1

Jornadas Científicas 99Grupos de Investigación Enológica

Zaragoza, 17-19 de mayo de 1999

Aspectos bioquímicosy microbiológicos

del vino

2

as toxinas killer disminuyen el gradienteelectroquímico de la membrana plas-mática de las levaduras sensibles, inte-

Utilización de compuestos nitrogenadosen mostos garnacha inoculados con cepas killerde S. cerevisiae

D. Torrea Goñi y C. Ancín Azpilicueta

Lrrumpiendo el transporte acoplado de proto-nes y aminoácidos.1 El objetivo de este traba-jo es estudiar la utilización de aminoácidos enmostos garnacha, inoculados con dos cepaskiller (K2) de S. cerevisiae (D47 y K1M). Laimplantación de dichas cepas se verificó porPCR, siguiendo el método de Lavallée et al.(1994).2 Los resultados se comparan con unmosto fermentado con sus levaduras autóc-tonas (muestra control). El análisis de losaminoácidos libres se realizó por HPLC, si-guiendo el método Pico-Tag.3

En el primer 25 % de azúcares fermenta-dos, los aminoácidos se consumen en granproporción en las tres muestras (tabla 1). Del25 % al 50 % de azúcares fermentados, los

Departamento de Química Aplicada, Universidad Pública de Navarra, Pamplona

aminoácidos se siguen consumiendo, aunquealgunos se excretan en las muestras sembra-das con las levaduras killer (tabla 1). Del 50al 75 % de azúcares fermentados (tabla 2),hay una tendencia a la excreción de amino-ácidos, sobre todo en la muestra D47. En lamuestra K1M, se consumen la mayoría deestos compuestos; esta cepa, en un mediosintético, presentó una demanda de nitrógenomuy superior a la de la cepa D47 (datos nopublicados), lo que podría explicar la diferen-cia entre ambas muestras. En la última fasefermentativa (75-100 % de azúcares fermen-tados) (tabla 2) se produce excreción deaminoácidos al medio como consecuencia dela acción tóxica del etanol.4 Dicha excreciónfue muy superior en las muestras sembradascon las levaduras D47 y K1M; en estasmuestras, al efecto tóxico del etanol sobre la

Tabla 1 Concentración de aminoácidos (Aa) en el mosto y su utilización en la primera mitadde fermentación por distintas cepas

Mosto inicial 0-25 % de azúcares consumidos 25-50 % de azúcares consumidos

Aa (mg/L) Control D47 K1M Control D47 K1M

His 33 ± 2 26 ± 2 26 ± 2 24 ± 2 — -3 ± 1 4,8 ± 0,4

Arg 384 ± 6 376 ± 6 349 ± 6 381 ± 6 5 ± 3 25 ± 1 —

Thr 15 ± 3 13 ± 3 13 ± 3 14 ± 3 1,3 ± 0,1 1,0 ± 0,1 -0,3 ± 0,2

Ala 56 ± 3 53 ± 3 52 ± 3 48 ± 3 0,9 ± 0,8 -4 ± 2 5,6 ± 0,3

Asp 17 ± 3 14 ± 3 13 ± 3 15 ± 3 2 ± 1 1,8 ± 0,1 —

Glu 64 ± 2 57 ± 3 54 ± 2 48 ± 2 4 ± 3 2,7 ± 0,4 8,0 ± 0,2

-: excreción; —: no presenta consumo ni excreción. Los resultados se presentan con su desviación estándar

3

Tabla 2 Utilización de aminoácidos (Aa) en la segunda mitad de fermentación por distintas cepas

50-75 % de azúcares consumidos 75-100 % de azúcares consumidos

Aa (mg/L) Control D47 K1M Control D47 K1M

His 3 ± 2 7 ± 1 3,5 ± 0,4 2,1 ± 0,6 -3,2 ± 0,4 -3,0 ± 0,3

Arg — — 1,6 ± 0,2 — -9,6 ± 0,6 -11 ± 1

Thr -0,7 ± 0,2 -1,3 ± 0,1 -1,0 ± 0,4 -0,7±0,3 -2,1 ± 0,4 -3,0 ± 0,6

Ala -2 ± 1 — — -5 ± 1 -11 ± 1 -10 ± 1

Asp — -1,8 ± 0,1 1,1 ± 0,2 0,5 ± 0,3 -2,5 ± 0,1 -3,7 ± 0,4

Glu -9 ± 1 -18 ± 1 1,4 ± 0,2 5,4 ± 0,9 3,2 ± 0,6 -8,4 ± 0,3

-: excreción; —: no presenta consumo ni excreción. Los resultados se presentan con su desviación estándar

membrana de las células habría que sumarla liberación de aminoácidos de levadurassensibles dañadas por la toxina killer. Portodo ello, se puede concluir que los vinos ob-tenidos a partir de muestras donde las leva-duras killer se sembraron y predominaron,presentaron menor estabilidad microbioló-gica. •

Bibliografía1. De la Peña P., Barros F., Gascón S., Lazo P.S., Ra-

mos S.: J Biol Chem 1981; 256: 10420-10425.2. Lavallée F., Salvas Y., Lamy S., Thomas D.Y., Degré

R., Dulau L.: Am J Enol Vitic 1994; 45: 86-91.3. Cohen S.A., Meys M., Tarvin T.L.: The Pico-Tag

Method. A manual of advanced tecniques for aminoacid analysis, Millipore Corp, Bedford, 1989.

4. Ingram L.O., Dombek K.M., Osman Y.A.: TrendsBiotechnol 1986; 4: 40-44.

4

n la elaboración del cava tienen lugardos fermentaciones alcohólicas sucesi-vas y el envejecimiento del vino en la

Selección de cepas de levadura para realizarla segunda fermentación en la elaboraciónde vinos de cava

A. Martínez-Rodríguez y A.V. Carrascosa

Instituto de Fermentaciones Industriales, CSIC, Madrid (ifimr41@ifi.csic.es)

Ebotella con las levaduras. Las condiciones enlas que se desarrolla la segunda fermenta-ción determinan las características que de-ben reunir las levaduras que hay que utilizarpara obtener un producto de óptima calidad.

En este trabajo se sugiere una metodolo-gía que consideramos adecuada para selec-cionar cepas de levadura que lleven a cabocon éxito la segunda fermentación y el enve-jecimiento en botellas, utilizando criteriosenológicos específicos que deben cumplir laslevaduras que participan en la segunda fer-mentación e incorporando al sistema de se-lección la capacidad de autólisis de las leva-duras en un sistema modelo.

El primer criterio de selección es el estudiodel poder fermentativo en un medio sintéticoque presenta una composición similar al vinobase de la segunda fermentación (25 g/L desacarosa en un medio de 10o alcohólicos, apH 3 e incubado a 16 oC).

El grupo de cepas que cumple este primerrequisito se somete a las siguientes pruebasde selección: producción de acidez volátil, re-sistencia al SO2, formación de SH2, capaci-dad floculante y capacidad autolítica medida

por la liberación al medio de aminoácidos yproteínas después de 24 horas de incubaciónen un sistema modelo. El análisis conjunto delos resultados obtenidos permite hacer unasegunda selección de las cepas que mejor seadaptan a los criterios de esta vinificación.

Para confirmar la identidad de las cepasse lleva a cabo un estudio de los patrones dedigestión del DNA mitocondrial frente a ungrupo de enzimas de restricción diferentes(Nucleic Acids Res 1990;18:1657).

Esta sistemática la hemos seguido en ellaboratorio para seleccionar una cepa ade-cuada para realizar la segunda fermentaciónde vinos de cava. Se partió de 35 cepas dela colección del Instituto de FermentacionesIndustriales que a priori podía suponerse queeran adecuadas para este fin. En la primeraselección quedaron 13 cepas. Éstas se so-metieron al segundo grupo de criterios de se-lección superándolo cuatro cepas. El patróndel DNA mitocondrial nos indicó que dos deellas eran la misma cepa por lo que quedarontres, con las que se han realizado vinificacio-nes en bodega para llevar a cabo un estudiomás profundo de los cambios que se produ-cen en la segunda fermentación y de la libe-ración de compuestos que tiene lugar duran-te la autólisis de las levaduras. •

5

L

Aplicación de la SPE a la extracción de OTA

D. Jornet, O. Busto y J. Guasch

a presencia de ocratoxina A en los vinosha suscitado un interés creciente en losúltimos años debido a sus propiedades

Departamento de Química Analítica y Química Orgánica, Unidad de Enología (CeRTA), Facultad de Enología deTarragona, Universitat Rovira i Virgili, Tarragona (qaenol@fe.urv.es)Este trabajo ha sido financiado por la Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología (CICYT, proyecto ALI97-0765)

toxicológicas y carcinógenas. Hasta este mo-mento, solamente se ha detectado en con-centraciones inferiores a 5 ug/L, límite máxi-mo admitido para los cereales y sus deriva-dos, de acuerdo con el Codex Alimentarius.

