Izotopska analiza

organskih spojin:

osnove, praksa in izzivi

Nives Ogrinc, Doris

Potočnik, Lidija Strojnik

Pomladna šola 4.4.-7.4.2017

Potvorbe - terminologija

Potvorbeživil

Nadomestki

Redčenje

Goljufije

Nedovoljenaobogatitev

Napačnooznačevanje

Prikrivanje

Črni market/ kraja/diversio

n

o Dodatek vode

(sadni sokovi,

mleko)

o Oljčno olje

razredčeno z

toksičnim oljem iz

čajev

Kopije določenih

živil – niso

pridelani z

priporočljivo

varnostjo

o Melamin dodan

mleku, za povečanje

proteinske vsebnosti

o Uporaba

nedovoljenih

dodatkov

Sončnično olje

nadomestimo z

mineralnimi olji

Hidrolizirani proteini

iz usnja v mleku

Prodaja izdelkov, ki

niso zavedeni

o Prisotnost

hormonov

(piščančje meso)

Dodatek barvil

svežemu sadju za

prekrivanje napak

o Geografsko poreklo

o Nepravilno označeno

reciklirano olje

Izdelki najbolj izpostavljeni potvorbam

Oljčno oljeRibe in morskisadeži

Mleko in mlečniizdelki

Med, javorjev sirupin ostala sladila

Sadni sokovi Kava in čaji

Arome in začimbeOrganska pridelavaživil

Dodatki za motnost

Izvor

Moore in sod., J. Food Sci., 2012

“Tradicionalne”

Preverjanje pristnosti

Ali je živilo naravnega izvora, ali mu je bilo kaj dodano?

Naravno ali sintetično

Ali je vanilin sintetiziran iz fižola ali iz lignina?

“Novi pristopi”

Pravilna deklaracija na živilu

konvencionalno ali “organsko”živilo

Določitev geografskegaporekla živila

sir in šunka iz Parme

Vrste analiz

Elementni in izotopski “fingerprinting”

KlasifikacijaVzorec

Elementna in

izotopska

analiza

Kemometrija

Ustreza bazi

podatkov

Država X

Področje Y

Vrsta Z

…..

Država X

Področje Y

Vrsta Z

…..

Elemental and

isotope

fingerprinting

PCA, CA, SIMCA,

LDA, PLS-DA ….

Izotopska karakterizacija vina

H2O

morje

CO2

ozračje

oblaki

tladež

transpiracija

fotosinteza

fermentacija

listi

glukoza + voda

etanol + voda

Slovenska baza podatkov

Baza podatkov izotopske sestave slovenskih vin:

od leta 1996 in ustanovitev konzorcija 2004 (KIS, KI, IJS)

EU baza podatkov od leta 2005

25 vzorcev slovenskih vin iz treh vinorodnih področij

vsako leto 5-10 inšpekcijskih vzorcev

ugotavljanje geografskega porekla

določila o dovoljenem mešanju vin pridelanih iz različnih sort

vinske trte

prepoved dosladkanja drozge ali mošta brez predpisanega

dovoljenja oziroma popolna prepoved v primeru drozge ali

mošta namenjenega za pridelavo vrhunskega vina

ugotavljanje letnika pridelave

e

Pet principov izotopskih parametrov z informacijo, ki jo

podajajo

Informacijao sorti

Informacija o fermentaciji

Informacija o vodnem

okolju in klimi

o (D/H)II – Specifično razmerje na metilenskem

mestu v etanolu vinskega destilata

o (D/H)I – Razmerje na metilnem mestu

v etanolu vinskega destilata

o C-13 vinskega destilata

o (D/H)w, d2H – Povprečno D/H

razmerje v vodi

o Povprečna vsebnost 18O v vinu

Site-specific Natural Isotopic Fractionation -

Nuclear Magnetic Resonance

Complementarna analitska metoda – SNIF-NMR

2H na metilnem mestu:

Pesni sladkor 92 ppm

Trsni sladkor 110 ppm

Wine 98 – 105 ppm

Definicija mejnih vrednosti in skladnosti

o Selekcija referenčnih vrednosti

o Povprečna vrednost, mediana, STD

o Izračuna se 95% interval zaupanja za pristnost (t-student test)

Bivariantni testi,

multivariantne analize)

Potvorbe/analitska metoda

Nedeklariran dodatek drugega sadja Sestava (+ DNA določenega sadja)

Nedeklariran dodatek sladkorja SNIF-NMR + GC sladkorjev in

oligosaharidov

Nedeklariran dodatek vode d18O z IRMS in etanol kot interno

referenco

Nedeklariran dodatek vitamina C d13C – IRMS askorbinske kisline

Nedeklariran dodatek citronske

kisline

d13C in d2H citronske kisline kisline

Nedeklariran dodatek jabolčne

kisline

d13C – IRMS jabolčne kisline

Geografsko poreklo Multi-elementna sestava in stabilni

izotopi

Nedeklariran dodatek arom GC-MS in GC-C-IRMS

Kakšna je situacija na slovenskem tržišču?

Vrednost izotopske

sestave

Območje

vrednosti

(‰)

Opomba

d13C - sladkorju -27 do -24

d18O - vodi Ustrezna baza podatkov

d13C – citronski kislini -28 do -24 Razlika med kislino in

sladkorjem:

-2 do 0 ‰

d13C – pulpi -28 do -24 Razlika med sladkorjem in

pulpo: -2 do +0.5 ‰

AIJN mejne vrednosti

Parametri: TA, FRU, GLU, d13C, d2H, d18O,

10% vzorcev

-28 -26 -24 -22 -20 -18

-2

0

2

4 r = 0,95

d1

3C

ho

n -

d1

3C

pro

t [‰

V-P

DB

]

d13

C honey [‰ V-PDB]

Metoda internega standarda – med

-27.5

-23.5

-21.5

-17.5

d13C

Interni

standard

Pristni

Potvorjen

Kropf et al., Food Chem 2010; Kropf et al., JAFC, 2010

Velja za potvorbe ≥ 7 %

From bulk to specific compound!

Bulk

Isotope

Analysis

Compound

Specific

Isotope

Analysis

GC-C-IRMS

Zakaj “compound-specific” namesto “bulk”?

Prednosti

❍ Povezava na molekularno

strukturo-določitev izotopske

sestave - izvor ali proces

❍ Količina vzorca; potrebujemo le

nekaj nanogramov posamezne

spojine

❍ Kompleksne materiale ali

mešanice; živi organizmi so

sestavljeni iz različnih spojin, ki so

odvisni od strukture in izvora

❍ Informacije o izotopski sestavi

posameznih spojin sestavlja

informacijo o celotni strukturi –

posamezne aminokisline v

proteinih

Slabosti

❍ Posamezne analize so zamudne

❍ Izguba vzorca med samo pripravo

❍ Tehnično bolj zahtevne meritve;

izkušen kader na področju organske

kemije, dražje in potrebno več

materiala

❍ Analitska natančnost je v primerjavi

z “bulk” analizami manjša – večja

napaka meritev

Metrološke težave

❍ Ni ustreznih referenčnih materialov

❍ Referenčni materiali ne ustrezajo matriki vzorca

❍ Pojavljanje izotopske frakcionacije med samo

pripravo vzorca, derivatizacijo, nepravilno uvajanje

vzorca in nepopolnim sežigom

❍ Popravki glede na uporabo topil

❍ Linearnost

❍ Možnost transformacijskih procesov

in vpliv na frakcionacijo

Priprava vzorca

Namen: izolacija kompleksnih ekstraktov, ki vsebujejo

stotine spojin in jih ločiti po skupinah spojin za GC analizo

Primer analitskega protokola

Vzorec

Ekstrakcijalipidov in

kromatografija

Kisla

frakcija

Neutralnafrakcija

Polarnafrakcija

Biopolimernaanaliza

Prvi korak 1 – priprava vzorca

Vzorec mora biti posušen in zdrobljen

Liofiliziran – odstranitev vode, pospeši

učinkovitost topil in penetracijo topil v

matriko

Lahko ga zdrobimo tudi s tekočim dušikom,

večja površina in homogenost

Vpliv anorganskih spojin, na primer S – se

odstrani z aktivnim Cu

Kontaminacija

Steklo

zelo čisto (v peči pri visoki T, uporaba topil)

Plastika

Mi sami!

Kontaminacija – dominantni piki višji od raziskovalnih spojin

Prekrivanja – “co-elution” z raziskanimi spojinami

Drugi korak – ekstrakcija

Ekstrakcija lipidov iz vzorca (kaj želimo analizirati,

stabilnost, matrica in velikost)

Soxhlet (tla, sedimenti)

Ultrazvok (manjše vzorce)

Ekstrakcija tekoče/tekoče (tekoče vzorce)

Mikrovalovni

Tretji korak – separacija lipidnih

ekstraktov

Kromatografija – principi:

Stacionarna faza (silica, aluminijev oksid) in mobilna

faza (topilo)

Različne molekule imajo različno afiniteto za obe fazi

pri potovanju skozi kolono z različno hitrostjo

Odvisnost od velikosti in/ali funkcionalnih skupin

Specifična stacionarna faza lahko povzroči ionsko

afiniteto določene funkcionalne skupine

Kromatografija

Tretji korak – separacija lipidnih

ekstraktov

Kromatografija – principi:

Stacionarna faza (silica, aluminijev oksid) in mobilna

faza (topilo)

Različne molekule imajo različno afiniteto za obe fazi

pri potovanju skozi kolono z različno hitrostjo

Odvisnost od velikosti in/ali funkcionalnih skupin

Specifična stacionarna faza lahko povzroči ionsko

afiniteto določene funkcionalne skupine

Ekstrakcija na trdnem nosilcu

Primer analitskega protokola

Vzorec

Ekstrakcijalipidov in

kromatografija

Kisla

frakcija

Neutralnafrakcija

Polarna frakcija

Biopolimernaanaliza

n-alkanonskekisline

Ogljikovodiki, voski, estri,

n-alkoholi, steroli

PLFAs

derivatizacija

Vzorec

Ekstrakcijalipidov in

kromatografija

Kisla

frakcija

Neutralnafrakcija

Polarnafrakcija

Biopolimernaanaliza

n-alkanonskekisline

Ogljikovodiki, voski, estri,

n-alkoholi, steroli

PLFAs

GC-IRMS

n-Alkani

ni funkcionalnih skupin

ni potrebne derivatizacije

Derivatizacija

Hlapne spojine – funkcionalne skupine na GC se

lahko kemijsko modificirajo

Derivatizirat – blokiranje funkcionalnih skupin z

apolarnimi skupinami

Primeri funkcionalnih skupin: -COOH, -OH, -NH

Primeri derivatiziranih reakcij:

esterifikacija

sililiranje

acetiliranje

Na kaj moramo biti pozorni

Izotopski efekt

Dodat čimmanj C

Hitra reakcija

Dobra separacijaposameznih spojin

Nobene interference z vmesnimi produkti

Stabilni končniprodukt

Negotovost glede na dodan C

Med

Potvorjen

-27.4‰-27.0‰

-26.4‰

-24.3‰

-26.7‰

D13Cmax = 3.1‰

Predlagani kriterijiParameter

(‰)

Suggested value

Dd13C fru-glu ± 1.0 ‰

Dd13C fru-ds

Dd13C fru-ts

Dd13C fru-p

Dd13C glu-ds

Dd13C glu-ts Max difference

Dd13C glu-p ± 2.1 ‰

Dd13C ds-ts

Dd13C ds-p

Dd13C ts-p

Dd13C p-h -1.0 ‰

Prednosti:

Znižanje detekcije dodatka sladkorja

1 % C4- sladkorji

10 % C3- sladkorji

Prva metoda za detekcijo pesnega sladkorja

d13C

Natural aroma > synthetic aroma

Synthetic vanillin (petrochemical)

20 kg = 180 EUR

Natural vanillin (extract is 2% of bean)

20 kg = 18 000 EURGreule et al., Eur. Food Res Technol., 2010, 231, 933

CAM plant

natural

synthetic

Lamprecht & Blochberger, Food Chem., 2009

Oljčno olje

Tip olja Enkrat-nenasičene

MK

Večkrat-nenasičene

MK

Nasičene MK

Orehovo olje 83 % 3 % 14 %

Oljčno olje 77 % 9 % 14 %

Konopljino olje 62 % 32 % 6 %

Arašidovo olje 49 % 33 % 18 %

Koruzno olje 25 % 62 % 13 %

Sojino olje 24 % 61 % 15 %

Sončnično olje 20 % 69 % 11 %

Olje iz žafranike 13 % 77 % 10 %

Ključni parametri za karakterizacijo in kakovost oljčnega olja: (1)

kislost; (2) senzorična ocena; (3) maščobnokislinska (MK) sestava

Compound-specific δ13C maščobnih kislin

Transesterifikacija trigliceridovNaOH v metanolu 2 M, 1 min

Piki: Heneikozan (1), metil-palmitat (2), metil-stearat (3), metil-oleat (4), metil-linoleat (5)

GC-c-IRMS analize13C/12C razmerje

Internal standard

-34.1‰

-34.3‰

-30.8‰

-31.2‰

GC/MS chromatogram

palmitic

oleic

palmitoleic

stearic linoleic

d13C (‰)16:0

d13C

(‰)

18:1

Vegetables

Rape

Olive

Olive-cake

Pumpkin

Sunflower

Canola -38

-36

-34

-32

-30

-28

-26

-24

-22

-38 -36 -34 -32 -30 -28 -26 -24 -22 -20

Hazelnut

Groundnut

Walnut

Pumpkin

Avocado

Maize

Sesame

Soy

1 SD

Spangenberg & Ogrinc, 2001

-32 -31 -30 -29 -28 -27 -26 -25 -24

-32

-31

-30

-29

-28

-27

-26

-25

-24

Slovene Istra

Croatia

Brda

Monte Negro

Italy

Spain

Greece

y=0.8*x-4.2

d13C

18:1 (‰

)

d13

C16:0

(‰)

70 % deviškega OO

10 % rafiniranega OT

20 % sončničnega olja

80 % deviškega OO

20 % palmovega olja

Mleko in

mlečni izdelki

Metode za določanje potvorjenosti

⇒ izotopska sestava O v mleku (IRMS)

⇒vsebnost in izotopske sestava maščobnih kislin v

mleku (GC-FID, GC-C-IRMS)

⇒PCR v realnem času

⇒ identifikacija proteinskih profilov (MALDI Q-

TOF)

⇒ iso-električno fokusiranje

⇒komercialno dostopna ELISA

Makroregije v Sloveniji

Izotopska sestava kisika v mleku

Jan Feb Mar Maj Jun Jul Avg Sep Okt Nov Dec Jan Feb Mar Apr May

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

Jan Feb Mar Maj Jun Jul Avg Sep Okt Nov Dec Jan Feb Mar Apr May

-12

-11

-10

-9

-8

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

d1

8O

[‰

]

mleko

podzemna voda

⇒δ18O v mleku in podzemni vodi - potvorjenost

⇒δ18O v mleku – geografsko poreklo

Določimo lahko med 7 do 34 % dodatka vode

Analiza stanja v praksi in na slovenskem

tržišču

Mleko na tržišču

Ustreznost deklaracije sirov

- siri višje cenovni

- siri nižje cenovni

Potrebe mlekarske industrije (elementi v sledovih, maslo)

Mleko na tržišču

Rezultat: vzorci mleka na tržišču junija 2012 podobno izotopsko sestavo kot

vzorci mleka v trenutni bazi podatkov

Analiza stanja v praksi in na slovenskem

tržišču

Ustreznost deklaracije sirov - siri višje cenovni (ovčji in kozji siri – 28 vzorcev) – PCR v realnem času

(BF UNI-LJ)- siri nižje cenovni (dodatek palmove masti) – MK

Rezultat:o največje nepravilnosti prisotne pri označbah ovčjih oziroma kozjih

sirih. V naši raziskavi je bilo kar 20 % vzorcev sira višjega cenovnega razreda, ki niso ustrezali deklaraciji.

o v sirih nižjega cenovnega razreda nismo zasledili dodatka drugih maščob

Maščobne kisline in izotopska sestava

REZULTATI:

Lahko ločimo geografsko poreklo na osnovi maščobnokislinske sestave mleka

Izotopska sestava posameznih maščobnih kislin za

Mediteransko in Panonsko regijo

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

-20 -10 0 10 20 30

Funct

2 (

2.1

%)

Funct 1 (97.6%)

Discriminant Plot A

D

M

P

Na podlagi uporabe LDA (linear discriminant analysis) smo

določili geografsko poreklo mleka.

Visoka ločljivost: 98,7 %

Najbolj pomembni parametri pri

ločitvi so: C20:4w-6, C20:3w-6,

C17:0, C18:3w-3 (sveža trava, laneno

seme)

Potrebujemo vsaj 6 vzorcev

iz vsake regije 2x letno

Italy (16)

Vzorci deviškega oljčnega

olja

Spain (11)Portugal (8)

Australia (9) Uruguay (2)

Turkey (2)Tunisia (1)

Argentina (1)

Paolini et al., TALANTA, under review

PCA in Box ploti po posameznih državah - “ bulk” analize

d13C

d2Hd18O

Multivariatna analiza δ13C maščobnih kislin

European

extra-virgin olive oils

non-European extra-virgin olive oil

Geografsko poreklo – sestava in izotopi MK

10 naključno zbranih vzorcev na slovenskem tržišču v letu 2007

- pristna oljčna olja

Italy (17)

Vzorci moke

Denmark (18)

3 tri različne vrste pridelave

Animal

manure

Green manure

(legume based)

Conventional

Kako lahko ločimo

d15N

bu

lk

Paolini et al., JAFC 25, 5841-5850, 2015

Compound-specific δ15N in δ13C analize

aminokislin

Hidroliza proteinov

HCl 6M, 110°C, 24h

Derivatizacija aminokislin

GC-c-IRMS analize

Peaks: Ala (1), Val (2), Ile (3), Leu (4), Gly (5), Nleu (6), Pro (7), Thr (8), Asx (9), Glx (10), Phe

(10)

15N/14N and 13C/12C Isotopic Fingerprints

Internal

standard

Glutaminska kislina

Prva aminokislina – proizvedena iz

kopenskih rastlin

CS conventional

OSA živalski gnoj

OSB zeleni gnoj (stročnice)

d13C

Glu

(‰)

d15NGlu (‰)

ORGANSKO

KONVENCIONALNA

Multivariatna analiza δ15N and δ13C aminokislin

CS

OSB

OSA

CS conventional

OSA animal manure

OSB green manure (legume

based)

Organsko vs. konvencionalna pridelava paradižnika

CONVENTIONAL

ORGANIC

Bontempo et al., RCMS 25, 899-909, 2011

Nacionalni in mednarodni projekti v teku

Program pametne specializacije: Živila prihodnosti,

koordinator Žito d.o.o.,

pristnost surovin - Frutarom Etol

MASSTWIN – Spreading excellence and widening

participation in support of mass spectrometry and

related techniques in Health, the Environment, and Food Analysis - Fondazione Edmund Mach di San Michele all'Adige

REALMed – Pursuing authenticity and valorization of

Mediterranean traditional products - tartufi

The Use of Stable Isotopes and Elemental Composition

for Determination of Authenticity and Geographical

Origin of Milk and Dairy Products

ARIMNet

IAEA

Stabilni izotopi pomembno

orodje za določanje pristnosti in

sledljivosti živil

Hvala za vašo pozornost!