MODELO FÍSICO DE LOS PARÁMETROS Y EFECTOS HIDRODINÁMICOS
INVOLUCRADOS EN UNA SEPARACIÓN ÓPTIMA DE CÉLULAS USANDO
UNA TÉCNICA CAMPO-FLUJO (S-SPLITT)
Iván Camilo Navarrete Quecano
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ciencias-Física
Directora:
Ph.D. María Marcela Camacho Navarro
Codirector:
Ph.D. Mauricio Hoyos Hoyos
Grupo de Investigación:
Grupo de Biofísica y Biología de Membranas.
Avalado por Centro Internacional de Física (CIF) y Universidad Nacional de Colombia.
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Física
Bogotá, Colombia
2013
Por su esfuerzo y su desvelo, por su ejemplo
y ternura, por todo lo que compartimos en
esta foránea existencia con el amor más
absoluto. Por todas sus enseñanzas sobre
todo la de tener valor y perseverar para
conocer. A mis padres y hermano mío.
A una mujer única con quién compartimos el
amor por la vida, la ciencia y la física: Mi
Adru.
Agradecimientos
A la profesora María Marcela Camacho Navarro, gracias por el apoyo recibido a lo largo
de esta grata estadía, por permitirme aprender muchas cosas en Biofísica, y propender
experiencias académicas que me hicieron crecer, gracias a sus aportes y correcciones,
pero sobre todo por permitirme trabajar en el laboratorio de biofísica, grupo de Biofísica y
Biología de membranas.
Al profesor Mauricio Hoyos por sus aportes y correcciones, muchas gracias por abrir las
puertas de su laboratorio en París, por la información y formación suministrada en Splitt y
en la construcción de canales S-Splitt.
Al Centro Internacional de Física por permitirme estar en un centro de investigación
independiente y único en su tipo, por el acceso a sus laboratorios y equipos, al igual que
por el apoyo suministrado por sus funcionarios y cuerpo administrativo.
A la Universidad Nacional de Colombia por brindarme buenas experiencias académicas,
al igual que docentes de calidad a los cuales agradezco la formación en estos años.
A Colciencias1 por darme la oportunidad de contar con un apoyo económico durante el
transcurso de este trabajo.
1 Camacho M, Sánchez M, Gómez MP, Stuhmer W. (2010) Estudios de la membrana de la vacuola
parasitófora de Leishmania. 519-2010 Banco proyectos Salud-nacional Colciencias, 222851928951, Código
Hermes 13002.
VIII
Al Laboratoire Du Physique et mecanique du mileaux heterogenes (LPMMH) en el marco
de cooperación ECOS NORD - Colciencias 2, me ofreció la posibilidad de llevar a cabo
una pasantía de investigación en tan reconocido centro.
Agradecimientos a mis compañeros del laboratorio de Biofísica y Biología de Membranas
por sus enseñanzas y apoyo directo en el trabajo, en especial a Michael García, Carolina
Ochoa, Lina Taboada, July Buitrago, Yenny Lozano, gracias a todos los compañeros del
grupo de Biofísica y Biología de Membranas que apoyaron el trabajo.
Un agradecimiento especial a mi colega y amigo Abelino Vargas pues gracias a las
discusiones planteadas alrededor del trabajo fue posible madurar conceptos e ideas que
hicieron posible su realización.
2 Camacho M, Hoyos M. Utilización de la levitación acústica para la separación y clasificación de células.
Convocatoria para conformar un banco de elegibles para el intercambio internacional de investigadores e innovadores en el marco de la formulación o de la ejecución de proyectos de investigación año 2011. ECOS-Colciencias.
Resumen y Abstract IX
RESUMEN
Este trabajo reporta un modelo de separación y los parámetros físicos necesarios para
enriquecer fracciones de un organelo intracelular llamado vacuola parasitófora PV. La PV
es generada al interior de macrófagos (células del sistema inmune) de la línea celular
J774.A1 al ser infectados por el parásito Leishmania amazonensis. Para la separación se
usó la técnica de separación hidrodinámica llamada Splitt thin flow fractionation acoplada
a una celda de separación Step-Splitt.
Se determinaron los parámetros propios (densidad, tamaño, forma), de esta línea celular
sin infección, en infección por el parásito L. amazonensis y luego de ruptura mecánica.
Además se determinaron las propiedades físicas del fluido transportador en el dispositivo
Step-Splitt (densidad, viscosidad dinámica) a dos temperaturas diferentes en el rango
fisiológico.
Con el hallazgo de estos parámetros y con criterios de sedimentación gravitacional de los
cuerpos celulares se diseñó, construyó y simuló mediante el paquete CFD Fluent® la
celda de separación, para analizar la estabilidad hidrodinámica y los parámetros que
optimizan la separación de estos organelos celulares.
Palabras clave: Separación celular, Técnica Splitt, Celda S-Splitt, Vacuola Parasitófora,
Leishmania amazonensis, Macrófago infectado, Ruptura Celular, Simulación,
Estabilidad Hidrodinámica.
X
Abstract
This manuscript reports a fractionation model using a hydrodynamic cell separation
technique called Splitt Thin Flow (SPLITT) coupled to a Step-Splitt mechanism to
separate a fraction of an intracellular organelle called the parasitophorous vacuole (PV) of
Leishmania amazonesis. It reports the physical parameters involved in the enrichment of
PVs which are generated inside macrophages (immune system cells) after interaction
with the parasite Leishmania. The physical parameters (density, size, shape) of the
macrophage-like mammalian cell line J774.A1 were measured in control conditions and
after infection. Differences in density, size and shape were found between these two
groups of cells and after mechanical disruption of infected cells. The physical parameters
of the carrier fluid (density and dynamical viscosity) were also measured at two different
temperatures within the physiological range. Based on the parameters found and
gravitational sedimentation criteria over the cell bodies, a Step Splitt cell was designed
built and simulated using the CFD Fluent® Package to analyze the hydrodynamic stability
and the potential parameters to achieve organelle separation.
Keywords: Cell fractionation, Splitt Technique, Parasitophorous Vacuole, Leishmania
amazonensis, infected macrophage, Cell’s rupture, Simulation, hydrodynamic stability.
Contenido XI
Contenido
1 LA TÉCNICA SPLITT .............................................................................................. 20 1.1 La celda de Splitt ................................................................................................ 20 1.2 Flujos en el canal y manipulación de planos de separación. ............................... 23 1.3 Mecanismo de transporte por sedimentación gravitacional ................................. 28 1.4 Mecanismo de Separación Step-Splitt................................................................. 30 1.5 Consideraciones. ................................................................................................ 32 2 PROPIEDADES FÍSICAS DE CÉLULAS Y FLUIDO VECTOR. ............................... 33 2.1 Vacuolas parasitóforas y el ciclo de vida del parásito Leishmania amazonensis. 33 2.2 Obtención de vacuolas parasitóforas en cultivo de macrófagos. ......................... 35 2.3 Disrupción mecánica de macrófagos infectados. ................................................ 37
2.3.1 Dispositivo de Ruptura. ........................................................................... 38 2.3.2 Montaje para ruptura de membrana celular ............................................ 39
2.4 Parámetros físicos de interés posteriores a una ruptura celular. ......................... 42 2.4.1 Densidad ................................................................................................ 44 Elaboración de rangos de densidad ..................................................................... 45 Medición de densidad: macrófagos infectados, sin infectar y vacuolas parasitóforas con detritos celulares. ..................................................................... 47 2.4.2 Tamaños ................................................................................................ 51 Tamaño macrófagos sin infección ........................................................................ 53 Tamaño macrófagos infectados ........................................................................... 54 Tamaño vacuolas parasitóforas y detritos celulares ............................................. 55 2.4.3 Forma. .................................................................................................... 58
2.5 Caracterización de parámetros en el flujo transportador ..................................... 61 2.5.1 Viscosidad del Fluido vector. .................................................................. 62
2.6 Medida de densidad Para la solución Salina NaCl .............................................. 65 2.7 Caracterización y fabricación de la celda de separación. .................................... 66 3 MODELO FISICO DE LA SEPARACIÓN................................................................. 73 3.1 Fuerzas sobre las células en la celda Step-Splitt. ............................................... 73 3.2 Velocidad de sedimentación para cuerpos celulares. .......................................... 75 3.3 Estabilidad hidrodinámica y tasas de flujo. .......................................................... 77 3.4 Separación de vacuolas parasitóforas de Leishmania amazonensis. .................. 83 4 Conclusiones. ......................................................................................................... 87 5 Recomendaciones .................................................................................................. 89 6 Anexo 1: Solución numérica de las ecuaciones que caracterizan el movimiento de un fluido. ................................................................................................................... 91 6.1 Solución numérica de las ecuaciones de Navier-Stokes ..................................... 93
Proceso de solución numérico ............................................................................. 95
Contenido XII
Lista de tablas
............................................................................................................................. Pág. Tabla 2-1 En valores de SIP 9:1 junto a los valores de medio (RPMI o NaCl 0,15M) que
se intercalan para generar las capas de los respectivos gradientes, en la medida de
macrófagos a los que se les ha aplicado ruptura celular. ....................................................
Tabla 2-2 valores de SIP 9:1 junto a los valores de medio (RPMI o Nacl 0,15M) que se
intercalan para generar las capas de los respectivos gradientes .................................... 47
Tabla 2-3 Medición de macrófagos infectados, no infectado e infectados rotos, por cada
vial .................................................................................................................................. 51
Tabla 2-4 Cconcentraciones y peso molecular de los compuestos utilizados en la solución
salina empleada como fluido transportador en Splitt ....................................................... 62
LISTA DE SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS
Símbolo Término Unidad
A Área m2
A Salida superior del canal
′ Entrada superior del canal
B Salida inferior del canal
B Ancho del canal m
b’ Entrada inferior del canal
Diámetro celular m
Diámetro critico m
Infinitesimal de tiempo s
Infinitesimal de espesor m
Infinitesimal de largo m
Fuerza de flotación N
Fuerza de arrastre N
Fuerza de empuje N
Fuerza gravitacional N
G Aceleración debida a la gravedad m/s2
L Longitud del canal s-splitt m
Re Número de Reynolds 1
Flujo total m3/s
Flujo por la salida a m3/s
Flujo por la salida b m3/s
Flujo en la región de transporte m3/s
U Velocidad de sedimentación m/s
Velocidad critica inducida m/s
Velocidad media del flujo total
Volumen del medio de cultivo m3
Volumen solución isotónica m3
Flujo total m3/s
Flujo por la salida a m3/s
Flujo por la salida b m3/s
Espesor del canal S-Splitt m
Posición del plano OSP m
′ Posición del plano ISP m
Espesor de la región de transporte M
Flujo total m3/s
Flujo por la salida a m3/s
14 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
Letras Griegas
Abreviaturas
Símbolo Término Unidad
Δ Diferencias de presiones Pa
Δ Flujo transversal de partículas m3/s
Densidad de la partícula Kg/m3
Densidad del fluido Kg/m3
Abreviatura Término
VP Vacuola Parasitófora SS Canal Step Splitt ISP Inlet Splitting plane OSP Oulet Splitting plane DT Detritos Celulares M Macrófago sin infectar
M Macrófago con infección PBS Solución salina Fosfatada Buferada ISP Inlet Splitting plane NaCl Clorúro de Sodio
SIP solución isotónica de Percoll™
15
16 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
Introducción
La separación y selección celular son procesos de importancia crítica en una variedad de
aplicaciones biomédicas y biotecnológicas que incluyen (i) diagnóstico (ii) terapia, e (iii)
investigación en biología celular (Gossett et al. 2010). En este último aspecto es
necesario realizar separaciones de material biológico cada vez más específico, valioso,
frágil y en algunos casos difícil de separar. Para afrontar estas dificultades desde los
años 60 hasta la actualidad las técnicas y mecanismos de separación se han optimizado
logrando generar variantes cada vez más adecuadas para la separación y el bioanálisis
de muestras biológicas como ADN, proteínas, virus y células (Roda et al. 2009), todo
esto aprovechando propiedades físicas de la muestra como: tamaño, forma, densidad,
impedancia eléctrica o acústica; junto a propiedades físicas de reacción a un campo de
fuerzas, ligado a propiedades hidrodinámicas. Entre los campos de fuerza más
empleados en las técnicas de separación y selección encontramos campos de tipo
gravitacional (Levin et al. 1992), eléctrico (Gale et al. 2001), magnético (Fuh et al. 1998).
ó acústico (Ratier et al 2010), cada uno de ellos con eficiencias características en el
resultado de la separación.
Los procesos de separar y seleccionar materiales particulados, no sólo tienen lugar en
células o material biológico, sino que pueden ser aplicados también en diversos
materiales como macromoléculas (Hoyos et al. 2003), partículas de almidón de trigo
(Contado et al. 2000), polímeros sintéticos y coloides industriales (Cölfen et al. 2000), al
igual que en emulsiones farmacéuticas (Fuh et al. 1997). Por tal motivo, los esfuerzos por
mejorar dichos procesos se convierten en un problema de interés a nivel investigativo,
que incluye a disciplinas como la Biología y la Física, esta última en relación a la
hidrodinámica y la microfluídica.
17
Cuando se realizan procesos de separación de cualquier material particulado, el
resultado obtenido puede ser útil para diferentes finalidades y catalogado de dos
maneras según el método que se emplea. Si el objetivo de la separación es analizar y
caracterizar a cualquier componente constitutivo de la mezcla en la búsqueda de un
parámetro físico específico, como el coeficiente de difusión de un virus (Reschiglian et al.
2005), su masa molar y densidad (Yonker et al. 1981), el método se denomina analítico.
Por otra parte si el objeto de la separación es el de obtener material que será reutilizado
posteriormente para otro fin como por ejemplo realizar una separación de células
infectadas de no infectadas para posterior tratamiento (Gascoyne et al 2004), el método
en este caso se denomina preparativo.
Las técnicas de separación que competen en este trabajo tienen su origen en el método
analítico, bajo una familia de técnicas de separación hidrodinámica inventadas por J.