La técnica analítica más empleada para sudeterminación es la RP-HPLC, aunque elmétodo oficial propuesto por la AOAC estábasado en la cromatografía en capa fina. Enestudios recientes, se ha propuesto un méto-do en el cual la OTA se extrae del vino me-diante tolueno y, tras un tratamiento de cleanup relativamente complejo, se cuantifica porHPLC. El método ha sido reconocido por laOIV como un método satisfactorio bajo unpunto de vista analítico, aunque implica lanecesidad de seguir unas condiciones estric-tamente controladas.

En el estudio realizado se utiliza un méto-do de HPLC precedido de una SPE que hapermitido el clean up y la concentración de

las muestras, pudiendo determinarse concen-traciones de OTA en vino a niveles de con-centración inferiores a 5 ug/L. La detección seha realizado fluorimétricamente ( exc=330 nm,

em =470 nm).

Las muestras de vinos blancos, rosados ytintos han sido extraídas directamente con uncartucho de octadecilsilano y concentradas,en una segunda etapa, bajo corriente de ni-trógeno. En estas condiciones, la OTA, quese añade a los vinos a una dosis de concen-tración de 3 ug/L, se concentra un mínimo de100 veces.

Se ha optimizado el método de trabajoprobando diferentes matrices y volúmenes demuestra. Se ha comprobado la linealidad dela respuesta en el intervalo de concentraciónhabitual en los vinos y las recuperacioneshan sido superiores al 80 % para todos losvinos analizados. El límite de detección hasido de 50 ug/L (S/N = 3).

El método optimizado es suficientementerápido y su reproducibilidad aceptable al nivelde concentración estudiado. •

6

L a fermentación maloláctica es un proce-so bacteriano deseable y determinanteen la definición de las características

Área de Tecnología de los Alimentos, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad de Castilla-La Mancha,Ciudad Real

Cambios en la composición de los vinos cencibeldebidos a la fermentación maloláctica

M.C. Díaz-Maroto Hidalgo, E. García Romero, I. Hermosín Gutiérrezy M.D. Cabezudo Ibáñez

sensoriales de los vinos, sobre todo de lostintos. Por ello es importante su conocimientoy control.

Han sido estudiados 13 vinos tintos de lavariedad cencibel, obtenidos en la planta pilo-to de la Universidad de Castilla-La Mancha(Ciudad Real). Terminada la fermentación al-cohólica, a seis de ellos se les adicionó bac-terias lácticas comerciales liofilizadas (Viniflo-ra OENOS, Leuconostoc oenos DSM 7008),dejando los restantes como muestras de con-trol. Además de las determinaciones conven-cionales, se han analizado los compuestosvolátiles mayoritarios y minoritarios por cro-matografía de gases (CG), y los ácidos orgá-nicos fijos y los antocianos por HPLC.

Las concentraciones del ácido láctico, elácido málico y el lactato de etilo han sufrido

los cambios esperados. Además, los ácidoscítrico y fumárico han sido metabolizados porlas bacterias lácticas utilizadas.

La concentración de acetaldehído disminu-ye de forma drástica, pues interviene en laruta metabólica de las bacterias lácticas hete-rofermentativas, como es el caso de Leuco-nostoc oenos. También disminuye la concen-tración del piruvato de etilo, debido probable-mente a las esterasas extracelulares que pro-ducen Leuconostoc oenos; además, el piru-vato formado puede entrar en distintas rutasmetabólicas citadas anteriormente, y favore-cer de esta forma la reacción.

Por último, se observa un aumento de losantocianos presentes en el vino, sobre todode los derivados no acilados, cifrándose des-de un 40 % para el 3-monoglucósido de mal-vidol, hasta un 128 % para el 3-monoglucósi-do de peonidol. •

7

Las seis levaduras presentan curvas defermentación semejantes aunque con peque-ñas diferencias de velocidad y de consumode compuestos nitrogenados. No obstante,todas ellas agotan en su totalidad la glucosay la fructosa.

Se encontraron diferencias en la produc-ción de acetatos y ésteres de ácidos grasospor los distintos tipos de cepas así como enla producción de ácidos orgánicos.

La maceración de los hollejos en la vini-ficación del mosto cencibel produce vinoscon mayor concentración de nitrógeno total,1-hexanol, 2-feniletanol, glicerina, metanol yacetato de etilo que los vinos airén. •

Diferencias en la composición de los vinosfermentados con cepas deSaccharomyces cerevisiae killer y killer curadas

D. Broceño Caminero, M.S. Pérez Coello, E. García Romeroy M.D. Cabezudo Ibáñez

Área de Tecnología de los Alimentos, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad de Castilla-La Mancha,Ciudad Real

S e fermentaron alícuotas de un mismomosto airén a 19 oC y de un mosto cen-cibel a 25 oC (obtenidos ambos a partir

de las uvas a escala de planta piloto) con seiscepas de levaduras Saccharomyces cerevisiede distinta procedencia: con factor killer, tra-tadas con cicloheximida (killer curadas), killersensibles y killer resistentes. La fermentaciónse siguió mediante monitorización del dióxidode carbono desprendido.

A los vinos obtenidos se les realizaron losanálisis químicos convencionales, los com-puestos volátiles (mayoritarios y minoritarios)por cromatografía de gases (CG), y los áci-dos orgánicos por HPLC.

8

L genes diversos de los ácidos grasos (proce-dentes de la uva o fermentativos), el perfil delos mostos difiere del de los vinos, tanto porsu naturaleza como por sus concentraciones.Así, los ésteres de etilo son siempre minorita-rios respecto a la cantidad de ácidos grasoslibres. La fracción esterificada en los mostoses prácticamente inexistente y, en cambio, enlos vinos puede representar hasta un 30 %del total. Por otra parte, en los mostos el96 % (~ 7 ppm) de los ácidos grasos son decadena larga ( de 16 a 18 átomos de carbo-no), mientras que en los vinos el 95 % (~ 18ppm) son de cadena corta (de 6, 8 y 10 áto-mos de carbono). En el caso de los vinos, seha observado también que la distribución por-centual de los ácidos grasos de diferente lon-gitud de la cadena carbonada es la mismapara la fracción libre y la esterificada. Asimis-mo, estos primeros datos de ácidos grasosde vinos base monovarietales apuntan la po-sibilidad de caracterizaciones varietales. •

Ácidos grasos libres y esterificadosen mostos y vinos base parala elaboración de cava

S. Francioli, M. Gallart, E. López-Tamames y S. Buxaderas

os ácidos grasos se encuentran enmostos y vinos tanto en forma libre co-mo esterificada, mayoritariamente como

ésteres de etilo. Ambas formas se han deter-minado utilizando un único método de croma-tografía de gases (CG) y, en consecuencia,en el mismo cromatograma. Además se hansolventado los problemas habituales de estetipo de determinaciones (volatilidad variable,concentraciones dispares, interferencias deotros componentes, etc.).

El método se ha aplicado para el estudiode la evolución de ácidos grasos y sus éste-res durante la vinificación de cuatro varieda-des de uva blanca (macabeo, xarel·lo, pare-llada y chardonnay) empleadas en la elabora-ción del cava. Para ello, durante tres vendi-mias consecutivas se han tomado muestrasen cuatro puntos del proceso de obtención, aescala industrial, de los vinos base mono-varietales.

Se ha comprobado que, debido a los orí-

Departamento de Nutrición y Bromatología (CeRTA), Universidad de Barcelona, Barcelona

9

L

Influencia del etanol y del ácido decanoico sobrela actividad H +-ATPasa y la incorporaciónde aminoácidos por Saccharomyces cerevisiae

J. Fuguet, F. Fort, N. Ferrer, Ll. Arola y F. Zamora

Departamento de Bioquímica y Biotecnología (CeRTA), Facultad de Enología de Tarragona, Universidad Rovira iVirgili, Tarragona (fzm@ee.urv.es)Este trabajo ha sido financiado por la CICYT (proyectos ALI-95-0887-C04-01 y ALI 98-0534)

as paradas de fermentación alcohólicaantes del completo consumo de los azú-cares fermentables son uno de los prin-

cipales problemas de la enología actual. Es-tas paradas de fermentación comportan unalto de riesgo de desarrollo de bacterias lác-ticas heterofermentativas que pueden meta-bolizar las hexosas presentes en el medio eincrementar drásticamente la acidez volátildel vino.

La bibliografía existente sobre las paradasde fermentación señala que las altas concen-traciones de etanol y la presencia de ácidosgrasos de cadena corta liberados por las pro-pias levaduras, podrían ser sus principalescausas.

El principal objetivo de este trabajo fue elde estudiar la influencia del etanol y del ácidodecanoico sobre algunos de los sistemas detransporte de nutrientes (actividad H+-ATPasay captación de aminoácidos) a través de lamembrana plasmática de Saccharomycescerevisiae.

La determinación de la actividad H+-ATPasa y de la velocidad de incorporación deaminoácidos fueron realizada en levaduras(Levuline CHP; GLO) durante la fase tumul-tuosa de la fermentación (tercer día).

Para la determinación de la actividad H+-ATPasa, las levaduras eran tratadas con liti-casa con el propósito de obtener esferoblas-

tos, los cuales eran sometidos posteriormen-te a un choque osmótico. Tras la purificaciónde las membrana se determinó la actividadH+-ATPasa mediante la medida de la veloci-dad de hidrólisis del ATP y del flujo de proto-nes a través de la membrana plasmática.

La determinación de la incorporación deaminoácidos fue realizada mediante la utiliza-ción de un análogo estructural de los amino-ácidos no metabolizable, el ácido 2-aminoiso-butírico (2-AIB) marcado con carbono-14, elcual es transportado al interior de la célulamediante la permeasa general de aminoáci-dos.

Los resultados obtenidos muestran que eletanol provoca una fuerte inhibición de la ac-tividad H+-ATPasa y del flujo de protones através de la membrana, mientras que el áci-do decanoico produce un incremente de suactividad.

La disminución de la actividad H+-ATPasaprovocada por la presencia de etanol indicaque, a medida que transcurre la fermentaciónalcohólica, las levaduras presentarán mayo-res dificultades para mantener el pH intrace-lular y, por tanto, todos los sistemas de trans-porte activo (symport con protones) estaránseriamente comprometidos. El incremento dela actividad H+-ATPasa inducido por la pre-sencia de ácido decanoico podría estar rela-cionada con la necesidad de mantener el pH

10

intracelular en condiciones que inducen suacidificación.

Por otra parte, tanto la presencia de etanolcomo de ácido decanoico provocaron unaclara inhibición de la incorporación de 2-AIB,lo que indicaría que el transporte de losaminoácidos, necesarios para la multiplica-

ción celular, estaría seriamente afectado porestas condiciones. Todo ello indicaría querealmente las altas concentraciones de etanoly la presencia de ácidos grasos de cadenacorta pueden realmente condicionar el co-rrecto desarrollo de la fermentación alcohóli-ca. •

11

E combinación, se evaluó en función de la velo-cidad de acetificación y el rendimiento. Serealizaron arbitrariamente 14 experimentos yse calcularon la velocidad de acetificación y elrendimiento. Se propuso una ecuación de re-gresión lineal múltiple que se resuelve con elprograma estadístico CSS-Statistica.

Optimización de un fermentador de laboratoriopara la elaboración de vinagre de vino

W. Tesfaye, M.L. Morales-Gómez, M.C. García-Parrilla y A.M. Troncoso

Departamento de Nutrición y Bromatología, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, Sevilla(wendu@fafar.us.es)

l objetivo del presente trabajo consisteen aumentar el rendimiento y la veloci-dad de acetificación para obtener vina-

gres de vino con alto grado acético en menortiempo. Para ello, se estudian las variablesque intervienen en el proceso: concentracióninicial de etanol, velocidad de agitación, volu-men de carga, proporción decarga, velocidad de carga,temperatura y suministro deaire.

El estudio se realizó conun fermentador a escala delaboratorio de B. Braun Bio-tech S.A. con un volumen de5 L de capacidad provisto de control de tem-peratura, pH, presión parcial de oxígeno y ve-locidad de agitación.

Durante el proceso de acetificación semantuvieron constantes los siguientes pará-metros: a) concentración inicial de etanol, quese fijó a 10o en los casos en que los sustratosvínicos presentaran un grado alcohólico supe-rior diluyendo con agua destilada; b) el sumi-nistro de aire se mantuvo entre 100-200 L/h(0,33-0,98 vvm), y c) la temperatura se regu-ló a 30 oC.

Se han seleccionado tres variables: veloci-dad de agitación, volumen de carga y propor-ción de carga observándose como afectan alproceso de acetificación. Para ello se aplicóel diseño factorial a dos niveles (tabla 1). Elefecto de cada variable, así como la posible

ResultadosDel diseño experimental a dos niveles para

tres variables se obtuvieron los siguientes re-sultados: la variable crítica para obtener unmejor rendimiento es la proporción de carga,y para conseguir una buena velocidad deacetificación la agitación ha demostrado serla variable más importante. •

BibliografíaCSS-Statistica: Complete Statistical System Statsoft,

Inc.Tulsa OK 74104, 1991.González A.G.: «Two level factorial experimental

designs based on multiple linear regression models:a tutorial digest illustrated by case studies», AnalChim Acta 1998; 360: 227-241.

Nieto J.: «Algunos aspectos de la tecnología de la fer-mentación acética. El vinagre de vino», Llaguo C.,Polo M.C. (eds.), Consejo Superior de Investigacio-nes científicas, Madrid, 1991: 69-103.

Tabla 1 Representación de las tres variables a dos niveles

Factores Niveles

Sin codificar Codif. Sin codificar Codif.

Agitación (x1) 250 rpm -1 450 rpm +1

Volumen de carga (x2) 3400 mL -1 5000 mL +1

Proporción de carga (x3) 1:1 vino/vinagre -1 2:1 vino/vinagre +1

12

Sla variedad garnacha negra, correspondientea la vendimia de 1998, en la finca experimen-tal Mas dels Frares, en Constantí, de la Fa-cultad de Enología de Tarragona. Con ello sepretendía, además de la puesta a punto delos métodos identificativos con DNA, verificarpor un lado cuáles eran las bacterias lácticasresponsables de la fermentación malolácticaen esta vinificación y, por otro, cuál era la po-sible proliferación de bacterias acéticas enestas condiciones, así como la identificaciónde las mismas.

La fermentación alcohólica se llevó a caboen paralelo en dos depósitos de vinificación ysin control de temperatura, uno de forma es-pontánea y otro inoculado con Saccharo-myces cerevisiae (L1118). A continuación, sinadición de sulfuroso, se dejó que se llevara acabo la fermentación maloláctica espontá-neamente, siendo el contenido inicial en L-málico de 2 g/L. Durante el transcurso de di-cha fermentación (10-20 días) se tomaronmuestras para cuantificar y aislar los dos ti-pos de bacterias, lácticas en placas de MRS(suplementado con málico y zumo de toma-te), y acéticas en placas con medio de Drys-dale y Fleet (1985) modificado. Para cadauno de los dos tipos de bacterias y de cada

Unidad de Enología, Centro de Referencia de Tecnología de Alimentos,Departamento de Bioquímica y Biotecnología, Universidad Rovira i Virgili, Tarragona

Seguimiento e identificación de bacterias lácticasy acéticas mediante métodos moleculares

C. Reguant, A. Ruiz, M. Poblet, N. Rozès, V. Garcia, M. Constantí,J.M. Guillamón, A. Bordons y A. Mas

e han aislado e identificado cepas debacterias lácticas y acéticas después deuna fermentación alcohólica en tinto de

muestra, se tomaron unas 20 colonias aisla-das para ser identificadas.

Las bacterias lácticas han sido identifica-das mediante extracción de su DNA genómi-co, seguida de amplificación con PCR me-diante dos cebadores (oligonucleótidos de 24bases) complementarios de regiones especí-ficas del gen del enzima maloláctico de Oe-nococcus oeni, obteniéndose en la electrofo-resis una banda de amplificado característicode esta especie. Se ha observado un creci-miento ostensible de la población de lácticas(hasta 108 por mL) solamente en el vino quehabía sido previamente inoculado con leva-dura. Se ha comprobado que la gran mayoríade aislamientos de bacterias lácticas de estasfermentaciones eran Oenococcus oeni. Paracomprobar si la fermentación maloláctica fuellevada a cabo por una sola cepa o por va-rias, se está procediendo en la actualidad a laidentificación a nivel de cepas, mediante am-plificación con PCR de regiones inespecíficas(RAPD) con diversos cebadores aleatorios de10 nucleótidos.

Las bacterias acéticas han sido identifica-das también a nivel de especie, de entre losdiversos Acetobacter, Gluconoacetobacter yGluconobacter, mediante extracción de suDNA genómico, seguida de amplificación conPCR mediante cebadores complementariosde regiones específicas del fragmento 16S

13

del rDNA, con tratamiento posterior conenzimas de restricción. Con ello se han obte-nido unos perfiles RFLP de amplificados, ca-racterísticos de las diferentes especies debacterias acéticas. Se ha observado que lapoblación de acéticas aumenta considerable-mente durante la fermentación malolácticapara caer al final de ésta. Al principio de la

misma la población de acéticas tiene espe-cies representantes de los tres géneros. Encambio, durante la fermentación maloláctica yal final de ésta, la especie mayoritaria y casiúnica ha sido Acetobacter aceti, con coloniasesporádicas de Acetobacter pasteurianus yGluconobacter oxydans. •

14

L

Efecto de la proteasa de Oenococcus oeni sobrelas proteínas de vinos blancos y tintos

M.C. Manca de Nadra,* V. Moreno-Arribas,** E. Pueyo,**M.E. Farías* y M.C. Polo**

deficiente en compuestos nitrogenados. Laactuación de estos enzimas puede aportar alvino los aminoácidos necesarios para el cre-cimiento de las bacterias lácticas.

El objetivo del trabajo es conocer el efectode la actividad proteásica de la cepa Oenoco-cccus oeni X2L sobre las proteínas de vinosblancos y tintos. Los ensayos se han realiza-do con los sobrenadantes de un cultivo librede células como solución del enzima, y lasproteínas obtenidas por diálisis y posteriorliofilización de los vinos, como sustratos. Sehan realizado ensayos comparativos antes ydespués de la acción de la proteasa compro-bándose la liberación de aminoácidos y depéptidos por HPLC. Además, se ha realizadola identificación parcial de algunos de lospéptidos liberados, mediante el análisis es-pectral. Los primeros resultados de este estu-dio ya han sido publicados (Manca de Nadraet al., 1997 y 1999). •

BibliografíaCorrea-Gorospe et al.: Food Chem 1991; 41: 135-146.Manca de Nadra et al.: FEMS Microbiol. Letters 1997;

150: 135-139 .Manca de Nadra et al.: FEMS Microbiol Letters 1999

(en prensa).Rollán et al.: World J Microbiol Biotechnol 1993; 9:

587-589.Rollán et al.: World J Microbiol Biotechnol 1995; 11:

153-155.Waters et al.: J Agric Food Chem 1996; 44: 3-5.

* Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia, Universidad Nacional de Tucumán y Centro de Referencias paraLactobacilos (CERELA), Tucumán, Argentina** Instituto de Fermentaciones Industriales, CSIC, Madrid

as proteínas del vino proceden en sumayoría de la uva. Se eliminan en partede una forma espontánea durante la ela-

boración por insolubilizarse a medida queavanza la fermentación y aumenta el gradoalcohólico y por formar complejos con loscompuestos fenólicos, especialmente en elcaso de los vinos tintos. Aunque están nor-malmente en el vino en concentraciones muypequeñas, generalmente del orden de variosmg/L, pueden ocasionar turbidez en los vi-nos. También se ha descrito que forman par-te de los inhibidores de la precipitación tartári-ca (Correa-Gorospe et al., 1991) dificultandola eliminación del bitartrato potásico del vino,por lo que es necesario eliminarlas. Lasenzimas que existen en el mercado no ac-túan sobre estas proteínas, sin que conozca-mos totalmente las causas. Waters et al.(1996) atribuyen la causa de dicha resistenciaal hecho de ser proteínas de resistencia apatógenos de la planta, con secuencias ho-mólogas a taumatina y quitinasa.

Rollán et al. (1993 y 1995) han aislado ce-pas de Leuconostoc oenos (Oenococcusoen ) que producen dos proteasas extracelu-lares. Esta actividad tiene un gran interés envinificación no sólo por el hecho antes men-cionado, sino porque la fermentación malo-láctica se produce generalmente después dela fermentación alcohólica, cuando el vino es

15

L a fermentación alcohólica espontáneadel mosto de uva es un proceso llevadoa cabo por la acción de levaduras perte-

Centro de Investigación y Desarrollo Agrario de La Rioja (CIDA)* Universidad de La Rioja, Logroño

Ecología de la fermentación alcohólica espontáneadurante varios años consecutivos.Influencia en la cinética fermentativa

P. Santamaría, A.R. Gutiérrez A.R.,* Epifanio, R. López y P. Garijo

necientes a diferentes géneros y especies.Las levaduras de bajo poder fermentativocrecen durante las etapas iniciales de las fer-mentaciones; cuando la concentración deetanol se incrementa, las levaduras más tole-rantes a este compuesto pertenecientes algenero Saccharomyces completan la fermen-tación. Dentro del género Saccharomycesexiste una gran diversidad genética. Para es-tudiar esta diversidad se han utilizado diver-sas técnicas de biología molecular.

En los últimos años se han llevado a cabogran cantidad de trabajos encaminados a es-tudiar si la fermentación alcohólica espontá-nea se lleva a cabo por un número alto o bajode clones distintos de Saccharomyces y siestos clones se mantienen en el ecosistemade la bodega de un año a otro.

En el presente trabajo se ha estudiado laecología de la fermentación alcohólica espon-tánea en la bodega experimental del CIDAdurante cinco años consecutivos (vendimias1994-1998). Para ello se han tomado mues-tras de 42 depósitos de elaboración de vinosblancos. Los aislamientos de levaduras serealizaron en tres etapas: mosto, fermenta-ción tumultuosa y fin de fermentación. Laidentificación de los aislados se realizó utili-

zando el análisis de restricción del DNAmitocondrial.

El análisis de restricción del DNA mitocon-drial de los aislados procedentes de los mos-tos mostró la ausencia de levaduras pertene-cientes al género Saccharomyces en estaetapa. Por el contrario, todas las colonias delas etapas fermentativas pertenecían a estegénero, salvo algunos aislados obtenidos en1997.

Los patrones de restricción del DNA mito-condrial de los 840 aislados estudiados reve-laron 73 perfiles diferentes, que correspondena diferentes cepas de Saccharomyces cerevi-siae. El número de cepas diferentes detecta-das para cada año y su frecuencia de apari-ción varían en función de la campaña estu-diada.

Al comparar los patrones obtenidos en loscinco años se observó que algunos de ellosestaban presentes en años consecutivos, pe-ro su presencia varía notablemente de unaño a otro. Estos resultados nos llevan a pen-sar sobre la existencia de un conjunto declones propios del ecosistema de cada bode-ga, cuya participación en la fermentación vie-ne determinada por su capacidad de adapta-ción a las condiciones en que se llevan acabo las vinificaciones (características delmosto en cada campaña, tecnología emplea-da en las elaboraciones, etc.).

16

En los cinco años del estudio, cuatro tuvie-ron fermentaciones normales; la excepciónfue la campaña de 1997. Este año fue proble-mático en varias regiones vitivinícolas espa-ñolas, donde se detectaron numerosas para-das de fermentación. En todos los depósitossometidos a muestra este año los vinos que-daron dulces y con una acidez volátil muyelevada. Esta inusual situación también sereflejó en los datos microbiológicos obteni-

dos; la población de bacterias acéticas en elmosto de partida fue muy superior al resto delos años y además levaduras no Saccharo-myces fueron las cepas dominantes durantela fermentación tumultuosa con una presen-cia del 50 %. Así, en este caso concreto, eldesequilibrio en la población microbiológicainicial y la falta de cepas del genero Saccha-romyces explicarían las disfunciones detecta-das en estas fermentaciones. •

17

L

Aislamiento e identificación por métodosmoleculares de la población levaduriformepresente en mostos

B. Esteve-Zarzoso, *,** F. Uruburu* y A. Querol**

* Colección Española de Cultivos Tipo, Edificio de Investigación Jeroni Muñoz, Universidad de Valencia, Burjassot,Valencia** Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos, CSIC, Burjassot, Valencia (braulio@iata.csic.es)

a transformación del mosto de uva envino es el resultado de la acción sucesi-va de diferentes especies de microorga-

nismos, en la que las levaduras juegan unpapel primordial, predominando al final de lafermentación cepas de la especie Saccharo-myces cerevisiae. Durante los primeros esta-dios de la fermentación se aíslan otras espe-cies de levaduras que pueden aportar carac-terísticas organolépticas deseables a los vi-nos, estas especies que nosotros denomina-mos no Saccharomyces, se aíslan principal-mente de fermentaciones espontáneas, sien-do difícilmente aisladas de fermentacionesinoculadas.

Los métodos de identificación basados enla asimilación y fermentación de distintoscompuestos carbonados y nitrogenados per-miten actualmente una identificación lenta delas especies de levaduras, además de dar unresultado no muy fiable. Sin embargo, la me-todología descrita por Esteve-Zarzoso et al.(1999) para identificar especies de levaduraspermite una rápida y fiable identificación delas mismas. Esta técnica consiste en la am-plificación por PCR y restricción de la regiónribosomal ITS-5,8S. Utilizando esta metodolo-gía se han podido identificar la mayor parte

de las 2591 colonias de levaduras que se ais-laron durante la vendimia de 1997 en las bo-degas Gonzalez-Byass de Jerez de la Fron-tera (Cádiz). Los aislamientos se realizarontanto de fermentaciones espontáneas comoinoculadas, y en dos medios de cultivo dife-rentes. Uno de los medios utilizados es elagar lisina, descrito para aislar especies delevaduras no Saccharomyces, y el otro mediode aislamiento fue agar YPD, como mediogeneral de aislamiento de levaduras.

De esta forma se pudo observar la presen-cia de una gran variedad de especies de le-vaduras durante las primeras fases de la fer-mentación, como especies pertenecientes alos géneros Candida, Hanseniaspora, Issat-chenkia, Zygosaccharomyces, entre otros.Dichas especies fueron reemplazadas por ce-pas de la especie Saccharomyces cerevisiaeen el transcurso de la fermentación, dominan-do al final de la misma. Cabe destacar quemediante esta tecnología se han aislado eidentificado cepas de levaduras de las espe-cies Candida albicans, C. sorbosa, Kluyvero-myces polysporus, Yarrowia lipolytica y Zygo-ascus hellenicus que nunca se había descritosu aislamiento de este ambiente. •

18

L

Sistemas moleculares de identificacióny tipificación de Lactobacillus heterofermentativospresentes en el vino

G. Lluesma, A. Rodas, I. Pardo y S. Ferrer

bodegas de las denominaciones de origenUtiel-Requena y Jumilla. De ellas, 91 pertene-cían a especies heterofermentativas obliga-das, de las cuales se identificaron 43 comoLactobacillus hilgardii, 12 como Lactobacillusbuchneri y 36 como Lactobacillus brevis, si-guiendo los criterios del libro The Prokaryotes(vol. II, 2ª ed.).

Tras poner a punto la técnica de extracciónde DNA en discos de agarosa, se llevó acabo el análisis de estas cepas medianteRFLP-PFGE con el enzima SfiI, y el análisisde bandas generadas por RAPD´S utilizandopara ello el cebador 17R. Los resultados ob-tenidos muestran en general una buena co-rrelación con la identificación fenotípica de lastres especies. Sin embargo, se ha observadocon ambas técnicas que las cepas identifica-das fenotípicamente como L. brevis muestrantres grupos diferentes de patrones de macro-rrestricción y RAPD’S. En algún caso estosperfiles son muy parecidos a los que presen-tan cepas identificadas como L. hilgardii. Estomuestra que existe cierta confusión entreambas especies, por lo que es necesario pro-fundizar mediante otras técnicas molecularespara la correcta separación de ambas. •

Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de Valencia, Burssajot, Valencia(Gloria.Lluesma@uv.es)Este trabajo ha sido financiado por la CIYT (proyecto ALI97-1077-C02-01)

actobacillus es uno de los géneros debacterias lácticas que pueden desarro-llarse durante el proceso de elaboración

del vino. Dentro de dicho género existen es-pecies homofermentativas, heterofermenta-tivas facultativas y heterofermentativas obli-gadas. En algunos casos, Lactobacillus pue-de alterar las características organolépticasde los vinos, de ahí la importancia de detec-tar la presencia de estas bacterias de una for-ma rápida y fiable con la finalidad de tomarmedidas para evitar sus efectos perjudiciales.

Los objetivos de este trabajo son: 1) desa-rrollar sistemas moleculares de identificacióny tipificación de las especies de Lactobacilluspresentes en el vino; 2) comparar estas téc-nicas y seleccionar la más adecuada para ta-les fines; 3) utilizar estas técnicas para llevara cabo el seguimiento de poblaciones natura-les en vinificaciones. Las técnicas inicialmen-te elegidas para cumplir estos objetivos hansido RAPD´S, análisis de fragmentos demacrorrestricción mediante electroforesis encampo pulsante (RFLP-PFGE) y desarrollode cebadores específicos.

Durante la vendimia de 1997-1998 se ais-laron 181 cepas de Lactobacillus a partir devinos y mostos procedentes de diferentes

19

P tadas de mostos y vino durante la vendimia1997-1998. Las muestras fueron tomadas endistintas bodegas de las denominaciones deorigen Utiel-Requena y Jumilla. Dichas cepasse identificaron según los criterios expuestosen el Bergey’s Manual of Determinative Bac-teriology (9ª ed.) y el Bergey’s Manual of Sys-tematic Bacteriology (9ª ed.), utilizando comocontroles las cepas tipo de las siguientes es-pecies de Pediococcus previamente descritasen el vino: P. acidilactici (CECT 98), P. parvu-lus (CECT 813), P. damnosus (DSM 20331),P. inopinatus (DSM 20285) y P. pentosaceus(CECT 923).

El resultado de la identificación fenotípica anivel de especie de los 114 Pediococcusmostró que tres cepas presentaban el perfilfenotípico de P. pentosaceus y 111 cepaspresentaban el perfil fenotípico de P. par-vulus.

Para llevar a cabo la identificación y tipi-ficación molecular se puso a punto la extrac-ción de DNA en bloque de agarosa, consi-guiendo minimizar el tiempo de lisis celular yobtener un elevado rendimiento de DNA degran pureza. Tras analizar varios oligonucleó-tidos hemos seleccionado uno de ellos, deno-minado 16R, como más adecuado para laidentificación a nivel de especie. Se ha reali-zado tipificación intraespecífica medianteRAPD’S con el oligonucleótido 17R y RFLP-

Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de Valencia, Burjasssot, Valencia(Ana.M.Rodas@uv.es)Este trabajo ha sido financiado por la CICYT (proyecto ALI97-1077-C02-01)

Sistemas moleculares de identificacióny tipificación de Pediococcus del vino

A. Rodas, G. Lluesma, I. Pardo y S. Ferrer

ediococcus es uno de los géneros debacterias lácticas que puede desarro-llarse durante la elaboración del vino. El

género Pediococcus incluye diferentes espe-cies, pero en el vino fundamentalmente sepresentan Pediococcus parvulus y Pedioco-ccus pentosaceus.

La presencia de Pediococcus puede serpotencialmente peligrosa para la industriaenológica al producir alteraciones en el sabor(producción de elevadas cantidades dediacetilo) y en la viscosidad (producción depolisacáridos). Por lo tanto, es necesario dis-poner de técnicas de identificación rápida quepermitan detectar su presencia en vino con elfin de poner medidas para evitar sus efectosperjudiciales en el mismo.

Los objetivos de este trabajo son analizarla capacidad de distintas técnicas molecula-res para identificar y tipificar las especies dePediococcus presentes en el vino. Las técni-cas seleccionadas son RAPD’S, oligonucleó-tidos específicos del rDNA 16S y macrorres-tricción mediante electroforesis de campopulsante (RFLP-PFGE). Una vez selecciona-das aquellas metodologías más adecuadasse realizarán estudios ecológicos sobre lapresencia y evolución de los Pediococcus du-rante la vinificación.

En este trabajo se aislaron 114 cepas dePediococcus a partir de 32 muestras recolec-

20

PFGE con los enzimas Sfi I, Not I y Sma I.Debido a los tamaños de fragmentos genera-dos por dichos enzimas, se requirió la puestaa punto de las condiciones adecuadas deelectroforesis en campo pulsante. Tras elanálisis de estos fragmentos hemos observa-

do que el enzima Sfi I es más discriminativoque los otros dos enzimas.

En la actualidad estamos trabajando en eldiseño de cebadores específicos para la de-tección directa de las especies presentes enel vino. •

21

L

Análisis estadístico del efecto del desfangadosobre la cinética fermentativade mostos blancos

F. Varela, F. Calderón, M.C. González, B. Colomo y J.A. Suárez Lepe

gados a temperatura ambiente, no se obser-van diferencias, en relación a la turbidez, delos mostos desfangados en frío y los obteni-dos mediante tratamientos dinámicos, aun-que estos últimos presentan la ventaja derealizarse en pocas horas frente a la 48 ne-cesarias para los desfangados estáticos.

El desfangado reduce la población de le-vaduras presente en los mostos, los trata-mientos enzimáticos y dinámicos son los quemayor influencia ejercen sobre la poblaciónde levaduras.

En relación a las concentraciones de áci-dos grasos los resultados indican que lasburbas son más ricas que los mostos; eldesfangado produce un descenso en la com-posición de ácidos grasos del mosto en todoslos tratamientos, el desfangado mediante flo-tación es el que mayor pérdida de ácidosgrasos induce. El ácido graso que se encuen-tra en mayor concentración es el ácido oleico,de los ácidos grasos saturados el palmíticoes el principal.

El tratamiento de desfangado provoca unaumento en la duración de la fermentación,las fermentaciones más largas para los trata-mientos dinámicos, intermedias para losdesfangados en frío y cortas para el desfan-gado a temperatura ambiente.

En relación al análisis estadístico de com-ponentes principales se observan altas corre-

Departamento de Tecnología de Alimentos, Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos,Universidad Politécnica de Madrid, Madrid (varela@tca.etsia.upm.es)

a elaboración de vinos blancos de cali-dad ha de realizarse a partir de un mostolimpio, un mosto que haya sufrido el pro-

ceso de desfangado, tratamiento que consis-te en provocar una clarificación del mosto an-tes de la fermentación, con el fin de eliminarlas partículas susceptibles de comunicar aro-mas desagradables al vino. El efecto favora-ble del desfangado es puesto en evidenciapor la superioridad organoléptica de los vinosobtenidos a partir de mostos desfangados,principalmente en el carácter aromático; ade-más, los vinos obtenidos a partir de mostosdesfangados son más estables, sobre todofrente a fenómenos oxidativos.

Frente a estos efectos positivos del des-fangado, los mostos sometidos a este trata-miento sufren ciertos problemas relacionadoscon el proceso fermentativo, como son losarranques tardíos, las ralentizaciones de lafermentación o las paradas de ésta. Estosproblemas se atribuyen al empobrecimientoquímico y microbiológico causado por eldesfangado.

El trabajo que se presenta evalúa el efectode diez técnicas de desfangado, estáticas ydinámicas sobre la población de levaduras, lacomposición en ácidos grasos y la cinéticafermentativa de los mostos obtenidos.

Se observa cómo los mostos tratados me-diante frío son más limpios que los desfan-

22

laciones entre limpidez con población de le-vaduras, turbidez con ácidos grasos y pobla-ción de levaduras con ácidos grasos. Se ob-serva cómo la duración de la fermentación esmás larga cuando la clarificación del mostoes más efectiva, esto es, cuando la turbidezes más baja.

También se observa cómo los diferentesmostos aparecen agrupados en diferentes

clusters según el tratamiento de desfangadoa que ha sido sometido el mosto, así los tra-tamientos dinámicos forman un cluster, losenzimáticos otro grupo, mientras que eldesfangado a temperatura ambiente se com-porta de forma intermedia entre el mosto nodesfangado y los mostos desfangados me-diante frío. •

23

L

Participación de los hongos filamentososen el «gusto a corcho»: biosíntesis y degradaciónde compuestos organoclorados in vitro

E. Navascués, F. Calderón, B. Colomo, J.A. Suárez y C. García Vallejo*

Departamento de Tecnología de Alimentos, Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos,Universidad Politécnica de Madrid, Madrid* Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias, Madrid

que participan directamente en la producciónde la anomalía sensorial, observando que to-das ellas lo hacen en mayor o menor medida.Existen diferencias cuantitativas en funciónde la especie, siendo Penicillium purpuro-genum, especialmente activo. Se detectanigualmente diferencias intraespecíficas, rela-cionadas con el grado de alteración de los vi-nos y corchos de partida, así como de la si-tuación del hongo en el cuerpo del tapón decorcho. En cualquier caso, las pautas de de-gradación de clorofenoles y síntesis decloroanisoles a lo largo del tiempo son comu-nes para todas las especies. Por último sedemuestra que la biosíntesis de cloroanisolespor hongos filamentosos puede llevarse acabo a partir de otros sustratos clorados dis-tintos de los clorofenoles, como son ciertosdetergentes de uso común en bodega yfitosanitarios (lindano) que presentan cloro ensu composición. La formación de cloroaniso-les se interpreta como la respuesta del hongofrente a un metabolito tóxico como el cloro. Elhecho de que la presencia de corcho en lossistemas de cultivo potencie la biosíntesis deorganoclorados parece deberse a la cesiónde su estructura aromática, en la que quedanenglobadas las moléculas de cloro. •

a alteración sensorial de vinos conocidacomo «gusto a corcho» o «gusto a ta-pón» se debe a derivados organoclora-

dos de la familia de los cloroanisoles, particu-larmente al 2,4,6 tricloroanisol (TCA) (Buseret al., 1982; Amon et al., 1989; Duncan,1995). Estos compuestos producen, en con-centraciones pequeñas (del orden de ng/L),sensaciones olfativas muy marcadas, gene-ralmente englobadas dentro del término mo-hoso, terroso o relacionados (humedad, cue-va, pozo). El problema parece derivar de lapresencia de fenoles clorados, que son trans-formados en cloroanisoles mucho más voláti-les y odoríferos por ciertas especies de hon-gos filamentosos (Curtis et al. 1975; Tindaleet al, 1989).

En este estudio se indujo la biosíntesis de2,4,6-tricloroanisol (TCA), 2,3,4,6 tetraclo-roanisol (TeCA) y pentacloroanisol (PCA) apartir de los clorofenoles 2,4,6-triclorofenol(TCF), 2,4,6 tetraclorofenol (TeCF) y pentaclo-rofenol (PCF) en sistemas modelo in vitro porespecies de Penicillium, Aspergillus, Clados-porium, Trichoderma, Rhizopus y Monilia, ais-lados de vinos y tapones correspondientes,afectados por «gusto a corcho». Se pretendióla búsqueda de aquella especie o especies

24

A

Vías metabólicas de utilización de argininapor bacterias lácticas. Producción de aminas

M.E. Arena y M.C. Manca de Nadra

Universidad Nacional de Tucumán y CERELA, Tucumán, Argentina (mcmanca@unt.edu.ar)

nen capacidad para degradar arginina. Sinembargo, otra cepa de Oenococcus oeni tie-ne información para utilizar citrulina, dandocomo productos ornitina CO2 y NH3.

Como el sistema ADI es un camino queconduce a la síntesis de ATP, las bacteriasque lo poseen tienen ventajas para desarro-llar en medios nutricionalmente pobres. Estacapacidad es de especial importancia enmedio vino con microflora láctica mixta. Alcompartir el mismo nicho ecológico se produ-cen interacciones y de las potencialidades decada uno de ellos dependerá la simbiosispositiva o negativa establecida.

Por la capacidad decarboxilante sobre losaminoácidos arginina y ornitina, demostra-mos que arginina conduce a la síntesis deagmatina y ornitina a la de putrescina. Agma-tina puede ser enzimáticamente convertidaen putrescina.

Lactobacillus plantarum N8 produce am-bas aminas biógenas a partir de ornitina. Lacepa N4 sólo produce putrescina, pero enmayor cantidad. Lactobacillus hilgardii produ-ce agmatina a partir de arginina y ornitina.

Los resultados hasta el presente indicanque se debe conocer la actividad metabólicade los microorganismos respecto a la utiliza-ción de arginina, en los ambientes naturalesen los cuales desarrollan, para predecir laposibilidad de síntesis de compuestos tóxicospara el hombre y actuar en consecuencia. •

rginina es uno de los aminoácidos quese encuentra en mayor proporción envinos y jugos de frutas, y puede ser de-

gradado por bacterias lácticas. El conoci-miento de las vías metabólicas para su utili-zación es de especial interés, principalmenteen lo referente a la producción de aminas.Las bacterias lácticas juegan un papel funda-mental en la elaboración de alimentos fer-mentados y las aminas biógenas pueden seragentes causales de intoxicaciones alimen-tarias.

En cepas de Lactobacillus plantarum aisla-das de jugo de naranja y en cepas de Oeno-coccus oeni, Pediococcus pentosaceus yLactobacillus hilgardii, aisladas de vinos, in-vestigamos el o los caminos que utilizan paracatabolizar arginina: sistema arginina dihidro-lasa (ADI), sistema arginasa-ureasa y/o argi-nina descarboxilasa.

En ninguno de los microorganismos se de-tectó el sistema arginasa-ureasa. Con respec-to al sistema ADI, dos cepas de Lb plantarum,N4 y N8, producen los metabolitos interme-dios de este camino, citrulina y ornitina enconcentraciones dependientes de la cepa.

De los géneros de bacterias lácticas de in-terés enológico, en Lactobacillus hilgardii seevidenció la degradación de arginina a CO2,

NH3 y ornitina, detectándose citrulina comocompuesto intermedio. Pediococcus pentosa-ceus y una cepa de Oenococcus oeni no tie-

25

D

Oenococcus oeni:degradación de proteínas

M.E. Farías y M.C. Manca de Nadra

Universidad Nacional de Tucumán y CERELA, Tucumán, Argentina (mcmanca@unt.edu.ar)

ruro), inhibidor de serina proteasa, no afectaal enzima.

El enzima producido al final de la fase decrecimiento exponencial es inhibido por Ca2+

y estimulado por Mg2+. La actividad proteolíti-ca en células enteras se detecta solamenteen presencia de Ca2+, indicando que estecatión podría mantener unida la proteasa a lacélula. El ácido málico, en un rango de con-centración de 2 a 4 g/L estimula la síntesis delas proteasas y a concentraciones superioreslas inhibe. El ácido cítrico (0,1 a 0,5 g/L), esti-mula la producción de ambos enzimas.

Células no proliferantes de Oenococcusoeni, en condiciones de estrés nutricional yenergético, producen una proteasa extracelu-lar después de 2 horas de incubación a 30 oC.A su vez, SO2 (60 mg/L) + etanol (8 %) estimulansu producción. Purificada a homogeneidad, elenzima nativo tiene un peso molecular aproxi-mado de 33,5 kDa. La proteína está formadapor dos subunidades idénticas de 17 kDa. •

BibliografíaRollán G.C, Farías M.E., Manca de Nadra M.C.: World

J Microbiol Biotechnol 1993; 9: 587-589.Rollán G.C, Farías M.E., Manca de Nadra M.C.: World

J Microbiol Biotechnol 1995; 11: 153-155.Farías M.E., Rollán G.C., Manca de Nadra M.C.: J Appl

Bacteriol 1996; 81: 398-402.Rollán G.C., Farías M.E., Strasser de Saad A.M., Man-

ca de Nadra M.C.: J Appl Bacteriol 1998; 85: 219-223.

Farías M.E., Manca de Nadra M.C.: Microbiol Alim Nutr1998; 16: 101-105.

urante el proceso de vinificación, losmicroorganismos que intervienen en ladesacidificación de los vinos están suje-

tos a condiciones ambientales desfavorables.Una cepa de Oenococcus oeni aislada de vi-no argentino tiene elevado potencial malolác-tico y demostramos, por primera vez, que po-see un sistema proteolítico que se expresaen diferentes condiciones de cultivo. Las pro-teasas liberan aminoácidos esenciales parael crecimiento de los microorganismos y pue-den jugar un importante papel al degradar lasproteínas, evitando su precipitación. Ambaspropiedades son beneficiosas durante la ela-boración de los vinos.

El sistema está integrado por dos activida-des exoproteásicas, expresadas en los mo-mentos de mayor estrés para el crecimientobacteriano: inicio y final de fase exponencial.Los enzimas tienen diferentes óptimos de pHy temperatura, para la producción y actividad.Son inhibidas completamente por cisteína ybeta-mercaptoetanol y parcialmente por ditio-treitol, indicando que uniones disulfuro estánimplicadas en sus actividades. EDTA y ome-ga-fenantrolina, inhibidores de metaloprotea-sas; iodoacetamida y p-hidroximercuribenzo-ato, reactivos covalentes de grupos sulfhidri-los, no afectan las actividades enzimáticassugiriendo que un ion metal no es requerido yque grupos sulfhidrilos no están involucradosen el sitio activo. PMSF (fenilmetilsulfonilfluo-

26

S

Influencia de la contaminación por Botrytis cinereaen la calidad de vinospara la elaboración de cava

M. Quintana, S. Francioli, C. Andrés, E. López-Tamames,S. Buxaderas y M.C. de la Torre

Departamento de Nutrición y Bromatología (CeRTA), Universidad de Barcelona, Barcelona

e ha estudiado la calidad de vinos desti-nados a la elaboración de cava cuyauva presentaba una infestación espontá-

nea por Botrytis cinerea. Para ello, se hanconsiderado distintos tipos de vinos de la va-riedad xarel·lo procedentes de uva afectada,en mayor o menor medida, por el hongo. Elgrado de infestación se ha establecido de for-ma visual por la observación del porcentajede superficie dañada, estipulándose diferen-tes lotes de uva que se han vinificado parale-lamente a escala industrial (control, botritico15 % y muy botrítico > 35 %).

En los mostos y vinos se han determinadoparámetros generales y específicos de Botry-

tis, así como aromas y potencial espumantecomo parámetros de calidad.

Los resultados ponen de manifiesto que amedida que aumenta el grado de infestaciónde la uva, en los vinos hay una pérdida depotencial espumante y aparecen compuestosde oxidación, lo que evidencia el metabolismooxidativo del hongo y la consecuente pérdidade calidad. Asimismo, estos primeros datosde mostos y vinos resultantes de uva con dis-tintos niveles de contaminación botríticaapuntan la posibilidad de controlar vinos pro-cedentes de uva infestada mediante la deter-minación del ácido glucónico, el glicerol y elbenzaldehído. •

27

tinta. Para le elaboración de rosados estánadmitidas las variedades pinot noir y trepat.

En este trabajo se revisan las investigacio-nes que se han llevado a cabo sobre losmostos y los vinos base de las variedadesautorizadas para la elaboración del cava, so-bre los vinos de cava y sobre los cambiosque se producen durante la segunda fermen-tación y el envejecimiento con las levaduras,extrayendo las conclusiones de estos traba-jos. Los temas se abordan por grupos decompuestos. También se dedica atención alos estudios que se han realizado sobre losaspectos microbiológicos de la elaboracióndel cava. •

Instituto de Fermentaciones Industriales, CSIC, Madrid (mcpolo@ifi.csic.es)

Análisis global del conocimiento actualdel vino de cava

M.C. Polo, E. Pueyo, V. Moreno-Arribas,A. Martínez-Rodríguez y M.A. del Pozo

D e acuerdo con la legislación españolaactual, se denominan cavas a «los vinosespumosos de calidad producidos por

fermentación en botella según el método tra-dicional, en una región determinada». Paraoptar a la denominación cava, «el vino debeestar en contacto con las levaduras de la se-gunda fermentación un mínimo de nuevemeses». La legislación determina ademásque las variedades de uva autorizadas parala obtención de vinos destinados a la elabo-ración de cavas son: macabeo, xarel·lo, pare-llada, subirat (malvasía riojana) y chardonnay,como variedades de uva blanca, y garnachatinta y monastrell, como variedades de uva

28

S

Estudio de las actividades enzimáticas con interésenológico en levaduras no Saccharomyces

M. Fernández, J. Úbeda y A. Briones

Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos, Universidad de Castilla-La Mancha, Ciudad Real

antes de empezar la fermentación y de mos-tos al inicio de la misma, en bodegas acogi-das a la DO La Mancha.

Para conocer si cada uno de los 182 aisla-dos mostraba las actividades proteolítica,poligalacturonásica y beta-glucosidásica, serealizaron ensayos en placa con los sustratosdiferenciales adecuados para cada caso (ca-seína y gelatina, ácido poligalacturónico yarbutina). Con objeto de que los resultadosde las actividades enzimáticas se pudierancomparar entre las levaduras a estudiar, lossustratos se inocularon con el mismo númerode células. Se encontró que casi el 80 % delas levaduras espontáneas poseían algún en-zima de interés biotecnológico.

Una vez conocidas las actividades enzi-máticas de los aislados, se caracterizarongenéticamente 69 de ellos, que poseían algu-na actividad de forma pronunciada y 11 sinninguna escogidos al azar, mediante PCR/RFLP, para ello se les extrajo el DNA, se am-plificó la región ITS y se sometió a restriccióncon el enzima Hinf I, obteniéndose 13 perfilesmoleculares diferentes.

e estudiaron las actividades enzimáticasde interés en enología de 182 levadurasno Saccharomyces aisladas de mostos

Los aislados pertenecientes a cada perfilse identificaron mediante las galerías APIATB32C y otras pruebas de taxonomía clási-ca recomendadas por el manual de Barnett etal. (1990) para levaduras vínicas.

El enzima beta-glucosidasa estuvo muyrelacionado con la especie Metschnikowiapulcherrima, mientras que la actividad poliga-lacturonásica fue frecuente en la mayoría delas especies identificadas. La actividad pro-teolítica se observó en Pichia membrana-efaciens y en Metschnikowia pulcherrima.

Todos los perfiles genéticos poseían aisla-dos con alguna de las actividades estudia-das, excepto Debaryomyces hansenii.

La caracterización genética mostró quepuede haber diferenciación intraespecífica enPichia membranaefaciens, porque para lamisma especie se obtuvieron seis perfilesmoleculares distintos con alguna banda derestricción en común.

El polimorfismo obtenido mediante PCR/RFLP manifestó gran coincidencia con las ca-racterísticas fenotípicas y permitió nombrar co-rrectamente aquellas especies en las que hu-bo discrepancia por los métodos clásicos. •

29

L

Desarrollo de marcadores molecularesen cepas de Saccharomyces cerevisiaebasados en microsatélites

I. Martínez, F.J. Gallego,* M.A. Pérez y P. Hidalgo

Instituto Madrileño de Investigación Agraria y Alimentaria, Alcalá de Henares, Madrid* Departamento de Mejora Genética y Biotecnología, CIT-INIA, Madrid.

tener perfiles genéticos de cepas de S. cere-visiae. Éste incluye la localización de secuen-cias repetidas en la base de datos del DNAgenómico de S. cerevisiae, la búsqueda decebadores para amplificar mediante PCR al-guna de esas secuencias, la amplificacióncon los primeros elegidos y el análisis de lavariabilidad obtenida en las cepas.

Concretamente, la utilización del microsa-télite SCTAT1 localizado en el cromosoma XIIIha servido como marcador molecular paracaracterizar y diferenciar nueve cepas deS. cerevisiae en estudio. En ellas se han ob-servado cinco genotipos homocigotos con unsolo tamaño de alelo y cuatro heterocigotoscon dos alelos de distinto tamaño. El númerode secuencias TAT repetidas se situó entre18 y 45.

Consecuentemente, la utilización de mi-crosatélites amplificados mediante PCRconstituye una potente herramienta para ana-lizar el genoma de las levaduras de esta es-pecie. •

a caracterización e identificación rápida,precisa y poco laboriosa de cepas deSaccharomyces cerevisiae, especie de

notable importancia en el proceso de vinifica-ción, constituye en la actualidad un aspectorelevante cada vez más demandado por in-vestigadores del campo enológico y profesio-nales del moderno sector vitivinícola.

Con este fin, en los últimos años se handesarrollado diversos métodos entre los quese encuentran los fundamentados en el análi-sis del polimorfismo del DNA celular, como elanálisis de restricción del DNA genómico ymitocondrial (RFLP), cariotipos molecularespor electroforesis en campo pulsante y «hue-lla» genética del DNA.

La aplicación de modernas técnicas debiología molecular basadas en la reacción encadena de la polimerasa (PCR) para la tipifi-cación de levaduras vínicas han representa-do un gran avance en relación con las utiliza-das previamente.

En el presente trabajo de desarrolla unnuevo método rápido, sencillo y fiable para ob-

30

L

Separación y cuantificación por HPLCde lípidos liberados durante la autólisisde levaduras vínicas

A. Martínez-Rodríguez, B. Bartolomé, G. Santa-María,M.C. Polo y E. Pueyo

Instituto de Fermentaciones Industriales, CSIC, Madrid (ifip305@ifi.csic.es)

a autólisis de las levaduras que se produ-ce de forma espontánea en las elabora-ciones que conllevan un prolongado tiem-

po de envejecimiento con las levaduras, comoes el caso de los vinos espumosos elaboradospor el método champenoise y de los vinos surlie que se elaboran en algunas regiones fran-cesas, confiere a estos vinos unas caracterís-ticas peculiares que los diferencian de otros.

Entre los compuestos de las levadurasque se liberan al vino durante la autólisis seencuentran los lípidos. La escasez de méto-dos analíticos que permitan separar y cuanti-ficar de forma fiable esta compleja fracción,que se encuentra en el vino en concentracio-nes del orden de microgramos o a lo sumo demiligramos, ha hecho que hasta el momentoactual exista un gran desconocimiento sobreeste grupo de compuestos.

El objetivo de este trabajo es la puesta apunto de un método de análisis de lípidos porHPLC, así como el estudio de la liberación alvino de los lípidos de las levaduras. Debido aque la autólisis de las levaduras en el vinotarda varios meses en producirse o al menosen ser detectable analíticamente, se ha reali-zado una inducción de la autólisis en un me-dio vínico modelo. Los autolizados se han

extraído con cloroformo:metanol (2:1, v/v).Para la separación de las distintas familias delípidos, se ha adaptado a la separación de loslípidos presentes en las levaduras, el métodopropuesto por Christie y Urbin (J High ResolChromatogr 1995; 18: 97-100) que empleauna columna YMC PVA-Sil. La detección seha realizado con un detector de dispersión deluz. Se ha determinado la concentración deésteres de esterol, triacilgliceroles, esteroles,1,3-diacilgliceroles, ácidos grasos libres, 1,2-diacilgliceroles, 2-monoacilgliceroles y 1-mo-noacilgliceroles. Se ha comprobado que lascurvas de calibrado de los lípidos se ajustana un modelo polinomial de tercer grado, ob-teniéndose coeficientes de determinaciónmayores de 0,94 en todos los casos con unerror estándar de la predicción menor del 6 %para seis de las ocho clases de lípidos cuan-tificadas. La repetibilidad del proceso de ex-tracción (n = 3) medida por la desviaciónestándar relativa es del 3 al 7 %.

Se ha observado una liberación de lípidosen los primeros momentos de la autólisis yuna disminución posterior lo que podría indi-car la solubilización de enzimas procedentesde las levaduras que degradan a los lípidosliberados. •

31

L producción de acetato de etilo con las levadu-ras H. subpelliculosa, T. delbrueckii y K. mar-xianus y 24 horas para la de acetato de isoa-milo con K. apiculata, H. subpelliculosa yK. marxianus). La levadura típica fermentado-ra produjo mayores cantidades de acetato deisoamilo que el resto de las levaduras utiliza-das en los estadios finales de la fermentación.

La síntesis de acetatos llevada a cabo porlas esterasas sólo se mostró activa para lasíntesis de acetato de etilo. Esta actividad sedetectó en las primeras horas de fermenta-ción en K. apiculata, K. marxianus y P. mem-branaefaciens, mientras que en C. guillier-mondii y T. delbrueckii fue al final de la mis-ma. No hubo detección de esta actividad enH. subpelliculosa y S. cerevisiae raza cere-visiae.

En todas las levaduras utilizadas se obser-varon síntesis de acetato de etilo y acetato deisoamilo por el enzima AATasa, siendo suscinéticas distintas en cada levadura.

El acetato de etilo se acumuló en el mediodurante toda la fermentación excepto conK. marxianus donde disminuyó al final. La es-pecie más productora fue K. apiculata.

El acetato de isoamilo se acumuló en elmedio durante toda la fermentación conS. cerevisiae raza cerevisiae, C. guilliermondiiy P. membranaefaciens y descendió al finalde la misma con K. marxian us, H. subpellicu-losa y T. delbrueckii. •

Enzimas implicados en la biosíntesisde acetatos con diferenteslevaduras enológicas

M.C. Plata, M.C. Millán, E. Valero, J.C. Mauricio y J.M. Ortega

os acetatos, tales como el acetato deetilo y el acetato de isoamilo, son com-puestos importantes en el aroma del

vino. Estos ésteres son sintetizados por laslevaduras durante la fermentación a travésde dos enzimas, la alcohol acetiltransferasa(AATasa, EC 2.3.1.84) y las esterasas (EC3.1.1.1).

La sucesión de levaduras en una fermen-tación alcohólica de mosto de uva natural esun hecho comprobado. En este trabajo se haestudiado la contribución de diferentes leva-duras enológicas al aporte de este grupo desustancias en el aroma del vino. Las levadu-ras utilizadas fueron las que se encuentrannormalmente en la primera fase de fermenta-ciones industriales llevadas a cabo en la zonade DO Montilla-Moriles: Pichia membranaefaciens, Candida guilliermondii, Hansenulasubpelliculosa, Kluyveromyces marxianus,Kloeckera apiculata y Torulaspora delbrueckii.Como levadura típica fermentadora se utilizóSaccharomyces cerevisiae raza cerevisiae(E-1). Las experiencias se realizaron en unmosto sintético para eliminar el posible efectoque acarrean las diferentes vendimias en lacomposición del mosto.

Las levaduras de primera fase de fermen-tación produjeron mayor cantidad de estosacetatos en las primeras horas de desarrollodel proceso fermentativo (seis horas para la