JST医学部合同新技術説明会

心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したex vivoシステム

浜松医科大学第三内科循環器科

助教 早乙女雅夫

教授 林 秀晴

2011年11月18日

はじめに

1.わが国では高齢化社会が進み、慢性心不全の患者数も増え続けている。慢性心不全の再入院を減らし、医療費負担を軽減させるために、新しい心不全治療薬の開発が求められている。

2.慢性心不全における心筋細胞では、基質代謝の変化とインスリン抵抗性が病態を悪化させる増悪因子であることが知られている（Metabolic Vicious Cycle）。

3.慢性心不全のインスリン抵抗性を改善させる“代謝改善薬”の心不全治療に対する効果が期待されているが、まだ十分な研究はされていない。

はじめに

Metabolic Vicious Cycleとは？

？

心筋のインスリン抵抗性を抑制できれば悪循環を阻止できるはず！

はじめに

今回紹介する技術の特徴

1. 株化された心筋芽細胞を至適条件によって分化させ、より心筋細胞に近い細胞を作成した。

2. 心不全の際に起こる血中遊離脂肪酸の上昇を疑似した環境で培養することによって、心不全時のインスリン抵抗性心筋細胞を再現した。

3. 心不全時の心筋細胞の基質代謝・エネルギー代謝を簡易に評価するための実験系を提供する

4. 心不全に対する心筋代謝改善薬の効果を簡易にスクリーニングすることができる。

本技術の元になる研究業績（一部抜粋）

1. Saotome M, Hayashi H: Transient opening of mitochondrial permeability transition pore by reactive oxygen species protects myocardium from ischemia/reperfusion injury: Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2009.

2. Kawashima H, Saotome M, Hayashi H: Protein phosphatase inhibitor-1 augments a protein kinase A-dependent increase in the Ca2+ loading of the sarcoplasmic reticulum without changing its Ca2+ release: Circ J., 2009.

3. Odagiri K, Saotome M, Hayashi H: Local control of mitochondrial membrane potential, permeability transition pore and reactive oxygen species by calcium and calmodulin in rat ventricular myocytes: J Mol Cell Cardiol., 2009.

4. Saotome M, Hajnóczky G: Bidirectional Ca2+-dependent control of mitochondrial dynamics by the mitochondrial RhoGTPase, Miro: Proc Natl Acad Sci USA, 2008

5. Tominaga H, Saotome M, Hayashi H: Different Effects of Palmitoyl-L-carnitine and Palmitoyl-CoA on Mitochondrial Function in Rat Ventricular Myocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2008.

6. Hajnoczky G, Saotome M: Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis. Cell Calcium. 2006.

7. Saotome M, Hayashi H: Mitochondrial membrane potential modulates regulation of mitochondrial Ca2+ in rat ventricular myocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol, 2005.

POINT-1

「株化された心筋芽細胞を至適条件によって分化させ、より心筋細胞に近い細胞を作成した」

Differentiation of H9c2 cell

Replace with DMEM with 1% FBS

multi-nuclear cell

enlarged and elongated like tube.

Gorwth medium used in H9c2 cell :

● DMEM ( cell growth medium)

● 10%FBS (containing a number of growth factor )

Differentiated H9c2 cell

Produce proliferation and block differentiation

1%FBS ( low growth factor ) Proliferation << Differentiation (Lim et al, Mol Endocrinol. 2007 )

A

GLUT4

β actin

IRS1

0 3 5 7 10

B

C

Exp

ress

ion

of

GL

UT

4

(fold

in

crea

se)

day

Exp

ress

ion

of

IRS

1

(fold

in

crea

se)

0 3 5 7

day

10

* * *

*

0 3 5 7

day

10

* *

* *

Expression levels of Insulin Signaling Molecules

N N

N N

Insulin (-)

H9c2 cells

Differentiat

-ed myocytes

20μm

20μm

Insulin (-) Insulin (+)

GLUT4 translocation after insulin

Insulin-induced 2-DG uptake

in differentiated cells

[3H

]-2D

G u

pta

ke

(fo

ld

incr

ease

)

0 1 10

Insulin (nM)

100

** *

H9c2 myoblasts

Differentiated myocytes

筋原性蛋白（Myogenin, TroponinT）と

インスリンシグナル蛋白（insulin receptor, IRS1,

GLUT4）の発現が亢進していた

インスリン刺激によるGLUT4 translocationと2-DG 取り込みが明らかであった

Summary 1

分化したH9c2細胞は糖代謝の実験に適した

性質を持つようになった。

分化したH9c2細胞では

POINT-2

「心不全の際に起こる血中遊離脂肪酸の上昇を疑似した環境で培養することによって、心不全時のインスリン抵抗性心筋細胞を再現した。」

Palmitate loading protocol

0.2mM palmitate loading

(24 hr)

differentiation

Glucose uptake

IRS-1 &AKT phosphorylation

Assay

control

Day 0 Day3 - 4 Day 5

Assay

Glucose uptakes in palmitate-loaded cell

[3H

]-2D

G u

pta

ke

(fold

in

crea

se)

0 1 10 Insulin

(nM) 100

** *

CTL

PAL

Insulin (+)

Insulin (+)

Control Palmitate

Phosphorylation of IRS-1 and AKT

by insulin in palmitate-loaded cells

Insulin (-)

Insulin (-)

P-AKT (Ser473)

AKT

β-actin

P-IRS1 (Tyr1222)

IRS-1

Control Palmitate

Phosphorylation of IRS-1

in palmitate-loaded cells

Phospho-IRS1 (Ser636/639)

IRS1

β-actin

Summary 2

インスリン刺激による糖取り込が低下した

インスリン刺激によるIRS-1とAKTのリン酸化が抑制された

IRS-1-serineの過リン酸化が生じ、同レベル

でのシグナルの抑制が考えられた

パルミチン酸負荷によるEx vivoインスリン

抵抗性心筋細胞モデルが確立した

パルミチン酸負荷した細胞では

POINT-3

「心不全に対する心筋代謝改善薬の効果を簡易にスクリーニングすることができる」

Fig7

Phosphorylation of IRS-1 and AKT by insulin

Under Perhexiline treatement

Phospho-IRS-1

(Tyr1222)

IRS-1

0μM 0.1μM 1μM 2μM 5μM

0.2mM palmitate

Perhexiline (0.1～5μM ）

Phospho-AKT

(Ser473)

AKT

Glucose uptakes in perhexiline-treated cell

CTL PAL PAL+PHX

**

Insulin

(-) (+) (-) (+) (-) (+)

[3H

]-2D

G u

pta

ke

(fold

in

crea

se)

*

**P< 0.01 vs CTL

* P< 0.05 vs PAL

Summary 3

パルミチン酸によるインスリンシグナルの

リン酸化抑制が改善された

パルミチン酸による糖取り込み抑制が

改善された

Ex vivoインスリン抵抗性心筋細胞モデルは

心筋代謝改善薬の効果判定に有用である

Perhexilineを前投与した細胞では

Perhexilineはパルミチン酸による心筋インスリン抵抗性を改善した。

本成果は、心不全時の心筋細胞のインスリン抵抗性を再現したex vivoシステムを提供するものであり、心不全の創薬事業に役立つ可能性が高い。

用途利用分野： 心筋代謝改善薬のスクリーニング

想定企業 ： 心不全に対する創薬企業、

細胞分化システムの製造販売企業

共同研究、共同開発による事業化パートナーを募集。

企業への期待

本技術における知的財産権

発明名称： 心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したex vivo心筋細胞システム

出願番号： 特願2011-000458

出願人： 浜松医科大学

発明者： 早乙女 雅夫、 林 秀晴

お問い合わせ先： 阿部 紀里子 浜松医科大学 知財活用推進本部 産学官連携コーディネーター TEL：053-435-2677 FAX：053-435-2179 E-mail：sangaku@hama-med.ac.jp