Calvin Giddings en los años 60 bajo el nombre de Field Flow Fractionation o FFF
(Giddings et al 1966), con el fin de hacer separación y análisis de muestras con
partículas en el rango macromolecular y supramolecular, utilizando como mecanismo de
separación un canal rectangular de una entrada y una salida de flujo tipo Hele-Shaw
(Figura 1.1), donde su largo y ancho son mucho mayores que su espesor (Giddings et
al.1966), en este tipo de canal se introduce y aspira muestra suspendida en un fluido, por
medio de bombas de inyección y succión, lo cual genera transporte de las partículas en
suspensión a través del volumen del canal; durante este transporte, las partículas son
sujetas a un campo de fuerzas ortogonal al flujo, lo que genera un gradiente de
concentración transversal el cual depende de los parámetros físicos de las partículas en
suspensión como: tamaño, densidad y rigidez; parámetros que generan diferentes
tiempos de residencia dentro del canal y permiten una caracterización del material en
suspensión .
Las técnicas de separación (FFF) iniciales tenían problemas para identificar, medir y
eventualmente separar componentes de partículas biológicas, dado que se hace
necesario procesar un volumen elevado de material por unidad de tiempo (troughoutput).
Esta limitante llevó al mismo Giddings en los años 80 a optimizar la técnica (Giddings et
al. 1985) adicionando una entrada y una salida al mecanismo de separación, llevando la
técnica al funcionamiento en continuo. Al momento de realizar esta modificación surge
una nueva técnica de separación conocida como Split-Flow Thin Fracionation (Splitt).
18 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
Sobre la cual se hacen nuevas reformas en el mecanismo de separación por parte del
laboratorio du Physique et Mechanique du Mileux Heterogenes, elevando la eficiencia de
la celda en términos hidrodinámicos y generando un nuevo mecanismo llamado Step-
Splitt (Figura 1.8) (Patente Hoyos et al. 2011). Éste mecanismo, se probó con éxito en
separaciones de partículas inertes de látex y sílice, extendiéndose para la separación de
algunos cuerpos biológicos como levaduras y bacterias (Callens et al. 2008).
En el laboratorio de Biofísica y Biología De Membranas del Centro Internacional de Física
(CIF), para la separación de cuerpos y organelos celulares concretos es necesario contar
con un método de separación celular económico, que no utilice membranas ni filtros que
atente contra la viabilidad celular, que sea capaz de procesar grandes poblaciones de
células en continuo sin cambiar sus condiciones fisiológicas, donde sea posible reutilizar
los cuerpos celulares enriquecidos para otros fines en el laboratorio, como la práctica de
la electrofisiología, en donde se necesitan condiciones ideales en la membrana celular
para realizar sellos (electrodo-membrana) y medir así las propiedades eléctricas de la
célula. En la experiencia del laboratorio el mecanismo de separación Step-Splitt, ha sido
utilizado con éxito en la separación de macrófagos infectados con el parásito Leishmania
amazonensis de aquellos que han fagocitado perlas de sílice (Hoyos et al. 2009),
logrando enriquecer macrófagos con infección para su posterior cultivo. Dado que la
técnica de separación es satisfactoria en la separación celular, los esfuerzos se
encaminan ahora al potencial que puede tener Step-Splitt en el enriquecimiento de un
organelo intracelular llamado vacuola parasitófora; el cuál es de importancia en las
investigaciones actuales del laboratorio de Biofísica y Biología de Membranas en el
entendimiento de la relación huésped hospedero durante la infección de macrófagos o
células del sistema inmune con el parásito Leishmania, en donde enriquecer vacuolas
parasitóforas podrá facilitar el estudio electrofisiológico de este organelo infectado por
parte del grupo, así que este trabajo busca:
Generar un modelo de separación de vacuolas parasitóforas haciendo uso de la técnica
Step-Splitt, teniendo en cuenta las propiedades físicas de los cuerpos celulares que
puede estar involucrados en el separación: macrófagos infectados, no infectados y restos
celulares con vacuolas parasitóforas, realizando un canal de separación basado en los
parámetros físicos encontrados, haciendo un análisis de los parámetros óptimos para
preservar la estabilidad hidrodinámica.
19
En función de este objetivo, el trabajo se desarrolla en tres capítulos. En el capítulo I, se
realiza una descripción de la técnica Splitt y su mecanismo de separación, para luego
introducir la variante realizada en el mecanismo Step-Splitt, mostrando así los principios
físicos generales que estructuran a esta familia de técnicas y su funcionamiento. En el
capítulo II, se hace una descripción de los cuerpos celulares de interés en la separación:
macrófagos infectados con el parásito Leishmania amazonensis, no infectados y
expuestos a ruptura celular donde se encuentran vacuolas parasitóforas, reportando los
parámetros físicos encontrados experimentalmente: tamaño, forma y densidad, para
realizar a la base de estos parámetros físicos una cámara S-Splitt miniaturizada. En el
capítulo III se expone el modelo para la separación de vacuolas parasitóforas de
Leishmania amazonensis en una celda Step-Splitt de 360 µm de espesor utilizando los
parámetros físicos encontrados experimentalmente en el capitulo anterior, realizando una
simulación con el paquete CFD Fluent™ donde se estudia el comportamiento
hidrodinámico en la celda para dos flujos específicos, para posteriormente reportar las
condiciones hidrodinámicas favorables para contar con estabilidad hidrodinámica in situ
mediante un experimento de intensidad de fluorescencia de células infectadas con
Leishmania, finalizando con el reporte de los flujos que optimizan la separación de
vacuolas, utilizando como criterio de separación el diámetro crítico de los cuerpos
celulares.
20 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
1 LA TÉCNICA SPLITT
1.1 La celda de Splitt
El mecanismo y la técnica de separación Splitt Flow Thin Fractionation pertenecen a una
familia de métodos de separación hidrodinámica inventada por Calvin Giddings en los
años 80, en respuesta a la necesidad de separar cantidades elevadas de material
particulado en continuo (Giddings et al. 1985), realizando separación de dicho material
transversalmente y no longitudinalmente como en técnicas previas (Giddings et al.,1966).
La celda de separación Splitt está constituida geométricamente por un canal rectangular
tipo Hele-Shaw, el cual se caracteriza por tener un espesor w pequeño con respecto al
largo L y ancho B, garantizando estabilidad hidrodinámica si
, (Figura 1-1).
Figura 1-1 Celda tipo Hele Shaw: el largo y el ancho b es mucho mayor al espesor .
21
El montaje experimental para realizar separación de material particulado mediante la
técnica Splitt se constituye por (Figura 1-2a): Un canal rectangular tipo Hele-Shaw, el
cual está constituido por una entrada ′ donde por la acción de una bomba de precisión
hay ingreso de muestra o material particulado suspendido en un liquido vector con un
flujo ; otra entrada por donde hay ingreso de de un líquido vector con flujo
el cuál en primer lugar focalizará a las partículas que entraron por ′ hacia la pared
superior del canal, para luego transportarlas en sentido longitudinal para que por la
acción de un campo de fuerzas transversal al flujo las partículas puedan para ser
separadas y recolectadas en las salidas a ó b del mecanismo de separación, para ser
monitoreadas, contadas y medidas por un detector (Figura 1-2b). El campo de fuerza en
mención puede ser: gravitacional, acústico, eléctrico o magnético.
Figura 1-2a Montaje experimental para realizar una separación splitt
Figura 1-2b Vista de un corte transversal de la cama splitt con las respectivas zonas importantes en la
separación: zona de transporte, planos divisores de entrada (ISP) y salida (OSP) junto a los respectivos divisores de flujo.
22 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
El canal posee en dirección longitudinalmente opuesta a las entradas de muestra, dos
salidas y , por las cuales saldrá líquido con la muestra separada por acción del campo
de fuerzas, a tasas de flujo y respectivamente. La suma entre los flujos de
entrada y salida deben ser equivalentes al flujo total y dado que la densidad del fluido
vector no varía al interior del canal se respeta el principio de conservación de la masa, y
por tanto principio de conservación del flujo, descrito por las ecuaciones (1.1) y (1.2)
(1.1)
(1.2)
El flujo en la zona de transporte es de importancia en la separación Splitt, pues como
se verá en la siguiente sección, la razón entre el flujo de entrada y el de la zona de
transporte dará paso a la formación de un plano divisor de entrada ISP con
espesor , de manera análoga sucede en la salida formando un plano divisor de salida
OSP; así que los planos virtuales importantes en la teorización de la separación son: ver
(Figura 1.2)
Plano Inlet Spliting plane (ISP): Este plano virtual se genera cuando el fluido
que ingresa por la entrada tiene contacto con una de las caras del divisor de
entrada; manipulando la magnitud del flujo en la entrada respecto al flujo
total se forma un plano ISP con un espesor .
Plano Outlet Spliting Plane (OSP): Este plano virtual se genera cuando el fluido
de la salida tiene contacto con el divisor de salida. Al manipular la magnitud de
la tasa volumétrica del flujo en la salida con respecto al flujo total , este
plano ISP variará su espesor .
Zona de Transporte: esta zona está determinada por la diferencia entre el
espesor del plano ISP y el espesor del plano OSP respecto al espesor
total del dispositivo de separación, el espesor de esta zona se nota como .
Estas zonas son de importancia, pues al momento de hacer un procedimiento de
separación de material particulado, es necesario conjugar de manera correcta la elección
de una tasa volumétrica de flujo total y su distribución en las entradas y salidas para
23
formar planos ISP y OSP con espesor adecuado. Para hacer que según las propiedades
físicas de las partículas en separación lograr según la necesidad experimental que
partículas con menor movilidad salgan por y las más móviles sean capaces de alcanzar
la pared inferior y salir por . En la siguiente sección se mostrará cómo las tasas
volumétricas de flujo están relacionadas con los espesores de estos planos divisores.
1.2 Flujos en el canal y manipulación de planos de separación.
La correcta formación de los planos divisores de flujo de entrada ISP y salida OSP, no
solo dependen de la correcta elección de los flujos en la entrada y salida en el
mecanismo Splitt, sino también de conseguir durante la construcción una razón
conveniente entre el largo L y el espesor para qué , la cuál debe estar dentro del
rango de 50-1000 para generar una celda Hele-Shaw (Callens 2005) (Figura 1-). Esto se
logra mediante la correcta configuración de laminas Mylar (polyethylene terephtalate),
que separadas entre sí por una lámina de metal genera los divisores de flujo de entrada
y salida (Figura 1-3); a la vez que se genera una cámara hueca con espesor que debe
estar de acuerdo con el criterio de celda tipo Hele-Shaw.
Figura 1-3 Configuración de la Celda Splitt. (Giddings. 1980), (Fuh et al. 1998).
24 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
Si se garantiza este tipo de celda los efectos de borde pueden ser despreciados y se
garantizará cierta estabilidad hidrodinámica, originándose al interior del canal un perfil de
velocidad parabólico o de tipo Poiseuille a una distancia de la pared; éste perfil a bajos
números de Reynolds es descrito por la expresión:
(1.3)
Siendo la velocidad media transversal a través del canal Splitt, la cual está
relacionada con el flujo total , siendo es el espesor de la celda y el ancho
del canal. Teniendo en cuenta que la velocidad en la entrada , puede ser escrita en
términos de la integral desde el inicio de la pared hasta el espesor del perfil
parabólico de velocidad dado en la ecuación (1.3), la velocidad en la entrada se
expresa como:
(1.4)
De manera que mediante es posible relacionar la tasa de flujo en la
entrada , con la razón entre los espesores para el plano de entrada
(1.5)
Separando y resolviendo la integral (1.5) se obtiene
(1.6)
Como con (1.6) se obtiene una solución, en forma cúbica:
(1.7)
Razón entre los espesores La solución de ésta ecuación cúbica para
está dada por
w
x
w
xvxv 16
dxw
x
w
xBvaQ
aw
0
2
2
6'
aw
dxxvBaQ
0
'
2
32
326'
w
w
w
wBvaQ aa
3
2
2
23'
w
w
w
w
Q
aQ aa
25
(1.8)
En la expresión (1.8) está dado por
(1.9)
Donde está confinado en el rango . Estas dos expresiones (1.8) y (1.9)
son de utilidad pues permiten realizar una relación gráfica (Figura 1-4) de las tasas de
flujo contra la tasa de espesor , las cuales son al momento de desarrollar
un experimento con esta técnica pues siendo conocido el espesor total del canal , el
flujo total y la forma en la que se distribuye este flujo total en la entrada , se
puede conocer el espesor del plano divisor de flujo ISP.
Figura 1-4 Relación entre las tasas de flujo de entrada, para encontrar el espesor del plano divisor de entrada ISP a una tasa de flujo total especifica.
En general la gráfica muestra una tendencia lineal para valores mayores a 0,2; es decir si
la razón aumenta, la zona ISP se hace más grande, obligando a la zona de
2
1
3
senw
wa
12cos
t
a
Q
Qar
26 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
transporte a disminuir su espesor y viceversa, si disminuye lo mismo sucede
con , por tal motivo la zona ISP se hace más pequeña y la zona de transporte
aumentará su espesor. El mismo procedimiento se utiliza para calcular la relación entre
las tasas de salida y su espesor, para el cálculo de espesor del plano de salida OSP.
A nivel experimental se propone seguir la metodología expuesta en (Callens et al. 2005),
pero aplicada a un canal S-Splitt (Figura 1-), en donde se puede dejar la zona ISP fija y
variar paulatinamente el plano OSP, ocasionando un cambio en el espesor de la zona de
transporte (Figura 1-); o como otra alternativa, dependiendo de las necesidades en la
separación, desplazar la zona de transporte en el espesor total del canal (Figura 1-),
dependiendo de la resolución que se quiera alcanzar y de las propiedades físicas de las
partículas que se estén separando.
Figura 1-5 Variación del plano de salida OSP dejando el plano de entrada ISP fijo , (Callens et al. 2005)
Figura 1-6 Desplazamiento de la zona de transporte variando tanto el ISP como el OSP
27
La optimización para una separación depende de: hacer una variación adecuada de las
tasas de flujo para tener control preciso de los espesores en planos de entrada ISP y
salida OSP, del conocimiento de los parámetros físicos de la muestra a ser separada, en
conjunción de un manejo de las dimensiones y características en la celda de separación,
todo lo anterior permite proponer condiciones para optimizar el proceso de separación de
material particulado utilizando la técnica Step-Splitt, en este caso para la separación de
objetos biológicos concretos, los cuales serán descritos en el siguiente capítulo.
