Izolovanje i prečišćavanje enzima

• Zašto izolujemo enzime?• Strategija prečišćavanja

- maksimalna prečišćenost- maksimalni prinos- maksimalno sačuvana aktivnost

Izvor enzima- obilnost- dostupnost (ekonomska, geografska, etička)- komparativne studije (izoenzimi)- lokalizacija

Ekstrakt (homogenizacija, ili prečišćavanje organela + homogenizacija)Sirovi preparat (large-scale separacija)Čist enzim (small-scale separacija, ili afinitetna hromatografija

direktno iz ekstrakta)

Faze u izolovanju

• Zahtevi za čistoćom se definišu prema konačnoj upotrebi preparata1. vrlo visoka (99 % i više) terapeutska primena, in vivo studije

2. umereno visoka (95-99 %) x-ray kristalografija, karakterizacija fiziko-hemijskim metodama

3. umerena izolovanje antigena za proizvodnju antitela, N-terminalno sekvenciranje

- Identifikujte ključne nečistoće

- Proverite stabilnost enzima (pH, jonska sila) i u skladu sa tim osmislite strategiju izolovanja i prečišćavanja

- Ukoliko niste zadovoljni čistoćom preparata, uključite nove korake

- Kontaminante koji mogu da inaktiviraju enzim, ili ga denaturišu, potrebno je ukloniti (ili inaktivirati npr. proteaze) što ranije iz smeše (najbolje već u prvom koraku).

Osobine proteina koje se koriste tokom prečišćavanja

• Naelektrisanje Jonoizmenjivačka hromatografija (IEX)

• Veličina Gel filtracija (GF)

• Hidrofobnost Hidrofobna hromatografija (HIC), RPC

• Bioprepoznavanje Afinitetna hromatografija

Enzimi dobijeni rekombinantnom tehnologijom

• Neke proteine je izuzetno teško izolovati iz prirodnih izvora

• Gen (cDNA) manipulacijom DNK se ubacuje u odgovarajući vektor

• Vektor se ubacuje u odgovarajući sistem za ekspresiju (proizvodnju): bakterijski, biljni, insektni, sisarski.

• Manipulacijom na nivou cDNA, rekombinantni protein može da dobije ekstra aminokiseline, ili čitave proteine (GST), u vidu fuzionog produkta, koji ne utiču na aktivnost, ili 3D, ali mogu da olakšaju postupak izolovanja (His tag).

• Koliko je protein dobijen rekombinantnom tehnologijom sličan (identičan) prirodnom proteinu?

• Karakterizacija...

• Primena...

Primer postupka prečišćavanja rekombinantnog enzima

Deacetoksicefalosporin C sintetaza (rDAOCS) je enzim osetljiv na kiseonik. Protein je “overexpressed” u rastvornoj formi u citoplazmi E. coli. U prvom koraku, ćelije su lizirane mehaničkom silom. Pufer za lizu je sadržavao inhibitore proteaza, pored ostalih komponenti (DTT).

Odredjivanje molekulske mase GF i SDS PAGE

Odredjivanje strukture rDAOCS

Afinitetetna hromatografija

• Enzim – analog supstrata, inhibitor, kofaktor• Antitelo – antigen, virus, ćelija• Lektin – polisaharid, glikoprotein, receptor na površini

ćelija, ćelija• Nukleinska kiselina – komplementarni lanac, histoni, NK

polimeraze, NK vezujući proteini• Hormoni, vitamini – receptor, transportni protein (nosač)• Glutation – Glutation-S-transferaza ili GST fuzioni

proteini• Joni metala – Poli(His) fuzionisani proteini, proteini bogati

His, Cys, Trp ostacima na površini

Protein Vrsta koloneGST fuzionisani proteini GSTrap FF

Albumin i enzimi koji vezuju nukleotide HiTrap Blue HP

Protein i peptidi sa izloženim His, Cys ili Trp ostacima (kao i (His)6 fuzionisani proteini

