Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica ...pefprints.pef.uni-lj.si/3852/1/Diplomsko_delo_Metka_Farkaš.pdf · Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella

UNIVERZA V LJUBLJANI

PEDAGOŠKA FAKULTETA

BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

Študijski program: Biologija in gospodinjstvo

Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella

enterica iz plazilcev v ujetništvu

Mentorica:

Jerneja Ambrožič Avguštin

Kandidatka:

Metka Farkaš

Somentorica:

Martina Turk

Ljubljana, september 2016

Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.

Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.

II

Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študija biologije in gospodinjstva. Opravljeno

je bilo v laboratoriju Katedre za molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov

Oddelka za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani.

Študijska komisija je za mentorico diplomskega dela imenovala doc. dr. Jernejo Ambrožič

Avguštin, za somentorico doc. dr. Martino Turk in za recenzentko doc. dr. Polono Zalar.

Mentorica: doc. dr. Jerneja Ambrožič Avguštin

Somentorica: doc. dr. Martina Turk

Recenzentka: doc. dr. Polona Zalar

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik: prof. dr. Marjanca STARČIČ ERJAVEC

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, oddelek za biologijo

Članica: doc. dr. Jerneja AMBROŽIČ AVGUŠTIN


Članica: doc. dr. Martina TURK


Članica: doc. dr. Polona ZALAR


Datum zagovora:

Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela.

Metka Farkaš



III

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

ŠD Dn

DK

KG plazilci/Salmonella enterica/antibiotiki/virulentni dejavniki

KK

AV FARKAŠ, Metka

SA AMBROŽIČ AVGUŠTIN, Jerneja (mentor)/ TURK, Martina (somentor)

KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

LI 2016

IN IZOLACIJA IN GENOTIPIZACIJA BAKTERIJE SALMONELLA ENTERICA IZ

PLAZILCEV V UJETNIŠTVU

TD DIPLOMSKO DELO (univerzitetni študij)

OP IX, 57 str., 8 tab., 13 sl., 2 pril., 65 vir.

IJ sl

JI sl/en

AI Plazilci so v zadnjih letih vse bolj priljubljeni hišni ljubljenčki, pogosto pa se

uporabljajo kot učni pripomoček v šolah. Velikokrat se omenjajo kot možni

prenašalci salmonele, zato je pri delu z njimi potrebna previdnost in ustrezna

higiena. Pri plazilcih zajetih v raziskavo smo salmonelo potrdili pri 42,4% živali.

Največ okuženih je bilo kuščarjev (58,8%), sledile so kače (42,9%), pri želvah

salmonele nismo identificirali. Večina izolatov je pripadala vrsti Salmonella

enterica subsp. enterica, v štirih primerih smo izolirali bakterijo Salmonella enterica

subsp. arizonae. Izmed vseh sevov je bilo 33,3% takšnih, ki so bili odporni proti

izbranim protimikrobnim učinkovinam. Največkrat proti streptomicinu. Preverili

smo tudi prisotnost genov za beta-laktamaze iz skupine CTX-M za odpornost proti

kinolonom (qnr). Čeprav sta bila dva izolata odporna proti ampicilinu, nismo

potrdili prisotnosti genov blaCTX-M in genov skupine qnr. Pri salmonelah iz plazilcev

smo potrdili prisotnost genov za virulentne dejavnike (invA, spoB, sifA, spvC), od

tega največkrat invA (92,3%). Veliko izolatov je vsebovalo dva ali tri testirane gene

za virulentne dejavnike. Zaradi prisotnosti virulentnih dejavnikov so salmonele

lahko potencialno patogene za ljudi. Da preprečimo prenos salmonele, moramo

paziti na ustrezno higieno rok in opreme za plazilce. Poleg tega pa se odsvetuje stik

s plazilci mlajšim otrokom, osebam z oslabljenim imunskim sistemom in starejšim

osebam.



IV

KEY WORDS DOCUMENTATION

DN Dn

DC

CX reptiles/Salmonella enterica/antibiotics/virulence factors

CC

AU FARKAŠ, Metka

AA AMBROŽIČ AVGUŠTIN, Jerneja (supervisor)/TURK, Martina (co-supervisor)

PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Biology

PY 2016

TI ISOLATION AND GENOTYPISATION OF SALMONELLA ENTERICA FROM

CAPTIVE REPTILES

DT Graduation thesis (University studies)

NO IX, 57 p., 8 tab., 13 fig., 2 ann., 65 ref.

LA sl

AL sl/en

AB Reptiles are becoming increasingly popular in recent years as pets, and they are

often used as a teaching aid in schools. They are often cited as potential carriers of

salmonella, so working with them requires caution and proper hygiene. In surveyed

reptiles salmonella was confirmed in 42.4% of the animals. The most infected were

lizards (58.8%), followed by snakes (42.9%), while in turtles they were not

identified. Most of the isolates belonged to Salmonella enterica subsp. enterica, in

four cases Salmonella enterica subsp. arizonae was isolated. Thirty-three percent of

salmonella strains were resistant against the tested antimicrobials, majority to

streptomicin. We also verified the presence of genes for beta-lactamases and

quinolone resistance genes (qnr). Although there were two isolates resistant to

ampicillin, we did not confirm the presence of bla genes and qnr genes. In

salmonella strains from reptiles we also confirmed the presence of genes for

virulence factors (invA, spoB, sifA, spvC), of which 92.3% strains contained invA.

The majority of strains contained two or three of the tested genes for virulence

factors. Due to the presence of virulence factors salmonella strains from reptiles are

potentially pathogenic for humans. To prevent transmission of salmonella, we must

pay attention to proper hand hygiene and equipment for reptile handling. Moreover,

young children, people with weakened immune systems and the elderly should

avoid all contact with reptiles.



V

KAZALO VSEBINE

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA.…………………………………….III

KEY WORDS DOCUMENTATION……………………………………………………....IV

KAZALO VSEBINE………………………………………………………………………...V

KAZALO TABEL…………………………………………………………………………VII

KAZALO SLIK…………………………………………………………………………...VIII

KAZALO PRILOG…………………………………………………………………………IX

1 UVOD ................................................................................................................................ 1

1.1 NAMEN DELA IN DELOVNE HIPOTEZE................................................................................................ 2

2 PREGLED OBJAV .......................................................................................................... 3

2.1 UPORABA ŽIVALI V UČNE NAMENE ................................................................................................... 3

2.1.1 Plazilci v izobraževanju in kot hišni ljubljenčki ................................................................ 3

2.2 ZNAČILNOSTI PLAZILCEV .................................................................................................................... 5

2.3 ZDRAVSTVENA TVEGANJA PRI ŽIVALIH - ZOONOZE...................................................................... 6

2.3.1 Zoonoze plazilcev ....................................................................................................................... 6

2.3.1.1 Mikobakterioza in klamidofiloza ................................................................... 6

2.3.1.2 Okužbe z aeromonasi in pseudomonasi ......................................................... 7

2.3.1.3 Salmoneloza ................................................................................................... 7

2.3.1.3.1 Pogostost okužb s salmonelo pri plazilcih in njen prenos na človeka ....... 7

2.3.1.3.2 Preprečevanje prenosa okužb na človeka ................................................. 10

2.4 BAKTERIJE RODU SALMONELLA ........................................................................................................ 10

2.4.1 Klasifikacija ............................................................................................................................... 11

2.4.2 Virulentni dejavniki .................................................................................................................. 12

2.4.3 Odpornost proti antibiotikom................................................................................................ 13

2.4.3.1 Odpornost proti beta-laktamskim antibiotikom in kinolonom ..................... 14

3 MATERIAL IN METODE ............................................................................................ 16

3.1 IZOLACIJA BAKTERIJ RODU SALMONELLA IZ PLAZILCEV ............................................................ 16

3.1.1 Vzorci ........................................................................................................................................... 16

3.1.2 Načrt dela ................................................................................................................................... 16

3.1.2.1 Predbogatitev ................................................................................................ 18

3.1.2.2 Bogatitev ...................................................................................................... 18

3.1.2.3 Selektivna izolacija salmonel v čisti kulturi ................................................. 20

3.2 IDENTIFIKACIJA BAKTERIJ RODU SALMONELLA IZ PLAZILCEV .................................................. 21

3.2.1 Fenotipska identifikacija z biokemijskimi testi ................................................................ 22

3.2.2 Genotipska identifikacija na osnovi nukleotidnega zaporedja gena za 16S rRNA 27

3.3 UGOTAVLJANJE ODPORNOSTI SALMONEL PROTI IZBRANIM ANTIBIOTIKOM ......................... 29

3.3.1 Difuzijski antibiogram po Kirby-Bauerju .......................................................................... 29

3.3.2 Inkorporacijski antibiogram.................................................................................................. 30



VI

3.4 GENOTIPSKA METODA ZA UGOTAVLJANJE PRISOTNOSTI BETA-LAKTAMAZ Z RAZŠIRJENIM

SPEKTROM DELOVANJA (ESBL) SKUPINE CTX-M IN GENOV ZA PLAZMIDNO POSREDOVANO

KINOLONSKO REZISTENCO (PMQR) SKUPINE QNR ..................................................................... 30

3.4.1 Pomnoževanje genov beta-laktamaz z razširjenim spektrom delovanja skupine

CTX-M (blaCTX-M) ..................................................................................................................... 30

3.4.2 Pomnoževanje genov za plazmidno posredovano kinolonsko rezistenco (PMQR)

skupine QNR................................................................................................................................. 31

3.5 UGOTAVLJANJE PRISOTNOSTI NEKATERIH VIRULENTNIH DEJAVNIKOV PRI IZOLATIH

SALMONEL IZ PLAZILCEV .................................................................................................................. 33

4 REZULTATI .................................................................................................................. 35

4.1 PRISOTNOST VRST IZ RODU SALMONELLA PRI PLAZILCIH ............................................................ 35

4.2 ODPORNOST IZOLIRANIH SEVOV PROTI IZBRANIM ANTIBIOTIKOM ......................................... 39

4.2.1 Prisotnost genov ESBL skupine CTX – M in PMQR skupine QNR ........................... 41

4.3 PRISOTNOST IZBRANIH VIRULENTNIH DEJAVNIKOV ................................................................... 44

5 RAZPRAVA IN SKLEPI .............................................................................................. 47

5.1 RAZPRAVA ............................................................................................................................................. 47

5.1.1 Prisotnost bakterij rodu Salmonella pri plazilcih ........................................................... 47

5.1.2 Odpornost salmonel proti antibiotikom in prisotnost virulentnih dejavnikov ........ 48

5.2 SKLEPI .................................................................................................................................................... 50

6 POVZETEK .................................................................................................................... 51

7 VIRI ................................................................................................................................. 52

ZAHVALA

PRILOGE



VII

KAZALO TABEL

str.

Tabela 1: Univerzalni bakterijski oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje

gena za 16S rRNA. ................................................................................................... 27

Tabela 2: Oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje genov ESBL skupine

CTX – M (blaCTX-M) ................................................................................................. 31

Tabela 3: Oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje genov qnr. .................... 32

Tabela 4: Oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje genov izbranih

virulentnih dejavnikov. ............................................................................................ 33

Tabela 5: Rezultati biokemijskih testov za salmonelo in sorodne vrste ................................ 37

Tabela 6: Rezultati izbranih biokemijskih testov za izolate salmonel iz plazilcev. ................. 38

Tabela 7: Rezultati odpornosti salmonel iz plazilcev proti izbranim antibiotikom ................. 40

Tabela 8: Prisotnost izbranih virulentnih dejavnikov pri salmonelah iz plazilcev. ................. 44



VIII

KAZALO SLIK

str.

Slika 1: Kolonije bakterije Salmonella enterica subsp. enterica na selektivnem gojišču XLD.

(Foto: M. Farkaš) ........................................................................................................ 11

Slika 2: Odvzem brisa iz kloake pri kraljevem pitonu (Foto: M. Turk) .................................. 16

Slika 3: Predbogatitev vzorcev iztrebkov v gojišču BPW (epruvete na levi) in bogatitev

vzorcev v gojišču MKTT (epruvete na desni) (Foto: M. Turk) ................................. 19

Slika 4: Mešana kultura s kolonijami potencialnih salmonel na selektivnih in diferencialnih

trdnih gojiščih XLD (levo, rožnate kolonije s črnim centrom) in SSA (desno,

prosojne kolonije s črnim centrom). ........................................................................... 21

Slika 5: Razmerje med številom okuženih (pozitivni) in neokuženih (negativni) živali s

salmonelo pri posameznih skupinah testiranih plazilcev. .......................................... 35


salmonelo pri posameznih skupinah testiranih plazilcev primerjalno med zasebnimi

gojitelji in izobraževalnimi ustanovami. .................................................................... 36


salmonelo pri posameznih skupinah testiranih plazilcev primerjalno med

posameznimi zasebnimi gojitelji in izobraževalnimi ustanovami. ............................. 36

Slika 8: Primer difuzijskega antibiograma po Kirby-Bauerju pri sevu salmonele z oznako

EXB L373 (Foto: M. Farkaš) ..................................................................................... 39

Slika 9: Agarozni gel po elektroforezi z nanešenimi pomnožki PCR za ugotavljanje

prisotnosti genov beta-laktamaz (ESBL) skupine CTX – M...................................... 42

Slika 10: Agarozni gel po elektroforezi z nanešenimi pomnožki PCR za ugotavljanje

prisotnosti genov qnr pri izbranih sevih salmonel iz plazilcev. ................................. 43

Slika 11: Prisotnost izbranih virulentnih dejavnikov pri salmonelah iz plazilcev. .................. 45

Slika 12: Število sevov salmonel iz plazilcev, ki vsebujejo določeno število virulentnih

dejavnikov. ................................................................................................................. 46

Slika 13: Prikaz prisotnosti izbranih virulentnih dejavnikov (v odstotkih) glede na vrsto

plazilca iz katerega je bila izolirana salmonela. ......................................................... 46



IX

KAZALO PRILOG

str.

Priloga 1: Seznam plazilcev, vključenih v analizo za prisotnost salmonele. ........................... 58 Priloga 2: Delna nukleotidna zaporedja gena za 16S rRNA izolatov salmonel iz plazilcev. .. 61



1

1 UVOD

Živali so se v šolah sprva uporabljale kot demonstracijski material ali za seciranje

(Balcombe, 2000). S spremembami učnih načrtov pa se je spremenil tudi namen in

pogostost uporabe živali v šolah (McGriffin, 1980). Prav otroštvo je ključno obdobje za

razvoj zavesti in pozitivnega odnosa do živali, ki je pomemben za ohranjanje biotske

raznovrstnosti (Ballouard, 2011).

V izobraževalnih ustanovah so med najpogosteje gojenimi živalmi predvsem glodavci

(miši, skakači, hrčki), ribe, žuželke (paličnjaki) in plazilci (želve, kače, kuščarji). Plazilci

pa so v zadnjem času zelo priljubljeni tudi kot hišni ljubljenčki, oziroma domače živali.

Vse naštete živali so lahko vir okužb s patogenimi mikroorganizmi, zato je potrebna

previdnost pri rokovanju z njimi. Med najbolj pomembne zoonoze (bolezni, ki se prenašajo

z živali na ljudi) uvrščamo antraks, brucelozo, mikrosporijo, listeriozo, tuberkulozo,

salmonelozo in še nekatere druge zoonoze (Ebani in Fratini, 2005).

Po navedbah Uprave za varno hrano, veterinarstvo in varstvo rastlin RS (UVHVVR, 2013)

so najpogostejše povzročiteljice zoonoz pri ljudeh bakterije rodov Campylobacter in

Salmonella. Pri živalih se lahko te bolezni pojavljajo brez specifičnih zunanjih znakov,

pogosto pa so te bakterije tudi normalni prebivalci njihove črevesne mikrobiote, zato je

njihovo prisotnost težko ugotoviti. Za človeka pa lahko te živali predstavljajo vir okužbe.

Vir okužbe s salmonelo je najpogosteje uživanje kontaminiranih živil ali pa stik z

obolelimi živalmi.

Tudi pri ljudeh je veliko okužb brez kliničnih znakov, ali pa so v blagih oblikah, bolezen

mine sama v nekaj dnevih. Znaki so driska, slabost, bolečine v trebuhu in povišana telesna

temperatura. Smrtnost je manj kot 1% (UVHVVR, 2015; Hollinger 2000).

Vse pogosteje se kot prenašalci salmonele na človeka omenjajo tudi plazilci, ki jih imajo

ljudje za domače živali (Pedersen s sod. 2009; Ebani in Fratini 2005; de Jong s sod. 2005).

Primarno se bakterije nahajajo v prebavnem traktu živali, preko iztrebkov pa se okužba

lahko prenese tako na druge živali, kot tudi na človeka. Čeprav se plazilci omenjajo kot

prenašalci salmonel, je v literaturi le malo podatkov o patogenosti teh sevov, torej o

prisotnosti genov z zapisi za virulenčne dejavnike, ki omogočajo okužbo ter širjenje in

razmnoževanje salmonele v gostitelju (Ibarra in Steele-Mortimer, 2009). Tudi podatkov o

odpornosti salmonel, ki jih najdemo pri plazilcih, proti različnim antibiotikom je zelo malo

(Ebani s sod., 2005; Corrente s sod., 2004). S poznavanjem prisotnosti genov za virulenčne

dejavnike bi lahko primerjali seve, izolirane iz plazilcev s sevi, izoliranimi iz obolelih

ljudi, in tako ugotavljali njihov patogeni potencial.



2

1.1 NAMEN DELA IN DELOVNE HIPOTEZE

Namen diplomske naloge je bil izolirati bakterije rodu Salmonella pri plazilcih, ki živijo v

ujetništvu. Za analizo smo iztrebke plazilcev ali brise njihove kloake zbirali v šolah in

izobraževalnih ustanovah, ki imajo terarije s plazilci, ter tudi pri zasebnih gojiteljih.

Poskusili smo ugotoviti, kolikšen del preučevanih živali je bil okužen s salmonelo. Pri

izoliranih sevih salmonel smo se osredotočili na ugotavljanje prisotnosti nekaterih genov,

ki nosijo zapise za virulenčne dejavnike. Preverjali pa smo tudi odpornost sevov proti

izbranim antibiotikom in poskušali ovrednotiti patogenost salmonel iz plazilcev za

človeka.

Delovne hipoteze:

1. Bakterije iz rodu Salmonella so zelo pogoste bakterije v prebavilih plazilcev.

2. Sevi salmonel, izoliranih iz plazilcev so občutljivi za testirane antibiotike, imajo pa

gene za določene virulenčne dejavnike in so tako lahko patogeni za ljudi.



3

2 PREGLED OBJAV

2.1 UPORABA ŽIVALI V UČNE NAMENE

Biologija je veda o življenju, zato bi se morala tudi ukvarjati z živimi organizmi, vendar je

bil poudarek klasične biologije v šolah predvsem na sistematiki in morfologiji, kjer so se

uporabljali na različne načine preparirani organizmi (McGriffin, 1980). Živali so se v šolah

uporabljale že od nekdaj, kot demonstracijski material, ali pa so učenci sami secirali mrtve

živali (Balcombe, 2000). Posledično učenci v mnogih šolah nikoli niso prišli v stik z živimi

organizmi. V zadnjih desetletjih pa je prišlo do sprememb v učnih načrtih in s tem do večje

uporabe živali v šolah (McGriffin, 1980). Kot navaja Balcombe (2000) je to spodbudilo

učence, da so izvajali vaje in znanstvene raziskave. Težava pa se je pojavila, ker so se pri

tem živali pogosto poškodovale. Zelo znani so na primer poskusi na živih žabah. Zaradi

porasta učnih ur, kjer so se izvajali takšne vrste poskusi, je bila javnost močno zaskrbljena.

Uvedli so pravila, ki so prepovedala poskuse na sesalcih, ptičih, plazilcih, dvoživkah in

ribah, ki bi lahko živalim povzročali bolečino ali pa bi bili škodljivi za njihovo zdravje.

V Sloveniji rejo in gojitev živali v šolah urejata Zakon o veterinarskih merilih (Ur. list, št.

93/05) in Zakon o zaščiti živali (Ur. list, št. 16/07). Vsaka reja ali gojitev mora izpolnjevati

predpisane pogoje glede prostorov, namestitve, oskrbe in zdravstvenega varstva živali.

Osnovne in srednje šole, ki začasno zadržujejo ali redijo živali, morajo določiti

oskrbovalca živali, ki je zadolžen za oskrbo živali. Živali morajo biti pod rednim

nadzorom, zagotovljeno morajo imeti ustrezno bivališče, hrano in vodo. Pomembna pa je

tudi svoboda gibanja in mikroklimatski pogoji.

Živali v osnovnih in srednjih šolah so namenjene opazovanju, drugi posegi in poskusi na

živalih pa so prepovedani (Ornik, 2007).

Živali se pri učnih urah uporabljajo iz več razlogov. Prvi je gotovo ta, da učenci lahko

vidijo ali občutijo živali iz različnih skupin. Na primer, da lahko občutijo kačo in spoznajo,

da ni sluzasta in mrzla, temveč presenetljivo suha, njeno telo pa ima sobno temperaturo.

Drugi razlog je razumevanje obnašanja živali, kar najlaže dosežemo z opazovanjem. Živali

v šoli pa imajo tudi pomembno vlogo pri razvijanju odgovornosti (McGriffin, 1980).