Uno de los parámetros físicos de interés para lograr optimizar la separación del material
particulado es conocer una expresión para la velocidad de sedimentación de dicho
material, pues como se verá a continuación es un parámetro determinante para
seleccionar condiciones experimentales como el flujo total , las tasas de flujo en las
entradas y salidas para generar planos de entrada y salida ISP y OSP, con espesores
que se ajusten a la necesidad de la separación. Por lo que se realizara a continuación un
28 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
análisis del mecanismo de transporte transversal por sedimentación de las partículas por
acción de un campo gravitacional.
1.3 Mecanismo de transporte por sedimentación gravitacional
El modo de transporte por sedimentación gravitacional (Figura 1-) es aplicable para
entender el movimiento de las partículas cuando son llevadas por un flujo axial a lo largo
del canal, con una velocidad y por una velocidad de transversal de sedimentación
bajo la acción de un campo de fuerzas que puede ser gravitacional (Springton et al.
1987), eléctrico (Narayanan et al. 2005) o acústico (Ratier et al. 2010). En este caso si
las partículas tienen propiedades físicas que las hacen tener una velocidad de
sedimentación mayor a la velocidad de flujo , estas contarán con un tiempo de
residencia suficiente en la celda de separación para llegar al plano de división OSP y de
esta manera salir por b.
Figura 1-7 Mecanismo de sedimentación en la celda de separación Splitt.
Para poder representar este modo de transporte en ecuaciones, se debe imaginar que el
flujo en el canal está dividido por en una serie de secciones o laminas diferenciales ,
de manera que las párticulas con velocidad de transporte migrarán hacia una lámina
específica en un tiempo .
(1.10)
U
dxdt
29
Esta ecuación representa las dos componentes de movimiento que posee la partícula en
el canal en modo de sedimentación, relacionando las dos componentes del movimiento
mediante la siguiente expresión tenemos:
(1.11)
Teniendo en cuenta que la tasa volumétrica de flujo que experimentaria una particula en
una lámina está dada por la relación
(1.12)
Introduciendo de (1.12) en (1.11), se genera una expresión que muestra la relación
lineal entre la taza de flujo en el eje (longitudinal) y el elemento de flujo , sobre el
cual la partícula realiza su migración transversal.
(1.13)
Integrando con respecto a la longitud se obtiene
(1.14)
Expresión con la que se puede determinar de manera teórica el lugar por el que saldrá la
partícula, si esta saldrá por , si las partículas saldrán por y por , y
en cualquier otro caso saldrán por . La magnitud de la velocidad de sedimentación en
(1.14) se encuentra mediante la ley de Stokes:
(1.15)
Δ es la diferencia de densidad entre el líquido vector y la partícula, es el diámetro de
la partícula en cuestión, es la aceleración debida a la gravedad y
es el factor de
esfericidad y es la viscosidad.
U
dxvdtvdt z
z
dxvbdQ z
bU
dQdz
bULQ
0
2
18f
f
gdU
30 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
Con la velocidad de sedimentación descrita por la ecuación (1.14) es posible calcular la
velocidad de sedimentación crítica en la cual la población de partículas se dividirá en
los sub extremos y
(1.16)
Mediante las ecuaciones (1.15), (1.16) y encontrando tenemos:
(1.17)
Según (1.17) las partícula que posean un serán capaces de atravesar la zona de
transporte y salir por , mientras que las que poseen menor tamaño saldrán por , como
se verá en el ultimo capitulo la expresión de diámetro critico será utilizada como criterio
de separación.
Otro mecanismo de transporte es el de difusión, para el caso particular de las
separaciones que se realizan en este trabajo, todas las partículas son de tamaños
mayores a las especies brownianas ( ) por lo que los efectos difusivos no se
tendrán en cuenta. A continuación se finalizará el primer capítulo describiendo el
dispositivo de separación con el que se desarrollarán los experimentos.
1.4 Mecanismo de Separación Step-Splitt
Aunque la técnica Splitt convencional de los años 80 ha mostrado gran versatilidad y
eficiencia en la separación de material particulado; el mecanismo y los efectos físicos que
producen la separación siguen siendo estudiados en la actualidad, encontrándose
efectos que hacen que la separación no sea la esperada teóricamente (Williams et al.
2003):
En la práctica, el corte crítico entre las poblaciones en la salida no es
exactamente el predicho en la teoría.
Las deformaciones que toma el flujo cerca de las paredes del canal, pueden
perturbar el perfil parabólico.
bL
QUc
2/12
3
fpBLg
tQdc
31
Imperfecciones en las paredes de la celda generan fuerzas de arrastre que
reducen la velocidad de flujo en sus cercanías; lo que hace que la migración
lateral tome más tiempo, haciendo que las partículas que tendrían que salir según
la teoría por salgan por .
Una alta concentración de muestra puede degradar la separación.
Las imperfecciones geométricas en los divisores pueden causar variaciones en el
espesor del canal generando un perfil local de velocidad.
Bajo algunas condiciones, vórtices pueden causarse cerca de los divisores, lo que
puede dañar la separación.
Con el fin de disminuir los efectos hidrodinámicos no deseados algunas investigaciones
recurren a modificaciones en la celda de separación, cambiando el diseño de la celda y
su geometría. La presente tesis se basa en la modificación hecha sobre la celda Splitt
convencional, en donde son eliminados los divisores de flujo o Splitters haciendo
introducción de escalones o Steps (Figura 1-), generando lo que hoy se conoce como
celda Step Splitt (SS) (Callens et al. 2005).
Figura 1-8 Modificación geométrica de la celda Splitt convencional en Step Splitt (SS), en el círculo se muestra la esencia de la modificación.
Esta modificación no solo disminuye los efectos hidrodinámicos no deseados en las
entradas y salidas de la celda, sino que hace posible miniaturizar la celda manipulando
cualquier largo (Callens et al. 2008), conservando los mismos principios teóricos del
Splitt convencional expuesto en secciones anteriores.
Una vez se han planteado las propiedades generales y el trasfondo teórico involucrado
en la separación Splitt convencional y la descripción del cambio de geometría en el
mecanismo de separación. En el siguiente capítulo se reportan los resultados
experimentales y la búsqueda de los parámetros físicos que optimizan la separación de
32 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
vacuolas parasitóforas de macrófagos no infectados e infectados con Leishmania
amazonensis. Estudiando las propiedades de las células, de la celda de separación y del
fluido transportador, junto a una descripción de ruptura de la membrana celular para la
obtención de vacuolas, las cuales serán aisladas y purificadas por la técnica Step-Splitt.
1.5 Consideraciones.
Se realizó una descripción de la base teórica y de los fundamentos en técnica de
separación Splitt, la cual deja ciertos aspectos a tener en cuenta para realizar un modelo
de separación en células y organelos intracelulares:
Es de importancia escoger una tasa volumétrica de flujo conveniente, al igual que
una distribución adecuada de las tasas volumétricas de flujo en las entradas y
salidas, teniendo en cuenta el principio de conservación de la masa, para formar
planos (ISP), (OSP) con espesor , según la necesidad en la separación.
Se deben tener en cuenta las componentes básicas del movimiento, las cuales
son propias del modo de transporte por sedimentación gravitacional; modo que
aporta la expresión para la velocidad de sedimentación , la cual depende de
parámetros físicos propios de cada población celular. De manera que para
realizar una separación con cuerpos celulares específicos, se deben conocer
experimentalmente cantidades físicas que afinan el modelo teórico, con el fin de
predecir el lugar de salida de las partículas del canal mediante el criterio de
diámetro crítico.
Al trabajar con una celda de separación en la que se han eliminado los divisores
de flujo o Splitters, se pueden generar diseños y construcción de celdas de
tamaño reducido, lo que puede garantizar velocidades axiales altas con tasas
volumétricas de flujo relativamente bajas.
33
2 PROPIEDADES FÍSICAS DE CÉLULAS Y FLUIDO VECTOR.
La finalidad de este trabajo es buscar un modelo de separación de vacuolas parasitóforas
de Leishmania amazonensis aplicando la técnica Step-splitt, para ello se muestra que es
necesario encontrar propiedades físicas en los cuerpos celulares a ser separados. En el
capitulo anterior se mostró el fundamento teórico de la técnica de separación en el modo
de transporte por sedimentación gravitacional, donde las ecuaciones (1.15) (1.17),
muestran que para separar una población celular usando un campo gravitacional es
necesario conocer parámetros propios del objeto de interés como el tamaño, la densidad,
la forma; junto a propiedades del fluido transportador como densidad y viscosidad
dinámica.
De manera que en este segundo capítulo se documenta el proceso de extracción de la
vacuola parasitófora, mediante un proceso de disrupción mecánica de la membrana
celular en macrófagos de la línea celular J774.A1. Para luego reportar las propiedades
del cuerpo celular de interés: vacuolas parasitóforas de Leishmania amazonensis, junto a
los cuerpos celulares involucrados en el proceso de disrupción mecánica, finalizando el
capitulo con las propiedades del fluido transportador y la caracterización de la celda de
separación Step-Splitt como un parámetro de interés en la separación.
2.1 Vacuolas parasitóforas y el ciclo de vida del parásito Leishmania amazonensis.
Leishmania amazonensis es un parásito intracelular obligatorio que ingresa a un
mamífero vertebrado (incluido el hombre), después que un insecto vector del género
Phlebotomus o Lutzomyiam se alimenta de la sangre de dicho mamífero. El parásito hace
su ingreso al hospedero vertebrado en forma de promastigote extracelular, que es una
forma móvil y altamente infectiva del parásito (Figura 2-2), infectando células
mononucleares de línea fagocítica (Alexander et al. 1999) y activando a su vez la
respuesta de células del sistema inmune llamadas macrófagos. Estas células fagocíticas
profesionales inician el proceso de internalización del parasito, aislándolo en un
compartimento endosomal tardío conocido como vacuola parasitófora (VP) (Russel et al.
1995), que se caracteriza ser un compartimento con pH ácido de 4.7 a 5.2 y rico en
34 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
hidrolasas, donde el parásito para lograr sobrevivir y multiplicarse en este ambiente
biológico adverso sufre profundas adaptaciones bioquímicas y morfológicas
transformándose en un pequeño amastigote ovoide (Alexander et al. 1999), el cuál
después de dividirse realiza un proceso de salida del macrófago, ingresando en gran
número a nuevas células hospederas (Mosser et al.1997), de tal manera que cuando un
insecto se alimenta de la sangre del mamífero vertebrado, este ingiere macrófagos
infectados, donde el parásito en forma amastigote sufre de nuevo al interior del intestino
medio del insecto nuevas transformaciones bioquímicas y morfológicas a promastigote
metacíclico lo que le permite sobrevivir en el insecto vector y garantizar la continuidad
del ciclo de vida (Figura 2-1).
Dentro del esquema del ciclo de vida, éste trabajo se focaliza únicamente en las horas
post-infección donde hay formación de vacuolas parasitóforas con parásitos en forma
amastigote en su interior, ver cuadro en la (Figura 2-1), como se especifica en la
siguiente sección.
Figura 2-1 Ciclo de vida del parásito Leishmania amazonensis, tomada de (OMS)
35
2.2 Obtención de vacuolas parasitóforas en cultivo de macrófagos.
Para infectar un cultivo de macrófagos y generar vacuolas parasitóforas en su interior, se
realiza primero un cultivo de promastigotes de Leishmania amazonensis a 240 C en
medio Schneider con suplemento de suero fetal bovino al 10% (Figura 2-2), hasta
alcanzar una fase estacionaria de 107. Luego estos parásitos se exponen a células de la
línea de macrófagos peritoneales de ratón J774.A1 a 350 C y 5% de CO2 durante 4
horas, removiendo el excedente de parásitos, para luego mantener bajo incubadora la
infección hasta alcanzar 48h.
Figura 2-2 Promastigotes en cultivo, en el recuadro un parásito en forma promastigote, donde se puede ver el
respectivo flagelo.
El tiempo de post-infección elegido para la realización de mediadas de parámetros
físicos es de 48 horas, dado que experiencias previas del grupo de investigación
(Cortazar et al. 2006), muestran que a horas inferiores las vacuolas parasitóforas
muestran una mayor viabilidad, pero una mayor variabilidad; cuestión que hace difícil
separarlas en una fracción, para tiempos muestran compartimentos muy frágiles
para experimentos posteriores.
Para reconocer si el cultivo de macrófagos en infección es apropiado para la medida de
parámetros físicos, se debe reconocer bajo microscopia criterios específicos del
compartimento llamado vacuola parasitófora (Lang et al. 1994): espacios delimitados por
una membrana, con diámetros entre 10 y 20 m, con parásitos en el interior.
36 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
Para reconocer el compartimento de interés, en cada experimento de este trabajo se
realiza marcación con la sonda metacromática naranja de acridina a una concentración
de . Esta sonda permea la membrana del macrófago, marcando en verde cuando se
intercala con los ácidos nucleicos y en rojo cuando tiene contacto con compartimentos
como la vacuola parasitófora ricos en H+, donde la sonda disminuye su movilidad
cambiando su espectro de emisión a un color rojo (Antoine et al.1991), de manera que
vacuolas aisladas deben tener este marcaje rojo para garantizar de manera indirecta su
viabilidad.
En la (Figura 2-) se muestra en simultánea una micrografía adquirida por microscopía de
luz y epifluorescencia, de un macrófago de la línea celular J774.A1 infectado; donde se
evidencian las tres membranas que garantizan la supervivencia del parásito: la
membrana del macrófago (en verde), la vacuola parasitófora (en rojo) y la membrana del
parásito (pequeños puntos verdes en el interior del compartimento).
Figura 2-3. Fotografía de luz y florescencia que muestra a un macrófago que ha generado vacuolas una vez es infectado con por el parasito Leishmania Amazonensis.
