GRAM POZITIVNE KOKE

OBLICI BAKTERIJSKIH

ĆELIJA

Bojenje po Gramu

Gram pozitivne bakterije

Gram negativne bakterije

Staphylococcus• Familiae I

Micrococcaceae• Genus I

Micrococcus• Genus II

Staphylococcus• Species 23

aureus•

intermedius•

epidermidis•

saprophyticus

Morfologija i antigenska građa

• Svi članovi porodice su Gram-pozitivni i katalaza pozitivni.

• Bakterije su loptaste, prečnika 0,5 do 1,5 µm, nepokretne i ne stvaraju spore.

• Staphylococci, Micrococci i Peptococci se grupišu u vidu grozdova, tetrada i sarcina

Determinacija gram-pozitivnih koka

• svrstavanjem stanica nakon bojenja po

Gramu• na osnovu tipa hemolize na krvnom agaru• na osnovu reakcije na katalazu• na osnovu reakcije na koagulazu• na osnovi izgleda kolonija (morfologija)

Staphylococcus

Kolonije stafilokoka Kolonije streptokokaVelicina 2-3 mm do 2 mmIzgled: izbocene, mutne, cesto obojene poluprozirne prozirne, Rast: grozdaste u parovima, nakupine u lancima Katalaza: pozitivan test negativanKoagulaza: pozitivan test negativanHemoliza: manje zone hemolize vece zone(Staphylococcus) (Streptococcus)

Staphylococcus/Streptococcus

Patogenost

• Staphylococcus aureus je najpatogenija vrsta u rodu Staphylococcus.

• Uzrokuje oboljenja sluznica, kože, posebno apscesa, furunkula i pustula.

• Uzročnik je septikemije, meningitisa, pneumonije, osteomijelitisa, toksičnog šok sindroma (TSS), menstrualnog šok sindroma i enterokolitisa.

Faktori patogenosti • produkuju veliki broj supstanci koje su u stanju

da oštete i razore tkiva:– enterotoksini, – koagulaze, – leukocidini, – hijaluronidaze, stafilokinaze, hemolizini ili – hemolitički toksini (alfa, beta, gama, delta), – lipaze, – nukleaze, – proteaze, – epidermolitički toksini, – pirogeni toksini – toksični šok sindrom toksin –1 (TSST-1).

ToksiniEpidermolitički toksin-exfoliatin izaziva

odjeljivanje epidermalnih ćelija od stratum granulosum kože i uzrokuje formiranje vezikula i bula.

Pirogeni toksini izazivaju povećanje tjelesne temperature i imaju važnu ulogu u pojavi stafilokoknog toksičnog šoka.

Hemolizini ili hemolitički toksini imaju hemolitičku, dermatotoksičnu i leukocidinsku aktivnost u zavisnosti od vrste kojoj pripadaju (alfa, beta, gama i delta).

Enterotoksini stafilokoka

- Enterotoksini su termostabilni toksini, rezistentnina kratkotrajno zagrijavanje. - A do F. - Enterotoksin B izaziva postantibiotski proliv- Enterotoksini A, C, D i F izazivaju trovanja hranom- Enterotoksin E izaziva sindrom stafilokoknogtoksičnog šoka.

Toksični šok sindrom toksin- 1Toksin- 1 djeluje kao toksin i kao superantigen,

aktivirajući nespecifično T limfocite i makrofage. Aktivirane ćelije oslobađaju veliku količinu

interleukina i citokina,Oni imaju snažno biološko djelovanje i dovode

do brojnih sistemskih poremećaja: povišene temperature, intravaskularne koagulacije, respiratorne slabosti, osipa, hemoragija, šoka i smrti.

Enzimi

Koagulaza uzrokuje koagulaciju plazme i stvaranje zaštitnog fibrinskog zida oko stafilokoknih lezija, koji ih štiti od fagocitoze.

Leukocidini su rastvorljive supstance koje inaktivišu i usmrćuju leukocite.

Hijaluronidaza razara vezivno tkivo i pojačava invanzivnost stafilokoka.

• Stafilokinaze (fibrinolizini) rastvaraju fibrin i na taj način povećavaju invazivnost i virulenciju stafilokoka.

Lipaza hidrolizuje lipide na površini kože i time omogućuje stafilokoku da adherira na kožu, da je kolonizira i inficira.

.

Kulturelne osobineKulturelne osobine

Identifikacija

• Katalaza test. U kontaktu H2O2 i kulture

Staphylococca dolazi do burne reakcije zbog dejstva enzima katalaze i oslobađanja nascentnog kiseonika.