Tudi Tomažič I. (2008) ugotavlja pomen neposredne izkušnje z živaljo na spremembo

odnosa do živali in znanja o njej. V raziskavi, v katero so bili vključeni učenci sedmih

razredov je bilo ugotovljeno, da lahko z neposredno izkušnjo učenci pridobijo več znanja,

prav tako pa je bil potrjen pozitiven vpliv na znižanje intrapersonalnih ovir ob stiku z

živalmi. Kot pravi Lačen (2009) je narava najboljši vir informacij, zato se učitelji

velikokrat odločajo za opazovanje in tudi gojenje živali v razredu. V raziskavi je potrjeno,

da ima uporaba živih živali v razredu pozitivne učinke. Izboljša se dojemanje in

spoznavanje lastnosti živali.

2.1.1 Plazilci v izobraževanju in kot hišni ljubljenčki

Hišne živali so živali, ki se vzrejajo, redijo ali gojijo za družbo, rekreacijo ali pomoč

človeku, njihov skrbnik pa mora poskrbeti za dobro počutje živali, jim nuditi primerno

namestitev, hrano in vodo (Uradni list RS, 2009).



4

Ljudje se za hišne živali odločajo iz različnih razlogov, dokazan pa je ugoden učinek na

zdravje ljudi, ki imajo pozitivne izkušnje z živalmi. Pri odločitvi za vrsto živali je

pomembno, da razmislimo, kakšno vlogo bo žival imela v našem življenju, kakšen

življenjski stil imamo in koliko časa se bomo posvečali živali (Radford, 2011).

Eksotične živali, med katere štejemo tudi plazilce, so v današnjem času zelo priljubljene.

Predstavljene so v trgovinah za male živali, pojavljajo se v filmih in reklamah (Case,

21.7.2016).

Melissa Kaplan (1997a) opozarja, na kaj vse moramo biti pozorni, oziroma o čem vse

moramo razmisliti, preden se odločimo za nakup plazilca. Večina plazilcev ima zelo

specifične potrebe glede hrane, prav tako pa tudi glede okolja, oziroma bivališča, ki se

mora čimbolj približati razmeram v njihovem naravnem okolju (vlaga, toplota). Veliko

otrok in tudi odraslih ljudi se po začetnem navdušenju kmalu naveliča skrbeti za žival,

sploh če jim ta vzame več časa, kot so ob nakupu predvidevali, zato je pomembno, da se

zavedamo trajne obveze do živali. Žival lahko tudi zraste in preraste terarij. Pred nakupom

se je o željeni vrsti plazilca dobro čim bolj podučiti, ter pomisliti tudi na to, da bo žival

morda potrebovala veterinarsko oskrbo, ki je v naši bližini ni. Svojo vlogo pri odločitvi za

vrsto plazilca ima tudi cena živali, zato je potrebno že v začetku razmisliti, koliko denarja

smo pripravljeni vložiti, ne samo za žival, ampak tudi njeno bivališče in hrano. Pri hrani

velja omeniti tudi to, da je potrebno nekatere vrste plazilcev hraniti z živim plenom.

Strokovnjaki ocenjujejo, da od 50-90% plazilcev umre že v prvem letu ujetništva, velik

odstotek že med transportom. Kasneje pa zaradi nepoznavanja potreb živali ali odrekanja

veterinarske oskrbe. Od vseh vrst živali, ki jih ljudje imamo za hišne ljubljenčke, so

plazilci edini, ki v ujetništvu ne dočakajo višje starosti kot v svojem naravnem okolju

(Kaplan, 1997a).

Plazilci se uporabljajo tudi v izobraževalne namene, pri tem pa se srečujemo z enakimi

težavami, kot pri uporabi ostalih vrst, saj plazilci niso nič bolj, oziroma nič manj nevarni

od ostalih vrst. Prav tako so nekateri bolj primerni, drugi manj. Res pa je, da lahko z

uporabo plazilcev v izobraževanju vplivamo na razširjen negativen pogled nanje (Kaplan,

1997b).

Glede plazilcev (predvsem kač) ima veliko otrok predsodke, vezane na strah in gnus, kljub

temu pa jih večina ljudi, ki obišče vivarij, želi videti od blizu (Tomažič K., 2008).

Pri uporabi plazilcev v izobraževalne namene pri učencih prihaja do osebne rasti in

razvoja. Učenci poleg dejstev o plazilcih, klasifikaciji, ekologiji in obnašanju živali uvidijo

tudi, kakšno vlogo ima žival v ekosistemu. Učenci so predvsem sposobni sprejeti več bolj

kompleksnih informacij. S tem, ko učenec premaga strah, da se živali tudi dotakne, gradi

tudi svojo samozavest in samospoštovanje (Kaplan, 1997b).

Cilj učenja s plazilci pa je predvsem doseči, da plazilci niso strašni plenilci, ter da si žival

ne glede na to, ali je hladnokrvna ali toplokrvna zasluži spoštovanje, ter da je pomembno

ohranjanje vseh živalskih vrst in njihovih ekosistemov. Izobraževanja lahko potekajo v

različnih okoljih, šolah, parkih in knjižnicah. Vse pogosteje pa se izobraževanje povezuje z

zabavo (npr. rojstnodnevna zabava). Na takšnih srečanjih so predstavljene značilnosti

plazilcev, razmnoževanje, prehrana in njihovo naravno okolje. Živali za razstave morajo

biti dobro prilagojene na ujetništvo, nekatere morajo biti navajene na dotike, predvsem pa

je pomembno, da so zdrave (Kaplan, 1997b).



5

2.2 ZNAČILNOSTI PLAZILCEV

Plazilci (razred Reptilia) so skupina štirinožnih vretenčarjev (oziroma so potomci

štirinožnih vretenčarjev), njihova telesna temperatura se prilagaja okolju (poikilotermni

organizmi). So prvi kopenski vretenčarji, ki so neodvisni od življenja v vodi, tudi razvoj

zarodkov poteka v celoti na kopnem (Mršić, 1997).

Plazilci, z izjemo želv, imajo podaljšano telo z okončinami ali brez njih. Jasno je izražen

vratni del telesa, na hrbtenici pa so lepo razvidne posamezne regije telesa (vratna, hrbtna,

ledvena, križna, repna). Pri kačah, ki nimajo okončin, je prišlo do sprememb v telesnih

regijah. Telo plazilcev je zaradi življenja na kopnem zaščiteno z močnim slojem

poroženelih in roženih celic na površini povrhnjice, prav tako pa imajo vsi plazilci tudi

okostenine v usnjici. Kožne tvorbe (nameščenost in oblika tvorb) so pomemben

taksonomski znak za določanje vrste in pripadnost posameznim skupinam. Koža plazilcev

je tudi brez žlez, izjema so kuščarji, pri katerih so žleze nameščene na zadnjih nogah,

močneje pa so razvite pri samcih. Poroženela plast kože se stalno obnavlja, kjer se odmrli

vrhnji sloj ob levitvi odlušči (Tome, 2003).

Na glavi plazilcev so dobro razvite oči z vekami, ki so pri kačah in gekonih zrasle v

prozorno veko, ki popolnoma prekriva oko.

Želve in kuščarji (z izjemo slepcev) imajo dobro razvite okončine, ki so pri morskih želvah

preoblikovane v plavuti. Na nogah je po pet prstov z močnimi kremplji. Slepci še imajo v

telesu ostanke oplečja in okončin, pri kačah pa so okončine popolnoma pokrnele.

Spolni dimorfizem se pri plazilcih kaže predvsem v velikosti in obarvanosti telesa, samice

pa so praviloma večje od samcev (Mršić, 1997).

Plazilci imajo nestalno telesno temperaturo, ki je odvisna od temperature okolja. Če se

temperatura v okolju zniža pod določeno mejo otrpnejo, kar pomeni, da se preneha vsako

gibanje, upočasnjeni pa so tudi ostali življenjski procesi. Razširjeni so po vsem svetu, z

izjemo severnega in južnega tečaja, ter nad nadmorsko višino 3500 m. Največ vrst pa živi

v tropskih krajih (Mršić, 1997). V Sloveniji živi 22 avtohtonih vrst plazilcev in 1

neavtohtona vrsta (želva vrste Trachemys scripta, kamor spadata rdečevratka in

rumenovratka) (Krofel, 2009).

Na svetu najdemo več kot 6550 živečih vrst plazilcev, ki jih uvrščamo v 4 rede, 48 družin

in 905 rodov (Mršič, 1997; Tome, 2003).

RED PODRED

želve (Testudines) kritovratke (Cryptodira)

vijevratke (Pleurodira)

luskarji (Squamata) kuščarji (Sauria)

kolutniki (Amphisbaenia)

kače

prakuščarji (Rhynchocephalia)

krokodili (Crocodylia)



6

2.3 ZDRAVSTVENA TVEGANJA PRI ŽIVALIH - ZOONOZE

Zoonoze so bolezni oziroma infekcije, ki se po naravni poti neposredno ali posredno

prenašajo od živali na ljudi. Do okužbe lahko pride z neposrednim stikom z okuženo

živaljo, zaužitjem kontaminirane hrane, lahko pa tudi s posrednim stikom iz

kontaminiranega okolja (Uprava RS za varno hrano, veterinarstvo in varstvo rastlin, 2015).

V Sloveniji, kjer v programu spremljanja zoonoz in povzročiteljev zoonoz sodeluje več

institucij (Uprava za varno hrano, veterinarstvo in varstvo rastlin RS, Zdravstveni

inšpektorat RS in Nacionalni inštitut za javno zdravje), se spremljanje izvaja pri živalih,

živilih živalskega izvora, živilih neživalskega izvora in krmi za živali.

Že Pačnik (2008) navaja, da se veterinarji v vsakodnevni praksi pogosto srečujejo z

eksotičnimi živalmi, med katere uvrščamo ptice, male sesalce, plazilce, dvoživke in tudi

druge vrste, njihovo število pa se je v zadnjih letih zelo povečalo. Ptice so lahko prenašalci

bakterije Chlamydophila psitaci. Simptomi okužbe pri ljudeh so podobni simptomom

gripe, bolezen pa lahko napreduje v hudo pljučnico z možnimi drugimi zapleti. Ljudje se

lahko okužijo tudi z bakterijami iz rodu Salmonella sp., pogoste pa so tudi okužbe z

mikobakterijami vrste Mycobacterium avium. Med malimi sesalci, kamor veterinarji

uvrščajo kunce, morske prašičke, činčile, podgane in druge, so zoonoze zelo številne.

Pogoste so različne glivične okužbe, pojavljajo pa se tudi kampilobakterioza, salmoneloza,

listerioza in druge bolezni.

Tudi plazilci so mnogokrat prenašalci različnih mikrobov, povzročiteljev zoonoz.

2.3.1 Zoonoze plazilcev

V zadnjih letih narašča število plazilcev, ki jih ljudje gojijo kot domače živali.

Najpogostejše so želve, pogosti pa so tudi kuščarji in kače. Te živali so lahko videti

povsem zdrave, vendar so lahko prenašalci različnih patogenov, ki pod stresnimi pogoji

povzročijo infekcijo pri živali, lahko pa pride tudi do prenosa mikrobov na človeka, sploh

če lastnik ni podučen o pravilni higieni in negi živali. S plazilcev na človeka se pogosto

prenašajo salmonele, mikobakterije, klamidije in klamidofile, ter aeromonasi in

pseudomonasi (Ebani in Fratini, 2005).

Tako bolane živali kot tiste brez simptomov okužbe, so pogosti prenašalci tudi drugih

bakterij. Mednje spadajo Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp., Citrobacter

spp., Proteus spp., in druge (Ebani in Fratini, 2005).

2.3.1.1 Mikobakterioza in klamidofiloza

Bakterije rodu Mycobacterium so povzročiteljice mikobakterioz in so prisotne v vodi,

prahu in zemlji. Tam lahko plazilci pridejo v stik z njim. Plazilci imajo razvito naravno

odpornost proti mikobakterijam, saj se okužba pri njih pojavi zelo redko, oziroma šele

takrat, ko je njihov imunski sistem močno načet. Mikobakterije iz plazilcev so potencialno

patogene za ljudi, Mycobacterium chelonae in Mycobacterium fortuitum povzročata

predvsem bolezni pljuč, lahko pa tudi lokalne okužbe kože, osteomielitis, ter poškodbe

mehkega tkiva, Mycobacterium cansasii pa povzroča kronične pljučne bolezni podobne

pljučni tuberkulozi (Ebani in Fratini, 2005).



7

Klamidofilozo povzročajo obligatni intracelični paraziti, bakterije iz rodu Chlamydophila.

Bolezen je razširjena tako pri domačih kot divjih živalih, prisotna pa je tudi pri človeku,

pogosto kot atipična pljučnica. Bolezen je bila opažena pri hladnokrvnih živalih, vendar je

število okužb verjetno višje, kot navaja literatura, saj kronični znaki bolezni niso vidni, da

gre za okužbo živali s temi bakterijami pa ponavadi ugotovimo šele, ko žival pogine

(Ebani in Fratini, 2005).

2.3.1.2 Okužbe z aeromonasi in pseudomonasi

Bakterije iz rodov Aeromonas in Pseudomonas so po Gramu negativne bakterije, splošno

razširjene v okolju in so potencialno patogene za ljudi in živali. Velikokrat jih odkrijejo pri

živalih, ki imajo dermatitis, stomatitis, okužbo kloake, ušesno ali dihalno okužbo ter

ognojke(Ebani in Fratini, 2005).

2.3.1.3 Salmoneloza

Salmoneloze so bolezni, ki jih povzročajo bakterije rodu Salmonella. Plazilci se s

salmonelo lahko okužijo ob neposrednem stiku z drugo okuženo živaljo ali s hrano. Možna

je tudi okužba jajc skozi lupino. Pri želvjih jajcih npr. lahko salmonela že v roku ene ure

prodre iz zunanjosti v jajce. Bakterije se zadržujejo v prebavnem traktu živali, znaki

okužbe pa največkrat niso vidni, vse dokler pod stresnimi pogoji ne pride do izbruha

bolezni. Klinični znaki okužbe s salmonelo so lahko zelo različni. Salmonela lahko

povzroči septikemijo, pljučnico, abscese, hipovolemični šok ter smrt pri okuženih živalih

(Ebani in Fratini, 2005). Po podatkih je salmonela velikokrat izolirana tako iz plazilcev v

ujetništvu, kot iz prosto živečih. Živali, ki ne kažejo kliničnih znakov salmoneloze, ni

potrebno zdraviti. Če pa se okužene živali uporabljajo na razstavah ali so v stiku z otroki,

jih je potrebno umakniti, ni pa jih potrebno usmrtiti. Potrebno je le ustrezno zdravljenje

(Mitchell, 2001).

Mitchell (2001) prav tako navaja, da je bila salmonela prvič izolirana iz kuščarja vrste

Heloderma suspectum leta 1944, čeprav se navajajo tudi nepotrjene informacije iz leta

1939. V skupini petih kuščarjev vrste Heloderma suspectum so 4 živali umrle v roku 18 ur

do treh mesecev. V kači, najdeni na puranji farmi so prav tako potrdili prisotnost

salmonele, to pa je bil tudi prvi primer, kjer so bili prisotni kar trije različni serotipi

salmonel. Prvo poročilo o prisotnosti salmonele pri želvah je potrdilo prisotnost v jetrih,

vranici, pljučih in črevesju. O salmonelozi so poročali tudi iz krokodilje farme. Prizadete

živali so bile shirane, septikemija pa je privedla do smrti.

2.3.1.3.1 Pogostost okužb s salmonelo pri plazilcih in njen prenos na človeka

O prvem primeru prenosa okužbe s salmonelo iz želve na človeka so poročali že leta 1943,

pogostost prenosov pa je v naslednjih dvajsetih letih naraščala, težave pa so se pojavljale

predvsem pri otrocih. Od leta 1990 se je pogostost s plazilci povezanih okužb dramatično

zvišala, kar je posledica vse večje priljubljenosti plazilcev kot hišnih ljubljenčkov

(Mitchell, 2001).

Po ocenah Centrov za nadzor in preventivo CDC (Centers for Disease Control and

Prevention), se v Združenih državah Amerike vsako leto pojavi okrog 93 000 primerov



8

salmoneloze pri ljudeh, ki je povezana s plazilci ali dvoživkami (Center for Food security

& Public Health, 5.8.2016).

Želve, ter mnogi drugi plazilci, se v živalskih vrtovih lahko prosto gibljejo, saj niso nevarni

ljudem. Salmonela pa je zelo odporna in obstojna v okolju, lahko se indirektno prenaša in

povzroči okužbo. Znan je primer okužbe v Denverju, kjer je zbolelo veliko otrok, ki so

obiskali živalski vrt, okužili pa so se posredno, preko lesene ograde. Kot navaja Bauwens s

sod. (2006), so v živalskem vrtu v Antwerpnu v raziskavi zbrali vzorce iz iztrebkov

zdravih in bolnih plazilcev, pregledali pa so tudi vzorce iz okolja (ograde, kuhinja, javni

prostori). Potrjena je bila prisotnost salmonele v vzorcih iz okolja, prav tako pa so bili sevi

bakterije najdeni v 47 (47%) od 100 vzorcev iz iztrebkov. Od skupno 66 sevov, ki so bili

serotipizirani jih je 29 (43,9%) predstavljalo vrsto Salmonella enterica subsp. enterica, 3

(4,5) subsp. salamae, 29 (43,9) subsp. arizonae ali diarizonae, 4 (6,1%) subsp. houtenae,

pri 1 (1,5%) pa je prišlo do avtoaglutinacije. V istem obdobju so bili testirani tudi vzorci

plazilcev in ptic. Ob primerjavi rezultatov je bilo ugotovljeno, da se salmonela pogosteje

pojavlja pri hladnokrvnih živalih.

Od 91 vzorcev iz živalskega vrta v Rimu in vzorcev zasebnih gojiteljev, ki so bili testirani

z uporabo standardnega protokola za izolacijo salmonele iz hrane, jih je bilo kar 46

(50,5%) pozitivnih na salmonelo. S tem je bila potrjena visoka razširjenost sevov

salmonele pri plazilcih, zlasti pri kačah in kameleonih, nasprotno pa je bila pri želvah zelo

nizka. Večina serotipiziranih sevov je pripadala vrsti Salmonella enterica subsp. enterica

(Corrente s sod., 2004).

Kljub opozorilom nevarnosti salmoneloze pri ljudeh, ki se pojavlja kot posledica stika s

plazilci, število plazilcev gojenih v ujetništvu še vedno narašča. Vzorci iztrebkov in brisov

iz kloak, ki so bili zbrani v Braziliji, so v 39,1% vsebovali bakterije iz rodu salmonela

(Abalem de sá, Solari, 2001).

V Južni Ameriki (Francoska Gvajana) so bili zbrani vzorci prosto živečih plazilcev in

plazilcev iz ujetništva. V 23,2 % so živali bile okužene s salmonelo. Isti serotipi (64,3%)

pa so bili izolirani tudi pri obolelih ljudeh. Plazilci so lahko vir okužbe in predstavljajo

tveganje za javno zdravje, sploh če se ti pogosto pojavljajo v okolici hiš in živine. Nekateri

plazilci so tudi hrana ljudem, zato je higiena pri pripravi in higiena v kuhinjah zelo

pomembna (Gay, 2014). Tudi Ebani s sod. (2004) poroča o prisotnosti salmonele pri

plazilcih. V letih 2001 in 2002 so pri pregledu vzorcev, ki so bili zbrani v trgovini z

živalmi v Italiji v 23,93% ugotovili prisotnost sevov Salmonella enterica. Ta se je

največkrat pojavila pri kuščarjih (60,27% vseh pozitivnih živali).

Prisotnost salmonele v iztrebkih pri želvah je nižja v primerjavi s kuščarji in kačami. Od 38

pregledanih želv je bila salmonela potrjena le v enem primeru, medtem, ko je bilo s

salmonelo okuženih kar 61% kuščarjev in 73,8% kač. Najpogostejša je bila Salmonella

enterica subsp. enterica, nato pa Salmonella enterica subsp. diarizonae, sta v svoji

raziskavi ugotovila Geue in Löschner (2002).

Živalski vrtovi imajo pogosto posebne oddelke, kjer potekajo delavnice in izobraževanja,

pri katerih obiskovalci pridejo v stik s plazilci. Tako je tudi v živalskem vrtu v

Kopenhagnu. Plazilci so razdeljeni v dve skupini, glavno zbirko plazilcev in plazilce, ki so

namenjeni izobraževanju in rokovanju. Izmed vseh odvzetih vzorcev iz kloak plazilcev

(obe skupini) je bilo 35% živali pozitivnih za salmonelo. Največ ravno na oddelku, kjer s

plazilci pridejo v stik tudi obiskovalci. Največ je bilo okuženih kač, sledile so želve,

najmanj okuženih osebkov pa je bilo med kuščarji. Izmed vseh serotipiziranih salmonel je

prevladovala Salmonella enterica subsp. diarizonae (Hydeskov s sod., 2013).



9

Pasmans s sod. (2005) se je v raziskavi osredotočil na kuščarje v ujetništvu. Pregledali so

iztrebke in brise iz kloak kuščarjev zasebnih gojiteljev, trgovin s plazilci in iz zoološkega

inštituta. Med vzorci, pridobljenimi z brisi, je bilo za salmonelo pozitivnih 62,5%, med

vzorci iz iztrebkov pa je bil odstotek salmonele še višji 75,8 %. Vsi serotipi salmonel so

predstavljali vrsto Salmonella enterica, prevladovala je Salmonella enterica subsp.

enterica.