Estas vacuolas parasitóforas en rojo son los organelos intracelulares a los que se les
hace medición de los parámetros físicos, para posteriormente encontrar un modelo de
separación Step-Splitt. Para lograr esto, las vacuolas parasitóforas deben ser extraídas
de los macrófagos que las contienen, mediante un proceso previo de disrupción
mecánica de la membrana celular del macrófago en presencia de un medio de lisis
compuesto por inhibidores de proteasas. Proceso que será descrito en mayor detalle la
siguiente sección.
37
Las vacuolas en estado aislado han sido de interés para las investigaciones que lleva a
cabo el Laboratorio de Biofísica y Biología de Membranas del Centro Internacional de
Física (CIF), con respecto a: el proceso de fagocitosis y la relación huésped hospedero
(Quintana et al. 2010), el proceso de salida del parásito de su célula hospedera (Niño et
al. 2003), la relación existente entre el volumen de la vacuola parasitófora y las
alteraciones de tipo morfológico, eléctrico y de permeabilidad que ésta puede inducir
sobre el macrófago (Forero et al. 1999).
Separaciones de vacuolas parasitóforas ya han sido realizadas con éxito, mediante la
técnica de gradientes de Percoll (Cortazar et al. 2006), pero en este estudio se reporta
que al aislar vacuolas parasitóforas mediante gradientes de densidad se dificulta la
posterior utilización de estos organelos en mediciones electrofisiológicas, dado que el
polímero Percoll se adhiere a la membrana de la vacuola impidiendo generar sellos de
calidad con el electrodo de medición; motivo por el cual es deseable separar con técnicas
que generen un menor daño a la muestra, de manera que se recurre a la potencialidad
de la separación por la técnica Step-Splitt.
En la siguiente sección se reporta el proceso de disrupción mecánica de las membranas
de los macrófagos infectados, como una condición importante para extraer vacuolas
viables para los experimentos de medición de parámetros físicos y pilotos de separación.
2.3 Disrupción mecánica de macrófagos infectados.
Para cualquier experimento de medición de parámetros físicos o separación de vacuolas
parasitóforas primero se debe tener acceso estas vacuolas parasitóforas, encerradas por
la membrana celular del macrófago y el citoplasma celular, en la literatura se han
propuesto diferentes métodos para la ruptura de la membrana celular y el aislamiento de
este compartimiento, donde se estandarizan las soluciones empleadas para mantener
vacuolas viables (Chakraborty et al. 1994), se separa el compartimento mediante
centrifugación diferencial y gradientes de densidad a base de Percoll (Cortazar et
al.2006). Donde es necesaria una manipulación de la muestra por tiempos extensos, una
exposición a esfuerzos mecánicos extendidos y una ruptura de la membrana celular que
depende en gran medida del experimentador. De manera que en esta sección se
propone la construcción y operación de un dispositivo de ruptura en la búsqueda de
estandarización de este proceso.
38 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
2.3.1 Dispositivo de Ruptura.
Para el dispositivo de ruptura se propone un sistema análogo a un sistema venturi,
compuesto por tres partes principales: Región de convergencia, garganta y región de
divergencia (Figura 2-4).
Figura 2-4 Representación esquemática del dispositivo de ruptura a ser empleado, este dispositivo tipo
venturi es acoplado a una jeringa de
El mecanismo de ruptura debe cumplir con ciertas condiciones para su uso en el
laboratorio: reutilizable, esterilizable, seguro para el operador evitando escapes de
muestra con parásitos. De manera que partiendo de materiales disponibles en el
laboratorio se diseñó y construyó un dispositivo de ruptura con regiones convergencia-
divergencia con dimensiones de 4,76 de diámetro y 16,76 de longitud, y una
garganta de 800 de diámetro y 4,28 de largo (Figura 2-5 a). El diámetro escogido
de la garganta fue de 800 , dado que después de realizar diferentes pruebas de
ruptura variando el diámetro su diámetro entre 1.7 mm a 450 (Figura 2-5 b), el
diámetro de 800 permitió mediante microscopia evidenciar un daño efectivo de la
membrana celular del macrófago.
(Figura 2-5) a. Dimensiones para la construcción del mecanismo, b. variación de diámetros en la garganta
39
Estos diámetros se alcanzaron mediante el acople de agujas de 26 Gauge, a puntas
metálicas en acero inoxidable y unidas por soldadura de electro plata, configurando la
punta de ruptura (Figura 2-6) que se emplea en el montaje del experimento de ruptura.
(Figura 2-6) Construcción del mecanismo de ruptura.
La estandarización en el montaje y del método de ruptura como se verá a continuación
es de importancia para obtener organelos celulares viables para ser purificados por la
técnica Step-Splitt.
2.3.2 Montaje para ruptura de membrana celular
Una vez obtenido el dispositivo de ruptura éste es acoplado a jeringas de para
configurar el montaje experimental (Figura 2-7), donde se lleva a cabo el proceso de
ruptura de la membrana celular.
(Figura 2-7), Montaje experimental para la ruptura de membrana celular.
40 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
En esta ruptura se obliga al material biológico a pasar por la garganta de 800
mientras está suspendido en un medio de lisis celular compuesto por Hepes a 20 mM,
EGTA a 0.5 mM, sacarosa a 250 mM y G-9383 0.1% (Sigma-Aldrich), en presencia de
inhibidores de un proteasas como EDTA 0.5mM, E64 2 , Pepstatina 0.1 ,
Leupeptina 0.1 mM (Chakraborty et al. 1994), a una temperatura exterior de 40C.
Durante el transporte cíclico de la muestra por el mecanismo de la Figura 2-7,
físicamente se espera que cuando el fluido pasa de la región de convergencia hacia la
región central se generen disminuciones de presión debido al aumento de velocidad del
fluido que transporta la muestra, lo que puede ir acompañado de efectos mecánicos en la
muestra como elongaciones y compresiones dado el constante cambio de presiones en
el transporte cíclico entre la región de convergencia-divergencia, a la vez que se
evidencia un gradiente de velocidades, que disminuye con respecto a eje del mecanismo,
lo que puede generar a su vez un efecto de fractura o corte por cizalla en el material
biológico suspendido en el fluido, en este caso medio de lisis celular.
Para visualizar los efectos físicos en el mecanismo de ruptura se llevo a cabo una
simulación del mecanismo utilizando un flujo de mediante el paquete CDF
Fluent® donde se puede evidenciar los cambios de velocidad (Figura 2-8) y presión
(Figura 2-9) en las tres regiones de ruptura (región de convergencia, garganta y región de
convergencia) .
(Figura 2-8) Simulación del mecanismo de ruptura a un flujo de , se evidencia el aumento de
velocidad en las tres zonas del mecanismo.
41
(Figura 2-9) Simulación del mecanismo de ruptura a un flujo de , se evidencia las diferencias de
presiones entras tres zonas de ruptura.
Al utilizar este montaje realizando transporte de células de una jeringa a otra por un
tiempo de 10 minutos se observa por microscopia el daño sobre la célula (Figura 2-10),
en donde se puede contar con organelos de las características de vacuolas parasitóforas
(Lang et al. 1994), macrófagos infectados, macrófagos sin infección y detritos celulares.
(Figura 2-10) Efecto del mecanismo de ruptura empleado sobre macrófagos infectados con L. amazonensis
Cuando se realizan micrografías de fluorescencia (Figura 2-11) mediante la sonda
naranja de acridina se puede evidenciar organelos intracelulares que han sufrido daño
42 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
mecánico y una ruptura por cizalla, pero dado que se cuenta con estructuras del orden de
6 a 7 , estas estructuras pueden ser núcleos rotos liberando su material interior, de
manera que se debe controlar la ruptura para generar un daño a la membrana celular y
no a los organelos intracelulares.
(Figura 2-11) Micrografía de fluorescencia de organelos intracelulares después de una ruptura, mediante la
sonda naranja de acridina.
Con estos experimentos es posible afirmar que después de una ruptura mecánica, para
una posible separación de vacuolas parasitóforas por Step-Splitt se tendrán tres
poblaciones, en las cuales se hace necesario conocer los parámetros físicos para una
purificación de vacuolas óptima.
2.4 Parámetros físicos de interés posteriores a una ruptura celular.
Se espera después de una ruptura mecánica de la membrana celular del macrófago
contar con tres tipos de cuerpos celulares:
Macrófagos enteros infectados (M ).
Macrófagos enteros sin infectar (M )
Vacuolas parasitóforas con detritos celulares ( ).
43
Un punto de partida para escoger los parámetros físicos que son de interés en la
separación Step-Splitt se encuentran en el modo de sedimentación gravitacional,
expuesto en la sección 1.3, mediante las relaciones que describen a la tasa volumétrica
de flujo ecuación (1.14) y la velocidad de sedimentación ecuación (1.15) junto a la
ecuación del diámetro critico (1.17) que es de gran importancia pues dará un parámetro
teórico para predecir el lugar por el cual saldrán las células en la celda de separación.
Los términos en estas ecuaciones incorporan las propiedades físicas que deben ser
encontradas experimentalmente con el fin de caracterizar a los cuerpos celulares
involucrados en la separación de las tres poblaciones que se obtienen después de
realizar disrupción mecánica en macrófagos infectados; estas propiedades son:
densidad, tamaño y forma. De igual manera las ecuaciones están escritas en términos de
las propiedades físicas del fluido transportador empleado en la separación: densidad y
viscosidad dinámica, las cuales son encontradas experimentalmente.
Los parámetros y magnitudes de la celda de separación: espesor , largo y ancho
también deben ser conocidos con certeza, para así ajustar de la manera más adecuada
posible los planos divisores de entrada y salida (ISP- OSP), garantizando según la
necesidad de la separación encontrar la tasas de flujo correctas todo lo anterior
constituye el modelo de separación, para optimizar la separación de vacuolas por el
método Step-Splitt.
(Figura 2-12) Expresiones que representan los eventos físicos y cantidades de interés para iniciar con un modelo de separación.
44 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
La Figura 2-12 muestra las expresiones y cantidades físicas que deben ser encontradas
para describir la separación en términos de un modelo de separación que describa el
movimiento de las partículas en sentido transversal del canal por sedimentación
gravitacional y el movimiento longitudinal de las partículas por medio de las ecuaciones
que describen el transporte de un fluido.
De manera que en las siguientes secciones se reporta la magnitud de los parámetros
físicos que constituyen el modelo de separación iniciando con la densidad de los cuerpos
biológicos involucrados.
2.4.1 Densidad
Para buscar la densidad de las células y de los organelos relacionados con la infección
del parásito Leishmania se utilizará una técnica que discrimina por densidad y
originalmente es usada para separación de células, organelos, virus y otras partículas
sub celulares, la cual recibe el nombre de gradientes a base de Percoll™.
PercollTM es un coloide que está recubierto del polímero polivinilpirrolidona (PVP), el cual
permite contar con ciertas especificaciones técnicas para el manejo de material biológico
como: baja viscosidad, no se introduce en las membranas biológicas, se obtienen
gradientes de densidad por centrifugación a bajas fuerzas g (Beckman™). La elaboración
del gradiente se inicia con la obtención de un rango de capas que varía de color y
densidad al ser servidas de manera conveniente en un tubo de ensayo Eppendorf™; la
densidad de cada capa se controla mediante la solución adecuada de volúmenes
apropiados de Percoll™ isotónico en volúmenes de medio de cultivo NaCl o RPMI 1640,
dependiendo el color deseado por capa (entre rojo y translúcido).
Una vez se cuenta con el rango de densidades deseado en dos tubos de ensayo, se
incorpora en cada uno de ellos tanto los especímenes a ser medidos como las perlas
calibradoras con densidad ya conocida. Así Cuando las perlas marcadoras y la muestra
con células, cuenten con una movilidad y una velocidad de sedimentación nula después
de centrifugar se dice que las partículas y la muestra han alcanzado sus puntos
isopícnicos (Figura 2-13); es decir que la densidad de la partícula se igualó con la
densidad de la capa de gradiente de exterior.
45
Figura 2-13 (a) Representación de perlas marcadoras suspendidas en un gradiente alcanzando isopícnicos en el tiempo (H- Pertof, GE Healthcare, 2007) (b) densidad de las perlas marcadoras densidad sigma™.
Una vez este equilibrio se alcance se realiza la medida de las distancias en la que quedo
la muestra con respecto al menisco o la punta del Eppendorf (Paterson et al. 2002) se
toma registro de las distancias de la muestra con respecto a la punta del Eppendorf y su
equivalente en densidad con las perlas patrón, para luego con estos registros realizar
una linealización y mediante la ecuación de la recta encontrar los puntos de densidad en
relación a la distancia en la que se alcanzó el punto isopícnico para cada componente de
la muestra. Este proceso parte como se ve a continuación de obtener un buen rango de
valores de densidad y la pericia del experimentador para servir cada una de las capas sin
que estas se mezclen.
Elaboración de rangos de densidad
Para la medición de densidad de las especies biológicas en cuestión es necesaria la
obtención de capas con densidad controlada, para lo cual se obtiene en primer lugar una
solución isotónica de Percoll™ (SIP), mediante un ajuste de osmolaridad del coloide
añadiendo 9 partes (v/v) de éste en 1 parte de NaCl 1.5 M, para luego diluir de manera
intercalada la solución (SIP) con NaCl 0,15 M y RPMI 1640 (1X) para lograr diferencias
de color entre cada capa de gradiente con una densidad particular (Figura 2-14)
46 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
Figura 2-14 Rangos de densidad alcanzados mediante la correcta solución de (SIP), de manera intercalada de RPMI y Nacl 0,15M.
Estas densidades están entre el rango de 1,010 y 1,080 g/ml dependiendo de la muestra
con la que se cuente, las relaciones entre de los volúmenes de medio y volúmenes de
(SIP) están dadas por las expresiones (2.1), (2.2) y (2.3):
(2.1)
(2.2)
(2.3)
Los resultados de estas expresiones serán tabulados para cada experimento en términos
de una densidad deseada para la capa entre 1,010 y 1,090 , la densidad del agua
y la densidad de cada medio , y
medsip
dessip
Totalmed VV
medTotalsip VVV
total
sipV
V100
%
47
Medición de densidad: macrófagos infectados, sin infectar y vacuolas parasitóforas con detritos celulares.