• Koagulaza test. Ovim testom dokazuje se prisustvo enzima koagulaze koja ubrzava zgrušavanje krvne plazme.

Katalaza

Enzim koji razgraduje H2O2 na vodu i kisik• Sintetizira ga najveci broj aerobnih i fakultativno anaerobnih bakterija• Po kemijskom sastavu-hemoprotein; postrukturi nalikuje hemoglobinu• Test: na prtedmetnom staklu; u epruveti; uPetrijevoj posudi

Katalaza test

Koagulaza

Aktivnost slicna protrombinu (tvori vidljiveugruške) – fibrinogen pretvara u fibrin• “in vivo” na mjestu stafilokokne infekcijestvara barijeru od fibrina• Dolazi kao: “slobodna”- (test u epruveti) i“vezana” koagulaza (faktor zgrušavanja) -(test na predmetnom staklu)

Koagulaza test

Biohemijska identifikacija

• Dokazivanje termostabilne DNA-ze se izvodi tako da se zasije ispitivani soj bakterija na podlogu sa ugrađenom deoksiribonukleinskom kiselinom. Kod

• pozitivnih sojeva, oko zasijanih kolonija stafilokoka, podloga ostaje prozračna zbog razgradnje DNA.

Osjetljivost

• Među nesporogenim bakterijama stafilokoki su najotporniji na nepovoljne uvjete okoline, ali su osjetljivi na sve dezinficijense koji su danas u bolničkoj uporabi.

• Staphylococcus aureus je bakterija koja lako i brzo razvija otpornost na antibiotike.

MRSA- MRSA (meticilin-rezistentni Staphylococcus aureus) - vrsta zlatnog stafilokoka, koja je postala otporna u prvom redu na penicilinske antibiotike (meticilin je također penicilinski antibiotik), a zatim i na mnoge druge antibiotike. - Staphylococcus aureus živi na koži i u nosu oko 30% ljudi (kliconoše) kao posve bezazlena bakterija. To stanje nazivamo kolonizacija. - MRSA nije štetan za zdrave ljude. Međutim prilikom oštećenja kože može doći do lokalne infekcije, a ako se radi o osobi koja dolazi na hirurški zahvat ili ima neku težu osnovnu bolest, Staphylococcus aureus može kod takve osobe uzrokovati teže infekcije (infekcije rane, krvi, kostiju, pluća). - MRSA je bakterija koja se uglavnom nalazi u bolnicama i jedna je od najčešćih bolničkih bakterija. Međutim nje ima i u vanbolničkoj sredini.

MRSA

Infekcije koje uzrokuje MRSA nisu drugačije niti teže od onih koje uzrokuje osjetljivi stafilokok. Problem je u tome, što se zbog otpornosti na mnoge antibiotike, infekcije koje uzrokuje MRSA liječe antibioticima koji su često toksični i imaju više nuspojava nego oni kojima se liječe infekcije uzrokovane osjetljivim stafilokokom.

MRSA

- Kolonizacija je stanje kada pacijent ima na svome tijelu MRSA ali nema kliničke znake ili simptome bolesti. Osoba kolonizirana sa MRSA može biti privremeni ili stalni kliconoša. Kolonizacija se najčešće javlja u nosnicama, pazuhu, preponi, hroničnim ranama, te oko traheostome ili/i gastrostome.- Infekcija se dešava kada MRSA uđe u tkivo i tu se umnožava, što dovodi do pojave simptoma bolesti. To se obično manifestira vrućicom, povećanim brojem bijelih krvnih stanica, te pojavom kožnih promjena, gnoja u rani ili tjelesnim šupljinama.

Lab. dg. MRSA

MRSA se može otkriti samo mikrobiološkim pregledom. Za pregled na kliconoštvo, zdravim osobama se uzima bris nosa, grla, prepone ili perianalne regije. Od bolesnika, u zavisnosti od znakova i simptoma bolesti se uzimaju: bris nosa, grla, kožne promjene, krv itd. Za mikrobilooške preglede potrebno je 2-3 dana.

DETEKCIJA MRSA

-Referentna metoda, «zlatni standard» u određivanju meticilinske rezistencije je prisutnost

mecA gena. -u većini rutinskih mikrobioloških laboratorija se

najčešće koriste fenotipske metode, disk-difuzija, i oksacilinska ploča, a postoje i komercijalni i

automatizirani sistemi za detekciju meticilinske rezistencije.

MRSA• Kromogeni agar za detekciju

MRSA je komercijalni agar koji koristi specifični kromogeni medij da bi detektirao kolonije MRSA bojeći ih u rozocrvenkastu boju nakon 24h inkubacije.