Med leti 1995 in 2006 so na Danskem pregledali plazilce živalskih vrtov, trgovin z

živalmi, nekaj pa je bilo tudi zasebnih gojiteljev. Ugotovitve potrjujejo potencialno

nevarnost okužb v živalskih vrtovih in tudi doma. Vsi izolati salmonele so pripadali vrsti

Salmonella enterica,, največ je bilo Salmonella enterica subsp. enterica, pogosti pa sta bili

tudi Salmonella enterica subsp. diarizonae in Salmonella enterica subsp. houtenae

(Pedersen s sod., 2009).

Pfleger s sod. (2003) je v raziskavo zajel 103 plazilce, pregledani pa so bili njihovi

iztrebki. Pri kačah je bila salmonela prisotna v 24%, pri kuščarjih v 17%, ter pri želvah v

3%. Med vsemi izoliranimi salmonelami je prevladovala Salmonella enterica subsp.

enterica. Ugotovil je da, četudi je odstotek za salmonelo pozitivnih živali nizek, te še

vedno predstavljajo tveganje, zato je pri rokovanju z njimi zelo pomembna higiena.

Po navedbah Mermina s sodelavci (2004), okužba s salmonelo pri ljudeh največkrat

povzroči drisko, lahko pa se pojavijo tudi hujše zdravstvene težave, kot sta sepsa in

meningitis, ki sta za dojenčke ali osebe z oslabljenim imunskim sistemom lahko smrtna.

Glavni vir okužbe so še vedno jajca in surovo meso. Pri preučevanju izbruhov bolezni pa

se je pokazala tudi povezava okužbe s salmonelo po direktnem ali posrednem stiku s

plazilci. Prav okužba preko plazilcev pogosteje pripelje do hospitalizacije. V letih 1996 in

1997 so bili v raziskavo vključeni ljudje, pri katerih je bila potrjena salmoneloza. Vsem so

bila postavljena vprašanja o morebitnem stiku s plazilci (lastništvo plazilca, obisk razstave,

trgovine z živalmi). S študijo je bilo v teh letih potrjenih kar 74 000 okužb, ki so bile

posledice stika s plazilci, okužbe pa so bile neposredne ali posredne, ker lahko salmonela

dolgo preživi v okolju, tudi do 6 mesecev v iztrebkih, ter 6 tednov v vodi.

Med leti 1994 in 1996 so v Kanadi opazili povečano število salmoneloz v povezavi s

plazilci. Že prej, med leti 1960 in 1970 pa je bilo opaziti porast z želvami povezane

salmoneloze, zaradi česar je takrat prišlo do spremembe zakonodaje in tudi do prepovedi

uvoza želv v Kanado. V obdobju med 1991 in 1996 je bilo opaženih veliko različnih

serotipov salmonel pri eksotičnih živalih, najpogosteje pri želvah in kuščarjih. V istem

obdobju so bili pregledani tudi vzorci pri ljudeh. Veliko serotipov je bilo enakih kot pri

eksotičnih živalih, prav tako pa so bili med izoliranimi serotipi tudi takšni, ki se praviloma

pojavljajo predvsem pri hladnokrvnih živalih (Woodward s sod.,1997).

Whitten s sod. (2015) v svoji študiji predstavlja s plazilci povezane okužbe. V anketnih

vprašalnikih, ki so služili kot pripomoček za nadaljne raziskave in ki so jih izpolnjevali s

salmonelo okuženi bolniki, so bila vključena tudi vprašanja v zvezi s plazilci (stik s

plazilci, prehrana plazilca). Med leti 1996 in 2011 je bilo skupno 3,5% okuženih ljudi, ki

so potrdili stik s plazilci. Največkrat so bili to kuščarji, nato kače, ali pa kombinacija več

plazilcev.

V zadnjih letih se je v Severni Ameriki in v Evropi povečalo število okužb ljudi, ki so v

povezavi z razstavami živali. Te so vedno pogostejša oblika razvedrila in tudi

izobraževanja, saj omogočajo neposreden stik z živalmi. Izbruhe največkrat povzročijo

poleg bakterije Salmonella enterica tudi Cryptosporidium parvum in Escherichia coli. Od



10

leta 1990 so bili v ZDA vsaj štirje večji izbruhi bolezni, ki so bili posledica razstave živali

(Keen, 2007).

2.3.1.3.2 Preprečevanje prenosa okužb na človeka

Odkrivanje in odpravljanje salmonele pri plazilcih ni dovolj učinkovita rešitev za

preprečevanje salmoneloze pri ljudeh. Do sedaj je bilo narejenih veliko poskusov, ki bi

preprečili širjenje salmoneloze pri plazilcih, vendar neuspešno. V perutninski industriji se

proti salmoneli uspešno uporablja cepivo, ki pa je brez učinka pri plazilcih. Do okužbe, ki

se prenese s plazilca na človeka ne more priti, če se človek zgolj dotakne plazilca, se pa

možnosti za okužbo povečajo, če z delom telesa, ki je bil v stiku s plazilcem sežemo v usta

(Gray, 2011).

Bauwens (2006) ugotavlja, da je potrebno izboljšati preventivne ukrepe, ter izpostavlja

pomen dobre higienske prakse, saj se s tem lahko zmanjša tveganje za prenos okužb.

Mnogo ljudi še vedno misli, da se s salmonelo lahko okužijo le preko hrane, ne vedo pa, da

je prenos okužbe možen tudi z želvami in kuščarji, ter preko njihove hrane. CDC (2016)

opozarja, da si je po rokovanju s plazilci, stikom z njihovim terarijem ali hrano vedno

potrebno umiti roke. Pomembno je tudi, da otroci, mlajši od pet let, ljudje z oslabljenim

imunskim sistemom, ter odrasli nad petinšestdeset let ne rokujejo s plazilci, saj je pri njih

povečano tveganje za okužbo (Radford, 2011). Paziti je potrebno tudi pri stiku s hrano za

plazilce ali z njihovimi terariji, če plazilce kopamo je pomembno, da pri tem ne

uporabljamo kuhinjskega korita ali umivalnika v kopalnici, temveč imamo v ta namen

posodo, ki je ne uporabljamo v druge namene. Plazilcev tudi ne poljubljamo ali si jih

stiskamo k obrazu, saj s tem povečamo tveganje za okužbo (CDC, 2016).

Pomembno je tudi, da plazilcem ne dovolimo prostih izhodov po kuhinji ali kopalnici, ter

da so naše živali zdrave, veterinarsko pregledane, imajo primerno hrano in oskrbo (Gray,

2011).

Veterinarji v zasebnih klinikah ali v zooloških inštitucijah imajo pomembno vlogo pri

preventivi in osveščanju. Lastniki plazilcev in obiskovalci živalskih vrtov pa morajo biti

obveščeni o možnostih tveganja pri rokovanju s plazilci (Mitchell, 2001).

2.4 BAKTERIJE RODU Salmonella

Bakterije rodu Salmonella so po Gramu negativne palčke, ki jih uvrščamo v družino

enterobakterij (razred gamaproteobakterij). Poimenovane so po ameriškem bakteriologu

Danielu Elmer Salmonu.

Velikost bakterije se giblje med 0,7 - 1,5 2,0 – 5,0 µm. Njene kolonije (slika 1) so

okrogle, velike od 2 – 4 mm. Bakterija je fakultativno anaerobna in gibljiva (s peritrihimi

flageli), ima fermentativni in respiratorni tip metabolizma (Garrity s sod., 2005).



11

Slika 1: Kolonije bakterije Salmonella enterica subsp. enterica na selektivnem gojišču XLD. (Foto: M.

Farkaš)

Bakterije so patogene tako za ljudi, kot za živali. Pri ljudeh povzročajo enterično mrzlico,

gastroenteritis in septikemijo (Garrity s sod., 2005).

Kot navaja Yan s sodelavci (2003) okužba s salmonelo največkrat mine brez večjih

zapletov, kljub temu pa se včasih (v manj kot 5% primerov) ne moremo izogniti uporabi

antibiotikov, predvsem pri rizičnih skupinah kot so starejši ljudje, bolniki po presaditvah

ali z oslabljenim imunskim sistemom in otrocih.

Habitat salmonel je omejen predvsem na prebavni trakt pri ljudeh in živalih. Njeno

prisotnost v vodi, hrani, ali okolju pa lahko razlagamo kot kontaminacijo z iztrebki.

Nekateri serovarji (serotipi) so omejeni na gostiteljske vrste, npr. serovar Salmonella

Abortusovis (povzroča splave) je omejen samo na ovce (Wray, 2000). Pri ljudeh so zelo

redko odkrite Salmonella enterica subsp. salmae, subsp. arizonae in diarizonae, se pa zelo

pogosto pojavljajo v prebavilih hladnokrvnih živali (Garrity s sod., 2005).

Pri plazilcih so pogosto ugotovljeni različni serotipi Salmonella enterica subsp. enterica,

poleg njih pa najdemo tudi bakterije Salmonella enterica subsp. salamae, S. enterica

subsp. arizonae, S. enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae, S. enterica

subsp. indica, ter tudi Salmonella bongori. Salmonela se lahko prenaša na ljudi ali druge

živali preko iztrebkov. Okuženi ljudje so lahko prenašalci po več mesecev ali celo več kot

leto. Preko 90% plazilcev je lahko prenašalcev salmonele, do sedaj pa so pri enem osebku

izolirali kar pet različnih serotipov (The Center for Food Security & Public Health, 2013).

2.4.1 Klasifikacija

Sama klasifikacija salmonel v taksonomski sistem oziroma razdelitev rodu v posamezne

vrste je bila že večkrat revidirana in zna biti precej zavajajoča. Po Bergey-u (2005) je rod

sestavljen iz dveh vrst Salmonella bongori in Salmonella enterica, ta je razdeljena še v šest

podvrst, poimenovanih (ali oštevilčenih); enterica (I), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb),

houtenae (IV), indica (VI) in salamae (II). Poleg tega je v veljavi tudi še sistem razdelitve

(klasifikacijska shema po White – Kauffmann) v različne serotipe (serovare) glede na

imunske reakcije z antigeni; K- kapsularni antigen (tudi Vi), H – flagelarni antigen in O –



12

somatski antigen (zunanji polisaharidni del lipopolisaharidov v zunanji membrani po

Gramu negativnih bakterij).

Issenhuth – Jeanjean (2014) v dopolnitvi White – Kauffmann in Le Minorjeve sheme

poroča o 63 novih serovarih, ki so bili odkriti med leti 2008 in 2010. Vrsta Salmonella

bongori obsega 22 serovarov, Salmonella enterica pa 2637 serovarov, od tega jih 1586

pripada subsp. enterica, 522 subsp. salamae, 102 subsp. arizonae, 338 subsp. diarizonae,

76 subsp. houtenae ter 13 subsp. indica.

Tako je recimo eden od najpogostejših povzročiteljev salmoneloze pri ljudeh sev

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis, ki ga krajše označujemo kot

Salmonella Enteritidis. Salmonella Enteritidis je tudi najpogosteje izolirana iz jajc,

medtem, ko so s Salmonella Choleraesuis pogosto okuženi prašiči (Yan, 2003).

Serovari iz vrste Salmonella bongori so največkrat najdeni v okolju, pogosto pa so izolirani

tudi iz hladnokrvnih živali, medtem, ko se pri sesalcih in pri ljudeh zelo redko pojavijo

(Yan, 2003).

Leta 2004 je bila predlagana še tretja vrsta rodu Salmonella, S. subterranea (Shelobolina s

sod., 2004).

2.4.2 Virulentni dejavniki

Kot virulenco definiramo sposobnost organizma, da povzroči bolezen v določenem

gostitelju (Johnson, 1991). Salmonele vsebujejo veliko genov za virulenco. Mnogo teh

genov se nahaja na tako imenovanih otokih patogenosti (SPI – Salmonella pathogenicity

islands) na njihovem kromosomu. Otoki patogenosti imajo zapise za določene dejavnike

virulence, ki so ključni za patogenezo bakterije (Marcus s sod., 2000). Virulentni

dejavniki, ki so kodirani na SPI 1, so odgovorni za vstop bakterije v gostitelja, na SPI 2, 3

in 4 pa so zapisi za virulentne dejavnike, ki omogočijo razmnoževanje in preživetje

salmonele v gostitelju. Virulentni dejavniki, kodirani na SPI 5 se vključujejo v fazo vnetja.

Poleg kromosoma se geni za virulentne dejavnike nahajajo tudi na plazmidih, kjer najdemo

npr. gene spvRABCD. Produkte teh genov bakterije potrebujejo za rast in preživetje znotraj

makrofagov (Kastelec in Harlander, 2006).

Geni spv so pomembni za razmnoževanje bakterij v gostiteljskih celicah. Gen spvC se

nahaja na plazmidu povezanim z virulenco, njegov produkt ima fosfotreoninliazno

aktivnost. Lahko inaktivira z mitogenom-aktivirane protein kinaze (MAPK) Erk 1/2, JNK

in p38 v človeških celicah (Ibbara in Steele – Mortimer, 2009; Kaur in Jain, 2011).

Virulentni dejavniki, kodirani na SPI 1, so odgovorni za vdor salmonele v črevesne celice

in pojav driske. Na SPI 1 se nahajajo geni sipA, sipB, sopA, sopB, sopC, sopD, sopE, sptP

in invA. SopB je fosfoinozitid fosfataza, ki hidrolizira fosfatidilinozitol-3,4,5-trifosfat v

fosfatidilinozitol-3-fosfat, ter tako spodbuja reorganizacijo aktinskega citoskeleta,

izločanje Cl- in preoblikovanje plazmaleme gostiteljske celice (Ibbara in Steele –

Mortimer, 2009; Kaur in Jain, 2011). Produkt gena invA pa je strukturni protein

sekrecijskega sistema tipa III (T3SS1), ki je vključen v vdor salmonele v celice črevesnega

epitelija (Hur s sod., 2011).

Na SPI 2 so geni spiC, sseF, sseG, sifA, sifB in drugi, ki omogočajo preživetje salmonele v

gostiteljski celici in sistemske okužbe. SifA je potreben za integriteto membrane

salmonele-vsebujoče vakuole (SCV; Salmonella-containing vacuole) in za tvorbo s

salmonelo-induciranih filamentov (SIF). Tvorba teh je nujna za razmnoževanje salmonele

v gostiteljski celici (Kaur in Jain, 2011).



13

2.4.3 Odpornost proti antibiotikom

Antibiotiki so naravne učinkovine, ki jih proizvajajo glive ali bakterije. Na

mikroorganizme delujejo tako, da zavirajo njihovo rast in razmnoževanje, delujejo

bakteriostatično, ali povzročijo propad celice oziroma imajo baktericidno delovanje. S

pojmom protimikrobna učinkovina pa označujemo tako naravne, kot tudi sintetične snovi,

ki prav tako delujejo bakteriostatično ali baktericidno. Danes se izraza velikokrat ne

ločujeta več, predvsem v splošni rabi se uporablja izraz antibiotik, tudi kadar govorimo o

sintetičnih snoveh (Madigan in Martinko, 2006; Reeves, 2012).

Antibiotike delimo v več skupin, npr. aminoglikozidi, beta-laktamski antibiotiki,

tetraciklini, kinoloni in drugi. Streptomicin se uvršča med aminoglikozidne antibiotike, ki

se vežejo na ribosomsko podenoto 30S. Tudi tetraciklin deluje baktericidno tako, da

inhibira sintezo proteinov z vezavo na ribosomsko podenoto 30S. Kloramfenikol pa se

veže na ribosomsko podenoto 50S. Beta-laktamski antibiotiki se na podlagi njihove

kemijske strukture nadalje delijo v skupine, vsem pa je skupen beta-laktamski obroč in

delovanje – zavirajo sintezo celične stene. Delimo jih na peniciline (npr. penicilin,

ampicilin), cefalosporine (npr. ceftazidim, cefotaksim), karbapeneme (npr. imipenem,

ertapenem), monobaktame (npr. aztreonam) in inhibitorje beta-laktamaz (npr. klavulanska

kislina). Uporabljajo se tako v veterini, kot v medicini. Kinoloni so skupina sintetičnih

antibiotikov, glede na razvoj jih delimo v štiri generacije, predstavnik prve generacije je na

primer nalidiksična kislina, druge generacije pa norfloksacin in v humani medicini

najpogosteje uporabljan kinolon ciprofloksacin. Tako kot beta-laktamski antibiotiki se tudi

kinoloni uporabljajo v veterini in medicini, zavirajo pa delovanje topoizomeraz tipa II

(DNA-giraze pri Gram-negativnih bakterijah, topoizomeraze IV pri Gram-pozitivnih

bakterijah). Fluorokinoloni (pogosto uporabljen je ciprofloksacin), uspešno delujejo proti

Gram – negativnim bakterijam (npr. Escherichia coli, Enterobacter, Salmonella) (Reeves,

2012).

Odpornost bakterij proti protimikrobnim sredstvom ni fenomen našega stoletja ali

posledica industrializacije, temveč gre za naraven ekološki pojav, v katerem

mikroorganizmi tekmujejo med sabo, kar je privedlo tudi do razvoja obrambnih

mehanizmov. Kot pravi Helmuth (2000) antibiotiki, ki so danes v uporabi, vplivajo tako na

biokemijske, kot tudi na fiziološke procese v prokariontskih celicah. S splošno uporabo

protimikrobnih sredstev je bil pojav odpornosti opažen skoraj pri vseh bakterijskih vrstah

in proti vsem sredstvom, ki so na voljo (Helmuth, 2000). Problem odpornosti bakterij proti

antibiotikom se v zadnjih letih povečuje in predstavlja večje tveganje za javno zdravje.

Med leti 1989 in 1990 je bilo kar 29% izolatov salmonel odpornih proti vsaj eni

protimikrobni učinkovini. Pri salmoneli je zaskrbljujoč tudi podatek o večkratni

odpornosti, ki je bila opažena proti ampicilinu, kloramfenikolu, streptomicinu in

tetraciklinu (Yan s sod., 2003).

Znani so različni načini, s katerimi si bakterije zagotovijo odpornost proti antibiotikom.

Salmonela je tako zaradi svoje Gram – negativne celične stene odporna proti vankomicinu,

ki s svojimi velikimi molekulami ne more prodreti v celico. Salmonela lahko proizvede

tudi določene encime, s katerimi vpliva na antibiotike, velikokrat pa je odpornost proti

antibiotikom posledica mutacij tarčnih mest (Yan s sod., 2003).

Odpornost proti antibiotikom bakterijam omogočajo tudi plazmidi, do večkratne

odpornosti pa lahko pride ob pretirani uporabi antibiotikov v bolnišnicah, ali če se

antibiotiki dodajajo v živalsko krmo. Tako je serovar Typhi okrog 1990 razvil odpornost

proti že poznanim antibiotikom (Garrity s sod., 2005).



14

Odpornost salmonele proti antibiotikom je moč zaznati predvsem v razvitejšem svetu,

medtem ko so raziskave ruralnih območij in divjine pokazale zelo nizko odpornost.

Odpornost proti kinolonom, še posebno fluorokinolonom, je bila opažena že leta 1980, od

takrat pa se pojavlja vedno pogosteje, kar je zaskrbljujoče, saj fluorokinolone uvrščamo

med novejše antibiotike, ki so v splošni uporabi tako v medicini, kot tudi veterini. Tako so

zabeležena poročila o vse manjši občutljivosti za ciprofloksacin in nalidiksično kislino

(Helmuth, 2000).

Domače živali, vključno s plazilci, so se pokazale kot možen vir okužbe s salmonelo,

število teh pa se v zadnjih letih povečuje. Žal pa je le malo podatkov o odpornosti bakterij,

izoliranih iz plazilcev, proti antibiotikom. Tako so na Tajvanu v študijo med leti 2005 in

2006 zajeli plazilce iz živalskega vrta, trgovin z malimi živalmi in z univerze. Salmonela je

bila potrjena pri 30,9 % živali. Prevladovale so kače, sledili so kuščarji, najmanj okuženih

pa je bilo želv. Serotipizirane salmonele so bile odporne proti antibiotikom, 6,9% je bilo

odpornih na 4 ali več antibiotikov. Največ sevov je bilo odpornih proti streptomicinu

(14,7%) in tetraciklinu (9,2%). Odpornost proti nalidiksični kislini so zaznali samo pri

želvah. Zaznana je bila tudi odpornost proti ampicilinu (6,9%), medtem ko odpornosti proti

ciprofloksacinu in norfoksacinu ni bilo (Chen s sod., 2010). Corrente s sod. (2004) je že

pred tem potrdil odpornost salmonel, izoliranih iz plazilcev, proti streptomicinu (32,6%),

tetraciklinu (19,6%), ampicilinu (17,4%) ter tudi odpornost sevov proti nalidiksični kislini

(13,1%). O odpornosti proti klavulanski kislini, ceftazidimu in ciprofloksacinu ne poroča.

Ebani s sod. (2005) je prav tako potrdil antibiotično odpornost salmonel, izoliranih iz

plazilcev. Med izoliranimi sevi so bili vsi odporni vsaj na en antibiotik ali več. Veliko je

bilo odpornih proti ampicilinu (27,4%) medtem, ko so vsi sevi razen enega pokazali

občutljivost za kloramfenikol, ter v 75,34% tudi za tetraciklinu.

2.4.3.1 Odpornost proti beta-laktamskim antibiotikom in kinolonom

Odpornost proti beta-laktamskim antibiotikom je lahko posledica prisotnosti encima beta-

laktamaze. Ta encim prekine beta-laktamski obroč tako, da cepi amidno vez. Nekatere

Gram - negativne bakterije so zaradi svoje lipopolisharidne zunanje membrane naravno

odporne proti beta-laktamskim antibiotikom (Reeves, 2012).