La medición que se reporta a continuación pretende lograr una medida de densidad para
las especies involucradas en la separación Step-splitt, posterior a un proceso de ruptura
celular: macrófagos infectados enteros ( ), Macrófagos sin infectar enteros ( ), y
vacuolas parasitóforas con detritos celulares (VP-DTC), involucrando tres mediciones en
un solo experimento, esto se realiza con el fin de asegurar las mismas condiciones para
cada una de las muestras bajo el patrón de densidad ofrecido por las perlas marcadoras;
para ello se elaboraron nueve capas de densidad con volúmenes de medio de cultivo y
solución (SIP) descritas en la (Tabla 2-).
Tabla 2-1 valores de SIP 9:1 junto a los valores de medio (RPMI o Nacl 0,15M) que se intercalan para generar las capas de los respectivos gradientes a un porcentaje de percoll dado.
Capa V
total de SIP
Medio de
cultivo
de Agua
de Medio
deseada
V medio
VSIP %
1 1 1,123 RPMI 0,996 1,0054 1,010 0,961 0,039 3,91
2 1 1,123 NaCl
0,15M 0,996 1,0046 1,020 0,870 0,130 13,00
3 1 1,123 RPMI 0,996 1,0054 1,030 0,791 0,209 20,91
4 1 1,123 NaCl
0,15M 0,996 1,0046 1,040 0,701 0,299 29,89
5 1 1,123 RPMI 0,996 1,0054 1,050 0,621 0,379 37,92
6 1 1,123 NaCl
0,15M 0,996 1,0046 1,060 0,532 0,468 46,79
7 1 1,123 RPMI 0,996 1,0054 1,070 0,451 0,549 54,93
8 1 1,123 NaCl
0,15M 0,996 1,0046 1,080 0,363 0,637 63,68
9 1 1,123 RPMI 0,996 1,0054 1,090 0,281 0,719 71,93
Suspendiendo cada una de las muestras en viales separados y llevando a centrifugación
se realiza la medida de la posición de los puntos isopícnicos alcanzados por la muestra
en cada uno de los viales, como se puede observar en la Figura 2-15, de manera que
dependiendo del estado biológico de la muestra ésta alcanza un punto isopícnico
determinado que mediante una regresión lineal que relaciona distancia y densidad es
posible encontrar la densidad de cada muestra.
48 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
Figura 2-15 Puntos isopícnicos alcanzados por macrófagos sin infección, infectados y con ruptura celular.
VIAL 1 VIAL 2 VIAL 3 PATRÓN
Tabulando y graficando las distancias para cada muestra en el vial desde la punta del vial
(Figura 2-15) con respecto a los puntos isopícnicos de las perlas marcadoras de
densidad se obtiene una gráfica a partir de la cual se hace una regresión lineal (Ecuación
2-4) para obtener la densidad de las diferentes muestras (Figura 2-16).
Figura 2-16. Regresión lineal de distancias y densidades medidas desde la punta del tubo Eppendorf en cada capa de muestra para cada vial, tanto de la muestra como de las perlas marcadoras.
49
La ecuación de la recta para la gráfica obtenida en la Figura 2-16 es:
(2.4)
De manera que los valores de densidad encontrados son los siguientes para cada vial:
Vial numero 1: (Macrófagos sin infección )
En este vial se encontró una sola capa correspondiente a los macrófagos sin infección
(2.5)
De manera que la medida de densidad para macrófagos sin infección es de
. En la (Figura 2-17) se muestra una imagen en microscopía de luz y de
epifluorescencia de la capa extraída en el gradiente, donde se puede evidenciar
mediante la sonda naranja de acridina el estado de no infección de la muestra.
Figura 2-17 Macrófagos sin infección con una densidad de
en luz y en fluorescencia
Vial numero 2: Macrófagos infectados
En este vial se encontraron dos capas de muestra una a desde la punta del
Eppendorf™ y otra a , una correspondiente a macrófagos infectados y otra a
macrófagos sin infección, esto se debe a que en el cultivo de partida no siempre se
cuenta con una infección del 100%, la densidad de macrófagos infectados es:
(2.6)
50 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
Al interpretar este resultado se puede inferir que cuando un macrófago es infectado
aumenta su volumen, motivo por el cual la densidad se hace más pequeña. En la (Figura
2-18), se muestra la imagen de fluorescencia resultante con el marcaje de naranja de
acridina, el marcaje en rojo evidencia la presencia de vacuolas parasitóforas y por tanto
de infección por parásitos Leishmania amazonensis.
Figura 2-18 Imagen de luz y fluorescencia con capa de macrófagos infectados con densidad
Vial numero 3: Macrófagos infectados expuestos a ruptura celular
En este vial se encontraron macrófagos infectados y sin infectar; con respecto al
producto de la ruptura en la muestra, se obtienen detritos celulares en el medio de las
dos capas de macrófagos con y sin infección, al no contar con una capa definida se mide
la densidad en la mitad de las capas para contar con un valor aproximado de los detritos
celulares, entre los que se puede encontrar vacuolas parasitóforas:
(2.7)
El marcaje de fluorescencia muestra células que han sufrido estrés mecánico, incluso se
evidencian pedazos de membrana, y vacuolas sueltas, ver recuadros (Figura 2-19).
51
Figura 2-19 Imagen de luz y epiflorescencia con capa de macrófagos a los que se le ha aplicado ruptura con
densidad
Los resultados de las medidas de densidad se resumen en la siguiente tabla (Tabla 2-)
Tabla 2-2 Medición de macrófagos infectados, no infectado e infectados rotos, por cada vial.
2.4.2 Tamaños
La medida de los tamaños de macrófagos infectados (M ), macrófagos sin infectar (M ),
junto a macrófagos en los que se ha aplicado ruptura celular que contiene vacuolas las
poblaciones se realiza mediante un contador Coulter es el dispositivo que se empleara en
la medición de tamaños para las especies celulares en estudio (Figura 2-20): macrófagos
infectados (M ), macrófagos sin infectar (M ), junto a macrófagos en los que se ha
aplicado ruptura celular. Este mecanismo se basa en la detección y medida de cambios
de resistencia eléctrica al paso de partículas con ciertas características de volumen por
una apertura micrométrica.
Estado del cuerpo celular en
estudio
Macrófagos sin Infectar
Macrófagos Infectados
Macrófagos rotos
Tubo No 1 Tubo No 2 Tubo No 3
Infectado 1,048±0,08 1,048±0,008
(Roto)
No infectado 1,075±0,007
52 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
Figura 2-20 Sistema de conteo Coulter Beckman empleado para medir tamaños.
En el caso particular las células en estudio son suspendidas en una solución conductora,
en este caso PBS; donde las partículas en suspensión actúan como aislantes, de tal
manera que al pasar por la apertura micrométrica de forma individual (Figura 2-21), se
genera un cambio de impedancia rompiendo el circuito entre dos electrodos, ubicados al
interior y exterior de la apertura, El número de pulsos cuando el aparato está en
funcionamiento indica el conteo de partículas, la amplitud de dicho pulso depende del
volumen de la partícula (Beckman Coulter®). Una vez que se realiza el respectivo conteo
de pulsos, el mecanismo cuenta con un software de análisis y caracterización de
partículas, el cual es capaz de hacer estadística de las partículas por tamaño.
Figura 2-21 Apertura de conteo en el dispositivo contador (Coulter® Z series).
53
Para el conteo de las células que nos compete en este estudio, se utilizó una apertura de
50 , por lo que la calibración del instrumento se realiza siguiendo el protocolo en de la
guía del usuario, con perlas calibradoras de látex de 5 .
Tamaño macrófagos sin infección
Para llevar a cabo esta medición se diluyen 300 de muestra de macrófagos de la línea
celular J744.A1 en 4 ml de PBS, teniendo en cuenta que la apertura es de 50 y la
fracción que recolecta el aparato es de 0,1 ml, de manera que el número de partículas
contado en este de volumen fue de 18082. La distribución de partículas resultante de
tamaños está dada por ver (Figura 2-22):
Figura 2-22 Número de células sin infección contadas en un rango de 12 a 22 partiendo de 300 de
muestra en 0,1ml.
Las mediciones de tamaño fueron confirmadas con microscopía de luz, utilizando una
cámara CCD en interfaz a un microscopio Zeiss® y el software AxioVision LE®, el cual
permite asignar una medida de longitud por cantidad de pixeles, mediante un proceso de
calibración previo con una escala micrométrica, la imagen correspondiente a la medición
Coulter anterior es entre 10 a 15 (Figura 2-23).
54 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
Figura 2-23 Medidas de tamaños por microscopía de luz en macrófagos sin infección
Tamaño macrófagos infectados
Mediante el mismo procedimiento con conteo Coulter™ y seguimiento por microscopía
de fluorescencia, utilizando la misma cantidad de muestra se realizó la medida de
tamaños para macrófagos que han sido expuestos a infección con el parasito Leishmania
amazonensis (Figura 2-24). En este caso la muestra posee una sedimentación rápida por
lo que la muestra debía ser agitada con frecuencia con el fin de lograr un registro de
tamaño.
Figura 2-24 Conteos de macrófagos infectados con L.amazonensis por contador Coulter
55
La imagen por microscopía muestran un aumento de tamaño en la muestra (Figura 2-25),
en esta micrografía no es evidente la marcación rojo del compartimento, dado que se
toma con un objetivo de 10X para lograr un panorama general del cuadro.
Figura 2-25 Medidas por microscopía de luz de macrófagos infectados con L.amazonensis
Se realizaron diferentes mediciones de tamaño para macrófagos con infección y sin
infección llegando a la conclusión que los efectos de la infección incrementa el volumen
del macrófago, generando en él una disminución en la densidad, esta diferenciación en
tamaño y densidad lo que es conveniente para la realización de la separación S-Splitt.
Tamaño vacuolas parasitóforas y detritos celulares
La ruptura celular en el desarrollo del trabajo experimental, trato de hacerse cada vez
más específica, para generar daño localizado en la membrana celular y minimizar el
daño en los organelos celulares. De manera que se desarrolló un cámara de ruptura
rectangular (Figura 2-26), pero conservando las dimensiones del dispositivo venturi ver
(Figura 2-a).
(Figura 2-26). Canal de ruptura con geometría rectangular.
56 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
Este canal se hizo con el fin de visualizar in situ la ruptura hecha sobre las células
infectadas realizando control de ruptura por medio de microscopía de luz y de
epífluorescencia (Figura 2-28), controlando a la vez los flujos mediante bombas, para
luego realizar conteos Coulter, las tasas de flujo empleadas fueron de 5, 10 y 20 .
(Figura 2-28) Imágenes de fluorescencia de células J774.A1 pasando dentro del canal de ruptura.
Una desventaja de utilizar bombas es la dificultad para cambiar la dirección del flujo,
aumentando el manejo de la muestra y el riesgo de contaminación.
(Figura 2-29) Tamaños de cuerpos celulares a diferentes tasas de flujo en el canal de ruptura 5, 10 y 20
.
57
De manera que refinando el método de ruptura se lograron obtener compartimentos que
conservan la característica de vacuolas parasitóforas, encontrando compartimentos de
tamaños entre 7 a 20 , (Figura 2-30), donde se puede observar compartimentos
diferenciados por una membrana con parásitos en su interior (puntos verdes dentro del
compartimento), estas imágenes son de vacuolas que se han adherido al recipiente que
las contiene, de manera que la mejor manera para obtener medidas de tamaño es de
estos organelos en suspensión; sin embargo para el desarrollo del modelo de separación
se tomará un valor medio de 13,5
(Figura 2-30) vacuolas parasitóforas diferenciados por una membrana y con parásitos en su interior, el
marcaje es del mismo color a cuando están dentro del macrófago.
Una vez se han descrito las propiedades físicas de las partículas al interior del canal, y el
proceso de ruptura mecánica, se puede da paso al reporte de las propiedades del flujo
transportador.
58 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
2.4.3 Forma.
Macrófagos infectados adheridos a la caja de cultivo.
Un cultivo de macrófagos de la línea celular J774.A1 que ha sido expuesto al parásito
Leishmania al estar adherido no cuenta con una forma definida, puede poseer
alargamientos, prolongaciones tanto de la membrana celular como del citoplasma
celular, pero se observa en general que aunque el cultivo este adherido, las vacuolas
parasitóforas en un interior conservan una geometría circular. En la Figura 2-31 se
muestra una micrografía de un cultivo en infección adherida donde se puede observar en
general el alargamiento que sufren las células y en la parte superior izquierda se muestra
un macrófago que a pesar de estar en adhesión cuenta con una vacuola circular. El
tamaño de ésta población adherida se puede incrementar de 100 a 200 .
Figura 2-31 Macrófagos de la línea celular J774.A1 adheridos a la caja de cultivo, en la parte superior un
macrófago con una vacuola parasitófora circular con Amastigotes en su interior.
59
Macrófagos infectados en suspensión
Cuando el cultivo se encuentra en suspensión los macrófagos infectados poseen una
forma con una mayor esfericidad, sin embargo se encuentra que la aproximación a la
esfericidad depende de la historia del cultivo, el estrés al que es sometido durante su
desarrollo y mantenimiento, al igual depende del tamaño de la vacuola parasitófora al
interior del macrófago y su grado de infección con respecto al número de parásitos en su
interior. En la Figura 2-32 se muestran macrófagos infectados marcados con la sonda
de fluorescencia naranja de acridina en suspensión, los cuales poseen formas que nos
permiten contar para efectos de un modelo con macrófagos infectados cercanos a una
esfera, en la parte superior de la Figura 2-32 se observa un macrófago infectado con una
vacuola parasitófora en su interior, esta vacuola aunque desplaza a el núcleo y al
citoplasma celular en general posee un geometría esférica conservada.
Figura 2-32, Macrófagos infectados en suspensión, muestran formas cercanas a una geometría esférica.