• Sigurnost ove metode za otkrivanje MRSA iznosi skoro 100%.

E TEST• Primjenom E-testa (AB Biodisk, Solna, Švedska) oksacilina i

cefoksitina dobivaju se vrijednosti minimalnih inhibitornih koncentracija (MIK)

• Upotreba ploče sa 6 mg/L oksacilina i 4% NaCl također je metoda kojom se može utvrditi meticilinska rezistencija.

Inkubacija

24 sata

STANDARDNE DIJAGNOSTIČKE METODE

Zasijavanje uzoraka

KULTURE ZA OBOGAĆIVANJ

E*

tekuće obogaćene podloge u koje se zasijavaju brisevi uzeti s različitih mjesta (najviše 3)

ČVRSTE PODLOGE

krvni agar primarna selektivna ploča za MRSA – manitol slani agar kromogeni agar za MRSA – MRSA select, MRSA ID, CHROM agar MRSA,

Inkubacija24 sata

Promjenaboje

poz. (+) neg. (-)

u uzorcima nema MRSA

gram + koki katalaza poz. (+)

poz. (+) neg. (-)

test koagulaze u epruveti ili lateks aglutinacijski test (spa)

KNS(koagulaza negativni stafilokoki)

Staphylococcusaureus

Antibiogram:DISK DIFUZIJA

cefoksitin R

poz. (+) neg. (-)

ili**

test koagulaze na stakalcu

IDENTIFIKACIJA

MRSA

STREPTOCOCCUS

Streptococcus

Klasifikacija• Familiae II Streptococcaceae• Genus I Streptococcus• Familiae III Peptococcaceae• Genus II Peptostreptococcus

KLASIFIKACIJA

• Schottmuler&Brown (α,β, y hemoliza)

• Sherman (piogene, mliječne, entero i viridans streptokoke)

• Lancefield (1933 god.)

Klasifikacija prema Klasifikacija prema hemolizihemolizi

• Najjednostavnija klasifikacija je na osnovu tipa hemolitičke reakcije koje se vide nakon porasta kolonija streptokoka na podlozi sa ovčijim eritrocitima. Hemoliza može biti:

• α (zelena), • β (bistra hemoliza)• γ (nema hemolize).

Lancefieldova klasifikacija

• Zasniva na antigenim osobinama različitih tipova streptokoka.

• Na osnovu reakcije precipitacije sa C ugljikohidratnim antigenom, koji se nalazi u bakterijskom zidu.

• Streptokoke su svrstane u grupe (20 grupa) označene slovima A - H i od K - T.

• Grupe A, B, C, G sadrže većinu streptokoka značajnih za humanu patologiju.

Streptococcus

• Streptococcus pyogenes (streptokok grupe A)

• Streptococcus agalactiae (streptokok grupe B)

• Streptococcus faecalis (streptokok grupe D)

MORFOLOŠKE KARAKTERISTIKE

• G+ koke, 1 μm veličine, grupisane u lance• nepokretne, asporogene• Fakultativno anaerobne• rastu na 37°C, • pH 7,2 - 7,4• katalaza negativne

Morfologija

Svi članovi familiae Streptococcaceae su Gram-pozitivne, katalaza-negativne, ovalne ili okrugle bakterije prečnika 0,5 do 1,0 µm. Nepokretne su i ne stvaraju spore.

Streptokoki su karakteristično raspoređeni u lance, međutim u nekih vrsta mogu se naći pojedinačne bakterije ili raspoređene u parove.

Mikroskopske karakteristike

Kulturelne osobine

- obogaćene podloge - dekstrozni bujon (fenomen geotaksije)- krvni agar (β hemoliza)- kolonije 1 mm, sitne, prozračne, glatke, sjajne, okrugle, (kapi rose) , β hemoliza

Beta-hemoliza

EGZOPRODUKTI ( enzimi i toksini):

• ERITROGENI (Dickov) TOKSIN A, B, C• STREPTOLIZINI O i S (hemolizini O i S)• NEFROTOKSIN KARDIOHEPATOTOKSIN• ENZIMI• faktori invazivnosti (hijaluronidaza, proteinaza,

streptokinaza) antifagocitna funkcija (neuraminidaza, NAA-diaminaza) amilaza, lipaza, DNA-za, esteraze,• β glukuronidaza

Faktori patogenosti i virulencije

Streptokinaza (fibrinolizin) – prevodi serumski plazminogen u plazmin koji je u stanju da razgradi fibrin, i povećava invanzivnost streptokoka jer razara fibrinsku barijeru između mjesta zahvaćenog infekcijom i zdravog tkiva.