Beta-laktamaze lahko delimo na podlagi njihovih fenotipskih lastnosti ali na podlagi

molekularnega razvrščanja, torej na podlagi nukleotidnega ali aminokislinskega zaporedja

encimov. Nekatere beta-laktamaze posredujejo odpornost tudi proti tretji in četrti

generaciji cefalosporinov (ceftazidim, cefotaksim). To so beta-laktamaze z razširjenim

spektrom delovanja (Extended-Spectrum Beta – Lactamases) ali krajše ESBL (Bush s sod,

1995; Samaha – Kfuory in Araj, 2003). ESBL nadalje delimo v več skupin. V skupino

CTX – M so uvrščeni encimi, ki najverjetneje izhajajo iz bakterij rodu Kluyvera in so se

prenesli na plazmide drugih bakterij, geni za beta-laktamaze CTX – M se najpogosteje

nahajajo na konjugativnih plazmidih. Beta-laktamaze z razširjenim spektrom delovanja

skupine CTX – M sodijo med najbolj razširjene in so najpogostejši vzrok odpornosti

enterobakterij proti cefalosporinom (Bonnet, 2004). Razvrščamo jih v 5 podskupin (CTX-

M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9 in CTX-M-25) (Woodford, 2010).

Odpornost bakterij proti kinolonom se povezuje predvsem z njihovo pretirano uporabo.

Odpornost proti njim nastaja zaradi mutacij v nukleotidnih zaporedjih kromosomskih

genov za DNA-girazo ali topoizomerazo IV (topoizomeraze tipa II). Do odpornosti lahko



15

privedejo tudi spremembe v izražanju različnih membranskih črpalk in porinov, ki

uravnavajo akumulacijo antibiotika v celici. Identificirali so tudi tretjo obliko odpornosti,.

Gre za prenosljive gene na plazmidih, ki posredujejo nizko raven odpornost proti

kinolonom in fluorokinolonom. To tretjo skupino genov označujemo kot gene za

plazmidno posredovano kinolonsko rezistenco ali krajše PMQR (plasmid-mediated

quinolone resistance). Med njimi so tudi tako imenovani geni qnr, ki kodirajo proteine iz

pentapeptidnih ponovitev, le-ti se vežejo in tako zaščitijo topoizomeraze tipa II pred

inhibicijo s kinoloni. Poznanih je več različic genov qnr: qnrA, qnrB, qnrS, ter qnrC in

qnrD (Robicsek s sod., 2006; Reeves, 2012; Jacoby, 2005).



16

3 MATERIAL IN METODE

3.1 IZOLACIJA BAKTERIJ RODU Salmonella IZ PLAZILCEV

3.1.1 VZORCI

Vzorce, iz katerih smo izolirali bakterije, smo zbirali od marca 2010 do februarja 2011.

Zbirali smo iztrebke in vzorce brisov iz kloak (slika 2) plazilcev zasebnih gojiteljev, v

raziskavo pa smo zajeli tudi nekaj šol in visokošolskih zavodov iz Ljubljane in okolice.

Slika 2: Odvzem brisa iz kloake pri kraljevem pitonu (Foto: M. Turk)

3.1.2 NAČRT DELA

Bakterije smo iz iztrebkov in brisov najprej izolirali in identificirali po normativu, ki se

uporablja v mikrobiologiji živil in krme za ugotavljanje vrst rodu Salmonella (ISO

standard 6579:2002). Ker pa smo ugotovili, da so rezultati zadovoljivi tudi s krajšim

postopkom, smo kasneje metodo priredili tako, da smo sveže iztrebke resuspendirali

(oziroma vatenke z brisi potopili) v gojišču BPW in jih stresali pri 37 ºC in 200

obratih/min eno uro ter s tem skrajšali čas predbogatitve za 17 ur, nato pa smo zopet sledili

prej omenjenemu postopku (slika 3).

Gojišča, ki smo jih uporabili v postopku izolacije in identifikacije smo pripravljali sami.

Uporabili smo recepte iz mednarodnega standarda ((ISO standard 6579:2002, gojišči BPW

in MKTT). Preostale recepte za gojišča pa smo povzeli po bakteriološkem priročniku

(Gerhardt s sod., 1994).



17

Slika 3: Prikaz postopka izolacije in identifikacije salmonel iz iztrebkov/brisov kloak plazilcev.

PREDBOGATITEV

1 g (1ml) vzorca ali vatenka - bris + 9 ml BPW

1 ura, 37 °C, stresanje 200 obratov/min

BOGATITEV

1 ml suspenzije vzorca v BPW + 9 ml MKTT

24 ur, 37 °C, stresanje 200 obratov/min

SELEKTIVNA IZOLACIJA

10 μl suspenzije vzorca na selektivno gojišče

XLD ali SSA

24 ur, 37 °C

IZOLACIJA ČISTE KULTURE

IDENTIFIKACIJA Z BIOKEMIJSKIMI TESTI

MOLEKULARNO – BIOLOŠKA

IDENTIFIKACIJA NA OSNOVI ZAPOREDJA

GENA ZA 16S rRNA



18

GOJIŠČA IN GOJENJE

3.1.2.1 Predbogatitev

PEPTONSKA VODA (BUFFERED PEPTONE WATER - BPW)

Kazein hidrolizat 10,0 g

Natrijev klorid (NaCl) 5,0 g

Dinatrijev hidrogen fosfat dodekahidrat

(Na2HPO4 12H20) 9,0 g

Kalijev dihidrogen fosfat (KH2PO4) 1,5 g

Destilirana voda 1000 ml

Kemikalije smo raztopili v destilirani vodi ob rahlem segrevanju. pH smo umerili na 7,0 z

1M NaOH in raztopino razdelili v infuzijske stekleničke. Avtoklavirali smo 15 min pri 121

ºC.

GOJENJE

Iztrebke ali vatenke z brisi smo dali v epruvete, jih označili, ter dodali BPW v razmerju

1:10. Kjer smo imeli iztrebke resuspendirane v vodi smo vzeli 1 ml suspenzije iztrebka in

dodali 9 ml BPW. Vzorce smo dobro premešali s pomočjo vibracijskega mešala, da so se

čim bolj resuspendirali, nato pa smo epruvete z vzorci stresali pri 37 °C in 200 obratih/min

približno 1 uro (slika 3).

3.1.2.2 Bogatitev

Gojišče MKTT (MULLER – KAUFFMANN TETRATHIONAT – NOVOBIOCIN)

Osnovno gojišče:

Mesni ekstrat 4,3 g

Encimatsko razgrajen kazein 8,6 g


Kalcijev karbonat (CaCO3) 38,7 g

Natrijev tiosulfat pentahidrat (Na2S2O3 · 5H2O) 47,8 g

Soli žolčnih kislin (Oxbile) 4,78 g

Barvilo Brilliant green 9,6 g


Kemikalije smo raztopili v destilirani vodi, tako da je raztopina vrela 5 minut. Nato smo

umerili pH na 8,2 z 1M NaOH.



19

Raztopina joda in jodida:

Jod 20,0 g

Kalijev Jodid (KI) 25,0 g


Popolnoma smo raztopili kalijev jodid v 10 ml sterilne destilirane vode, nato smo dodali

jod in dolili sterilno destilirano vodo do 100 ml. Raztopine nismo avtoklavirali.

Raztopina novobiocina:

Novobiocin - kalcijeva sol 0,04 g


Novobiocin smo raztopili v destilirani vodi, nato pa raztopino sterilizirali s filtracijo

Sestava celotnega gojišča:

Osnovno gojišče 1000 ml

Raztopina joda in jodida 20 ml

Raztopina novobiocina 5 ml

V osnovno gojišče smo sterilno dodali 5 ml raztopine novobiocina in dobro premešali, nato

smo dodali še 20 ml raztopine joda in jodidater ponovno dobro premešali. Po 9 ml gojišča

smo nato razdelili v sterilne epruvete.

GOJENJE

V vsako epruveto smo dodali po 1 ml gojišča BPW s kulturo iz predbogatitve. Zopet smo

dobro premešali, ter epruvete 24 ur inkubirali ob stresanju 200 obratov/min pri temperaturi

37 °C (slika 3).

Slika 3: Predbogatitev vzorcev iztrebkov v gojišču BPW (epruvete na levi) in bogatitev vzorcev v

gojišču MKTT (epruvete na desni) (Foto: M. Turk)



20

3.1.2.3 Selektivna izolacija salmonel v čisti kulturi

Za selektivno izolacijo salmonel iz vzorcev smo uporabili selektivni in diferencialni trdni

gojišči agar Salmonella – Shigella ter ksiloza lizin deoksiholatni agar.

Gojišče SSA (SALMONELLA – SHIGELLA AGAR)

Goveji ekstrakt 5 g

Pepton 5 g

Laktoza 10 g

Barvilo Brilliant green 0,33 g

Nevtralno rdeče 0,08 g

Natrijev deoksiholat 8 g

Natrijev tiosulfat 8,5 g

Železov citrat 1 g

Natrijev citrat 8,5 g

Agar 15 g


Kemikalije smo raztopili v destilirani vodi, pH umerili na 7,5 z 1M NaOH in segrevali

dokler gojišče ni zavrelo. Nato smo gojišče razlili na sterilne petrijeve plošče.

Gojišče XLD (KSILOZA LIZIN DEOKSIHOLATNI AGAR)

Ksiloza 3,5 g

L – lizin 5 g

Laktoza 7,5 g

Saharoza 7,5 g

Natrijev klorid (NaCl) 5 g

Kvasni ekstrat 3 g

Fenol rdeče 0,08 g

Natrijev deoksiholat 2,5 g


Železov amonijev citrat 0,8 g

Agar 15 g


Kemikalije smo raztopili v destilirani vodi, pH umerili na 7,4 z 1M NaOH in segrevali do

vretja. Gojišče smo nato razlili v sterilne petrijeve plošče.

GOJENJE

Po 24 urah smo pregledali vzorce, ki smo jih bogatili v gojišču MKTT, ter iz vsake

epruvete s plastično ezo nacepili po 10 μl kulture na selektivni gojišči SSA in XLD. Plošče

smo inkubirali 24 ur pri 37 °C. Po končani inkubaciji smo pregledali selektivna gojišča, ter

na njih označili kolonije, ki bi po obliki in barvi lahko predstavljale salmonelo (prosojne

brezbarvne kolonije s ali brez črnega centra na agarju SSA (slika 4), rožnate kolonije

(laktoza pozitivne) s ali brez črnega centra na agarju XLD (slika 1 in 4).



21

Slika 4: Mešana kultura s kolonijami potencialnih salmonel na selektivnih in diferencialnih trdnih

gojiščih XLD (levo, rožnate kolonije s črnim centrom) in SSA (desno, prosojne kolonije s črnim

centrom). Vcepek je bil bogatitvena kultura iztrebkov v gojišču MKTT.

Za izolacijo čiste kulture smo uporabljali že prej omenjeni selektivni in diferencialni

gojišči SSA in XLD, ter osnovno gojišče hranilni agar.

Gojišče HRANILNI AGAR

Hranilna juha (nutrient broth) 8 g


Agar 15 g


Kemikalije (razen agarja) smo raztopili, gojišče avtoklavirali 15 min pri 121 ºC in ga

sterilno razlili v petrijeve plošče.

GOJENJE

Iz selektivnih gojišč SSA in XLD, na katerih smo označili kolonije, ki bi lahko potencialno

bile salmonele, smo nato le-te izolirali v čisti kulturi. Posamezno kolonijo smo precepili

naprej na selektivno gojišče, po 24-urni inkubaciji pri 37 °C pa na hranilni agar. Če kultura

ni bila čista smo postopek ponovili.

3.2 IDENTIFIKACIJA BAKTERIJ RODU Salmonella IZ PLAZILCEV

Za identifikacijo izoliranih bakterij smo uporabili izbor biokemijskih testov, s katerimi

lahko razlikujemo salmonele od ostalih sorodnih enterobakterij (ISO standard 6579:2002,

Gerhardt s sod., 1994). Fenotipsko identifikacijo pa smo potrdili še z genotipsko

identifikacijo na osnovi delnega nukleotidnega zaporedja gena za 16S rRNA. Za vse čiste

kulture domnevnih izolatov salmonel smo naredili preparat in ga barvali po Gramu, nato

smo izvedli različne biokemijske teste, tako smo dobili njihove delne fenotipske profile in

jih na osnovi teh rezultatov identificirali s pomočjo Bergeyevega priročnika determinativne

bakteriologije (Holt s sod., 1994). V začetku testiranja smo uporabili več različnih

biokemijskih testov, kasneje pa smo jih nekaj opustili. Za te izbrane seve, prepoznane kot



22

salmonele, smo nato identifikacijo potrdili še s pomočjo njihovega nukleotidnega

zaporedja gena za 16S rRNA.

3.2.1 Fenotipska identifikacija z biokemijskimi testi

CITRATNI TEST

S citratnim testom ugotavljamo sposobnost mikroorganizmov, da uporabljajo citrat kot

edini vir ogljika. Mikroorganizem, ki lahko uporablja citrat, bo uporabljal amonijevo sol

kot vir N in ob tem sproščal amonijak, zaradi česar gojišče postane alkalno, kar se odraža v

spremembi barve indikatorja. Rezultat je pozitiven, če opazimo spremembo barve iz zelene

v modro, negativen pa, kadar ni spremembe barve in rasti.


MgSO4 0,2 g

NH4H2PO4 1 g

Na3C6H5O7 · 2H2O 5 g

KH2PO4 1 g

Bromtimol modro (0,2 odstotna raztopina) 40 ml

Agar 20 g


Sestavine smo raztopili v destilirani vodi, umerili pH na 6,8, ter razdelili v srednje epruvete

v vsako po 3,5 ml. Epruvete smo avtoklavirali in pripravili poševna gojišča.

V epruvete s poševnim gojiščem smo nacepili kolonijo, ter inkubirali za 4 dni pri 37 °C.

Pri nacepljanju smo pazili, da s cepilno zanko nismo prenašali hranil iz drugih gojišč, ter s

tem vplivali na rezultate testa.

INDOLNI TEST

Z indolnim testom ugotavljamo razgradnjo triptofana do indola, ki ga lahko razgrajujejo

bakterije z encimom triptofanazo. To ugotavljamo z aldehidnim reagentom (Kovacsev

reagent), ki reagira z indolom , tako dobimo obarvan produkt. Rezultat je pozitiven, če je

indikator na vrhu gojišča rdeč (rdeč obroč) in negativen, če je rumen.

Pepton (tripton 10 g ali casiton 15 g) 20 g

NaCl 5 g


Sestavine smo natehtali in raztopili v destilirani vodi, umerili pH na 7,2 in gojišče razdelili

v majhne epruvete po 5ml in avtoklavirali.

Indikator: Kovascev reagent

para-dimetilaminobenzaldehid 3 g

izoamil alkohol 75 ml

koncentrirana HCl 25 ml



23

V tekoče gojišče smo nacepili kolonijo, nato inkubirali 24 ur pri 37 °C. Po inkubaciji smo

v vsako epruveto dodali 3 kapljice Kovacsevega reagenta, rahlo pretresli ter spremljali

pojav rdečega obroča na vrhu gojišča.

TEST LDC

Ugotavljamo prisotnost encima lizin dekarboksilaze, ki dekarboksilira aminokislino lizin,

pri čemer nastanejo bazični amini. Rezultat je pozitiven, če se gojišče obarva vijoličasto in

negativen, če ne spremeni barve. Če se spremeni tudi barva v kontrolni epruveti, je

potrebno teste ponoviti.

Pepton 5 g

Mesni ekstrat 5 g

Piridoksal 5 mg

Glukoza 0,5 g

Bromkrezol modro 1-odstotna raztopina 0,625 ml


Sestavine smo zatehtali in raztopili v destilirani vodi, umerili pH na 6,0 ter gojišče

avtoklavirali. Ločeno smo pripravili aminokislino lizin v 10-odstotni koncentraciji (10 g L-

lizin hidroklorida raztopimo v 100 ml destilirane vode) in raztopino sterilno prefiltrirali. V

osnovno gojišče smo sterilno dodali raztopino lizina (100 ml na 900 ml osnovnega gojišča,

končna koncentracija 1-odstotna), razdelili v sterilne majhne epruvete, v vsako po 2.5 ml in

prekrili s sterilnim mineralnim oljem. Pripravili smo tudi kontrolne epruvete brez dodane

aminokisline.

Nacepili smo tekoče gojišče z aminokislino in kontrolno gojišče brez aminokisline, ter

inkubirali 4 dni pri 37 °C, ob dnevnem spremljanju sprememb.

TEST OF

S tem testom ugotavljamo, ali bakterija razgrajuje ogljikove hidrate po oksidativni, ali po

fermentativni poti. Sprememba barve iz zelene v rumeno da pozitiven rezultat. Test vedno

izvajamo v dveh epruvetah, ena je pokrita z mineralnim oljem (F anaerobna), druga ne (O

aerobna)

Pepton 2 g


K2HPO4 0,3 g

Agar 3 g

Bromtimol modro 1- odstotna vodna raztopina 3 ml


Raztopili smo sestavine, ter umerili pH na 7,2. Po avtoklaviranju smo dodali sladkor

(najpogosteje glukozo, pripravili smo 10-odstotno raztopino sladkorja v destilirani vodi in

jo sterilno prefiltrirali) do končne koncentracije 1% in razdelili po 3-4 ml v male sterilne

epruvete. Polovico epruvet smo prekrili s sterilnim mineralnim oljem.



24

Kolonije smo vbodno nacepili v gojišče prekrito z mineralnim oljem, kjer smo ugotavljali

fermentativno razgradnjo škroba (F) in v gojišče brez mineralnega olja, kjer smo

ugotavljali oksidativno razgradnjo škroba (O). Inkubirali smo 24 ur pri 37 °C, nato pa

ugotavljali spremembo barve. Sprememba v epruveti O – oksidativna razgradnja sladkorja,

sprememba v obeh epruvetah – fermentativna razgradnja sladkorja, ni spremembe v

epruvetah – ni razgradnje sladkorja.

OKSIDAZNI TEST

Uporabljamo ga za ugotavljanje prisotnosti encima citokrom c oksidaze, ki lahko oksidira

dodani akceptor elektronov tetrametil-p-fenilen diamin dihidroklorid, ta se ob tem obarva.

Rezultat je pozitiven, če se kultura, ki smo jo nanesli na reagent, po 10 do 15 sekundah

obarva intenzivno modro, negativen pa kadar se kultura ne obarva.

Oksidazni reagent: 1-odstotna raztopina tetrametil-p-fenilen diamina v DMSO

Na košček sterilnega filter papirja smo kapnili malo oksidaznega reagenta in nanj s lesenim

zobotrebcem ali plastično cepilno zanko nanesli kolonijo. Spremljali smo spremembo

barve.

KATALAZNI TEST

Katalazni test uporabljamo za ugotavljanje prisotnosti encima katalaze, ki katalizira

reakcijo pretvorbe dveh molekul vodikovega peroksida do vode in kisika. Rezultat je

pozitiven, če ob nanosu kulture v vodikov peroksid opazimo mehurčke kisika, ter

negativen, če teh ni.

Reagent: 3-odstotni vodikov peroksid v destilirani vodi

Na objektno steklo smo kanili kapljico vodikovega peroksida, ter vanjo s cepilno zanko

vnesli kulturo, rahlo pomešali in opazovali reakcijo.

TEST ONPG

Z ONPG ugotavljamo prisotnost encima β-galaktozidaze, ki cepi laktozo in druge β-

galaktozide. Rezultat testa je pozitiven, če se gojišče obarva rumeno, če pa ostane

brezbarvno, je negativen.

1. Raztopina ONPG

ONPG (orto-nitrofenil--

galaktopiranozid) 0,6 g

Na – fosfatni pufer; 0,01 M, pH 7,5 100 ml



25

2. Peptonska voda, 1-odstotna

Pepton 1 g



Naredili smo raztopino ONPG in jo sterilno filtrirali. Pripravili smo še peptonsko vodo ter

jo avtoklavirali. Sterilno smo dodali 1 del raztopine ONPG v 3 dele peptonske vode.

Raztopino smo razdelili v sterilne male epruvete, v vsako po 1,5 ml.

V peptonsko vodo z ONPG smo s cepilno zanko vnesli kulturo. Nato smo inkubirali 24 ur

pri 37 °C, ter nato opazovali spremembo barve raztopine.

TEST TSI (trojni sladkor z železom)

S tem testom ugotavljamo fermentacijo glukoze, laktoze in saharoze ter produkcijo H2S.

Ob fermentaciji sladkorjev nastanejo kisline, zato se pH gojišča zniža in barva indikatorja

se spremeni iz rdeče v rumeno.

Rezultat:

Kislo dno

RUMENO

Kisla poševna ploskev

RUMENA

Glukoza +

Laktoza + in/ali

saharoza +

Kislo dno

RUMENO

Alkalna poševna ploskev

RDEČA

Glukoza +

Laktoza-

Saharoza-

Alkalno dno

RDEČE

Alkalna poševna ploskev

RDEČA

Glukoza-

Laktoza-

Saharoza-

Produkcijo H2S opazimo kot temno obarvano dno gojišča. Produkcijo plina ob fermentaciji

opazimo kot dvig gojišča z dna epruvete ali razpoke v gojišču.