60 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
Macrófagos infectados expuestos a ruptura
Cuando se exponen macrófagos en infección al estrés mecánico del dispositivo de
ruptura (Ver Figura 2-6) con el fin de obtener la vacuola parasitófora del interior, puede
suceder que el macrófago se rompa en su totalidad dejando tras su ruptura pedazos de
membrana y otros organelos (detritos) junto a vacuolas parasitóforas (Figura 2-33 a.), o
que el macrófago no se rompa, pero dado el estrés mecánico al que fue sometido, se
generen cambios de forma, que lo alejan de una forma esférica (Figura 2-33 b-c).
Figura 2-33. a). Núcleos rotos y detritos celulares después de un ruptura celular, b) y c). Células que han
perdido su esfericidad al no desprenderse la vacuola parasitófora de su interior, d) Célula que ha sufrido
ruptura celular y su vacuola parasitófora contiene gran cantidad de Amastigotes.
De igual manera puede suceder que durante un tiempo prolongado de lisis celular se
rompan organelos celulares como núcleos (Figura 2-33 a.) y las mismas vacuolas
parasitóforas, dejando libre el contenido del núcleo o parásitos en forma amastigote
61
(Figura 2-33 d), de manera que para reducir estos efectos, contar con un mecanismo y
proceso de ruptura controlado de la membrana de los macrófagos es de importancia para
no generar consecuencias y cambios físicos que puedan degradar la separación. Con
respecto a la forma de las vacuolas parasitóforas que se han obtenido por ruptura
mecánica se observó por microscopia de fluorescencia que estas poseen un
comportamiento totalmente esférico cuando se encuentran en suspensión (Figura 2-34).
Figura 2-34 Vacuola parasitófora en suspensión.
Lo que es de utilidad en un modelo de separación; aunque se debe tener en cuenta que
en la separación hay células que no han sido completamente rotas y detritos celulares
que no necesariamente contarán con una geometría definida, por lo que a futuro se debe
evaluar el impacto de los objetos celulares que no conservan total esfericidad.
Una vez evaluados los parámetros físicos que describen a las partículas que estarán en
una separación S-Splitt (tamaño, densidad, forma), se describen las propiedades físicas
del flujo transportador, que en este caso es solución salina.
2.5 Caracterización de parámetros en el flujo transportador
Como se mencionó con anterioridad, las propiedades necesarias para lograr un modelo
de separación involucran también la búsqueda de dos parámetros específicos en el
62 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
fluido, a ser empleado en la separación Splitt, viscosidad y densidad; en este caso se
emplea, solución salina, que es obtenida bajo los siguientes compuestos (Tabla 2-).
Tabla 2-3 Cconcentraciones y peso molecular de los compuestos utilizados en la solución salina empleada como fluido transportador en Splitt
Compuesto Concentración (mM)
Peso Molecular g/mol
NaCl 145 58,44
KCl 5 74,56
HEPES 10 280
A continuación se reportan los resultados experimentales de la búsqueda de estos dos
parámetros
2.5.1 Viscosidad del Fluido vector.
La viscosidad , es la medida de la fricción interna en un fluido, mientras más grande sea
la fricción, más fuerza será requerida para generar movimiento en el fluido, esto se
representa con el principio de fuerza de cizalla (Figura 2-31)
Figura 2-31 Modelo newtoniano de placas paralelas a diferentes velocidades, al imponer una fuerza en
una de las placas, se mide indirectamente la viscosidad.
Este principio se define mediante el modelo Newtoniano de dos placas paralelas de fluido
de igual área , separadas una distancia , las cuales se mueven en la misma dirección
a diferentes velocidades y . En donde la fuerza requerida para mantener esta
diferencia de velocidad entre las placas, es proporcional al gradiente de velocidades
en el líquido, esta fuerza se denomina fuerza de cizalla y está dada por la expresión:
63
(2.8)
La cual está representando la cantidad de fuerza aplicada en un área para lograr una
componente diferencial de velocidad en todo el fluido y a la vez un gradiente de cizalla
(2.9)
De manera que la viscosidad dinámica puede ser obtenida mediante la relación
(2.10)
En este caso se realizaron registros mediante un viscosímetro para controlar la variación
del gradiente de cizalla, por medio de un mecanismo que hace variaciones en la
velocidad de un rotor cilíndrico y permite obtener valores para la fuerza de cizalla .
El viscosímetro utilizado para la medición del fluido transportador en la separación SS
fue un aparato Rotovisco-RV20™ (Figura 2-32), que se encuentra en el Instituto de
ciencia y tecnología de alimentos de la Universidad Nacional de Colombia (ICTA).
Figura 2-32 Viscosímetro Rotovisco-RV20™ empleado en la medida de viscosidad del fluido transportador NaCl.
Este aparato está constituido por un panel de control que permite ajustar la velocidad de
un rotor cilíndrico hueco (Figura 2-33), que está inmerso en la solución en estudio (NaCl),
de tal manera que se pueden obtener medidas de viscosidad a una velocidad de rotación
determinada, registrando parámetros como , .
A
F
dy
dvD x
D
64 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
Figura 2-33 Sistema de rotación que genera variaciones en la fuerza , y gradiente de cizalla
En este caso los valores registrados para y a una temperatura de fueron con la
respectiva gráfica (Figura 2-34)
Figura 2-34 Gráfica gradiente de cizalla en función de la fuerza de cizalla para encontrar la viscosidad de
la solución salina a temperatura ambiente.
La pendiente posee un valor de 0.0013, indicando que el valor de la viscosidad es
corresponde a 0,0013 o 0,0130 . Por otra parte la relación gráfica entre
y para encontrar La viscosidad a C es: (Figura 2-35).
D´( ) ( )
27 0,0356
45,9 0,0712
75,6 0,1246
126,9 0,2136
207,9 0,356
348,3 0,623
583,2 0,9968
969,3 1,6554
1620 2,7768
2700 4,806
65
Figura 2-35 Gráfica vrs para encontrar la viscosidad de la solución salina a C
La pendiente posee un valor de 0,00177, indicando que el valor de la viscosidad
corresponde a (0,00177 o 0,0177 .
2.6 Medida de densidad Para la solución Salina NaCl
Para la medida de la densidad se empleó un montaje compuesto por un picnómetro
Brand Duran™ de 25,317 , una balanza analítica, agua destilada y solución salina
(Figura 2-36), utilizando la relación de densidad relativa ver (Ecuación 2.11)
(2.11)
Esta expresión permite encontrar la densidad del líquido problema, relacionando la
densidad de un líquido ya conocido (agua destilada), con las diferencias de las masas de
estos dos líquidos contenidos en el volumen también conocido del picnómetro.
Después de realizar múltiples mediciones para las diferencias y a
temperatura ambiente se encuentra la densidad está dada por:
(2.12)
D´( ) ( )
27 0,0356
45,9 0,0534
75,6 0,089
126,9 0,1424
207,9 0,2492
348,3 0,3916
583,2 0,6408
969,3 1,1214
1620 1,8512
2700 3,6312
OHsolmm
mm2
01
02
3007,00071,1
cm
gam
66 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
Figura 2-36 Montaje experimental utilizado en la medición de la densidad de la solución salina empleada en la separación Splitt.
De manera que la densidad de la solución salina a temperatura ambiente es de
. Se realizo el mismo procedimiento a sin encontrar una variación
significativa.
Los anteriores experimentos permitan la medición de los parámetros que caracterizan al
fluido transportador, donde dichas medidas sugieren que el fluido utilizado es de carácter
Newtoniano, viscoso e incompresible, lo que es útil en términos de la separación.
Una vez se caracterizaron los parámetros físicos de los cuerpos celulares a ser
separados, el fluido vector empleado en la separación, los siguientes parámetros de
interés están relacionados con la celda de separación los cuales se reportan a
continuación.
2.7 Caracterización y fabricación de la celda de separación.
Diseño de la celda de Separación
Cuando se realizan separaciones celulares se encuentra que para optimizar una
separación es necesario: a) Contar con las características físicas propias de la población
67
a ser separada, y una vez se conocen estas características, es necesario b) contar con
una celda de separación que posea dimensiones -compatibles- con esas características
físicas de las células; los que junto con una correcta selección de las tasas de flujo
empleadas en la separación permitirá optimizar una separación. Donde uno de los
problemas fue la disminución de las dimensiones de la celda y la búsqueda de materiales
que permitan estar más cerca de una esterilización de la celda por auto clavado.
La celda de separación se fabrica en este trabajo partiendo de las celdas Step-Splitt
convencionales (Ratier et al. 2006), con materiales que se encuentran en el país y en el
laboratorio de Biofísica y Biología de Membranas del Centro Internacional de Física, la
primera etapa que se tiene en cuenta para caracterizar la celda de separación es el
diseño del canal para lo cual utilizó un programa de asistencia por computadora para
modelado mecánico -Solid Works™- en donde se diseñó cada una de las piezas de la
celda de separación (Figura 2-38) la cual está constituida por el ensamblaje de laminas
intercaladas sucesivas de varios materiales, en éste caso laminas de boro silicato de 76 x
25 x 1 milímetros para formar los soportes superiores e inferiores; y superposición de
laminas policloruro de vinilo, un material flexible recubierto con un adhesivo removible, el
cual cuenta con un calibre de 80 µm, para conformar el cuerpo del canal.
(Figura 2-38) Configuración básica de un canal S-Splitt para separación de vacuolas parasitóforas.
El cuerpo del canal es un parámetro de importancia pues al modificarse el ancho, largo y
espesor dependiendo de los parámetros físicos de la muestra a separar, la separación
68 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
puede ser optimizada. De manera que se propone que para optimizar la separación de
cualquier población celular una de las maneras es construir celdas con espesores
determinados, adecuados a los tiempos de residencia y velocidades propias de cada
cuerpo celular en la celda de separación a determinadas tasas de flujo.
En este caso el cuerpo del canal se construyo de tal manera que la superposición de dos
láminas de policloruro de vinilo generara entradas y salidas de 160 , y una zona de
transporte de 320 (Figura 2-39), sin embargo se encontraron aspectos que varían la
el espesor de la celda inicialmente diseñada, al momento de ser construida como se verá
más adelante.
(Figura 2-39), Superposición de láminas de policloruro de vinilo, para lograr espesores deseados para la
separación de organelos intracelulares.
La segunda etapa en la caracterización de la celda después de realizar el sólido
computacional de cada pieza que lo compone, consiste en ensamblar estas piezas y
fabricar “virtualmente” la celda S-Splitt, y partiendo de este ensamble generar un dominio
computacional, de la parte “hueca” por donde fluyen el fluido vector con la muestra en
suspensión (Figura 2-40)
(Figura 2-40) Ensamble de cada pieza para generar una celda S-Splitt (parte inferior), junto al dominio
computacional obtenido del ensamble de piezas (parte superior)
69
Este dominio computacional será de utilidad para caracterizar el comportamiento y los
efectos hidrodinámicos que se generan dentro del canal de separación, al resolver
numéricamente las ecuaciones que describen al fluido pasando por este dominio : las
ecuaciones Navier-Stokes, como se verá más adelante.
Construcción de la celda.
Para obtener el canal que se utilizó en este trabajo fueron diseñados y fabricados 4
prototipos que variaban en dimensiones y espesores. Para el caso del canal definitivo, se
tuvo en cuenta no solo las propiedades físicas de los macrófagos en infección y en
estado de ruptura, sino también propiedades de otros grupos celulares que son utilizados
en el laboratorio.Para el ensamble de la cámara de separación fue necesario un
pegamento a base de Neopreno para garantizar capas uniformes en la superposición de
piezas (Error! Reference source not found.), de manera que se encontró durante la
fabricación que los espesores deseados (Figura 2-42) en las entradas, salidas y zona de
transporte, varían en 20 por cada aplicación de pegamento, esto es de importancia
pues para optimizar el proceso de separación factores como éste al tenerse en cuenta
pueden dar una mejor resolución en la separación.
Figura 2-41 Ensamblaje de la celda Splitt, el pegamento durante el ensamble puede variar el espesor deseado.
70 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
Teniendo en cuenta la variación del espesor por cada aplicación de pegamento, las
dimensiones del espesor se modifican, contando con un espesor total , un
largo de y un espesor en las entradas y salidas de (Figura 2-42).
(Figura 2-42), Espesores reales de la celda S-Splitt después de su construcción teniendo en cuenta la
variación que genera la aplicación de pegamento.
Acoplando todas las piezas, para finalizar la construcción del canal de separación se
incorpora a las entradas y salidas tubos de HALAR de diámetro interno de 0.062 in y
diámetro exterior de 0.125 in, que comunicaran al canal con las bombas de inyección de
muestra, para obtener como resultado la celda de separación S-Splitt a ser utilizada en
los experimentos de separación (Figura 2-43).
Figura 2-43 Celda de Separación Step-Splitt utilizada en los experimentos de separación.
En la realización y caracterización de la celda de separación se encuentra que la
miniaturización de la celda es un proceso de importancia en la optimización de la
separación cuando en ésta se involucran muestras de alta dilución, lo que permite
extender el uso de esta celda a casos a otros modelos celulares, haciendo que cámaras
de menores dimensiones disminuyan el problema de la baja dilución de la muestra en la
separación (Figura 2.44).
71
Figura 2.44. Disminución de las dimensiones de la celda Step-Splitt.
Resumen de los parámetros físicos encontrados
En general una condición de partida para optimizar la separación en Step-Splitt, es
conocer los parámetros físicos de las partículas en separación, por lo general cuando se
realizan separaciones de perlas inertes, desde fábrica se cuenta con parámetros físicos
establecidos en tamaño y densidad; pero cuando se trabaja con poblaciones celulares se
debe encontrar las variables físicas características a la población celular que no están a
excepción de glóbulos rojos reportadas en la literatura, de manera que en la Tabla 2-4 se
encuentran los parámetros propios a macrófagos infectados y sin infección, vacuolas
parasitóforas junto a propiedades del fluido transportador de separación.
Tabla 2-4 Parámetros Físicos de cuerpos celulares Involucrados en la separación de vacuolas parasitóforas
de Leishmania amazonensis.