Dezoksiribonukleaza (streptodornaza) – smanjuje viskozitet gnojnog eksudata i tako olakšava širenje infekcije.

Hijaluronidaza – denaturiše hijaluronsku kiselinu, osnovni sastojak vezivnog tkiva i na taj način olakšava prodiranje i širenje kroz tkiva.

Faktori patogenosti i virulencije

M proteinski antigen je tipski specifičan, ima antifagocitno dejstvo i nosilac je virulencije.

Eritrogeni toksin je egzotoksin rezistentan na zagrijavanje od 60ºC u toku nekoliko časova. Produkuju ga lizogeni sojevi grupe A. Postoji pet antigenski različitih tipova. Odličan je antigen i odgovoran je za pojavu eritema koji se javlja zbog toksičnog dejstva na endotel krvnih sudova.

Patogenost

• Streptococcus pyogenes (Lancefeldova grupa A) sposobna je da izazove mnogobrojna oboljenja sa različitom lokalizacijom, koja se mogu podijeliti u tri osnovne grupe:

Invazivno-zapaljenska oboljenja

• akutna upala grla (tonzilitis, faringitis) i peritonzilarni apsces,

• infekcije uha (otitis media i mastoiditis),• puerperalna sepsa,• infekcija kože i potkožnog tkiva (celulitis,

erizipel, impetigo),• sepsa i endocarditis.

Toksemično oboljenje (šarlah)

• Uzrokovano je lizogeničnim sojevima, koji luče eritrogeni toksin (oko 2% Streptococcus pyogenes). Eritrogeni toksin ima osnovnu ulogu u patogenezi oboljenja.

Poststreptokokne sekvele

• Poststreptokokne sekvele (reumatska groznica i glomerulonefritis) su komplikacije prethodna dva oblika streptokokih infekcija.

• Bolest se javlja u osoba koje imaju predispoziciju da se senzibilišu na Streptococcus grupe A i njegove egzoprodukte.

• Oštećenja tkiva i organa nastaju u toku imunopatoloških procesa vezanih za imune komplekse i lokalne citotoksične reakcije.

BAKTERIOLOŠKA DIJAGNOZA:

• morfološke osobine

• kulturelne osobine

• fiziološko-biohemijske osobine

• antigenska građa

• dokazivanje poststreptokoknih sekvela

FIZIOLOŠKO-BIOHEMIJSKE OSOBINE

• katalaza test (katalaza -)• komercijalni API testovi za ispitivanje fermentativnih

svojstava• ispitivanje osetljivosti na BACITRACIN• BRZE METODE IDENTIFIKACIJE• određivanje grupno specifičnog C antigena

(imunoaglutinacija)• detekcija enzima - Pyr test (pyrolidonylaminopeptidaza)• IF testovi

Bacitracinski test

DIJAGNOZA POSTSTREPTOKOKNIHSEKVELA

• ASO TEST (antistreptolizin O test, titar ≥ 200 jed.)• Anti DNA-za test• Anti hijaluronidaza test• Anti streptokinaza test

Streptococcus pneumoniaeStreptococcus pneumoniae  

• Streptococcus pneumoniae je nepravilno okruglog oblika, koji podsjeća na izgled plamena svijeće ili lancetu.

• Streptococcus pneumoniae su oko 0,5 µm u prečniku, Gram su pozitivni, nepokretni i inkapsulirani.

• Grupišu se u parove okrenuti širim dijelovima jedan prema drugom ili u kraće lančiće

Streptococcus pneumoniaeStreptococcus pneumoniae  

Kulturelne osobine

Streptococcus pneumoniae za svoj rast treba povećanu koncentraciju CO2 od 5 do 10%.

Kultivira se na temperaturi od 35ºC. Veoma je osjetljiv na promjenu kiselosti sredine

tako da je potrebno u određenim intervalima u toku kultiviranja kontrolirati bujonsku kulturu, da bi se dobio obilan rast.

Identifikacija

• Direktni mikroskopski pregled • Bojenjem po Gramu nalaze se tipične Gram-pozitivne

bakterije, oblika plamena svijeće, raspoređene u parove, okružene širokom kapsulom.

• Serološkom tipizacijom. Prati se bubrenje kapsule (Neufeldov test). Do bubrenja kapsule dolazi u homolognom serumu, zbog mikroprecipitacije. Na osnovu različitih antigena kapsule podjeljeni su u 83 serološka tipa.

• Na krvnom agaru kolonije Streptococcus pneumoniae formira karakteristične kolonije sa α hemolizom.

• Osjetljiv je na optohin.