Mesni ekstrat 3 g

Kvasni ekstrat 3 g

Pepton 20 g

Laktoza 10 g

Saharoza 10 g

Glukoza 1 g

Železov (III) amonijev citrat 0,3 g



Agar 12,5 g

Fenol rdeče 0,024 g



26

Komponente smo raztopili v destilirani vodi, uravnali pH na 7.3, segreli, da smo raztopili

agar in razdelili v srednje epruvete, v vsako po 4 ml, ter avtoklavirali. Po avtoklaviranju

smo epruvete naložili na poševno stojalo, da smo dobili poševna gojišča.

Na poševno gojišče smo nacepili kulturo od zgoraj navzdol, nato pa s cepilno zanko

zabodli še v dno gojišča. Po 18-24 urah inkubacije pri 37 °C smo odčitali rezultate.

VOGES-PROSKAUERJEV TEST

Uporabljamo ga za dokazovanje butandiolske fermentacije glukoze, kjer nastanejo

nevtralni produkti kot je acetoin. Rezultat je pozitiven, če se ob dodatku reagentov v

zgornjem delu gojišča razvije rožnato rdeča barva, negativen pa, če ni spremembe barve.

K2HPO4 0,5 g

Pepton 0,5 g

Glukoza 0,5 g


Sestavine smo raztopili v destilirani vodi, ter umerili pH na 7,5. Raztopino smo razdelili v

male epruvete, v vsako po 2 ml in avtoklavirali.

Indikator: 40-odstotni KOH, 5-odstotni α – naftol v 96-odstotnem etanolu

V epruvete z gojiščem smo nacepili kulturo, ter inkubirali 48 h pri 37 °C. Nato smo najprej

dodali štiri kapljice α – naftola v 96-odstotnem etanolu, nato pa še dve kapljici KOH.

Spremljali smo spremembo barve.

UREAZNI TEST (po Christensenu)

Ugotavljamo prisotnost encima ureaze, ki cepi ureo do amoniaka. Rezultat je pozitiven, če

se gojišče obarva rožnato, negativen pa, če sprememb v barvi ni.

1.

Pepton 1g


Kalijev dihidrogen fosfat (KH2PO4) 2 g

Glukoza 1 g

Fenol rdeče (2-odstotna raztopina) 6 ml

Agar 20 g


2.

Urea 20 g




27

Zatehtali smo sestavine, ki so navedene pod 1. (brez agarja), jih raztopili v destilirani vodi,

ter umerili pH na 6,9 in dodali agar. Raztopino smo avtoklavirali.

Zatehtali smo še ureo in jo raztopili v destilirani vodi, jo sterilno filtrirali in dodali v

raztopino po avtoklaviranju (končna koncentracija uree v gojišču je 2-odstotna).

Gojišče smo razdelili v epruvete, v vsako po 1 ml.

Na poševna gojišča smo nacepili kulturo, inkubirali 24 ur pri 37 °C, nato pa odčitali

rezultate.

3.2.2 Genotipska identifikacija na osnovi nukleotidnega zaporedja gena za 16S

rRNA

IZOLACIJA DNA

Reagenti: PrepMan® Ultra Samle Preparation Reagent (Thermo Fischer Scientific)

Štiriindvajseturne čiste kulture izolatov smo uporabili za izolacijo DNA. V 1,5 ml

centrifugirko po Eppendorfu smo dali 30 μl reagenta ter vanjo vnesli po eno kolonijo

kulture. Celice smo resuspendirali v reagentu na vibracijskem mešalu in jih kuhali 15

minut, jih nato ohladili, sledilo pa je 10-minutno centrifugiranje pri 16 000 g in sobni

temperaturi. Po centrifugiranju smo v nove centrifugirke odpipetirali supernatant, ki je

predstavljal našo matrično DNA. Do verižne reakcije s polimerazo smo supernatant

shranili pri -20 °C.

PCR – verižna reakcija s polimerazo

Za celokupno 50 μl reakcijo za PCR smo na ledu pripravili mešanico reagentov (velja za

eno reakcijo):

10 polimerazni pufer z MgCl2 (Thermo Fischer Scientific) 5 μl

10 mM dNTP (mešanica deoksiribonukleotidov, Applied

Biosystems)

0,5 μl

10 mM oligonukleotidni začetnik 27F 0,5 μl

10 mM oligonukleotidni začetnik 1495r 0,5 μl

H2O MilliQ 42,37 μl

polimeraza DreamTaq (5U/ μl, Thermo Fischer Scientific) 0,125 μl

Tabela 1: Univerzalni bakterijski oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje gena za 16S

rRNA.

V 0,2 ml centrifugirke za PCR smo odpipetirali po 49 μl mešanice reagentov in dodali še 1

μl supernatanta (matrična DNA).

Vzorce smo dali v aparaturo za PCR (PCR Mastercycler ep Gradient, Eppendorf) in izvedli

verižno reakcijo s polimerazo s padajočo temperaturo prileganja (touchdown PCR) po

programu; začetna denaturacija pri 94 ºC 5 minut, sledi 5 ciklov z denaturacijo pri 94 ºC po

27F (16S rRNA – bakterijski) 5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

1495r (16S rRNA – bakterijski) 5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’



28

30 sekund, prileganje pri 60 ºC za 30 sekund in podaljševanje pri 72 ºC za 60 sekund. Sledi

5 ciklov (denaturacija pri 94 ºC 30 sekund, prileganje pri 55 ºC za 30 sekund in

podaljševanje pri 72 ºC za 60 sekund) in 30 ciklov (denaturacija pri 94 ºC za 30 sekund,

prileganje pri 50 ºC za 30 sekund, podaljševanje pri 72 ºC za 60 sekund), zaključi pa se s

končnim podaljševanjem pri 72 ºC za 7 minut.

AGAROZNA GELSKA ELEKTROFOREZA

Reagenti: agaroza, Tris-acetatni-EDTA pufer (TAE), barvilo SybrSafe (Invitrogen), 5-

kratni nanašalni pufer, mešanica fragmentov DNA znanih velikosti (GeneRuler™ 100 bp

Plus DNA Ladder, Thermo Fischer Scientific)

50-kratni pufer TAE (uporabljali smo 1-kratni TAE)

Tris baza 242 g

Ocetna kislina 57,1 ml

0,5 M EDTA pH 8 100 ml


5-kratni nanašalni pufer

Bromfenol modro 0,25 g

Ksilen cianol 0,25 g

Glicerol 30 ml


Z agarozno gelsko elektroforezo smo preverili, če je bila reakcija PCR uspešna. Pripravili

smo 1-odstotni agarozni gel z 1-kratnim pufrom TAE, ki smo mu dodali barvilo SybrSafe

(10 µl na 100 ml 1-odstotne agaroze) in ga razlili v pripravljeni nosilec. Ko se je agarozni

gel strdil, smo na gel nanesli po 3 μl reakcijske mešanice, ki smo ji prej dodali 2 μl

nanašalnega pufra. Na gel smo nanesli tudi 2 μl mešanice fragmentov DNA znanih

velikosti (standard DNA). Elektroforezo smo izvajali pri 120 V. Po končani elektroforezi

smo gel osvetlili z UV transluminatorjem (G-Box Chemi, Syngene) in ga fotografirali.

Velikost pomnožene DNA smo določili primerjalno s fragmenti DNA znanih velikosti.

SEKVENCIRANJE GENA ZA 16S rRNA IN IDENTIFIKACIJA IZOLATOV

Vzorce z uspešno pomnoženim delom gena za 16S rRNA smo poslali na ugotavljanje

nukleotidnega zaporedja (sekvenciranje) v Macrogen (Južna Koreja). Med objavljenimi

nukleotidnimi zaporedji podatkovne zbirke Ribosomal Database Project-II smo s pomočjo

zbirkinih iskalnikov poiskali homologe dobljenim delnim nukleotidnim zaporedjem gena

za 16S rRNA (priloga 1) naših izolatov (http://rdp.cme.msu.edu, 21. 3. 2011). Čiste

bakterijske kulture identificiranih sevov smo shranili v Mikrobiološko zbirko Ex

Infrastrukturnega centra Mycosmo (MRIC UL) pri -80 °C v vialah sistema Microbank

(Pro-Lab Diagnostic).

http://www.fermentas.com/en/products/all/dna-electrophoresis/generuler-dna-ladders/sm032-generuler-100bp-plus


http://rdp.cme.msu.edu/



29

3.3 UGOTAVLJANJE ODPORNOSTI SALMONEL PROTI IZBRANIM

ANTIBIOTIKOM

Vse izolirane seve, za katere smo na osnovi fenotipskega profila in nukleotidnega

zaporedja gena za 16S rRNA dokazali, da so salmonele, smo testirali za občutljivost proti

izbranim antibiotikom. Uporabili smo dve metodi in sicer difuzijski antibiogram po Kirby-

Bauerju in inkorporacijski antibiogram.

3.3.1 Difuzijski antibiogram po Kirby-Bauerju

Ta metoda difuzijskega antibiograma z diski je kvalitativna metoda, kjer lahko ugotovimo

le, ali je sev občutljiv ali odporen proti testiranemu antibiotiku. Pri izvedbi smo sledili

navodilom Ameriškega društva za mikrobiologijo (Cavalieri s sod., 2005)

MUELLER – HINTONOVO GOJIŠČE

Mesni ekstrat 3 g

Encimatsko razgrajen kazein 17,5 g

Škrob 1,5 g

Agar 17 g


Kemikalije (razen agarja) smo raztopili, dodali agar, gojišče avtoklavirali 15 min pri 121

ºC in ga sterilno razlili po 25 ml v sterilne petrijeve plošče.

V epruvete s 5 ml sterilne fiziološke raztopine (0,9% NaCl) smo vnesli polno ezo kulture

celic, jih resuspendirali, nato smo z dodajanjem fiziološke raztopine uravnali motnost

bakterijske suspenzije na gostoto 0,5 po McFarlandovemu standardu. To suspenzijo celic

smo nato nacepili na gojišče Mueller-Hinton z vatenko tako, da smo ploščo trikrat

prebrisali. Na plošče s konfluentno nacepljeno kulturo smo položili komercialno

pripravljene antibiotične diske enakomerno oddaljene eden od drugega in po inkubaciji 18-

24 ur pri 37 °C izmerili premere cone inhibicije rasti (premer v milimetrih) okrog vsakega

diska, te podatke pa primerjali s kriteriji za interpretacijo premerov con inhibicije rasti.

Uporabili smo naslednje antibiotične diske (Oxoid, Thermo Fischer Scientific):

TE – tetraciklin (30 μg)

IMP – imipenem (10 μg)

S – streptomicin (10 μg)

NOR – norfloksacin (10 μg)

NA – nalidiksična kislina (30 μg)

CIP – ciprofloksacin (5 μg)

CTX – cefotaksim (30 μg)

CAZ – ceftazidim (30 μg)

CAZ/CLA – ceftazidim/klavulanska kislina (30/10 μg)

Za branje rezultatov pa smo uporabili naslednje kriterije za interpretacijo premerov con

inhibicije rasti (CLSI standards M100-S24, 2014):



30

Antibiotik Rezistenca Vmesno Občutljivost

TE ≤ 11 12-14 ≥ 15

IMP ≤ 13 14-15 ≥ 16

S ≤ 11 12-14 ≥ 15

NOR ≤ 12 13-16 ≥ 17

NA ≤ 13 14-18 ≥ 19

CIP ≤ 15 16-20 ≥ 21

CTX ≤ 22 23-25 ≥ 26

CAZ ≤ 17 18-20 ≥ 21

CAZ/CLA ≤ 22 23-25 ≥ 26

3.3.2 Inkorporacijski antibiogram

Za ugotavljanje odpornosti sevov salmonel proti antibiotiku ampicilinu smo pripravili

hranilni agar s koncentracijo antibiotika 100 mg/l. Založno koncentracijo ampicilina smo

naredili tako, da smo raztopili 100 mg antibiotika v 1 ml destilirane vode in sterilizirali s

filtracijo. Nato smo v pripravljen hranilni agar (priprava opisana zgoraj), ohlajen na 55 °C

dodali 1 ml založne raztopine ampicilina in agar razlili v sterilne petrijeve plošče. Na

ploščo z ampicilinom smo nanesli po eno kolonijo 24-urne čiste kulture posameznega seva,

gojene na hranilnem agarju (4 seve na ploščo). Za preverjanje učinkovitosti antibiotika v

gojišču smo kot kontrolo uporabili sev Escherichia coli BL-11, ki smo ga nacepili na

gojišče z ampicilinom in brez. Po inkubaciji 48 ur pri 37 °C smo na ploščah pregledali, če

so naše kulture rastle. Rast pomeni rezistenco, če ni rasti pa občutljivost bakterije za

ampicilin pri koncentraciji 100 mg/l.

3.4 GENOTIPSKA METODA ZA UGOTAVLJANJE PRISOTNOSTI BETA-

LAKTAMAZ Z RAZŠIRJENIM SPEKTROM DELOVANJA (ESBL) SKUPINE

CTX-M IN GENOV ZA PLAZMIDNO POSREDOVANO KINOLONSKO

REZISTENCO (PMQR) SKUPINE QNR

3.4.1 Pomnoževanje genov za beta-laktamaze z razširjenim spektrom delovanja

skupine CTX-M (blaCTX-M)

Za ugotavljanje prisotnosti genov blaCTX-M pri sevih salmonel, izoliranih iz plazilcev, smo

uporabili oligonukleotidne začetnike, navedene v tabeli 2.

Priprava mešanice za PCR (multipla reakcija)

za 1 vzorec:

- 12,5 μl 2 mešanice reagentov DreamTaq PCR

Master Mix (Thermo Fisher Scientific)

- 1 μl vsakega začetnika F (M1, M2, M8, M9, M25)

- 1 μl vsakega začetnika R (M1, M2, M8, M9, M25)

- 0,5 μl H2O

Program za PCR:

30X

94°C 5 minut

94°C 25 sekund

52°C 40 sekund

72°C 50 sekund

72°C 6 minut



31

Tabela 2: Oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje genov ESBL skupine CTX – M

(blaCTX-M)

Gen nukleotidno zaporedje (5' - 3')

velikost

pomnožka (bp) referenca

blaCTX - M1 CTX - M1 F (AAAAATCACTGCGCCAGTTC) 415

Woodford s sod., 2006

CTX - M1 R (AGCTTATTCATCGCCACGTT)

blaCTX - M2 CTX - M2 F (CGACGCTACCCCTGCTATT) 552

CTX - M2 R (CCAGCGTCAGATTTTTCAGG)

blaCTX - M8 CTX - M8 F (TCGCGTTAAGCGGATGATGC) 666

CTX - M8 R (AACCCACGATGTGGGTAGC)

blaCTX - M9 CTX - M9 F (CAAAGAGAGTGCAACGGATG) 205

CTX - M9 R (ATTGGAAAGCGTTCATCACC)

blaCTX - M25 CTX - M25 F (GCACGATGACATTCGGG) 327

CTX - M25 R (AACCCACGATGTGGGTAGC)

Vse reagente smo hranili na ledu ter jih pred uporabo dobro premešali z vibracijskim

mešalom. V 0,2 ml centrifugirke po Eppendorfu smo odpipetirali po 23 μl reakcijske

mešanice za PCR ter na koncu v vsako centrifugirko dodali še 2 μl matrične DNA

(pripravljene kot je opisano pod poglavjem 3.2.2). Vzorce smo dali v aparaturo za PCR

(PCR Mastercycler ep Gradient, Eppendorf) in izvedli verižno reakcijo s polimerazo po

protokolu, opisanem zgoraj.

Po končani verižni reakciji smo preverili uspešnost pomnoževanja z agarozno gelsko

elektroforezo kot je opisano zgoraj (poglavje 3.2.2) s spremembami, uporabili smo 2-

odstotni agarozni gel, nanašali po 5 μl reakcijske mešanice, kot mešanico fragmentov DNA

znanih velikosti (standard DNA) pa smo uporabili GeneRuler™ 50 bp DNA Ladder

(Thermo Fischer Scientific). Na gel smo nanesli tudi dve pozitivni kontrolni reakciji

(pomnoženi geni CTX-M8, CTX-M9 in CTX-M25). Po končani elektroforezi smo gel

osvetlili z UV transluminatorjem (G-Box Chemi, Syngene) in ga fotografirali. Pogledali

smo razvrstitev pomnožkov in velikost pomnoženih fragmentov DNA določili primerjalno

z uporabo nanešenega standarda DNA.

3.4.2 Pomnoževanje genov za plazmidno posredovano kinolonsko rezistenco

(PMQR) skupine QNR

Za ugotavljanje prisotnosti genov qnr pri sevih salmonel, izoliranih iz plazilcev, smo

uporabili oligonukleotidne začetnike, navedene v tabeli 3.

Priprava PCR mešanice (multipla reakcija)

za 1 vzorec:

- 12,5 μl 2 mešanice reagentov

DreamTaq PCR Master Mix

(Thermo Fisher Scientific)

- 1 μl vsakega začetnika F (A, B, S)

- 1 μl vsakega začetnika R (A, B, S)

- 5,5 μl H2O

Priprava mešanice za 1 vzorec (qnrC ali

qnrD):

- 12,5 μl 2 mešanice reagentov

DreamTaq PCR Master Mix

(Thermo Fisher Scientific)

- 1 μl začetnik F (C ali D)

- 1 μl začetnik R (C ali D)

- 9,5 μl H2O





32

Tabela 3: Oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje genov qnr.

gen nukleotidno zaporedje (5' - 3')

velikost


qnrA qnrA - F (AGAGGATTTCTCACGCCAGG) 580

Cattoir s sod., 2007

qnrA - R (TGCCAGGCACAGATCTTGAC)

qnrB qnrB - F (GGMATHGAAATTCGCCACTG) 264

qnrB - R (TTTGCYGYYCGCCAGTCGAA)

qnrS qnrS - F (GCAAGTTCATTGAACAGGGT) 428

qnrS - R (TCTAAACCGTCGAGTTCGGCG)

qnrC qnrC - F (GGGTTGTACATTTATTGAATCG) 308 Wang s sod., 2009

qnrC - R (CACCTACCCATTTATTTTCA)

qnrD qnrD - F (CGAGATCAATTTACGGGGAATA) 582 Cavaco s sod., 2009

qnrD - R (AACAAGCTGAAGCGCCTG)

Vse reagente smo hranili na ledu ter jih pred uporabo dobro premešali z vibracijskim

mešalom. V 0,2 ml centrifugirke po Eppendorfu smo odpipetirali po 24 μl reakcijske

mešanice za PCR ter na koncu v vsako centrifugirko dodali še 1 μl matrične DNA

(pripravljene kot je opisano pod 3.2.2). Vzorce smo dali v aparaturo za PCR (PCR

Mastercycler ep Gradient, Eppendorf) in izvedli verižno reakcijo s polimerazo.

PCR smo izvedli po naslednjem programu:

30X


elektroforezo, kot je opisano za gene blaCTX-M (poglavje 3.4.2). Na gel smo nanesli tudi

pozitivne kontrolne reakcije, kjer smo pomnoževali dele genov qnr. Po končani

elektroforezi smo gel osvetlili z UV transluminatorjem (G-Box Chemi, Syngene) in ga

fotografirali. Ugotavljali smo prisotnost pomnožkov in velikost pomnoženih fragmentov

DNA določili primerjalno z uporabo nanešenega standarda DNA.

95°C 5 minut

94°C 30 sekund

52°C 30 sekund

72°C 1 minuta

72°C 7 minut



33

3.5 UGOTAVLJANJE PRISOTNOSTI NEKATERIH VIRULENTNIH DEJAVNIKOV

PRI IZOLATIH SALMONEL IZ PLAZILCEV

Za preverjanje prisotnosti genov virulentnih dejavnikov invA, sopB, sifA in spvC pri sevih

salmonel, izoliranih iz plazilcev, smo pripravili po 25 μl celokupne reakcijske mešanice za

PCR na vzorec in uporabili oligonukleotidne začetnike, navedene v tabeli 4. Vse reagente

smo ves čas hranili na ledu, ter jih pred uporabo dobro premešali z vibracijskim mešalom.

2 mešanica reagentov DreamTaq PCR Master Mix (Thermo

Fischer Scientific)

12,5 μl

10 mM 5'- oligonukleotidni začetnik F 1 μl

10 mM 3'- oligonukleotidni začetnik R 1 μl

H2O MilliQ 9,5 μl

V 0,2 ml centrifugirke za PCR smo odpipetirali po 24

μl reakcijske mešanice ter na koncu v vsako centrifugirko dodali še 1 μl matrične DNA

(priprava opisana zgoraj, poglavje 3.2.2).

Tabela 4: Oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje genov izbranih virulentnih

dejavnikov.

Vzorce smo dali v aparaturo za PCR (PCR Mastercycler ep Gradient, Eppendorf) in izvedli

verižno reakcijo s polimerazo.

Za gena sopB in invA po programu:

30X

Za gen spvC po programu:

30X

gen nukleotidno zaporedje (5' – 3')

velikost


sopB-F CCTCAAGACTCAAGATG 220

Hur s sod., 2011

sopB-R TACGCAGGAGTAAATCGGTG

spvC-F ACTCCTTGCACAACCAAATGCGGA 571

spvC-R TGTCTCTGCATTTCGCCACCATCA

sifA-F ATGCCGATTACTATAGGCAATGG 1011

sifA-R TTATAAAAAACAACATAAACAGCCG

invA-F ACAGTGCTCGTTTACGACCTGAAT 244

invA-R AGACGACTGGTACTGATCGATAAT

94°C 5 minut

94°C 30 sekund

52°C 30 sekund

72°C 30 sekund

72°C 10 minut

95°C 5 minut

94°C 30 sekund

55°C 30 sekund

74°C 1 minuta

74°C 10 minut



34

Za gen sifA po programu:

30X


elektroforezo, kot je opisano za gene blaCTX-M (poglavje 3.4.2). Kot standard DNA smo

uporabili mešanico fragmentov DNA znanih velikosti (GeneRuler™ 100 bp Plus DNA

Ladder, Thermo Fischer Scientific). Na gel smo nanesli tudi pozitivne kontrolne reakcije,

kjer smo pomnoževali dele genov izbranih virulentnih dejavnikov (navedenih v tabeli 4).