72 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
Durante la medición de los parámetros físicos se encontró evidencia experimental inicial,
que sugiere que parámetros como la densidad varían de manera significativa
dependiendo del estado biológico de las células, calidad del cultivo celular así como el
tiempo de infección. Para un cultivo de macrófagos infectado con Leishmania
amazonensis, 24h post infección el tamaño medio de los macrófagos es de 12 µm, un
tamaño de vacuola parasitóforas entre un rango de 6 a 11 µm y una densidad de 1.044 ±
0,008 .
De igual manera mediante la misma metodología experimental por gradientes de
densidad y verificación de conteos por microscopia de luz y fluorescencia se encontró
que los parámetros físicos están sujetos a variaciones que dependen incluso de la
especie de Leishmania que infecta a los macrófagos o células del sistema inmune, para
un cultivo de macrófagos infectados con Leishmania braziliensis, a las 48h post infección,
se encontró una densidad para los macrófagos de 1.005 ± 0,008, con un tamaño
medio de 18 µm y 6 a 10 µm para vacuolas parasitóforas. De manera que para lograr una
separación de células u organelos intracelulares óptima por Step-Splitt, la primera
recomendación es contar con los parámetros físicos de los objetos involucrados en la
separación.
73
3 MODELO FISICO DE LA SEPARACIÓN
Una vez encontrados experimentalmente los parámetros físicos de los cuerpos celulares
involucrados en la separación (macrófagos infectados, no infectados y vacuolas
parasitóforas); junto a las propiedades del flujo transportador, es posible utilizar estos
parámetros para afinar un modelo que logre predecir las tasas de flujo necesarias para
una separación de vacuolas parasitóforas en el mecanismo Step-Splitt. Por tanto en este
último capítulo se realizará una descripción de las fuerzas involucradas en la separación,
para proponer mediante el criterio de diámetro crítico (Ecuación 1.17) y la respectiva
velocidad de sedimentación de cada cuerpo celular (Ecuación 1.15) un rango tasas de
flujo que permiten lograr separación de vacuolas parasitóforas de Leishmania
amazonensis en un mecanismo Step-Splitt.
3.1 Fuerzas sobre las células en la celda Step-Splitt.
Cuando los cuerpos celulares de interés están en suspensión durante la separación,
estos están sujetos a fuerzas, que varían en magnitud según sus propiedades físicas y el
tipo de campo al que estos son expuestos. En un análisis clásico de fuerzas, los cuerpos
celulares en separación están sujetos a una fuerza de carácter externo , debida al
campo gravitacional, otra de carácter resistivo debida al arrastre hidrodinámico , a la
vez que se genera una fuerza de empuje que es explicable desde el principio de
Arquímedes (Figura 3-1).
Figura 3.1 Fuerzas involucradas sobre un cuerpo esférico en suspensión en la celda Step-Splitt.
74 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
El espacio para la sedimentación de las células está dado por el espesor del canal o la
distancia total entre las paredes A y B desde su fabricación (Figura 3-1), que para el caso
de la celda construida es de ; por los experimentos realizados y reportados en el
capítulo anterior se puede encontrar que macrófagos infectados, no infectados y
vacuolas parasitóforas tienen propiedades físicas de densidad y tamaño diferentes, de
manera que cada uno de estos cuerpos celulares posee una velocidad de sedimentación
diferente y una movilidad característica en el espesor del canal, la cual como veremos en
las siguientes secciones es aprovechada para la separación de vacuolas parasitóforas de
otros cuerpos celulares involucrados, en donde se tiene en cuenta que las especies con
menor movilidad serán recuperadas por la salida a, mientras que las que poseen una
mayor movilidad son recuperadas por la salida b.
Las separaciones celulares se realizarán a una baja dilución, y dado que la forma de las
de los macrófagos y vacuolas en suspensión son muy cercanas a una esférica, en una
dilución baja de muestra, es posible despreciar las interacciones hidrodinámicas entre las
células que componen la muestra; por lo que las fuerzas que actúan sobre los
constituyentes de la muestra son (Ratier 2006):
Fuerza de arrastre
La fuerza de arrastre es una fuerza dependiente de las características del objeto que se
mueve en el fluido, en este caso dado que se trabaja con objetos celulares cercanos a
una forma esférica. Para una célula de radio moviéndose con una velocidad relativa
a través de un fluido con viscosidad , esta fuerza puede escribirse por la ley de Stokes
como:
(3.1)
En este caso la velocidad es relativa a la velocidad del fluido y la velocidad de
las partículas , de manera que la ecuación (3.1) se escribe:
(3.2)
Donde es la viscosidad dinámica del fluido y es el radio de las células. La velocidad
del fluido está dada por el perfil parabólico de velocidades (de Poiseuille) que se
genera en la cámara Step-Splitt el cual esta descrito por la Ecuación 3.3.
75
(3.3)
Fuerza boyante o de Flotabilidad
Esta es una fuerza resultante del peso de las partículas y del principio de Arquímedes,
esta expresión se escribe como:
(3.4)
Donde es el radio de las partículas, es la gravedad, es la densidad de las celulas,
en la densidad del fluido, de manera que una célula que está bajo la acción tanto de la
fuerza de arrastre (Ecuación 3.2) como bajo la acción de la fuerza boyante (Ecuación 3.4)
se sedimentará en el canal de separación; donde después de un tiempo bajo el equilibrio
de estas dos fuerzas, la velocidad de sedimentación es constante, descrita por la
expresión:
(3.5)
En la siguiente sección se calcula la velocidad de sedimentación para cada uno de los
cuerpos celulares involucrados en la separación.
3.2 Velocidad de sedimentación para cuerpos celulares.
Para encontrar la velocidad de sedimentación en cada cuerpo celular, se debe tener en
cuenta ésta depende del diámetro dé cada uno y de la diferencia entre la densidad de las
células y del fluido transportador, si el tamaño o la diferencia de densidad en la Ecuación
3.5 disminuyen esta velocidad de sedimentación será más baja. Dado que después de
realizar disrupción mecánica de la membrana se cuenta con tres poblaciones celulares:
macrófagos enteros sin infección con un diámetro de 11,84 , macrófagos infectados
con un diámetro de 13,52 y vacuolas parasitóforas con diámetros de , se
calcula la velocidad de cada una de estas poblaciones; para el caso de las vacuolas
parasitóforas se toma el diámetro medio de 13,5 .
Con los parámetros físicos reportados en segundo capítulo, haciendo uso de una tabla
dinámica que recopila los datos experimentales y los incorpora en la ecuación de
76 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
sedimentación, se encontraron las respectivas velocidades de sedimentación para cada
cuerpo celular de interés en el espesor de los cuales se encuentran reportados
en la Tabla 3-1.
Tabla 3-1 velocidades de sedimentación para cuerpos celulares involucrados en la separación.
Al realizar una separación por Step-Splitt de los cuerpos celulares de interés, en la tabla
3-1 se puede observar que los macrófagos sin infectar e infectados poseen una menor
movilidad con una velocidad de sedimentación de de respectivamente,
mientras que vacuolas parasitóforas cuentan por su tamaño y densidad con
una movilidad mayor con una velocidad de sedimentación de ; por tanto se
puede inferir que vacuolas con densidad de y con tamaños mayores a
tendrán una movilidad mayor separándose de los otros cuerpos celulares por
una de las salidas de la celda utilizando un flujo conveniente.
Cuando se realizan separaciones de material biológico es deseable contar con maneras
de realizar experimentos de separación alternos que eviten la perdida de material
biológico y emulen los parámetros físicos de la muestra, de manera que mediante la
ecuación 3.5 se encuentran las similitudes entre las propiedades de células y perlas
inertes de látex, teniendo en mente que este material particulado cuenta con propiedades
estándar: densidad 1.050 , tamaño y la forma (esférica), así que se
calculan los valores de la velocidades de sedimentación para los diferentes tamaños de
perlas inertes con los tres parámetros anteriores, junto a las propiedades del fluido y se
comparan con su cuerpo biológico análogo Tabla 3-2.
77
Tabla 3-2 Velocidades de sedimentación para partículas de látex con parámetros experimentales conocidos,
junto a los tamaños y velocidades de sedimentación junto a la correspondiente Similitud con los cuerpos
celulares de interés.
Observando la Tabla 3-2, se puede encontrar que las perlas con tendrán una
velocidad de sedimentación cercana a macrófagos sin infectar de , las perlas
con de diámetro poseen velocidades similares a macrófagos infectados de
y perlas de poseen una velocidad de sedimentación cercana a vacuolas
parasitóforas de , lo que puede ser de utilidad para realizar experimentos piloto
de separación sin la necesidad de perder material valioso que proviene de varios días de
preparación y mantenimiento de cultivo celular. Una vez se conocen las velocidades de
sedimentación para los objetos involucrados en la separación celular y de partículas
inertes de partículas de látex que pueden emular las condiciones de separación, es
necesario escoger las tasas de flujo adecuadas para enriquecer vacuolas parasitóforas,
para lo cual se buscan las tasas de flujo optimas en la celda Step-Splitt, como se verá a
continuación. Para lo cual se realiza un seguimiento de la estabilidad hidrodinámica a
diferentes flujos para escoger un flujo optimo en la separación de estos organelos
aplicando el criterio de diámetro crítico.
3.3 Estabilidad hidrodinámica y tasas de flujo.
Antes de buscar las tasas de flujo óptimas en la separación mediante el criterio de
diámetro crítico (Ecuación 1-17), se realiza el montaje experimental adecuado (Figura
3.2) el cual está compuesto por cuatro bombas de precisión Harvard® y Kit Scientific
Syringe Pump® que inyectan de manera constante a la celda Step Splitt (Figura 2.43)
78 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
solución salina caracterizada (Ver tablas 2-3,2-4) y células en suspensión infectadas con
Leishmania amazonensis, las cuales son cargadas con el floróforo Naranja de Acridina,
con la finalidad de hacer posible un seguimiento del paso de las células por la celda
haciendo uso de un microscopio Zeiss Axiovision® y un registro de la traza de
florescencia mediante micrografías de florescencia adquiridas con el sistema adquisición
de imágenes Axio-observer®, el cual permite realizar un perfil de fluorescencia para las
dos tasas de flujo total.
Figura 3-2 Montaje con la Celda Step-Splitt para verificar estabilidad con células infectadas marcadas con un
fluoróforo con tres tasas de flujo determinadas.
En este caso se escogieron dos tasas de flujo “limite” una alta de 10
y otra baja de 1
, sobre las cuales se evalúa la estabilidad y junto al criterio de diámetro critico se acota
como lo veremos más adelante la sección del flujo adecuado para el enriquecimiento de
vacuolas parasitóforas de Leishmania amazonensis de tamaño superior a .
bajo condiciones experimentales (Tabla 3-3) ya planteadas como: tasas de flujo a la
entrada ′ , tasas de flujo en la salida , un espesor de la zona de
transporte de , de en la zona ISP y de en la zona de salida
OSP.
79
Tabla 3.3 Flujos en las entradas y salidas para los casos experimentales de interés.
Analizando el flujo más alto de , bajo las condiciones experimentales
anteriormente planteadas se verifica el comportamiento hidrodinámico durante el
transporte de las células infectadas en la parte central de la celda de separación (Figura
3-3).
Figura 3-3 Visualización bajo el microscopio de Florescencia del paso de las partículas en la celda de separación para 10 ml/h, derecha de la imagen se muestra la intensidad de fluorescencia con respecto a la variación del ancho del canal
80 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
La medida de intensidad de fluorescencia en función del ancho de la celda (Figura 3-4)
se obtiene mediante el programa de análisis de imágenes ImageJ®, en esta medida se
puede observar un aumento significativo en el pico de intensidad hacia la región central
de la celda, mientras que se hace insignificante hacia las paredes, lo que es coherente
con el hecho de que las células se mueven a una mayor velocidad en el centro y a una
menor conforme se acercan a las paredes, lo anterior permite evidenciar que el fluido que
se transporta laminarmente bajo una distribución parabólica tipo Poiseuille (Figura 3-4).
Figura 3-4 Superposición del perfil de fluorescencia a un flujo de 10ml/h en la celda Step-Splitt, el centro del
canal con respecto al ancho de la celda se nota con la línea roja.
En vista que experimentalmente se evidencia en la celda bajo un flujo total de un
comportamiento estable, a continuación se plantea bajo condiciones de fronteras
impuestas por el experimento, una solución numérica de la ecuación de continuidad
(Ecuación 3.5)
(3.5)
Esta ecuación es resuelta para el dominio computacional de la celda Step-Splitt (Figura
2-40) realizando un proceso de: a) Mallado, b) Planteamiento de condiciones de frontera
y c) solución por iteración, obteniéndose una solución para cada elemento del espacio de
la ecuación de continuidad (Apéndice 2).
Efectuando la solución por medio del software CFD Fluent® de la ecuación de
continuidad con 1000 iteraciones y empleando un mallado con dimensiones máximas y
mínimas para cada elemento de la malla con respectivos máximos y mínimos de
y , unidos por 135.624 puntos de 5µm de resolución (ver Apéndice 2) y
utilizando la velocidad media de 1,5 mm/s se puede observar el comportamiento
0 v
81
parabólico que toma el fluido al interior del canal lo que está de acuerdo con lo observado
experimentalmente.
Figura 3-5 Perfil parabólico en la simulación para la geometría planteada
Dado que experimentalmente aun no es posible obtener imágenes de un corte
transversal de la celda en los de espesor del canal y observar desde una vista
lateral el comportamiento del flujo in situ, la simulación mediante el paquete CFD Fluent®
hace evidente el comportamiento laminar del fluido para las condiciones experimentales
planteadas (Figura 3-6)
Figura 3-6. Visualización del comportamiento laminar del fluido bajo en los 360 de espesor en la celda de
separación bajo las condiciones experimentales propuestas.
82 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
Observando esta Figura 3-6 en la parte superior se puede observar el comportamiento
estable de las entradas y salidas, donde se hace evidente la formación de una especie
de planos transportadores, los cuales poseen correspondencia con el gradiente de
velocidad observado en la parte inferior para el canal completo; donde la velocidad es
más alta hacia las paredes y se reduce hacia el centro del mecanismo de separación.