HiTrap Chelating HP

DNK vezujući proteini i koagulacioni faktori

HiTrap Heparin HP

Tripsinu slične proteaze (Faktor Xa, trombin i tripsin)

HiTrap Benzamidine FF

Prečišćavanje enzima: onovni problemi i postavke -         Neophodan je odgovarajući test enzimske aktivnosti-         Odgovarajući test za odredjivanje koncentracije proteina-         Definicije: specifična aktivnost, prinos, stepen prečišćenja, broj izmena-         Dnevnik postupka izolovanja i prečišćavanja (zapremina, conc., akt.)-         Izbegavati one korake koji daju slab prinos i mali porast u čistoćiNeke osnovne definicije:- Jedinica aktivnosti (1 U): Ona količina enzima neophodna za katalizu reakcije transformacije 1 mikromola supstrata po minuti pri

standardnim uslovima*.- 1 Katal – 1 mol supstrata u 1 sPrimer: Ako 0,1 mg/mL enzima katalizuje konverziju 10 mikromola substrata po minutu, tada u 1 mL ima 10 jedinica aktivnosti. Specifična aktivnost ovog rastvora će biti 100 U/mg

proteina.

*Standardni uslovi: oni koji odgovaraju datom enzimu (pufer, prisustvo kofaktora etc). Odnosno, kad god je moguće:-         Temperatura 30 oC -         pH optimum za dati sistem Enz-Sub

Koncentracija substrata na 10x poluzasićenja substratom (10 Km)

Brzina: promena koncentracije reaktanata u vremenu.Reakciona brzina koja se odredjuje u kinetičkim eksperimentima odgovara početnoj brzini reakcije (vi, vo). Sprečava se efekat povratne reakcije, inhibicija proizvodom se svodi na minimum.

- Poluzasićenje -         Brzina enzimske reakcije postiže zasićenje kada je koncentracija substrata toliko visoka da su sva

aktivna mesta zauzeta (maksimalna brzina – Vmax).-         Poluzasićenje enzima substratom je ona konc. substrata kada se postiže 50 % Vmax (Km – merilo

afiniteta enzima za odgovarajući substrat)Poznavanje vrednosti Km za dati sistem je moguće ukoliko se poznaje Vmax ili nakon serije eksperimenata

za odredjivanje brzine za različite konc. substrata i »fitovanja« tih podataka u jednačinu koja opisuje oblik ove krive prema nepoznatim vrendostima (Km i Vmax).  

Koju jednačinu koristiti...       Nekoliko hemijskih kinetičkih modela daje slične jednačine oblika: Y = aX/(b+X)

Analitika proteina Elektroforetske tehnike -         Nativna elektroforeza-         Elektroforeza u prisustvu uree-         SDS PAGE-         Gradijentni gelovi-         Izoelektrofokusiranje-         Dvodimenzionalne elektroforeze-         Kapilarna elektroforeza

 Detekcija nakon elektroforetskog razdvajanja -         Proteini (CBB, Ag)-         Glikoproteini (Šifovo bojenje)-         Antigeni (uz odgovarajuće antitelo, najčešće nakon transfera na membranu – imunoblot)-         Enzimi: kao i nakon hromatografskih razdvajanja, uglavnom podrazumeva nativne uslove tj. tehnike separacije koje

zadržavaju korektnu tercijernu strukturu proteina/enzima  

SDS PAGE proteina ekstrakta ploda kivija (levo neredukujući uslovi, desno redukujući)

Detekcija enzimske aktivnosti nakon elektroforetskog razdvajanja

 

-         Sa solubilnim supstratom – podrazumeva prethodnu eluciju proteina iz gela (zametna i neprecizna tehnika)

-         Sa precipitirajućim supstratom koji daje proizvod koji se može detektovati (u gelu ili na membrani) – enzim nativan ili renaturisan

Tehnika zimograma (za proteolitičke enzime)

Aktininidin razvojen 2D PAGE i detektovan tehnikom zimogramaAktinidin detektovan bojenjem CBB-om, nakon 2D PAGE

u različitim uzorcima ekstrakta ploda kivija.