Po končani elektroforezi smo gel osvetlili z UV transluminatorjem (G-Box Chemi,

Syngene) in ga fotografirali. Ugotavljali smo prisotnost pomnožkov in velikost

pomnoženih fragmentov DNA določili primerjalno z uporabo nanešenega standarda DNA.

95°C 5 minut

94°C 30 sekund

55°C 30 sekund

74°C 1,5 minut

74°C 10 minut





35

4 REZULTATI

4.1 PRISOTNOST VRST IZ RODU SALMONELLA PRI PLAZILCIH

Plazilci so vedno bolj priljubljene domače živali, ki pa se vse pogosteje omenjajo kot

prenašalci salmonele na človeka. Zato smo proučili, kolikšen del plazilcev, gojenih po

šolah in visokošolskih zavodih ter pri zasebnih gojiteljih v Ljubljani in okolici, je okuženih

s salmonelo. Ker se salmonele primarno nahajajo v prebavnem traktu živali, preko

iztrebkov pa se lahko prenesejo na druge živali ali človeka, smo pregledali iztrebke in brise

iz kloak 66-ih plazilcev. Največji odstotek pregledanih vzorcev so predstavljale kače, ki jih

je bilo 42 (63,6%), 17 (25,8%) je bilo kuščarjev, ter 7 (10,6%) želv (priloga 1).

Od vseh pregledanih živali jih je bilo s salmonelo okuženih kar 42,4 % (28 okuženih živali

od 66-ih). Največji delež okuženih živali smo zasledili pri kuščarjih (10 pozitivnih na

salmonelo; 58,8 %), pri kačah je bil odstotek okuženih živali nekoliko nižji (18 pozitivnih

živali; 42,9 %), pri želvah pa salmonele nismo zasledili (slika 5).

Slika 5: Razmerje med številom okuženih (pozitivni) in neokuženih (negativni) živali s salmonelo pri

posameznih skupinah testiranih plazilcev.

Primerjali smo tudi število živali, okuženih s salmonelo, med zasebnimi gojitelji in

izobraževalnimi ustanovami (slika 6). Pri zasebnih gojiteljih je bila salmonela izolirana iz

17 živali (40,5 %) in sicer pri 13-ih kačah (56,6%) in 4-h kuščarjih (44,4 %). Iz

izobraževalnih ustanov pa je bilo 11 živali pozitivnih na salmonelo (45,8%), od tega 5 kač

(55,6 %) in 6 kuščarjev (75 %).

24

7 7

18

10

0

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

kače kuščarji želve

šte

vilo

pre

gle

dan

ih ž

ival

i

pozitivni

negativni



36


posameznih skupinah testiranih plazilcev primerjalno med zasebnimi gojitelji in izobraževalnimi

ustanovami.

Če si ogledamo še razmerja okuženih/ neokuženih živali s salmonelo med posameznimi

gojitelji (slika 7) lahko opazimo, da so bile pri nekaterih izobraževalnih ustanovah vse

pregledane živali okužene s salmonelo (kuščarji pri ustanovi A in kače pri ustanovi F).


posameznih skupinah testiranih plazilcev primerjalno med posameznimi zasebnimi gojitelji in

izobraževalnimi ustanovami.

Vse domnevne izolate salmonel smo najprej identificirali z izbranimi biokemijskimi testi.

Izbor biokemijskih testov s podanimi rezultati, ki smo jih uporabili za ločevanje salmonel

od sorodnih enterobakterij, je predstavljen v tabeli 5.

20

5

04

2

7

13

4

0

56

0

0

5

10

15

20

25

30

35

kače kuščarji želve kače kuščarji želve

zasebni gojitelji izobraževalne ustanove

štev

ilo p

regl

edan

ih ž

ival

i

pozitivni

negativni



37

Tabela 5: Rezultati biokemijskih testov za salmonelo in sorodne vrste (povzeto po Holt, 1994).

biokemijski test Salmonella Proteus Citrobacter Shigela

LDC + - - -

ONPG - - + - ( + S. sonnei)

Indol - - (+ P. vulgaris) + (- C. freundii) +, -

H2S + +, - - (+ C. freundii) -

Ureaza - + +, - -

fermentacija

glukoze + + + +

fermentacija

laktoze -, + - d -

Legenda; (+) 90 % ali več sevov je pozitivnih; (-) 90 % ali več sevov je negativnih; (+,-) variabilna lastnost;

(d) 11-89% sevov je pozitivnih.

Rezultati fenotipskih lastnosti salmonel, dobljeni z izbranimi biokemijskimi testi, so

predstavljeni v tabeli 6. Fenotipski profili testiranih sevov so večinoma odgovarjali profilu

salmonele.



38

Tabela 6: Rezultati izbranih biokemijskih testov za izolate salmonel iz plazilcev.

EXB

oznaka

seva

LDC ONPG indol TSI

urea

glukoza laktoza H2S

L320 + - - + - + -

L328 + - - + - + -

L329 + - - + - + -

L330 + + - + - + -

L339 + - - + - + -

L340 + + - + - + -

L341 + - - + - + -

L342 + - - + - + -

L343 + - - + - + -

L344 + - - + - + -

L345 + - - + - + -

L346 + - - + - + -

L347 + - - + - + -

L348 + + - + - + -

L349 + - - + - + -

L350 + + - + - + -

L351 + - - + - + -

L352 + + - + - + -

L353 + + - + - + -

L354 + + - + - + -

L355 + + - + - + -

L356 + - - + - + -

L369 + - - + - + -

L370 + + - + - + -

L371 + + - + - + -

L372 + - - + - + -

L373 + + - + - + -

L374 + - - + - + +, -

L375 + - - + - + - Legenda:

LDC: (+) prisotnost encima lizin dekarboksilaze; ONPG: (+) prisotnost encima β – galaksidaze; INDOL: (+)

prisotnost encima triptofanaze

TSI (trojni sladkor z železom): (+) (fermentacija glukoze in/ali laktoze, H2S (+) produkcija vodikovega

sulfida; UREA: (+) prisotnost encima ureaze

S krepko pisavo so označeni sevi, za katere smo na osnovi nukleotidnega zaporedja gena za 16S rRNA

potrdili, da gre za vrsto Salmonella enterica subsp. arizonae. Atipični rezultati so označeni s sivo.

Pri sevih S31, S32B, S33B, S34, S35, S38, S39, S40, S41 in L335 biokemijskih testov

nismo opravljali.



39

Da bi potrdili fenotipsko identifikacijo smo vse izolate salmonel še genotipsko

identificirali s pomnožitvijo in sekvenciranjem dela gena za 16S rRNA in primerjali

njihova zaporedja s homologi iz podatkovne zbirke Ribosomal Database Project II.

Ugotovili smo, da se večina sevov uvršča v podvrsto Salmonella enterica subsp. enterica,

le v štirih primerih (sevi EXB L352, L353, L354 in L370) smo izolirali podvrsto

Salmonella enterica subsp. arizonae (priloga 1). Testirane živali so bile okužene ali z eno

ali z drugo podvrsto.

Z analizo nukleotidnega zaporedja dela gena za 16S rRNA smo pri nekaterih izolatih

ugotovili, da ne gre za salmonele in jih izločili iz nadaljnega dela. Večinoma so bili to

izolati rodov Providencia, Citrobacter, Pseudomonas in Klebsiela.

4.2 ODPORNOST IZOLIRANIH SEVOV PROTI IZBRANIM ANTIBIOTIKOM

Za vse izolirane seve salmonel iz plazilcev smo ugotavljali, ali so občutljivi ali odporni

proti desetim izbranim antibiotikom. Uporabili smo tetraciklin, streptomicin

(aminoglikozidni antibiotik), beta-laktamske antibiotike iz skupin penicilinov (ampicilin),

karbapenemov (imipenem) in cefalosporinov 3. generacije (cefotaksim in ceftazidim, tudi

v kombinaciji s inhibitorji beta-laktamaz, kot je klavulanska kislina) ter kinolone

(nalidiksična kislina) in fluorokinolone (norfloksacin in ciprofloksacin). Izvedli smo

difuzijski antibiogram po Kirby-Bauerju za vse testirane antibiotike (slika 8) razen za

ampicilin (inkorporacijski antibiogram). Premeri con inhibicije rasti in rast na ploščah z

ampicilinom so podani v tabeli 7.

Slika 8: Primer difuzijskega antibiograma po Kirby-Bauerju pri sevu salmonele z oznako EXB L373

(Foto: M. Farkaš)



40

Tabela 7: Rezultati odpornosti salmonel iz plazilcev proti izbranim antibiotikom

Antibiotiki

EXB oznaka seva

TE IMP S NOR NA CIP CTX CAZ CAZ/CLA AMPc

S31 32 37 17 37 31 40 38 34 34 -

S32B 28 31 9 36 22 38 37 31 32 -

S33B 27 33 17 36 27 38 37 32 32 -

S34 27 34 16 37 33 40 37 31 31 -

S35 29 30 8 36 28 37 36 31 34 -

S38 28 34 8 38 29 37 37 32 32 -

S39 29 37 9 40 28 41 38 31 34 -

S40 29 32 10 37 27 39 37 33 35 -

S41 30 32 10 38 28 38 34 30 32 -

L320 28 35 16 38 31 45 36 32 32 -

L328 28 31 16 36 27 37 37 31 32 -

L329 31 37 17 39 29 42 37 31 35 -

L330 31 34 10 41 32 43 42 37 39 +

L335 30 33 17 41 31 43 38 34 35 -

L339 31 32 17 38 30 39 39 32 34 -

L340 25 34 11 30 22 32 33 30 30 -

L341 8 21 18 41 31 44 46 39 40 -

L342 8 31 19 41 29 42 40 37 37 -

L343 29 37 18 37 29 41 38 32 33 -

L344 30 31 17 31 28 35 35 29 31 -

L345 27 32 16 34 24 37 36 28 30 -

L346 26 30 17 35 26 36 35 30 31 -

L347 25 30 16 35 26 26 35 31 34 -

L348 31 34 11 39 30 41 41 37 37 -

L349 27 31 17 37 26 36 36 31 31 -

L350 29 33 12* 36 30 38 39 34 35 -

L351 29 33 18 37 31 40 40 35 35 -

L352 28 33 18 38 26 39 37 34 34 -

L353 28 35 19 35 25 35 38 33 34 -

L354 29 36 20 36 28 37 37 33 33 -

L355 30 34 20 36 27 36 37 31 31 -

L356 29 37 18 36 30 37 35 30 30 -

L369 31 33 20 39 29 40 37 33 34 -

L370 28 34 18 35 26 36 36 30 32 -

L371 26 34 11 35 22 36 36 32 32 -

L372 30 34 21 41 32 43 39 34 34 -

L373 9 27 16 42 31 41 42 35 35 +

L374 28 33 17 35 27 40 34 28 30 -

L375 27 30 18 35 27 38 34 29 29 -



41

Legenda: TE – tetraciklin (30 μg), IMP – imipenem (10 μg), S – streptomicin (10 μg), NOR – norfloksacin

(10 μg), NA – nalidiksična kislina (30 μg), CIP – ciprofloksacin (5 μg), CTX – cefotaksim (30 μg), CAZ –

ceftazidim (30 μg), CAZ/CLA – ceftazidim/klavulanska kislina (30/10 μg), AMPc – ampicilin (100 mg/l)

Številke predstavljajo premer cone inhibicije rasti (v mm). Temneje obarvano okence – sev je odporen proti

testiranem antibiotiku; zvezdica (*) ob številki – sev je intermediaren. Pri inkorporacijskem antibiogramu za

ampicilin AMPc; (+) rast (odpornost proti AMPc), (-) ni rasti (občutljivost proti AMPc). S krepko pisavo so

označeni sevi, za katere smo na osnovi nukleotidnega zaporedja gena za 16S rRNA potrdili, da gre za vrsto

Salmonella enterica subsp. arizonae.

Proti antibiotikom je bilo odpornih razmeroma malo sevov, izmed 39 sevov le 13 (33,3%).

Od tega je bilo 11 sevov (28,2%) takšnih, ki so bili odporni proti enemu izmed

uporabljenih antibiotikov. Tako sta bila 2 seva (5,1%) odporna proti tetraciklinu in 9 sevov

(23,1%) proti streptomicinu. Samo dva seva (5,1%) sta pokazala hkratno odpornost proti

dvema izbranima antibiotikoma, sev L373 proti streptomicinu in ampicilinu, sev L330 pa

proti tetraciklinu in ampicilinu. V enem primeru je bil sev intermediaren proti

streptomicinu.

Vsi sevi, ki so bili odporni proti antibiotikom so bili sevi podvrste Salmonella enterica

subsp. enterica. Pri sevih podvrste Salmonella enterica subsp. arizonae (L352, L353, L354

in L370) odpornosti nismo zaznali.

4.2.1 Prisotnost genov ESBL skupine CTX-M in PMQR skupine QNR

Pri vseh sevih salmonel smo s PCR preverili prisotnost genov za beta-laktamaze z

razširjenim spektrom delovanja (ESBL) skupine CTX-M (podskupine M1, M2, M8, M9 in

M25) (slika 9).



42

Slika 9: Agarozni gel po elektroforezi z nanešenimi pomnožki PCR za ugotavljanje prisotnosti genov

beta-laktamaz (ESBL) skupine CTX-M.

Ob desnem robu je nanešena mešanica fragmentov DNA znanih velikosti (GeneRuler 50bp DNA Ladder

(Thermo Fischer Scientific).

Od 39 sevov pri nobenemu nismo zasledili pomnožka prave velikosti za gene blaCTX-M.

Prav tako smo preverili tudi prisotnost genov za plazmidno posredovano odpornost proti

kinolonom (PMQR) skupine QNR, ki so povezani z nizko odpornostjo proti

fluorokinolonom (slika 10).

Ugotovili smo, da izolirani sevi salmonel iz plazilcev nimajo genov za plazmidno

posredovano odpornost proti kinolonom skupine QNR.



43

Slika 10: Agarozni gel po elektroforezi z nanešenimi pomnožki PCR za ugotavljanje prisotnosti genov

qnr pri izbranih sevih salmonel iz plazilcev.

Ob robovih je nanešena mešanica fragmentov DNA znanih velikosti (GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder

(Thermo Fischer Scientific)). Kot pozitivna kontrola je na desni strani vsakega gela tik pred standardom

DNA nanešena pozitivna kontrola (kontroli) z označeno velikostjo.




44

4.3 PRISOTNOST IZBRANIH VIRULENTNIH DEJAVNIKOV

S PCR smo pri vseh izoliranih sevih salmonel iz plazilcev preverili tudi prisotnost izbranih

virulentnih dejavnikov (invA, sopB, spvC, sifA) (tabela 8).

Tabela 8: Prisotnost izbranih virulentnih dejavnikov pri salmonelah iz plazilcev.

EXB oznaka seva invA (244bp) sopB (220bp) spvC (571bp) sifA (1011bp)

S31 + - - +

S32B - - - -

S33 + + - -

S34 + + - -

S35 + + - -

S38 + + - -

S39 + + - -

S40 - - - -

S41 - - - -

L320 + + - -

L328 + + - +

L329 + + - +

L330 + + - -

L335 + + - -

L339 + + - +

L340 + + - -

L341 + + - -

L342 + + - +

L343 + + - +

L344 + + - +

L345 + + - +

L346 + - - -

L347 + - - -

L348 + + - -

L349 + + - +

L350 + + + -

L351 + + + +

L352 + + - -

L353 + + - -

L354 + + - -

L355 + + + -

L356 + + - +

L369 + + - -

L370 + - - -

L371 + + - -

L372 + + - -

L373 + - - -

L374 + - - -

L375 + - + +

Legenda: + pozitivno, - negativno

S krepko pisavo so označeni sevi, za katere smo na osnovi nukleotidnega zaporedja gena za 16S rRNA

potrdili, da gre za vrsto Salmonella enterica subsp. arizonae.



45

Gen za virulentni dejavnik invA smo dokazali pri 92,3% vseh salmonel iz plazilcev,

produkt tega gena sodeluje pri vdoru salmonele v celice črevesnega epitelija. Pogost je bil

tudi sopB (74,4%), ki kodira fosfoinozitid fosfatazo, pri 30,8% izolatov pa smo potrdili

tudi gen sifA (Protein SifA omogoča salmonelam razmnoževanje v gostiteljski celici.

Najmanj salmonel je imelo gen spvC (10,3%), produkt tega gena je fosfotreoninliaza, ki

defosforilira MAP kinaze in s tem prepreči odziv gostiteljske celice na napad salmonele.

Na sliki 11 je predstavljeno razmerje med številom pozitivnih in negativnih sevov

salmonel za določen virulentni dejavnik.

Slika 11: Prisotnost izbranih virulentnih dejavnikov pri salmonelah iz plazilcev.

Največ je bilo izolatov, ki so vsebovali 2 gena (46,2 %), 30,8 % izolatov je imelo 3 gene za

virulentne dejavnike, 12,8 % izolatov je vsebovalo 1 gen. Pri treh izolatih (7,7 %) nismo

potrdili nobenega od testiranih genov. En izolat (L351) je vseboval vse štiri testirane gene

za virulentne dejavnike (slika 12).

36

30

4

12

3

9

35

27

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

invA sopB spvC sifA

štev

ilo v

zorc

ev

negativni

pozitivni



46

Slika 12: Število sevov salmonel iz plazilcev ki vsebuje določeno število virulentnih dejavnikov.

Pri nadaljnji razdelitvi na kače in kuščarje (slika 13) smo ugotovili, da sevi izolirani iz kač

vsebujejo več genov za virulentne dejavnike kot tisti, izolirani iz kuščarjev. Največja

razlika je pri invA, kjer smo pri vseh sevih salmonel iz kač (100%) potrdili prisotnost tega

gena, medtem ko je bil pri salmonelah iz kuščarjev prisoten v 78,6%.

Slika 13: Prikaz prisotnosti izbranih virulentnih dejavnikov (v odstotkih) glede na vrsto plazilca iz

katerega je bila izolirana salmonela.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 1 2 3 4

število virulentnih dejavnikov

štev

ilo s

evo

v

100

60

12

32

78,6

57

7

28,6

0

20

40

60

80

100

120

invA sopB spvC sifA

Štev

ilo p

ozi

tivn

ih v

torc

ev [

%]

kače

kuščarji



47

5 RAZPRAVA IN SKLEPI

5.1 RAZPRAVA

Plazilci so vedno bolj priljubljene domače živali, ki pa se vse pogosteje omenjajo kot

prenašalci salmonele na človeka. Primarno se bakterije nahajajo v prebavnem traktu živali,

preko iztrebkov pa se okužba lahko prenese tako na druge živali, kot tudi na človeka.

V raziskavi smo zajeli plazilce zasebnih gojiteljev in izobraževalnih ustanov iz Ljubljane

in okolice, ter iz njihovih iztrebkov ali brisov iz kloak pridobili seve Salmonella enterica

subsp. enterica in Salmonella enterica subsp. arizonae. Prisotnost salmonele v iztrebkih

plazilcev smo primerjali z dosedanjimi objavami. Izolirane seve smo nato testirali na

odpornost proti izbranim antibiotikom, ter preverili prisotnost nekaterih genov, ki so

povezani z odpornostjo proti beta-laktamskim in kinolonskim antibiotikom. Preverjali smo

tudi prisotnost izbranih genov za virulentne dejavnike.

5.1.1 Prisotnost bakterij rodu Salmonella pri plazilcih

V naši raziskavi smo potrdili prisotnost salmonel pri plazilcih. Odstotek s salmonelo

okuženih živali je bil dokaj visok, saj smo salmonelo potrdili kar pri 42,4 % pregledanih

živali, hkrati pa smo ugotovili, da se pojavnost salmonel med vrstami plazilcev razlikuje

(59 % okuženih kuščarjev, 43 % okuženih kač in nobene okužene želve). Če primerjamo

odstotek s salmonelo okuženih živali drugih raziskav z našo, ugotovimo precejšnja

odstopanja. Ebani s sod. (2004) in Gay (2014) sta ugotovila skoraj za polovico nižje število

okuženih plazilcev, medtem ko je Pasmans s sod. (2005) v svoji raziskavi potrdil prisotnost

salmonele v več kot 60 %. Razlike se pojavljajo tudi pri številu okuženih živali pri

posameznih skupinah plazilcev. Corrente s sod. (2004) in Geue in Löschner (2005) so tako

kot mi potrdili nizko okuženost pri želvah, oziroma salmonel tu niso odkrili. V splošnem

(Ebani s sod., 2004; Corrente s sod., 2004; Pfleger s sod., 2003) velja, da so prenašalci

salmonel največkrat kuščarji. Haydeskov s sod. (2013) pa je v svoji raziskavi največ okužb

potrdil pri kačah, sledile so želve, najmanj okuženih je bilo kuščarjev. V primerjavi števila

okuženih plazilcev pri zasebnih gojiteljih in v izobraževalnih ustanovah bistvenih razlik

nismo ugotovili, pri zasebnih gojiteljih je bila salmonela izolirana pri 40,5%, v

izobraževalnih ustanovah pa pri 45,8% testiranih živali. Zanimiv je rezultat števila

okuženih živali pri izobraževalnih ustanovah, kjer so bile v enem primeru pozitivne vse

testirane kače, v drugem primeru pa vsi testirani kuščarji. Vzrok, da so vse živali pri istem

gojitelju okužene s salmonelo, je lahko okužena hrana živali, lahko je v enem terariju

naseljenih več živali, kjer se okužba prenaša z ene živali na drugo. Glede na to, da so ravno

nekatere izobraževalne ustanove primer, kjer so okužene vse živali, bi do okužb lahko

prišlo tudi posredno. Za živali v šolskih terarijih običajno skrbi več kot ena oseba, prav

tako pa z njimi rokujejo tudi učitelji in učenci pri pouku.