Cuando se realiza el seguimiento de las trazas de fluorescencia para una tasa de flujo de
, se encuentra que las células se des-focalizan del centro de la celda para
acercarse más hacia las paredes (Figura 3-7), de manera que se encuentra que a mayor
flujo total las partículas se focalizaran alejándose de las paredes de la celda, lo que
puede ser benéfico en la separación.
Figura 3-7 Visualización bajo el microscopio de Florescencia del paso de las partículas en la celda de separación para 1 ml/h, reconstrucción del perfil en la localización de la medida en la celda de separación.
De manera que observando este cambio en el comportamiento del flujo en el canal se
tomará la tasa de 1 ml/h como límite inferior para la búsqueda del flujo total que optimice
83
la separación de vacuolas parasitóforas de Leishmania amazonensis, de manera que
ahora en la última sección de este trabajo, utilizando el criterio de diámetro crítico, se
reporta el flujo total más eficiente entre el intervalo de 1 y 10 ml/h.
3.4 Separación de vacuolas parasitóforas de Leishmania
amazonensis.
Cuando se realizan separaciones a nivel experimental es de ayuda conocer teóricamente
la tasa de flujo en la cual todos los cuerpos celulares saldrán solamente por y la tasa
en la que todo el material saldrá únicamente por para luego bajo el conocimiento de
los parámetros físicos de la muestra, buscar la tasa óptima para lograr separación de
células. En este caso se utiliza la definición de diámetro crítico (Ecuación 1-17),
Expresión que está escrita en términos de parámetros ya encontrados: la dimensión de la
celda, características físicas como densidad del fluido transportador junto a tamaño y
densidad de los cuerpos celulares en separación. De manera que conociendo estos
parámetros se puede calcular el dímetro crítico para el cual dichos objetos celulares
empezaran a salir por realizando una comparación entre el diámetro critico y el valor
real en µm para células con un tamaño y densidad particular a una tasa de flujo total
dada; de manera que según esos parámetros si los cuerpos celulares en
cuestión estos saldrán por a y si por el contrario por medio de la variación de las tasas de
flujo en el canal se llega a que los cuerpos saldrán por . El objetivo es
efectuar separaciones de vacuolas parasitóforas de los otros objetos biológicos, el
tamaño real de las vacuolas parasitóforas de Leishmania amazonensis encontrado por
microscopia de fluorescencia y reportado en el capitulo anterior corresponde a un rango
de 7 a 20 , de manera se toma el tamaño promedio de 13,5 µm. Para una tasa de flujo
de 10ml/h siguiendo el criterio de igualdad entre el diámetro critico y real, se encuentra
que macrófagos infectados, sin infección y vacuolas parasitóforas saldrán todas por
(Tabla 3-4). Los valores de diámetro critico fueron encontrados utilizando una hoja
dinámica de Excel y comprobados mediante un programa implementado en C++ por
(Vargas.2012).
84 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
Tabla 3-4 Diámetros críticos y diámetros reales para una tasa de 10 ml/h, todo el material sale por
Para este caso se emplean tasas de flujo en las entradas y salidas bajo condiciones
experimentales específicas ilustradas en la Figura 3-8
Figura 3-8 condiciones en la celda de separación para que todas la población celular salga por
De manera análoga para un flujo de 1 ml/h se encuentra mediante la (Ecuación 1-17) los
valores para el diámetro crítico (Tabla 3-5), en donde se encuentra que los valores del
diámetro crítico son menores que el diámetro real de cada una de las poblaciones
celulares involucradas en la separación, de manera que los cuerpos celulares saldrán
todos por (Figura 3-9).
Los diámetros reales de los cuerpos celulares fueron medidos para macrófagos y
vacuolas que provienen de cultivos 48 horas post-infección, junto a macrófagos sin
infección, de manera que para calcular estos diámetros es necesario tener en cuenta el
historial de preparación, manejo y mantenimiento de los cultivos celulares.
85
Tabla 3-5 Diámetros críticos y diámetros reales para una tasa de 1 ml/h, todo el material sale por
Bajo las condiciones experimentales ilustradas en la Figura 3-9 el flujo total al ser menor
permitirá que las células en suspensión tengan una mayor movilidad a través del espesor
del canal, dando un tiempo suficiente para que se sedimenten hasta alcanzar la salida b.
Figura 3-9 condiciones en la celda de separación para que todas la población celular salga por
En los tres casos anteriores se puede evidenciar que el diámetro crítico para estas
poblaciones celulares tiende a aumentar conforme se incrementa el flujo total en la celda
de separación, se debe encontrar una tasa de flujo que permita la separación de
vacuolas de ,
Calculando el valor de diámetro critico mediante la ecuación 1-17 (la cual incorpora las
propiedades de los cuerpos celulares), se encuentra que para un flujo de 8 ml/h se
tendrá un enriquecimiento de vacuolas parasitóforas de mayor tamaño - a partir de
86 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
13,6µm – por la salida b, dejando a las vacuolas de menor tamaño y células infectadas y
no infectadas enteras salida por (Tabla 3-6).
Este resultado se basa en con zonas de separación , ,
donde para el flujo total de se emplean tasas a las entradas y salidas
y respectivamente (Figura 3-10).
Tabla 3.6 Criterio de diámetro crítico para las poblaciones celulares de interés a un flujo de .
Figura 3-10 condiciones en la celda de separación para que vacuolas parasitóforas de mayor tamaño salgan
por
Con el hallazgo de la tasa volumétrica de flujo que optimiza la separación de la vacuola
parasitófora de Leishmania, resta para trabajos futuros buscar un control más específico
de la muestra en la celda de separación
87
4 Conclusiones.
El conocimiento de parámetros físicos como: Tamaño, densidad y forma en los
cuerpos celulares, ayuda a optimizar el proceso de separación; conjugando éstos
parámetros con una caracterización completa tanto del fluido transportador como
de la celda utilizada.
La optimización de la ruptura celular de la vacuola parasitófora de Leishmania
amazonensis es un proceso de importancia para lograr compartimentos viables
para la separación celular y su posterior estudio, de manera que el desarrollo de
métodos que permitan cuantificar el impacto físico sobre la membrana del
macrófago optimizan el proceso de selección.
La densidad es un parámetro preponderante para determinar la movilidad de cada
una de estas poblaciones celulares en el canal de separación, donde se
encuentra que vacuolas y macrófagos sin infección tendrán una mayor movilidad
transversal y una menor movilidad para macrófagos infectados dado su aumento
en volumen.
Para efectos de un modelo futuro el parámetro de forma debe ser analizado más
a fondo, dado que no se contará después de una ruptura celular con formas
completamente esféricas, lo que puede generar una mayor precisión en un
modelo de separación.
La miniaturización de la celda es un proceso de importancia en la optimización de
la separación cuando en ésta se involucran muestras de alta dilución, lo que
permite extender el uso de esta celda a casos a otros modelos celulares (células
de Schwann).
Se encontró experimentalmente y por medio de una simulación que a un flujo total
10 ml/h se conserva estabilidad hidrodinámica en el canal, observándose en el
espesor de 360 µm efectos hidrodinámicos a los descritos por la teoría. A la vez
88 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos
que se evidencia un perfil de velocidades parabólico garantizando estabilidad
hidrodinámica.
Para empezar a obtener enriquecimientos de vacuolas parasitóforas en la celda
de separación construida se debe trabajar con un flujo total de 8 ml/h, a tasas de
flujo 0,2 en la entrada y 0,5 en la salida, donde vacuolas de 14 a 20 µm saldrán
por la B y de 7 a 14µm saldrán por A.
89
5 Recomendaciones
Se aconseja con el fin de lograr separaciones de material biológico aún más
específico, experimentar con el método de separación Step-Splitt acoplado a otro
tipo de campo: por ejemplo un campo acústico.
Para la construcción de la celda de separación es deseable contar con materiales
totalmente compatibles con muestras biológicas, que sean esterilizables; para lo
cual deben se recomienda seguir la construcción de canales en vidrio, buscando
resinas y pegamentos que sean durables en el tiempo impidiendo fugas de
muestra.
En este caso se construyó una celda de separación enfocada a la separación de
dos especies celulares de interés en nuestro grupo de investigación, sin embargo
si la separación se quiere realizar de una manera más específica y en menor
tiempo, es posible aumentar los flujos de separación aumentando el largo de la
celda de 30.74mm a el doble, es decir buscar un tipo de celda más especifico
enfocado a disminuir el problema de la dilución de la muestra.
Es aconsejable la búsqueda de elementos que mejoren la ruptura celular de la
membrana del macrófago, durante ésta se pueden generar cambios geométricos
que alejan a los cuerpos celulares de una forma esférica.
6 Anexo 1: Solución numérica de las ecuaciones que caracterizan el movimiento de un fluido.
En el desarrollo del trabajo se modelo el comportamiento del flujo en la celda de
separación, donde el tratamiento matemático que se involucra en la dinámica de un fluido
es algo complejo debido a la presencia de múltiples escalares, campos vectoriales y
tensoriales, para ello se analiza la dinámica del fluido y el transporte de partículas en
sentido longitudinal de la celda mediante la solución numérica de las ecuaciones que
gobiernan el fluido bajo condiciones de frontera impuestas por un dominio computacional,
obtenido en el desarrollo del trabajo. De manera que las ecuaciones de movimiento que
gobiernan a un fluido son (Landau 1959), (Bruss 2011):
Ecuación de continuidad
La ecuación de continuidad expresa la conservación de la masa, para encontrar esta
ecuación se tiene en cuenta el cambio de densidad en el fluido como función del espacio
y el tiempo al interior de una región Ω (Figura 3.2), la masa total en esta región se
puede expresar como una integral de volumen sobre la densidad (Ec 3.6)
Figura 3-2 Representación de la densidad de corriente fluyendo por una región .
92 Título de la tesis o trabajo de investigación
(3.6)
Dado que no puede aparecer o desaparecer masa espontáneamente solo varia
debido al flujo de masa a través de la superficie de la región , la densidad de
corriente de masa es definida como la densidad de masa por el flujo de masa
por unidad de área en (3.7):
= (3.7)
Diferenciando la integral de volumen (3.6)
(3.8)
O una integral de superficie sobre de la densidad de corriente de masa
ecuacion (3.7).
Utilizando el teorema de Gauss para el campo vectorial
(3.9)
Con las ecuaciones (3.8) y (3.9) se observa que la integral de superficie es
análoga a la integral de volumen.
(3.10)
De manera que si los integrados son idénticos, se obtiene la ecuación de
continuidad:
Apéndice 93
(3.11)
La ecuación de Navier Stokes.
La segunda ecuación que gobierna el movimiento del fluido es la ecuación de Navier-
Stokes, que es una ecuación de movimiento para un campo de velocidades Euleriano
relacionado con la conservación del momento y la densidad de momentum , la
derivación es similar a la ecuación de continuidad, considerando la i-esima componente
del momento total Ω dentro de una forma región arbitraria Ω, la tasa de cambio de
momento está dado por Ω :
(3.12)
La tasa de cambio del momento en la región Ω esta bajo la acción de fuerzas dadas
por la segunda ley de Newton, estas fuerzas se dividen como fuerzas que actúan
en el interior de la región Ω (fuerzas eléctricas y gravitacionales) y fuerzas de
contacto como la presión y la viscosidad. De manera que la i-esima componente
del momento puede ser escrita como:
(3.13)
Para cada una de estas componentes según el caso hay una integral de volumen o de
superficie la cual es diferenciada para obtener la ecuación de Navier-Stokes:
(3.14)
6.1 Solución numérica de las ecuaciones de Navier-Stokes
que la velocidad del fluido es mucho más pequeña que la velocidad del sonido (ondas de
presión), por lo que se cuenta dentro del canal con un fluido incompresible, de manera
que la densidad es constante en el espacio y en el tiempo, así que la ecuación (3.11)
de continuidad se escribe como:
94 Título de la tesis o trabajo de investigación
(3.15) De igual manera teniendo en cuenta en el canal se cuenta con flujo un estacionario,
viscoso, y Newtoniano, dado por las propiedades del fluido encontradas
experimentalmente la ecuación de Navier-Stokes que es resuelta numéricamente es de
la forma:
( )
(3.16)
Donde es la velocidad del fluido, es la viscosidad cinemática y la carencia de efectos
de superficie permite el uso de una presión modificada . La ecuación (3.15)
es una ecuación de conservación, la ecuación (3.16) puede ser vista como una ecuación
de transporte que representa en este caso transporte de momento lineal a través de un
dominio computacional, si se asume que y son constantes, para un flujo
tridimensional, se generan cuatro ecuaciones diferenciales con cuatro incógnitas y
de manera que la ecuación de continuidad para su solución numérica es de la forma:
Mientras que la ecuación de momento (3.16), para ser solucionada se divide en las tres
coordenadas, quedando una ecuación para el momento en en términos de las
variables antes mencionadas:
Momento en
Momento en
Momento en
Apéndice 95
Proceso de solución numérico
Para la solución de estas últimas cuatro ecuaciones se utiliza un paquete CDF, para
solucionarlas numéricamente en este caso se utiliza el paquete de dinámica de fluido
FLUENTTM , el proceso de solución se sintetiza en los siguientes cuatro numerales:
1. Dominio Computacional: Se toma el dominio computacional, creado a partir del
diseño y construcción de la celda S-Splitt, y dicho dominio se divide en celdas, las cuales
pueden ser pensadas como elementos de volumen en donde las ecuaciones de
continuidad son resueltas, este proceso se denomina mallado (Figura 3-3).
Figura 3-3 División del dominio computacional en celdas de volumen
2. Condiciones de frontera: Se especifica en el dominio computacional las caras donde
se inician las condiciones iniciales para la solución (Figura 3-4)
Figura 3-4 a) elección de las coordenadas en donde se inicia la solución en el dominio
96 Título de la tesis o trabajo de investigación
b) Proceso de ubicar las caras sobre el dominio computacional.
3. Tipo de Fluido: se define el tipo de fluido y sus propiedades, para ello se tomaron las
propiedades encontradas para la solución salina, en el capitulo anterior.
4. Iteración: se inicia la solución de las ecuaciones al interior de la geometría, utilizando
las ecuaciones de continuidad y momento.
Apéndice 97
98 Título de la tesis o trabajo de investigación
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