Največkrat izolirana podvrsta salmonel iz proučevanih plazilcev je bila Salmonella

enterica subsp. enterica, odkrili pa smo tudi seve Salmonella enterica subsp. arizonae.

Corrente s sod. (2004) in Pasmans s sod. (2005) sta tako kot mi največkrat izolirala

Salmonella enterica subsp. enterica, medtem ko je Haydeskov s sod. (2013) največkrat

izoliral Salmonella enterica subsp. diarizonae, ki je mi nismo določili. Med pogosto



48

izoliranimi se omenja tudi Salmonella enterica subsp. salamae, Salmonella enterica subsp.

arizonae in Salmonella enterica subsp. diarizonae (Bauwens s sod., 2006).

Do vseh teh odstopanj v številu okuženih živali med posameznimi raziskavami lahko pride

že zaradi samih postopkov izolacije, saj se na selektivnih gojiščih za salmonele (kot sta

XLD in SSA) lahko pojavijo tudi atipične salmonele, ki jih tako ne prepoznamo kot

salmonele in jih ne izoliramo. Na rezultate lahko vpliva tudi starost odvzetih vzorcev

(iztrebkov in brisov kloak, ustne votline, površine kože), zato je dobro, da vzorce takoj po

odvzemu nacepimo na primerna gojišča.

Biokemijski testi, s katerimi smo ugotavljali fenotipske lastnosti salmonel, so nam služili

kot pripomoček za lažje določanje vrst in za razlikovanje salmonel od ostalih

enterobakterij. Uporabili smo več različnih testov, dobljene rezultate pa smo primerjali z

opisi iz Bergey-evega priročnika (Holt, 1994), ter izolate na osnovi fenotipskih profilov

posameznih rodov in vrst enterobakterij poskušali identificirati. Ker imajo bakterijske

vrste, ki so si sorodstveno blizu, lahko zelo podobne fenotipske profile in ker imajo lahko

različne podvrste salmonel tudi atipične lastnosti (tabela 6), je identifikacija na osnovi

rezultatov biokemijskih testov nezanesljiva. Zato smo za potrditev uporabili genotipsko

identifikacijo na osnovi nukleotidnega zaporedja gena za 16S rRNA.

5.1.2 Odpornost salmonel proti antibiotikom in prisotnost virulentnih dejavnikov

Problem odpornosti bakterij proti antibiotikom se povečuje in predstavlja tveganje za javno

zdravje. O sami odpornosti salmonel, izoliranih iz plazilcev, pa do sedaj ni bilo veliko

podatkov (Yan s sod., 2003; Chen s sod., 2010). V literaturi se omenja odpornost salmonel

proti streptomicinu, tetraciklinu, ampicilinu in tudi proti nalidiksični kislini (Corrente s

sod., 2004; Chen s sod., 2010).

V raziskavi smo uporabili 10 različnih antibiotikov in z difuzijskim antibiogramom po

Kirby-Bauerju ter inkorporacijskim antibiogramom preverjali odpornost izoliranih sevov

proti izbranim antibiotikom.

Ugotovili smo, da je med izoliranimi sevi salmonel delež odpornih proti izbranim

antibiotikom relativno majhen. Tako je bilo odpornih 33,3 % sevov, največ proti

antibiotiku streptomicin iz skupine aminoglikozidnih antibiotikov. Med izoliranimi sevi sta

bila tudi dva takšna, ki sta bila odporna proti dvema antibiotikoma. V enem primeru je bil

sev odporen proti streptomicinu in ampicilinu, v drugem primeru pa proti tetraciklinu in

ampicilinu. Vsi sevi, ki so bili odporni proti antibiotikom so pripadali podvrsti Salmonella

enterica subsp. enterica, med podvrsto Salmonella enterica subsp. arizonae rezistenc

nismo odkrili. Salmonele iz plazilcev so tako večinoma občutljive za antibiotike, ki se

danes najpogosteje uporabljajo za zdravljenje bakterijskih okužb.

Z vidika veterine in medicine je najbolj zanimiva odpornost proti beta – laktamskim

antibiotikom in kinolonom, saj sta ti dve skupini antibiotikov največkrat uporabljeni za

zdravljenje številnih bakterijskih okužb. Proti tema dvema skupinama so bili naši sevi

salmonel večinoma občutljivi, z izjemo dveh sevov, ki sta bila odporna proti ampicilinu.

Zaradi splošne uporabe beta – laktamskih antibiotikov in kinolonov, ter pomembnosti teh

dveh skupin antibiotikov za ljudi, smo se odločili preveriti tudi prisotnost beta – laktamaz z

razširjenim spektrom delovanja (ESBL) iz skupine CTX-M, ter prisotnost genov za

plazmidno odpornost proti kinolonom skupine QNR.



49

Encimi beta-laktamaze, ki deaktivirajo beta-laktamske antibiotike, so med najbolj

razširjenimi, hkrati pa so tudi najpogostejši vzrok za odpornost enterobakterij proti beta-

laktamskim antibiotikom (Robicsek s sod., 2006; Reeves, 2012; Jacoby, 2005). Beta-

laktamaze z razširjenim spektrom delovanja (Extended-Spectrum Beta – Lactamases;

ESBL) so encimi, ki posredujejo odpornost tudi proti tretji in četrti generaciji

cefalosporinov (ceftazidim, cefotaksim) (Bush s sod, 1995; Samaha – Kfuory in Araj,

2003). Zato smo med izoliranimi sevi salmonel preverjali prisotnost njihovih genov in

sicer skupine CTX-M. Med izoliranimi sevi Salmonella enterica subsp. enterica in

Salmonella enterica subsp. arizonae prisotnosti genov blaCTX-M nismo odkrili. Prisotnosti

genov za plazmidno posredovano odpornost proti kinolonom skupine QNR tudi nismo

potrdili. Odpornost proti kinolonom je največkrat posledica pretirane uporabe in zlorabe

antibiotikov, saj zaradi mutacij prihaja do sprememb v nukleotidnih zaporedjih genov za

tarče kinolonov (topoizomeraze tipa II).

Prisotnost virulentnih dejavnikov pri izoliranih sevih smo preverjali s PCR. Zanimala nas

je prisotnost plazmidno kodiranega gena spvC, genov za dva virulentna dejavnika, ki ležita

na otoku patogenosti SP – 1 (invA in sopB), ter gena za virulentni dejavnik iz SP – 2 (sifA).

Corrente s sod. (2006) je v raziskavi salmonel iz plazilcev potrdil prisotnost gena sopE,

medtem ko gena spvC ni uspel določiti. Tudi Hur s sod. (2011) poroča o virulentnih

dejavnikih, ki se pojavljajo pri salmoneli, največkrat je potrdil gene, ki ležijo na SP – 1 in

SP – 2, ter tudi gene spv. Prisotnost teh genov povečuje patogenost salmonel in možnost

prenosa okužb na človeka. Tako smo v naši raziskavi gen za invA, njegov produkt sodeluje

pri vdoru salmonele v celice črevesnega epitelija, potrdili pri 92,3% vseh izolatov, sledil je

sopB, ki smo ga potrdili pri 74,4 % sevov (produkt tega gena je fosfoinozitid fosfataza, ki

skrbi za reorganizacijo aktinskega citoskeleta in preoblikovanje plazmaleme gostiteljske

celice), nato sifA (30,8 % sevov), najmanj pogost pa je bil gen spvC (10,3 % sevov), ki

kodira fosfotreoninliazo, ta preprečuje odziv gostiteljske celice na salmonelo z

defosforilacijo MAP kinaz. Največ izolatov je vsebovalo dva (30,8%) ali tri (46,2%)

testirane gene za virulentne dejavnike, samo trije (7,7 %) niso imeli nobenega testiranega

gena, 5 (12,8%) je vsebovalo enega, v enem samem izolatu pa smo potrdili prisotnost vseh

štirih testiranih genov za virulentne dejavnike. Zanimala nas je tudi pogostost genov za

virulentne dejavnike med posameznimi skupinami plazilcev, kjer smo ugotovili, da imajo

sevi, izolirani iz kač, več testiranih genov virulentnih dejavnikov, najbolj opazno je bilo pri

invA, kjer smo njegovo prisotnost potrdili prav pri vseh kačah. Isti gen je bil pogost tudi pri

kuščarjih, le v nižjem odstotku (78,6%). Pred začetkom študije smo sklepali, da salmonela

vsebuje gene za virulentne dejavnike, ter da je lahko potencialno patogena za ljudi. Z

rezultati, ki smo jih dobili, lahko to potrdimo, saj smo dokazali prisotnost genov, ki

omogočajo vdor in tudi preživetje salmonele v gostiteljskih celicah.

Z našo raziskavo smo torej potrdili prisotnost salmonele pri plazilcih. Ta se lahko

navzkrižno prenaša iz ene živali na drugo, ali v okolico, hkrati pa obstaja tudi možnost

prenosa na človeka, sploh če pri delu s plazilci nismo previdni. Da preprečimo razširjanje

salmonel je pomembno, da smo pri negi živali previdni, da ne okužimo sebe, drugih ljudi

ali živali iz drugih terarijev. Do prenosa okužbe s plazilca na človeka ne more priti, če se

človek zgolj dotakne plazilca, se pa možnosti za okužbo povečajo, če z delom telesa, ki je

bil v stiku s plazilcem, sežemo v usta (Gray, 2011). Plazilcem ne dovolimo prostih izhodov

po kuhinji ali kopalnici, živali damo tudi veterinarsko pregledati. Prav tako je pomembno,

da pazimo pri higieni hrane za živali in samih terarijev ter da si po vsakem stiku s plazilci,



50

njihovim terarijem ali hrano umijemo roke. Pomembno je tudi, da otroci, mlajši od pet let,

ljudje z oslabljenim imunskim sistemom, ter odrasli nad petinšestdeset let ne rokujejo s

plazilci, saj je pri njih povečano tveganje za okužbo (Radford, 2011).

5.2 SKLEPI

1. Od 66 testiranih plazilcev iz izobraževalnih ustanov in zasebnih gojiteljev (Ljubljana z

okolico) smo pri 42,4 % izolirali salmonelo, od tega pri 58 % kač in 42,9 % kuščarjev,

želve, ki smo jih testirali, pa niso bile okužene z njimi. Med zasebnimi gojitelji in

izobraževalnimi ustanovami ni bilo večjih razlik v okuženosti živali, v dveh primerih

izobraževalnih ustanov pa smo potrdili, da so bile okužene vse testirane kače ali kuščarji.

Najverjetneje so se okužbe prenesle z ene živali na drugo v terariju, preko hrane ali preko

oskrbnika.

2. Relativno manjši delež salmonel (33,3 %), izoliranih iz plazilcev, je bil odporen proti

testiranim antibiotikom. Od teh izolatov sta bila samo dva odporna proti dvema

antibiotikoma, ostali pa proti enemu samemu, streptomicinu ali tetraciklinu. Zato lahko

sklepamo, da so salmonele iz plazilcev še relativno občutljive za antibiotike, predvsem za

beta-laktame in kinolone, ki sta zaradi splošne rabe v veterini in tudi humani medicini

pomembni skupini.

3. Prisotnost genov za beta-laktamaze z razširjenim spektrom delovanja skupine CTX-M

nismo potrdili. Genov za plazmidno posredovano odpornost proti kinolonom (PMQR)

skupine QNR, ki so povezani z nizko odpornostjo proti fluorokinolonom, tudi nismo

zasledili.

4. Pri salmonelah iz plazilcev je večina izolatov vsebovala dva ali tri testirane gene za

virulentne dejavnike (invA, sopB, sifA in spvC), s čimer se povečuje možnost patogenosti

za živali in tudi ljudi. Najpogostejši je bil gen za virulentni dejavnik invA, ki ga je

vsebovalo 92,3 % vseh salmonel iz plazilcev, produkt tega gena sodeluje pri vdoru

salmonele v celice črevesnega epitelija.

5. Kljub temu, da pri izolatih iz plazilcev nismo potrdili pomembnejše odpornosti proti

antibiotikom, je pri delu z njimi potrebna previdnost, ker so sevi lahko potencialno

patogeni za ljudi, zaradi prisotnosti genov za virulentne dejavnike.



51

6 POVZETEK

Plazilci so v zadnjih letih vse bolj pogosti hišni ljubljenčki, narašča njihova priljubljenost

na razstavah in v živalskih vrtovih, prav tako pa so velikokrat naseljeni v terarijih

izobraževalnih zavodov, kjer služijo kot učni pripomoček, s katerim učenci podrobneje in

lažje spoznavajo živalske vrste in s katerimi se odpravlja tudi predsodke do manj poznanih

živalskih vrst. Kot se omenja v literaturi so plazilci potencialni prenašalci različnih

patogenih organizmov, med njimi tudi salmonel. Tako lahko žival izgleda povsem zdrava,

kljub temu pa je prenašalka salmonel, zato je pri rokovanju z njimi potrebna previdnost in

ustrezna higiena.

V naši raziskavi smo iz iztrebkov in brisov iz kloak plazilcev zasebnih gojiteljev in

izobraževalnih ustanov v Ljubljani in okolici izolirali salmonelo. Na podlagi fenotipskih in

genotipskih lastnosti (zaporedje gena za 16S rRNA) smo identifikacijo salmonel potrdili

pri 42,4% pregledanih plazilcev. Večina izolatov je pripadala podvrsti Salmonella enterica

subsp. enterica, štirje izolati pa Salmonella enterica subsp. arizonae. Največ okuženih

živali je bilo med kuščarji (58,8%), sledile so kače (42,9%), pri želvah salmonel nismo

identificirali. Bistvenih razlik med okuženostjo plazilcev pri zasebnih gojiteljih in

izobraževalnih ustanovah nismo zasledili, izstopala sta le dva izobraževalna zavoda, kjer

so bile okužene vse testirane živali. Tu je šlo najverjetneje za navzkrižne okužbe med

živalmi, ki živijo v istem terariju ali s posrednim prenosom prek oskrbnika, lahko pa je

prišlo do okužbe s hrano. Pri izoliranih sevih salmonel je bil delež odpornih proti izbranim

antibiotikom relativno majhen (33,3% odpornih sevov). Tako je bilo 28,2% sevov

odpornih proti enemu antibiotiku, največ proti streptomicinu (23,1%). Le dva seva sta bila

odporna proti dvema izbranima antibiotikoma, eden proti streptomicinu in ampicilinu,

drugi proti tetraciklinu in ampicilinu. Preverili smo tudi prisotnost genov za beta –

laktamaze z razširjenim spektrom delovanja skupine CTX-M in genov za plazmidno

posredovano odpornost iz skupine QNR. Prisotnost genov blaCTX-M nismo potrdili, prav

tako tudi ne genov qnr. Preverili smo tudi prisotnost genov za izbrane virulentne

dejavnike (invA, spoB, sifA, spvC). Največ izolatov je vsebovalo dva (30,8%) ali tri

(46,2%) testirane gene, v enem samem pa smo potrdili prisotnost vseh štirih genov za

virulentne dejavnike.

Izolati salmonel pri plazilcih torej imajo nekatere gene za virulentne dejavnike in so tako

lahko potencialno patogeni za ljudi. Relativno manjši delež teh izolatov pa je odporen proti

antibiotikom, tudi beta-laktamskim in kinolonom, ki se danes najpogosteje uporabljajo za

zdravljenje bakterijskih okužb. Kljub temu moramo s plazilci rokovati nadvse previdno.

Potrebna je ustrezna higiena rok po stiku z plazilci ali njihovo opremo, previdni moramo

biti, da okužb ne prenašamo iz ene živali na drugo in na ljudi. Ne glede na dobro stran

uporabe plazilcev v šolah velja omeniti, da se rokovanje s plazilci odsvetuje mlajšim

otrokom, osebam z oslabljenim imunskim sistemom, ali starejšim osebam.



52

7 VIRI

Abalem de sá I. V., Solari C.A. 2001. Salmonella in Brazilian and imported pet reptiles.

Brazillian Journal of Microbiology, 32: 293 - 297

Balcombe J., Ph. D. 2000. Animals in Higher Education, problems, alternatives &

recomendations. Washington DC, The Humane Society Press: 104

Balluard J. – M., Brischoux F., Bonnet X. 2011. Children Prioritize Virtual Exotic

Biodiversity over Local Biodiversity. Plos One 6, 8: e23152

Bauwens L., Vercammen F., Bertrand S., Collard M. J., De Ceuster S. 2006. Isolation of

Salmonella from enviormental samples collected in the reptile department of Antwerp Zoo

using different selective methods. Journal of Applied Microbiology, 101: 284 - 289

Bonnet R.2004. Groving group of extended - spectrum β lactamases. The CTX – M

Enzymes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 48: 1 – 14

Bush K., Jacoby G., Medeiros A.A. 1995. A functional classification scheme for beta –

lactamases and its correlation with molecular structur. Antimicrobial agents and

chemotherapy, 39 (6): 1211 – 1233

Case R. Best Pet Reptiles for Children, http://www.reptilesmagazine.com/Reptile-Care-

For-Beginners/Best-Pet-Reptiles-For-Children/ (21.7.2016)

Cavaco L. M., Hasman H., Xia S., Aarestrup F. M. 2009. qnrD, a novel gene conferring

transferable quinolone resistance in Salmonella enterica serovar kentucky and

Bovismorbificans strain of human origin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 53 (2):

603 – 608

Catoir V., Poirel L., Rotimi V., Soussy C.-J., Nordmann P. 2007.Multiplex PCR for

detection of plasmid – mediated quinolone resistance qnr genes in ESBL –producing

enterobacterial isolates. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 60: 394 - 397

Cavalieri S. J., Harbeck R.J., McCarter Y.S., Ortez J. H., Ramkin I. D., Sautter R. L.,

Sharp S. E., Spiegel C. A. 2005. Manual of Antimicrobial Susceptibility Testing. American

Society of Microbiology, 151 – 166

Coates A. RM., Halls G., Hu Y. 2011. Novel classes of antibiotics or more of the same.

British Journal of Pharmacology, 163: 184 – 194

Corrente M., Madio A., Friedrich G. K., Greco G., Desario C., Tagliabue S., D'Incau M.,

Campolo M., Buanavoglia C. 2004. Isolation of Salmonella strains from reptile faeces and

comparison of different culture media. Journal of Microbiology, 96: 709 – 715

http://www.reptilesmagazine.com/Reptile-Care-For-Beginners/Best-Pet-Reptiles-For-Children/

http://www.reptilesmagazine.com/Reptile-Care-For-Beginners/Best-Pet-Reptiles-For-Children/



53

Chen C. – Y., Chen W. – C., Chin S. – C., Ali Y. – H., Tung K. – C., Chiou C. S., Hsu Y.

– M., Chung C. – C. 2010. Prevalence and antimicrobial susceptibility of salmonelae

isolates from reptiles in Taiwan. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 22: 44 –

50

De Jong B., Andersson Y., Ekdahl K. 2005. Effect of Regulation and Education on Reptile

– associated Salmonellosis. Emerging Infectious Diseases, 11 (3): 398 – 403 str.

Ebani V.V., Cerri D., Fratini F., Mielle N., Valentini P., Andreani E. 2005. Salmonella

enterica isolates from faeces of domestic reptiles and a study of their antimicrobial in vitro

sensitivity. Research in Veterinary Science 78: 117 – 121

Ebani V. V., Fratini F. 2005. Bacterial zoonoses among domestic reptiles. Analli fac. med.

vet. LVIII: 85 – 91

Garity G., Brenner D.J., Krieg N.R. Staley J.R., Bergey's manual of systematic

bacteriology. The proteobacteria, part: The Gammaproteobacteria,

Gay N., Le Hello S., Weill F.-X., de Thoisy B., Berger F. 2014. Salmonella serotypes in

reptiles and humans, French Guiana. Veterinary Microbiology, 170: 167 - 171

Gerhardt P. (glavni urednik), Murray R. G. E. , Wood W. A. Krieg N. R. (uredniki) 1994

Methods for general and molecular bacteriology. American Society for Bacteriology,

Washington DC, 791

Gray Z.T. 2011. Update: Reptiles and Salmonella. Journal of Exotic Pet Medicine, 20, 1:

14 – 17

Helmuth R., 2000. Antibiotic resistane in Salmonella. V: Salmonella in Domestic Animals.

Wray C., Wray A.(ed.), CABI publishing: 89 – 106

Hollinger K. 2000. Epidemiology and salmonellosis. V: Salmonella in domestic animals.

Wray C., Wray A.(ed.), CABI publishing: 341 – 353

Holt J.G., Krieg N.R., Sneath P.H.A., Staley J.T., Williams S.T. 1994. Bergey's Manual of

Determinative Bacteriology, 9. izdaja, Williams and Wilkins

Hur J., Kim J.H., Park J.H., Lee Y.-J., Lee J.H. 2011. Molecular and virulence

characteristics of multi – drug resistant Salmonella Enteritidis strains isolated from poultry.

The Veterinary Journal, 189 (3): 306 – 311

Hydeskov H.B., Guardabassi L., Aalbæk B., Olsen K. E. P., Nielsen S.S., Bertelsen M.F.

2013. Salmonella Prevalence Among Reptiles in a Zoo Education Setting. Zoonoses and

Public Health, 60: 291 – 295



54

Ibarra J.A., Steele – Mortimer O. 2009. Salmonella – the ultimate insider. Salmonella

virulence factors that modulate intracellular survival. Cellular Microbiology, 11 (11): 1579

– 1586

Jacoby G.A. 2005. Mechanisms of resistance to quinolones. Clinical Infectious Diseases,

41 (2): 120 – 126 str.

Johnson J. R.1991. Virulence factors in Escherichia coli urinary tract infections. Clinical

Microbiology Reviews, 4 (1): 80 – 128

Kaplan M. 1997a. So, you think you want a reptile

http://www.anapsid.org/parent.html (21.7.2016)

Kaplan M. 1997b. The use of reptiles in public education

http://www.anapsid.org/repsineduc.html (21.7.2016)

Kastelec B., Harlander T. 2005. Enterobacteriaceae kot povzročiteljice okužb s hrano v

Sloveniji. Zdravstveno varstvo, 45: 165 – 174

Kaur J., jain S.K. 2011. Role of antigenes and virulence factors of Salmonella enterica

serovar Typhi in its pathogenesis. Microbiological Research, 167: 199 – 210

Keen E. J., Durso M. L., Meehan P. T. 2007. Isolation of Salmonella enterica and Shiga –

Toxigenic Echerichia coli o157 from Feces of Animals in Public Contact Areas of United

States Zoological Parks. Applied and enviormental Microbiology, 73, 1: 362 - 365

Krofel M., Cafuta V., Planinc G., Sopotnik M., Šalamun A., Tome S., Vamberger M.,

Žagar A., Razširjenost plazilcev v Sloveniji: pregled podatkov, zbranih do leta 2009.

Natura Sloveniae 11, 2: 61 – 99

Lačen I., Fošnarič S. 2009. Vpliv izkustva ob živih živalih v razredu na učenčevo

poznavanje živali in njihovih lastnosti. Revija za elementarno izobraževanje, 2 – 3: 163 –

174

Letno poročilo o zoonozah in povzročiteljih zoonoz, 2012. 2013. Uprava za varno hrano,

veterinarstvo in varstvo rastlin RS, 83 str.

Letno poročilo o zoonozah in povzročiteljih zoonoz, 2014. 2015. Uprava za varno hrano,

veterinarstvo in varstvo rastlin RS, 98 str.

Madigan M. T., Martinko J. M. 2006. Brock biology of microorganisms. 11th edition.

Upper Saddle River, New Jersey, Perrson Prentice Hall, 992 str.

Marcus L.S., Brumell J. H., Pfeifer C. G., Finlay B.B. 2000. Salmonella pathogenicity

Islands: big virulence in small packages. Microbes and Infection, 2 (2): 145 – 156

http://www.anapsid.org/parent.html

http://www.anapsid.org/repsineduc.html



55

McGriffin H., Brownley N., 1980. Animals in Education: USE of Animals in High School

Biology Classes and Science Fairs. Washington DC, The Institute fort he Study of Animal

Problems: 160 str.

Mermin J., Hutwagner L., Vugia D., Shallow S., Daily P., Bender J., Koehler J., Marcus

R., Angulo F.J. 2004. Reptiles, Amphibians, and Human Salmonella Infection: A

Population – Based, Case – Control Study. Clinical Infectious Diseases, 38, 3: 253 - 261

Micorbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the detection of

Salmonella spp., ISO 2002

Mitchell A. M., Shane M. S. 2001. Salmonella in Reptiles. Seminars in Avian and Exotic

Pet Medicine, 10, 1: 25 – 35

Mršić N. 1997. Plazilci (Reptilia) Slovenije. Ljubljana, Zavod republike Slovenije za

šolstvo: 167 str.

Ornik D. Navodila VURS-A v primerih, ko se na šoli gojijo živali. 2007. Ministrstvo za

izobraževanje, znanost in šport (18.7.2016)

http://www.mizs.gov.si/nc/si/medijsko_sredisce/novica/article/12058/5595/

Pačnik J. 2008. Zoonoze pri pticah, malih sesalcih in plazilcih. Revija Vita. 63: 5

(27.6.2016)

https://www.revija-vita.com/vita/63/Zoonoze_pri_pticah,_malih_sesalcih_in_plazilcih

Pasmans F., Martel A., Boyen F., Vandekerchove D., Wybo I., Immerseel F., V.,

Heyndrickx M., Collard J. M., Ducatelle R., Haesebrouck F. 2005. Characterization of

salmonella isolates from captive lizards. Vetrinary Microbiology, 110: 285 – 291

Pedersen K., Lansen – Nielsen A. – M., Nordentoft S., Hammer A.S. 2009. Serovars of

Salmonella from captive reptiles. Zoonoses and Public Health, 56: 238 – 242

Pfleger S., Benyr G., Sommer R., Hassi A. 2003. Pattern of Salmonella excretion in

amphibians and reptiles in a vivarium. International Journal of Hygiene and Enviormental

Health, 206: 53 – 59

Pravilnik o zaščiti hišnih živali. Ur. l. RS, št. 51/2009

Radford G. Davis 2011. Caring for family pets, choosing and keeping our companion

animals healthy. ABC – CLIO, LLC: 224 str.

Reeves P.T. 2012. Antibiotics: Groups and properties. V: Chemical Analysis of Antibiotic

Residues in Food. Wang J., MacNeil J. D., Kay J. F. (ed.) John Wiley & sons: 1-60

Reptile - associated salmonellosis. 2013. The Center for Food Security & Public Health, 6

http://www.cfsph.iastate.edu/Factsheets/pdfs/reptile_associated_salmonellosis.pdf,

(5.8.2016)

https://www.revija-vita.com/vita/63/Zoonoze_pri_pticah,_malih_sesalcih_in_plazilcih

http://www.cfsph.iastate.edu/Factsheets/pdfs/reptile_associated_salmonellosis.pdf



56

Robicsek a., Jacoby G.A., Hooper D. C. 2006. The Worldwide emergence of plasmid –

mediated quinolone resistance. Lancet Infect Dis, 6 (10):629 – 640

Samaha – Kfoury J., Araj G.F. 2003. Recent developments in β lactamases and extended

spectrum β lactamases. Clinical review, 327: 129 – 1213

Take Care with Pet Reptiles

http://www.cdc.gov/features/salmonellafrogturtle/ (5.8.2016)

Tindall B. J., Grimont P. A. D., Garrity G. M., Euzéby J.P. 2005. Nomenclature and

taxonomy of the genus Salmonella. International Journal of Systematic and Enviormentary

Microbiology, 55: 521 – 524

Tomažič I. 2008. The influence of direct experience of students' attitudes to, and

knowlwdge about amphibiants. Acta biologica Slovenica, 51, 1: 39 – 49

Tomažič K. 2008. Odnos mladostnikov do živali in kako ga vključiti v izobraževalni

proces. Diplomsko delo, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo, 73

Tome S. 2003. Plazilci - Reptilia. V: Živalstvo Slovenije. Sket B., Gogala M., Kuštor V. 1.

natis. Ljubljana: Tehniška založba Slovenije, str. 512-518

Yan S. S., Pendrak M. L., Abela – Ridder B., Punderson J. V., Fedorko D. P., Foley S. L.

2003. An overview of Salmonella typing Public health perspectives. Cliniccal and Applied

immunology Reviews, 4: 189 – 204

Wang M., Guo Q., Xu X., Wang X., Ye X., Wu S., Hooper D. C., Wang M. 2009. New

plasmid – mediated quinolone resistance gene, qnrC, found in a clinical isolate of proteus

mirabilis. Agents and Chemotherapy, 53 (5): 1892 – 1897

Wayne, P.A. 2014. Supplement. CLSI document M100-S24. CLSI. Performance Standards

for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fourth Informational Clinical and

Laboratory Standards Institute

Woodford N. 2010. Rapid characterization of beta – lactames by PCR. Methods in

Molecular Biology, 642: 181 – 192

Woodward D. L., Khakhiria R., Johnson W. M. 1997. Human Salmonellosis Associated

with Exotic Pets. Journal of Clinical Microbiology, 35 (11): 2786 – 2790

http://www.cdc.gov/features/salmonellafrogturtle/



57

ZAHVALA

Najprej se iskreno zahvaljujem mentorici doc. dr. Jerneji Ambrožič Avguštin, ki mi je

tekom dela v laboratoriju pomagala z nasveti.

Posebej bi se rada zahvalila somentorici doc. dr. Martini Turk. Njene spodbudne besede,

potrpežljivost in pripravljenost priskočiti na pomoč, ko se je pri pisanju diplome zataknilo,

so mi olajšale delo in dale motivacijo. Hvala tudi za uvajanje v laboratorijsko delo in

pomoč pri izvedbi raziskave.

Lepa hvala vsem zaposlenim na Katedri za biologijo mikroorganizmov in v laboratoriju

Katedre za molekularno genetiko Oddelka za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v

Ljubljani, s katerimi sem se srečevala med laboratorijskimi vajami in tudi kasneje pri

raziskavi za diplomsko delo.

Brez vzorcev, ki sem jih pridobila s pomočjo Iztoka Tomažiča, ne bi doživela vseh lepih

trenutkov v laboratoriju. Hvala!

Zahvala gre tudi mojemu fantu Klemnu, ki mi je že tekom študijski let stal ob strani, v

zadnjih tednih pred diplomo pa trpel z mano.

Nenazadnje bi se rada zahvalila tudi svojim staršem, za vso podporo, tako moralno,

predvsem pa finančno, saj so mi s tem omogočili dokončanje študija.

PRILOGE

Priloga 1: Seznam plazilcev, vključenih v analizo za prisotnost salmonele.

V prilogi 1 so zbrani podatki za vse pregledane živali. Navedena so imena živali

(slovensko in latinsko), anonimizirane oznake gojiteljev, šifra sevov salmonel (če so bile

izolirane), shranjenih v Mikrobiološki zbirki Ex Infrastrukturnega centra Mycosmo (MRIC

UL) ter navedba vrste in podvrste salmonele, ki je bila izolirana v iztrebkih ali brisu kloake

plazilca.

Žival Šifra

gojitelja

EXB

oznaka Izolacija salmonele

1. Mlečna kača (Lampropeltis

triangulum) B L339 Salmonella enterica subsp. enterica

2. Ameriški gož (Elaphe guttata) B L370 Salmonella enterica subsp. arizonae

3. Ameriški gož (Elaphe guttata) B / /

4. Tigrasti piton (Python molurus) J / /

5. Rdečerepi udav (Boa

constrictor) J / /


constrictor) J / /


constrictor) J / /

8. Tigrasti piton (Python

molurus)- albino C

L340 Salmonella enterica subsp. enterica



constrictor) C




constrictor) C L342 Salmonella enterica subsp. enterica


constrictor) C / /

12. Ameriški gož (Elaphe guttata) C / /

13. Tigrasti piton (Python molurus) C / /

14. Ameriški gož (Elaphe guttata) C / /

15. Mrežasti piton (Python

reticulatus) C / /

16. Podganarica (Elaphe obsoleta) C / /


constrictor) C / /

18. Kraljevi piton (Python regius) K / /


triangulum) D L373 Salmonella enterica subsp. enterica

20. Leopardji gekon (Eubleparis

macularis) D / /


constrictor) D / /

22. Peščeni udav (Eryx sp.) D / /

23. Ameriški gož (Elaphe guttata) D L343 Salmonella enterica subsp. enterica


24. Bradata agama (Pagona

vitticeps) D




vitticeps) D L345 Salmonella enterica subsp. enterica


vitticeps) D L346 Salmonella enterica subsp. enterica


vitticeps) D / /


vitticeps) D / /

29. Ameriški gož (Elaphe guttata) D L347 Salmonella enterica subsp. enterica


30. Ameriški gož (Elaphe guttata) D / /

31. Mavrični udav (Epicrates

cenchria cenchria) D



32. Madagaskarski udav

(Acranthopis dumerili) D / /

33. Zeleni legvan (Iguana Iguana) D / /



36. Grebenasti gekon

(Rhacodactylus ciliatus) D



37. Tigrasti piton (Python

molurus)-albino D L350 Salmonella enterica subsp. enterica

38. Ognjeni skink (Riopa fernandi) D / /


triangulum) E / /

40. Kraljevi piton (Python regius) E L351 Salmonella enterica subsp. enterica


triangulum) E L352 Salmonella enterica subsp. arizonae

42. Rdečevratka (Trachemys

scripta elegans) O / /

43. Ameriški gož (Elaphe guttata) F L353 Salmonella enterica subsp. arizonae

L354 Salmonella enterica subsp. arizonae

44. Ameriški gož (Elaphe guttata) F L355 Salmonella enterica subsp. enterica

45. Ameriški gož (Elaphe guttata) L / /

46. Močvirska sklednica (Emys

orbicularis) L / /


constrictor) L / /


scripta elegans) L / /


scripta elegans) F / /


scripta elegans) M / /


scripta elegans) N / /

52. Zeleni legvan (Iguana Iguana) I / /

53. Ameriški gož (Elaphe guttata) H L369 Salmonella enterica subsp. enterica



vitticeps) G / /

55. Ameriški gož (Elaphe guttata) G / /


triangulum) G L356 Salmonella enterica subsp. enterica

57. Ameriški gož (Elaphe guttata) A S31 Salmonella enterica subsp. enterica

58. Ameriški gož (Elaphe guttata) A / /


scripta elegans) A / /

60. Jemenski kameleon

(Chamaeleo Calyptratus) A S32B Salmonella enterica subsp. enterica

61. Blavor (Ophisaurus apodus) A S33B Salmonella enterica subsp. enterica


vitticeps) A S34 Salmonella enterica subsp. enterica

63. Orjaški madagaskarski

kameleon (Furcufer oustaleti) A S35 Salmonella enterica subsp. enterica


(Chamaeleo Calyptratus) A

S38 Salmonella enterica subsp. enterica



(Chamaeleo Calyptratus) A




constrictor) D L335 Salmonella enterica subsp. enterica

Priloga 2: Delna nukleotidna zaporedja gena za 16S rRNA izolatov salmonel iz plazilcev (v formatu

Fasta).

>EXB S31

TTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCC

TGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCA

AGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGG

ATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTC

TGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGG

GAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATG

CCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAA

GGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCG

GCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGG

AATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATC

CCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAG

AGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAA

TACCGGTGGCGAAGGCGG

>EXB S32B

TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGTTTCGCTGACGAGTGGCGGA

CGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAA

ACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGG

CCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGG

CTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGG

AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA

CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG

GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCACAGCA

ATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG

TAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA

GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT

TCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGC

GGTGAAATG

>EXB S33B

TGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGG

ACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGA

AACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGG

GCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACG

GCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTG

GAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGC

ACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCG

GGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGC

AATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG

GTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGC

AGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCA

TTCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAG

CGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCG

>EXB S34

GTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAAT

GTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTGGCTAATA

CCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAG

ATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGAC

GATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGT

CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGC

CTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTT

TCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGACGTTACCCG

CAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGT

GCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAA

GTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAG

GCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTA

GAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGC

>EXB S35

GTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAAT

GTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTGGCTAATA

CCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAG

ATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGAC

GATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGT

CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGC

CTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTT

TCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGACGTTACCCG

CAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGT

GCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAA

GTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAG

GCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTG

>EXB S38

GCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGAC

GGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAA

CGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGC

CTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGC

TCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGA

ACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCAC

AATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGG

TTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAA

TTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGT

AATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA



GGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGG

>EXB S39

GCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGA







GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCA





GGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCG

>EXB S40

TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGTTTCGCTGACGAGTGGCGGA












GGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGC

>EXB S41

TCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGTTTCGCTGACGAGTGGCGGACGGGT

GAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGT

GGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTT

GCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACC

AAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGA

GACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGG

GCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTA

AAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCACAGCAATTGAC

GTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATAC

GGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGG

TCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAA

ACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGA

AATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCC

>EXB L320

TGCAGTCGACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGGAC



CTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGC

TCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGA








GGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCC

>EXB L328

GGTATCAGGAAGCACCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAA

TGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTGGCTAAT

ACCGCATAACGTCGCAAGACCAGAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCA

TATGTGCCCATGTGGGATTAGCTTGGTGGTGAGGTAACGGCTCTAAAGGCGAC

GATCCCTACCTGGTCAGAGAGGATGACCAGCCACACTGCAACTGAAACACCGT

CCAGACTCCTACGGGTGGCACCCGTGGGGAATGTCGCCCATTGGGCGCAACCC

TGATGCCCCCATGCCGTGTGTATGAATATTCCCTTCTGGTTGTAAACTACTTTC

GTCGGGGAGGAACGTGTTGTGGTTAATAACCGTCTCAATTGACGTTACCCTATC

TAAACCCGCCGATTAACTCCGGACCACAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAA

GCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCG

GATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTT

GAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG

ATCTGGAGGAATACCGGTGG

>EXB L329

GCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGGAC



CTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCT

CACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGA


AATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAATAAGGCCTTCGGG


TTGACGTTACCCGCAGAAAAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGT





>EXB L330

TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGA



CCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGG










L335

TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGGA












GGTG

>EXB L339

TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTYGCTGACGAGTGGCGGA











TCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAG

>EXB L340

TGCAGTCGACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGAC











TCAAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAG

>EXB L341











GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACT

>EXB L342













GGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGG

>EXB L343




CCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTNGTTGGTGAGGTAACGG




GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGNGGTTAATAACCGCAGCA

ATTGACGTTACCCGCAGAANAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG




GGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGG

>EXB L344




CCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTWGTTGGTGAGGTAACGG




GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGNGGTTAATAACCGCAGCA




T

>EXB L345

TGCAGTCGACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGAC










GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCACGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT

TCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTATAGGGGGG

>EXB L346

GCAGCTTGCTGCTTTGCTGACAGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAA

ACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCATAAC

GTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCA

GATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACTTCG

CTAGTCAGAGATGCCAACCAACCTTACTGGAACAGAAAAACATTGCTTACGCC

TAAAGGAGGTTTTGGTTTCAGATTTATATACTTGAAAACTATATCGGAACAAG

AAATGCCTTTGTTGATTCTATTTTGAAAAAATGCAAAAGGATTTCTTTGGAGTA

AAAAAACTATTCCAATTTCACTACTCATTCAAATTGAATTTTTATAAAAGCAAA

GAAAGGGGCATCTCGTCCCCTCATGCGAAGGACTTGAATTCCGACTCCCGGAT

GGATG

>EXB L347








GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCACCA

ATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCGCCCGCGG

TAATACTGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACACC

GGCGGCCTGTCAACTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTC

>EXB L348

GCAGTCGAACGGTAACAGAAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGAC













>EXB L349









ATTGACGTTACCCCCATAACAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCTCTTCCCGCGGT

AATTCGGAGGGAGCGAGCGGTAATTGGAATTACTGGCCGGGAAGTGGGCGCA

AGCCGGCTGTCCGTTCGGAAGTG

>EXB L350

TGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGNAGTGGCG

GACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGG

AAACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCG

GGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAAC

GGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACT

GGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTG

CACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTC

GGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCNCAG

CAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGC

GGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCAC

GCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTG

CATTCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCA

>EXB L351














>EXB L352

TGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGG


AACGGTAGCTAATACCGCATAATGTCGCAGGACCAAAGAGGGGGACCTTCGG





GGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGATAAGGTTAATAACCTTGTT

CATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG


AGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGGCTCAACCTGGGAACTGC

>EXB L353



CGGTAGCTAATACCGCATAATGTCGCAGGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCC

TCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTC

ACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAA

CTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACA

ATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGT

TGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGGTTAAGGCTAATAACCTTGTTCAT

TGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTA

ATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAG

GCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATT

CGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGA

>EXB L354



CGGTAGCTAATACCGCATAATGTCGCAGGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCC

TCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTC

ACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAA

CTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACA

ATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGT

TGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGGTTAAGGTTAATAACCTTGTTCAT

TGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTA

ATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAG


CGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCG

GTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCC

>EXB L355

TGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGG


AACGGTAGCTAATACCGCATAATGTCGCAGGACCAAAGAGGGGGACCTTCGG





GGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGGTTAAGGCTAATAACCTTGTT

CATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG




CGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCC

>EXB L356













GGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTG

GACAAAGACTGACGCTCAG

>EXB L369

TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCTGCTGACGAGTGGCGG












CGGTG

>EXB L370



ACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAGGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGG





GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGGTTAAGGTTAATAACCTTGTTC





GGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTG

GACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGA

>EXB L371













GGTG

>EXB L372













GGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGG

>EXB L373

GCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGAC









AATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCAGAATTTCTGGGCGTAAAGCGCACGCAG


CGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCG

GTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGA

>EXB L374













CGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGG

>EXB L375













CG

UNIVERZA V LJUBLJANI

PEDAGOŠKA FAKULTETA

BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

DIPLOMSKO DELO

METKA FARKAŠ

Documents

Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica ...pefprints.pef.uni-lj.si/3852/1/Diplomsko_delo_Metka_Farkaš.pdf · Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella