Embed Size (px)
Citation preview
VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS
GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS
BIOCHEMIJOS KATEDRA
Julija Krupskytė
CINKO OKSIDO NANODALELIŲ POVEIKIS LĄSTELIŲ
GYVYBINGUMUI IR MITOCHONDRIJŲ FUNKCIJOMS
Bakalauro baigiamasis darbas
Biochemijos studijų programa, valstybinis kodas 612C73002
Molekulinė biologija, biofizika ir biochemija studijų kryptis
Vadovė: Doc. Dr. Rasa Žūkienė ____________ ___________ (Parašas) (Data)
Apginta: Prof. Dr. Saulius Mickevičius ____________ ___________ (Fakulteto/studijų instituto dekanas/ direktorius) (Parašas) (Data)
Kaunas, 2020
2
SANTRUMPOS
A549 - alveolinės adenokarcinomos ląstelių linija
BEAS-2B - bronchų epitelio ląstelių linija
BSA ‒ jaučio serumo albuminas (angl. bovine serum albumin)
CHO – kininio žiurkėnuko kiaušidžių ląstelių linija (angl. Chinese hamster ovary cells)
H1355- žmogaus plaučių karcinomos ląstelių linija
HiPSC- žmogaus pluripotentinių kamieninių ląstelių linija
HUVEC- žmogaus bambos venų epitelio ląstelių linija
JC-1 – 5,5`,6,6`-tetrachlor-1,1`,3,3`-tetraetilbenzimidazolo karbocianino jodidas
LSPR - lokalizuotas paviršiaus plazmonų rezonansas
MFS - mononuklidinės fagocitinės sistemos
MPT - membranos pralaidumo pereinamumas
MSN - mezoporinės silicio nanodalelės
ND - nanodalelės
PBS – fosfatu buferiuotas fiziologinis tirpalas (angl. phosphate buffered saline)
RKO - gaubtinės žarnos karcinomos ląstelių linija
ROS - aktyviosios deguonies formos (angl. reactive oxygen species)
SEM - skenuojančioji elektroninė mikroskopija
TEM - transmisijos elektroninė mikroskopija
3
TURINYS
SANTRUMPOS ................................................................................................................................. 2
SANTRAUKA .................................................................................................................................... 4
ABSTRACT ....................................................................................................................................... 5
ĮVADAS ....................................................................................................................................... 6
1. LITERATŪROS APŽVALGA ..................................................................................................... 8
1.1. Nanodalelės .............................................................................................................................. 8
1.2. Nanodalelių rūšys .................................................................................................................... 9
1.3. Cinko oksido nanodalelės ..................................................................................................... 13
1.4. Cinko oksido nanodalelių poveikis gyvoms sistemoms ir jų toksiškumas ....................... 16
1.5. Cinko oksido nanodalelių poveikis mitochondrijoms ....................................................... 20
2. METODAI IR MEDŽIAGOS .................................................................................................... 24
2.1. Medžiagos .............................................................................................................................. 24
2.2. Cinko oksido nanodalelių paruošimas ................................................................................ 24
2.2.1. Cinko oksido ND suspensijos paruošimas....................................................................... 24
2.2.2. Cinko oksido nanodalelių su baltymų vainiku (ZnO-BSA) suspensijos paruošimas ...... 24
2.3. Ląstelių auginimas ................................................................................................................ 24
2.4. Ląstelių gyvybingumo nustatymas naudojant MTT metodą ........................................... 25
2.5. Mitochondrijų membranos potencialo tyrimas, panaudojant lipofilinį katijoninį JC-1
dažą................................................................................................................................................25
2.6. Mitochondrijų kiekio nustatymas naudojant mitochondrijoms atrankų fluorescencinį
dažą MitoTracker® Green FM ................................................................................................... 27
2.7. Statistinė analizė ................................................................................................................... 27
3. REZULTATAI IR APTARIMAS .............................................................................................. 28
3.1. ZnO ir ZnO-BSA nanodalelių poveikis ląstelių gyvybingumui ........................................ 28
3.2. ZnO ir ZnO-BSA ND poveikis mitochondrijų membranos potencialui .......................... 29
3.3. ZnO ir ZnO-BSA ND poveikis mitochondrijų kiekiui CHO ląstelėse ............................. 31
4. IŠVADOS ..................................................................................................................................... 33
5. LITERATŪROS SĄRAŠAS ....................................................................................................... 34
4
SANTRAUKA
Bakalauro darbo autorius: Julija Krupskytė
Bakalauro darbo pavadinimas: Cinko oksido nanodalelių poveikis ląstelių gyvybingumui ir
mitochondrijų funkcijoms
Vadovas: Doc. Dr. Rasa Žūkienė
Darbas pristatytas: Vytauto Didžiojo Universitetas, Gamtos mokslų fakultetas, Kaunas, 2020 m.,
birželio 18d.
Puslapių skaičius: 38
Lentelių skaičius: 0
Paveikslų skaičius: 16
Priedų skaičius: 0
Šio darbo tikslas buvo įvertinti ZnO nanodalelių (ND) ir ZnO nanodalelių su BSA baltymų
vainiku (ZnO-BSA) poveikį ląstelių gyvybingumui ir mitochondrijų funkcijoms. Tyrimo metu buvo
nustatomi cinko oksido nanodalelių (d = 20 nm) ir cinko oksido nanodalelių, kurios buvo padengtos
jaučio serumo albumo baltymu (ZnO-BSA ND), poveikio mechanizmai kininio žiūrkėnuko
kiaušidžių (CHO) ląstelių linijai. Toksinis ZnO nanodalelių poveikis buvo vertinamas nustatant
ląstelių gyvybingumo pokyčius, naudojant MTT metodą. Mitochondrijų funkcijų pokyčiai buvo
nustatyti stebint JC-1 dažo sudaromų agregatų ir monomerų fluorescencijos santykį, taip pat, stebėti
mitochondrijų kiekio pokyčiai, kurie nustatyti naudojant MitoTracker Green dažą.
Atlikus tyrimus buvo nustatyta, kad:
ZnO ND mažina ląstelių gyvybingumą 4-23%, priklausomai nuo koncentracijos. Baltymų
vainikas mažina ZnO ND sukeltą citotoksiškumą 10-12%, esant 10, 25, 100 μg/ml ND koncentracijai.
ZnO ir ZnO-BSA ND 1-10 μg/ml koncentracijų ribose stimuliuoja, o 50-150 μg/ml
koncentracijų ribose nežymiai slopina mitochondrijų membranos potencialą. Pastebėta, kad 1, 10,
100 ir 150 μg/ml koncentracijų grupėse baltymų vainikas didina ND neigiamą poveikį mitochondrijų
membranos potencialui.
ZnO ir ZnO-BSA ND mažina mitochondrijų kiekį, inkubuojant 24 h, esant 20 μg/ml ND
koncentracijai. Baltymų vainikas sustiprina ZnO ND neigiamą poveikį.
5
ABSTRACT
Author of Bachelor Thesis: Julija Krupskytė
Full title of Bachelor Thesis: Effect of Zinc Oxide Nanoparticles on cell viability and mitochondrial
functions
Supervisor: Doc. Dr. Rasa Žūkienė
Presented at: Faculty of Natural Sciences, Vytautas Magnus University, Kaunas, June 18th, 2020.
Number of pages: 38
Number of tables: 0
Number of pictures: 16
Number of appendices: 0
The aim of this study was to estimate the effect of ZnO nanoparticles (ND) and ZnO
nanoparticles with BSA protein corona (ZnO-BSA) on cell viability and mitochondrial functions. The
study investigated the mechanisms of action of zinc oxide nanoparticles (d = 20 nm) and zinc oxide
nanoparticles coated with bovine serum albumin protein (ZnO-BSA ND) on the Chinese hamster
ovary (CHO) cell line. The toxic effects of ZnO nanoparticles were assessed by detecting changes in
cell viability using the MTT assay. Changes in mitochondrial function were determined by
monitoring the fluorescence ratio of aggregates to monomers formed by the JC-1 dye, also, changes
in mitochondrial mass observed using the MitoTracker Green dye.
Studies have shown that:
ZnO ND reduces cell viability by 4-23%, depending on the concentration. The protein
corona reduces ZnO ND induced cytotoxicity by 10–12% at 10, 25, 100 μg /ml concentrations of NP.
ZnO and ZnO-BSA NP in the concentration range of 1-10 μg /ml stimulate and slightly
inhibit the mitochondrial membrane potential in the concentration range of 50-150 μg /ml. In the 1,
10, 100, and 150 μg /ml concentration groups, the protein corona was observed to increase the
negative effect of NP on mitochondrial membrane potential.
ZnO and ZnO-BSA NP reduce mitochondrial mass by incubating cells for 24 h with 20 μg
/ml concentration NP. The protein corona enhances the negative effects of ZnO NP.
6
ĮVADAS
Bėgant laikui žmonių požiūris į mokslą sparčiai keičiasi ir plečiasi: atrandama daug įvairių
naujų mokslo sričių, tobulinamos jau žinomos sritys. Taip atsirado ir nanotechnologijos mokslas,
kuris kaip mokslinių tyrimų sritis yra žinomas jau nuo praėjusio amžiaus. Šių laikų visuomenėje
nanotechnologijos yra plačiai tyrinėjamos, o dėka šio mokslo pagrindinio objekto – nanodalelių -
unikalių funkcijų, atliekant įvairius biologinius tyrimus ieškoma ir atrasta daug įvairių sričių, kur jos
gali būti panaudojamos, pavyzdžiui, biologinių procesų ląstelėje vaizdinimui, įvairioms terapijoms,
vaistų transportui, vėžio terapijoje, kosmetikos gamyboje ir pan.
Cinko oksido nanodalelės JAV maisto ir vaistų administracijos (FDA) yra pripažinta kaip
GRAS, saugi medžiaga (Ekielski, 2018). Tačiau atsirandant vis daugiau įvairių duomenų apie ZnO
ND sukeliamą citotoksinį poveikį, pavyzdžiui, žinios apie į kvėpavimo takus patekusių nanodalelių
toksiškumą organizmui, kuris priklauso nuo dalelių formos ir dydžio, pastūmėjo mokslininkus tirti
galimus šių dalelių pavojus. Svarbu suprasti ZnO ND sąveikos su kraujo plazmos baltymais būdą,
baltymų vainiko poveikį ZnO nanodalelių sukeliamam toksiškumui, toksiškumo mechanizmus ir
galimus jų mažinimo būdus.
Nanodalelei patekus į fiziologinę aplinką šios paviršius yra padengiamas baltymų sluoksniu,
kuris sudaro baltymų vainiką (BSA). Ši struktūra pakeičia nanodalelės dydį, agregacijos būseną.
Baltymai gali būti naudojami kaip taikiniai, kuriuos atpažįsta ląstelė bei kai kuriais atvejais gali
pakeisti atsaką į ND toksišką poveikį. Baltymų vainiko sąvoka yra svarbi norint suprasti nanodalelių
dinamines paviršiaus savybes biologinėje aplinkoje. Baltymų vainikui susidarius, baltymai silpnai
jungiasi su nanodalele skirtingomis jėgomis: van der Valso, vandenilio ryšio, hidrofobiniu ir kt.
(Žukiene ir Snitka, 2015).
Šiuo metu atlikti tyrimai rodo, kad nanodalelės gali turėti neigiamą poveikį įvairiems
organams, pavyzdžiui, įkvepiant nanodaleles šios gali pakenkti žmogaus plaučiams, taip pat, gali
neigiamai veikti ląstelėje esančių mitochondrijų atliekamas funkcijas, naudojant jas kaip taikinį
ląstelėje, taip sutrikdant medžiagų apykaitą, bei sukeliant apoptozę ar net ląstelės mirtį.
Šiame darbe tirtas ZnO nanodalelių poveikis CHO ląstelių linijos gyvybingumui ir
mitochondrijų funkcijoms, naudojant 20 nm ND, ir siekiant nustatyti, kaip šios pažeidžia arba
nepažeidžia minėtas ląstelės vietas. Taip pat, tirtas ZnO-BSA poveikis citotoksiškumui, žinant, kad
ši struktūra pakeičia nanodalelės poveikio mechanizmus bei patekimą į ląstelę.
7
Darbo tikslas:
Įvertinti ZnO nanodalelių ir ZnO nanodalelių su BSA baltymų vainiku (ZnO-BSA) poveikį
ląstelių gyvybingumui ir mitochondrijų funkcijoms.
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti ZnO ir ZnO-BSA nanodalelių poveikį CHO ląstelių gyvybingumui.
2. Palyginti ZnO ir ZnO-BSA nanodalelių poveikį CHO ląstelių mitochondrijų membranos
potencialui.
3. Nustatyti ZnO ir ZnO-BSA ND poveikį mitochondrijų kiekiui CHO ląstelėse.
8
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Nanodalelės
Nanotechnologijos kaip mokslinių tyrimų sritis yra žinoma jau nuo praėjusio amžiaus, jas
1959 m. pristatė Nobelio premijos laureatas Richardas. P Feynmanas (Khan ir kt., 2017). Nuo to laiko
nanotechnologijų srityje įvyko didelė pažanga.
Nanodalelės (ND) – tai pavienės 1-100 nm skersmens dalelės, sudarančios nanomedžiagas.
Šios dalelės yra įvairių tipų, jų sudėtyje yra kietųjų dalelių, kurių bent vienas matmuo yra mažesnis
nei 10 nm. Šios medžiagos gali būti įvairių dydžių, formų, skirtingos sudėties, tam, kad būtų galima
jas naudoti bei taikyti įvairiose biologijos, biomedicinos srityse. ND gali būti klasifikuojamos pagal
jų kilmę į natūralias ir žmogaus sukurtas nanodalelės. Natūralios ND egzistuoja pasaulyje jau
milijardus metų, jų yra žemės atmosferoje, dirvožemyje ar vandenynuose, taip pat gyvuose
organizmuose (Smita ir kt., 2012). Gyvuosiuose organizmuose ND gali būti naudojamos diagnostikai
ir terapijai.
Priklausomai nuo dalelių bendros formos, jos gali būti 0D, 1D, 2D arba 3D. Šių medžiagų
svarba buvo įvertinta, kai tyrėjai nustatė, kad jų dydis gali turėti įtakos cheminėms ir fizikinėms
medžiagos savybėms, pvz., optinėms savybėms. 20 nm aukso (Au), platinos (Pt), sidabro (Ag) ir
paladžio (Pd) nanodalelės yra atitinkamai raudonos, gelsvai pilkos, juodos ir tamsiai juodos spalvos.
Visos šios skirtingos spalvos parodo, jog dalelės labai skiriasi nuo minėtų metalų spalvos
makroformoje (Khan, Saeed, ir Khan, 2017).
Nanodalelės dėka savo struktūros pasižymi unikalia sudėtimi bei atlieka unikalias funkcijas,
dėl kurių ND galima labai įvairiai panaudoti biomedicinos srityje. Pavyzdžiui, ND gali būti
naudojamos biologinių procesų ląstelėje vaizdinimui (Wang ir Wang, 2014). Mažesnės nei 50 nm
dydžio nanodalelės į ląstelę patenka endocitozės būdu, po patekimo gali sąveikauti su ląstelės
receptoriais, transkripcijos veiksniais ir kitomis molekulėmis (Xu ir kt., 2004). Terapijos tikslams
nanodalelės gali būti įvairiai modifikuojamos, prie jų paviršiaus prijungiant specifines molekules,
nukreipiančias daleles į pasirinktą taikinį ląstelėje. Į ND darinių ertmę galima įkapsuliuoti vaistus ir
įvairius žymenis, kurie būtų selektyviai išleidžiami pasirinktoje vietoje. Kadangi patekusios į
organizmą ND nesukelia imuninio atsako, jų nesuardo fermentai, vaistai efektyviau pristatomi į
ląsteles – taikinius (Hasnain ir kt., 2013).
Dirbtinės nanodalelės naudojamos įvairiose srityse: elektrotechnikoje, energijos ir
informacijos saugojime, kosmetikoje, biologijoje, medicinoje, gali būti gaminamos metalo, metalų
oksidų, keramikos, polimerų, silicio, taip pat dendritų ar liposomų pagrindu (Xu ir kt., 2004).
9
1.2. Nanodalelių rūšys
Nanodalelės yra skirstomos į įvairias kategorijas, atsižvelgiant į jų morfologiją, chemines
savybes bei dydį. Toliau pateikiamas nanodalelių skirstymas pagal medžiagas, iš kurių jos yra
pagamintos.
Anglies nanodalelių pagrindinės jų sudėtyje esančios grupės yra fulerenai ir anglies
nanovamzdeliai. Fulereno sudėtyje yra nanomedžiagų, kurios yra pagamintos iš tuščiavidurių narvų,
pvz., alotropinių anglies atmainų. Dėl savo elektrinio laidumo, didelio stiprumo, elektronų afiniteto,
universalumo bei struktūros šios grupės nanodalelės sukėlė didelį mokslininkų susidomėjimą (Khan,
Saeed, ir Khan, 2017). Šios struktūros sudarytos iš penkiakampiais ir šešiakampiais išsidėsčiusių
anglies atomų, o kiekviena anglis yra sp2 hibridizacijos. 1.1 paveiksle yra pavaizduoti gerai žinomi
fulerenai, kurie susideda iš 60 ir 70 anglies atomų, jų skersmuo atitinkamai yra 7,144 (1.1 pav. A) ir
7,648 nm (1.1 pav. B).
1.1 pav. C60 fulerenas (A) ir C70 fulerenas (B) (Khan ir kt., 2017)
Anglies nanovamzeliai, yra 1-2 nm skersmens. Dėl savo unikalių fizikinių, cheminių ir
mechaninių savybių, šios medžiagos yra naudojamos kaip efektyvūs dujų absorbentai aplinkos
apsaugai ir kaip pagalbinė priemonė neorganiniams ir organiniams katalizatoriams (Khan ir kt.,
2017).
Liposomos tai nanodalelės, kurios yra sudarytos iš vandeninės terpės vidinės dalies,
apgaubtos lipidų dvisluoksniu (Wang ir Wang, 2014). Liposomos yra unikalios dėl jų įvairios
sudėties, gebėjimo pernešti ir apsaugoti daugumos rūšių biomolekules. Tokių junginių sintezei yra
naudojamos amfifilinės molekulės, kurios yra panašios į biologines membranas, dėl to šios
10
nanodalelės yra naudojamos įvairių vaistų efektyvumo ir saugumo gerinimui (Olusanya ir kt., 2018).
Liposomų dydis gali varijuoti nuo labai mažų (25 nm) iki didelių (2,5 μm) pūslelių. Taip pat,
liposomos gali turėti viengubą arba dvigubą membraną. Kriterijus, skirtas liposomų cirkuliacijos
pusinės eliminacijos periodui nustatyti, yra vezikulų dydis, o abiejų sluoksnių storis bei skaičius
įtakoja vaistų kapsulių kiekį liposomose (Akbarzadeh ir kt., 2013). Aktyvusis komponentas tokiuose
dariniuose būna vidinėje vandeninėje terpėje, jei yra tirpus vandenyje, arba lipidinėje membranoje,
jei yra tirpus lipiduose. Liposomos yra pajėgios nukreipti hidrofobinius ir amfifilinius vaistus.
Hidrofobiniai vaistai yra lipidų sluoksnyje, kai tuo tarpu hidrofiliniai vaistai patenka į vandeninę fazę,
dėl šių savybių galima plačiau rinktis vaistinius preparatus (Bei, Meng, ir Youan, 2010). Liposomų
sandaros schema pateikta 1.2 paveiksle:
1.2 pav. Liposomos struktūra (adaptuota pagal Bei, Meng, ir Youan, 2010)
Polimerinės nanodalelės gali būti suskirstytos į dvi pagrindines šeimas: nanosferas,
pasižyminčias homogenine struktūra visoje dalelėje ir nanokapsules, kurios turi tipišką šerdies-
apvalkalo struktūrą (Viswanathan, Muralidaran, ir Ragavan, 2017).
Nanosferos tai sferinės dalelės, kurių skersmuo svyruoja nuo 10 nm iki 200 nm. Šios dalelės
gali būti amorfinės arba kristalinės, jos sugeba apsaugoti vaistą nuo fermentinės ir cheminės
degradacijos. Šių dalelių privalumas yra toks, kad jų veiklioji medžiaga yra nukreipiama tiesiai į
organus, tačiau turi ir trūkumų - hidrofobinis paviršius yra labai jautrus opsonizacijos procesui, ribota
vaistų kiekio talpa (Viswanathan, Muralidaran, ir Ragavan, 2017). Nanosferos yra vientisos, kietos
sferinės nanodalelės, plačiai tiriamos kaip vaistų nešikliai. Aktyviosios medžiagos paprastai
pasiskirsto tolygiai visoje polimerinėje šerdyje, o kapsulinis vaistas išskiriamas į aplinką difuzijos
11
būdu. Be to, kai kurie vaistai gali būti adsorbuojami ant jų paviršiaus. Šios medžiagos reguliuoja
vaistų perdavimą ir padidina blogai tirpstančių vaistų tirpumą, nes jos turi galimybę prisijungti
hidrofobinius vaistus. Vaistų įkrovimo efektyvumas ir nanosferos dydis yra svarbiausi veiksniai,
turintys įtakos vaistų išsiskyrimui. Vaistų išsiskyrimo metu vyksta įvairūs procesai: polimerinės
matricos išsiplėtimas, hidratacijos, erozijos, polimerų jungčių skilimo, fermentinio skilimo arba
hidrolizės ir fiziškai įpainioto vaisto difuzija (García, 2018). Nanosferos struktūra pateikta 1.3
paveiksle:
1.3 pav. Nanosferos struktūra (adaptuot pagal Viswanathan, Muralidaran, ir Ragavan,
2017).
Nanokapsulės dėl savo mikrodydžio gali būti naudojamos pernešti išgertus vaistus, kurių
sudėtyje yra peptidų ir baltymų, fermentų, organinių arba neorganinių katalizatorių, aliejų, paviršiaus
polimerų, neorganinių mikrodalelių ir nanodalelių arba net biologinių ląstelių. Tačiau jie yra apriboti
epitelio ir virškinimo fermentų skaidymo (Viswanathan, Muralidaran, ir Ragavan, 2017).
Nanokapsulės susideda iš skysto / kieto branduolio, kuriame vaistas, genas, baltymas bei kitos
medžiagos yra įtrauktos į vidinę ertmę, kurią supa išskirtinė polimerinė membrana. Vaistų pernešimo
sistemoje jų įkapsuliavimas į nanoskalių apvalkalą yra vienas iš būdų, apsaugančių vaistus nuo
degradacijos ir greito metabolizmo per įkapsuliavimo laiką ir taip pat apsaugant kūną nuo toksiškų
vaistų (Baghaban-Eslaminejad ir kt., 2017). Nanokapsulės struktūra pateikiama 1.4 paveiksle:
1.4 pav. Nanokapsulės struktūra. (adaptuota pagal Viswanathan, Muralidaran, ir Ragavan,
2017).
12
Dažniausiai naudojami sintetiniai polimerai yra polilaktidai, polilaktidai-poliglikolidai,
polikaprolaktonai ir poliakrilatai (Pund ir Joshi, 2017). Polimerinės nanodalelės yra naudojamos kaip
vaistus pernešančios sistemos (Krishnaswamy ir Orsat, 2017). Taip pat, yra perspektyvios priemonės
priešvėžiniam gydymui ir kaip priešnuodis skirtas neutralizuoti pavojingų toksinų sisteminį
toksiškumą žmonių sveikatai (Battig ir Wang, 2014).
Metalų nanodalelės yra sudarytos iš metalų. Metalų nanodalelių dydžių ir formos kontrolė
yra svarbi šiuolaikinėms medžiagoms. Metalų nanodaleles ir nanostruktūrizuotas metalų plėves
sužadinus elektromagnetinė spinduliuote, šios pasižymi kolektyvinėmis laidumo juostos elektronų
osciliacijomis– lokalizuotu paviršiaus plazmonų rezonansu (localized surface plasmon resonance –
LSPR), kuris suteikia šioms medžiagoms įdomių ir įvairiai pritaikomų savybių. Viena iš paviršiaus
plazmonų nulemtų savybių – laikyti optinę energiją sukoncentruotą nanoskalėje ir elektromagnetinio
lauko sustiprinimas šalia metalo nanodalelių, atvėrė galimybes manipuliuoti įvairių medžiagų
optinėmis savybėmis (Sorokin ir kt., 2014). Iš aukso pagamintų ND danga yra plačiai naudojama
skenuojančios elektronų mikroskopijos (SEM) mėginių analizei, siekiant pagerinti elektronų srautą,
kuris padeda išgauti aukštos kokybės SEM vaizdus (Khan ir kt., 2017).
Keramikines nanodaleles dažniausiai sudaro oksidai, karbidai, fosfatai ir karbonatai, savo
sudėtyje turintys metalų ir metaloidų, pvz., kalcio, titano silicio ir t.t. Šios dalelės gali plačiai
prisitaikyti dėl daugelio savybių, pvz., didelio atsparumo karščiui ir cheminės inercijos. Iš visų
keramikinių nanodalelių taikymo sričių labiausiai ištirta yra biomedicinos sritis. Šioje srityje
nanodalelės yra laikomos puikiais vaistų, genų, baltymų nešikliais. Kad dalelė galėtų veikti kaip gera
vaistų tiekimo agentė, reikia ją kontroliuoti ir parinkti pagal tam tikras jos savybes, pavyzdžiui,
dalelės dydį, poringumą, paviršiaus plotą, tūrio santykį ir kt. Svarbiausias vaidmuo siekiant pritaikyti
šias savybes tenka paruošimo metodui ir geram kintamųjų procesų valdymui. Pasirinkus tinkamą
nanodalelių paruošimo būdą, kartu įnešant didelį vaisto kiekį, atsiranda veiksmingų vaisto įvedimo į
dalelę ar ląstelę sistemų, kurios vėliau yra tiriamos. Keramikinės nanodalelės sėkmingai yra
naudojamos kaip vaistų nešikliai įvairioms ligoms gydyti, tokioms kaip bakterinės infekcijos,
glaukoma ir kt., plačiausiai yra naudojamos vėžio gydymui (Thomas ir kt., 2015).
Nanodalelių forma. Nanodalelės gali būti įvairių formų (1.5 pav), tokių kaip pluoštinės,
žiedinės, vamzdelio formos, sferinės ir plokščios. Nuo formos priklausantis toksiškumas yra
nustatytas milijonams nanodalelių, įskaitant anglies, silicio dioksido, nikelio, aukso ir titano
nanodaleles. Iš esmės, nuo formos priklausomas nanotoksiškumas įtakoja membraną in vivo
endocitozės ir fagocitozės metu. Sferinių nanodalelių endocitozės procesas vyksta lengviau ir
greičiau, nei lazdelių formos ar pluoštinių nanodalelių ir svarbiausia yra tai, jog sferinės ND yra
santykinai mažiau toksiškos nepriklausomai nuo to, ar jos yra homogeninės ar heterogeninės.
Nesferinės nanodalelės yra labiau prisitaikiusios pereiti pro kapiliarus, taip sukeldamos įvairias
13
biologines pasekmes. Tyrimai parodė, jog vienasieniai anglies nanovamzdeliai (single-walled carbon
nanotubes) gali užblokuoti K+ jonų kanalus du ar tris kartus efektyviau, nei sferiniai anglies fulerenai.
Nuo formos priklausantis silicio dioksido alotropinių atmainų toksiškumas yra akivaizdus
atsižvelgiant į tai, jog amorfinis silicio dioksidas yra naudojamas kaip maisto priedas, kai tuo tarpu
kristališkas silicio dioksidas yra žmogaus kancerogenas. Taip pat įrodyta, jog aukso nanolazdelių
įsisavinimas yra lėtesnis procesas, nei nanosferų (Gatoo ir kt., 2014).
1.5 pav. Įvairios nanodalelių formos. (a- sferinės, b- stačiakampio formos diskai, c-
lazdelės, d- siūlo formos, e- suplotos elipsės, f- elipsiniai diskai, g- lėkštelės formos, h- apvalūs diskai
(adaptuota pagal Champion, Katare, ir Mitragotri, 2007).
Nanodalelių kristalinė struktūra. Nuo kristalinės ND struktūros priklauso jų toksiškumas.
Buvo nustatyta, kad rutilo (TiO2) nanodalelės, kurių struktūra yra tetragono formos, sukelia
oksidacinę DNR pažaidą, lipidų peroksidaciją ir mažų branduolių susidarymą nesant šviesos šaltiniui,
tačiau tokio pat dydžio ir cheminės sudėties, kaip ir TiO2 kristalo formos, anatazės kristalinės
struktūros nanodalelės tokio poveikio neturėjo (Gatoo ir kt., 2014).
Nanodalelės gali keisti savo kristalinę struktūrą po sąveikos su vandeniu ar kita dispersine
terpe. Cinko sulfido nanodalelės būdamos vandenyje pertvarko savo kristalinę struktūrą ir tampa
storesnėmis (Gatoo ir kt., 2014).
1.3. Cinko oksido nanodalelės
Cinkas yra vienas iš pagrindinių žmogaus organizmo mikroelementų, be kurio daugelis
fermentų, pvz., karboanhidrazės, karboksipeptidazės ir alkoholio dehidrogenazės tampa
neaktyviomis. Eukariotams šis elementas yra būtinas, nes jis reguliuoja daugelį fiziologinių funkcijų.
Žmogaus organizme yra apie 2-3 g cinko, o rekomenduojama cinko paros dozė yra 10-15 mg (Siddiqi
ir kt., 2018). Cinko oksidas yra n tipo puslaidininkis su plačia, tiesiogine 3,37 eV draustine juosta ir
14
60 eV eksitono prisijungimo energija. Tokios savybės suteikia galimybę gaminti fotodetektorius,
saulės baterijas, dujų jutiklius, pjezoelektrinius įrenginius, kremus nuo saulės (Zhang ir kt., 2013).
Cinko oksido nanodalelės - tai neorganinės, vandenyje netirpios dalelės. ZnO nanodalelės
dėl savo didelio paviršiaus ploto ir katalizinio aktyvumo gali būti naudojamos reakcijų katalizei.
Cinko oksidas pasižymi skirtingomis cheminėmis ir fizikinėmis savybėmis, priklausomai nuo
nanodalelių morfologijos, todėl atsižvelgiant ir į šias nanodalelių savybes yra naudojami įvairūs
metodai nanostruktūroms sukurti: hidroterminis, cheminis garinimas, terminis skilimas ir kt. (Kumar
ir kt., 2013). Priklausomai nuo taikomos sintezės metodo, galima gauti įvairias ND: nanolazdeles,
nanolėkšteles, nanosferas, nanodėžutes, šešiakampes, trikojes, tetrapodus, nanovirveles,
nanovamzdelius, nanožiedus ir nanonarvelius (Siddiqi ir kt., 2018).
ZnO nanodalelės gali būti naudojamos vaistų gamybai, kaip antimikrobiniai agentai,
konservantai. Jos lengvai patenka į maisto medžiagas, naikina mikrobus, taip apsaugodamos žmogų
nuo įvairių ligų sukėlėjų (Siddiqi ir kt., 2018).
Cinko oksido kristališkumas. Cinko oksidas turi tris kristalines formas: vurcito, sfalerito ir
akmens druskos. Šešiakampis vurcitas yra grotelių formos, tarp kurių tarpai yra: a= 0,352 nm ir c=
0,521 nm, santykis yra lygus c
a~ 1,6 , kuris yra labai arti idealios šešiakampės gardelės vertės, ji lygi
c
a= 1,633. Kiekvienas Zn atomas yra apsuptas keturių deguonies atomų, ši struktūra yra
termodinamiškai stabili ją supančioje aplinkoje. Sfalerito struktūra yra metastabili ir gali būti
stabilizuojama naudojant augimo metodus. Cinko oksido kristalinės struktūros yra pateikiamos 1.6
paveiksle, juodos ir pilkos figūros atitinkamai vaizduoja deguonies ir cinko atomus (Sirelkhatim ir
kt., 2015).
1.6 pav. Cinko oksido kristalinės struktūros (adaptuota pagal Sirelkhatim ir kt., 2015).
Cinko oksido nanodalelių taikymas vaistų pernašai. Vaistų nešikliai, tokie kaip Fe3O4
nanodalelės, anglies nanovamzdeliai, mezoporinės silicio nanodalelės (MSN) ir polimeriniai
15
nanokaroliukai gali patekti į ląsteles pro viduląstelinius endocitinius kelius ir efektyviai pernešti
vaistus į nurodytą vietą, ypatingai kai vaistai savaime negali būti pasisavinami ląstelių.
Mokslininkai sukūrė naują vaistų pernašos sistemą, kai doksorubicinas (DOX) buvo
pernešamas į Hela ląsteles in vivo. Ši sistema susidėjo iš MSN, porose turinčių DOX ir ZnO kvantinių
taškų, kurie buvo naudojami kaip dangteliai, uždengiantys poras. Cinko oksido kvantiniai taškai yra
stabilūs, kai pH yra apie 7, bet greitai tirpsta, kai pH yra mažesnis už 6. ZnO savaime nėra toksiškas,
bet po ND disociacijos Zn2+ jonai yra citotoksiški. Be to, cinko oksido kvantinių taškų fluorescencija
gali būti naudojama vaistų pernešimo proceso vaizdinimui. SEM ir transmisijos elektroninės
mikroskopijos (TEM) rezultatuose matome, jog MSN poras dengiantis cinko oksidas gali būti
pašalinamas naudojant buferį, kurio pH yra lygus 5. Sistemos struktūros schema ir pernešimo
procesas yra pavaizduoti 1.7 paveiksle:
1.7 pav. MSN padengtos cinko nanodangteliais. SEM (A) ir TEM (C), SEM (B) ir TEM
(D) kai pH 5. E- schema, vaizduojanti DOX patekimą į ląstelę (adaptuota pagal H.-M. Xiong, 2013).
Siekiant išgauti tokią vaistų pernešimo sistemą, pirmiausia karboksilinės grupės buvo
pritvirtintos prie MSN išorinio paviršiaus, tuomet vidiniai MSN kanalai iš dalies buvo
funkcionalizuojami naudojant amino grupes, o cinko oksido kvantinių taškų nanodalelės buvo
pakeistos aminopropilo grupėmis. Kadangi DOX molekulės yra katijoninės ir cinko oksido kvantiniai
taškai ant savo paviršiaus turi katijonines grupes, jie sėkmingai yra adsorbuojami anijoninių MSN.
Šie junginiai yra labai stabilus buferiniuose tirpaluose kurių pH 7,4, todėl nėra atpalaiduojami iš
MSN. Tačiau, kai ZnO-MSN-DOX mėginys yra suspenduojamas buferyje, kurio pH yra 5, daugiau
nei 30 % adsorbuoto DOX yra išlaisvinama iš vamzdelių per 5 h. Rūgtinėje lizosomų terpėje (pH ≈
4,5 – 5,0), cinko oksido nanodangteliai yra suskaidomi ir DOX molekulės yra išleidžiamos iš MSN
16
tam, kad sunaikintų Hela ląsteles. Reikia paminėti, kad nors ir MSN yra stabilūs vaistų pernašos metu
ir yra biologiškai suderinami su ląstelėmis kultūroje, jo degradacija ir poveikis gyvūnų organizme
kelia daug diskusijų.
Nustatyta, jog Zn2+ jonų susidarymas gali sukelti keletą žalingų efektų, pvz., lizosomų žūtį
t.y įvyksta ląstelės nekrozė, mitochrondrijų funkcijų sutrikdymą ir padidintą ROS gamybą. Specialaus
paruošimo neturinčios ZnO nanodalelės yra citotoksiškos. Tačiau, jei šios nanodalelės yra
padengiamos apsaugančiais gaubtais, jos yra labai stabilios buferyje, kurio pH 7,4 ir ląstelių
kultūrose. ZnO kvantiniai taškai gali būti absorbuojamas ant vaistų ar biomolekulių paviršiaus arba
gali būti naudojami kaip dangteliai. Taip vaistai ir biomolekulės saugiai yra pernešami cinko oksido
nanodalelių atlikti savo užduotį (Xiong, 2013).
1.4. Cinko oksido nanodalelių poveikis gyvoms sistemoms ir jų toksiškumas
Cinko perteklius gali būti labai kenksmingas sukeldamas netinkamą baltymų
funkcionavimą, DNR struktūros pažeidimus, pakenkti augalų dygimo procesui. Šis elementas yra vis
dažniau naudojamas nanodalelių pavidalu šiuo būdu cinko poveikis yra sustiprinamas. Nors ir minėta,
jog nanodalelės gali būti naudojamos vaistų pernašai gyvose sistemose, taip gydant įvairias ligas,
pvz., bakterines infekcijas, vėžį, tačiau šios dalelės organizmams sukelia ir neigiamą poveikį. Toliau
yra aptariamas cinko oksido poveikis įvairioms gyvoms sistemoms, ypatingą dėmesį skiriant ZnO
ND toksiškumui (Mielcarz-Skalska ir Smolińska, 2017).
Poveikis ląstelėms. Cinko oksido ND pasižymi dideliu toksiškumu ląstelėms. Setyawati ir jo
kolegos atliko tyrimą, kuriame buvo naudojamos ZnO, SiO2 ir TiO2 nanodalelės. Buvo tirtas šių
dalelių poveikis žarnyno ląstelėms. Po tyrimo nustatyta, jog labiausiai joms toksiškos buvo ZnO ND.
Jos sukėlė šioms ląstelėms oksidacinį stresą, uždegimą, pažeidė DNR ir sutrikdė ląstelės ciklą, kuris
sukėlė ląstelės žūtį (Setyawati, Tay, ir Leong, 2015). Mokslininkai Prajitha, Athira ir Mohanan tyrė
ZnO ND poveikį CHO ląstelių linijai jas inkubuojant 3, 6 ir 24 val (1.8 pav). Veikiant CHO ląsteles
skirtingomis ZnO ND suspensijos koncentracijomis pastebėta, jog gyvybingumas mažėja,
priklausomai nuo ND koncentracijos 50-100 μg/ml ribose (Prajitha, Athira ir Mohanan, 2019).
17
1.8 pav. CHO ląstelių gyvybingumas po inkubacijos ZnO ND 3, 6 ir 24 valandas
(adaptuota pagal Prajitha, Athira ir Mohanan, 2019).
ROS gamyba sukelia oksidacinę DNR pažaidą ir oksidacinį stresą. In vitro tyrimai Comet
metodu parodė, jog ZnO ND gali sukelti oksidacinę DNR pažaidą ir genotoksiškumą, žmogaus
limfoblastoidinėse ląstelėse. Kiti tyrimai naudojant žinduolių ląstelių kultūras taip pat parodė, jog
cinko oksido nanodalelės gali kelti genotoksiškumo pavojų (Ng ir kt., 2017).
Nustatyta, jog tai kaip nanodalelės reaguoja su ląstelėmis priklauso nuo ND fizikinių ir
cheminių savybių. Dalelių dydis gali lemti jų toksiškumą. Mažesnės nanodalelės turi didesnį
paviršiaus plotą, taigi, didesnis paviršiaus plotas suteikia galimybę sąveikauti su ląstelių
komponentais, tokiais kaip nukleino rūgštys, baltymai, riebalų rūgštys bei angliavandeniai. Mažesnis
ND dydis leidžia joms lengvai patekti į ląstelę, tačiau tokiu būdu ją pažeidžia.
Dalelių forma taip pat gali sukelti toksišką poveikį. Buvo atliktas tyrimas su pelėmis,
kuriame pastebėta, jog lazdelės formos Fe2O3 nanodalelės sukelia daugiau toksiniu reakcijų, nei
sferinės formos Fe2O3 nanodalelės pelių makrofagų ląstelių linijoje. Naudojant didesnį kiekį laktato
dehidrogenazės, yra sukeliamas uždegiminis atsakas, ROS gamyba ir įvyksta ląstelės nekrozė
(Huang, Cambre, ir Lee, 2017). ND patekusios į ląstelę endocitozės būdu gali patekti į mitochondrijas
bei jose skatinti aktyviųjų deguonies formų gamybą. Nustatyta, kad limfocituose padidėjęs ROS
kiekis tiesiogiai priklauso nuo ZnO koncentracijos. Nuo šios koncentracijos taip pat priklauso DNR
pažaidų kiekis, dėl savo mažo dydžio ND pereina pro ląstelės branduolio membraną, kur toliau
sąveikauja su DNR, skatindamos chromatino fragmentaciją, inicijuodamos ląstelės apoptozę (Aula ir
kt., 2014).
Poveikis baltymams. Baltymai supantys ND yra vadinami „baltymų vainiku“ (protein
corrona). Daugybė atliktų tyrimų parodė, jog baltymų vainikas suteikia ND unikalias biologines
savybes. Įdomu yra tai, jog vainiko sudėtį praturtinantys opsoniniai baltymai (pvz., IgG komplemento
faktoriai ir fibrinogenas) sukelia fagocitozę sąveikaudami su imuninėmis efektorinėmis ląstelėmis
18
arba yra įsisavinami makrofagų in vivo. Literatūroje akcentuojama, jog 95% sintetinių ND užstringa
filtraciją atliekančiuose organuose, tokiuose kaip kepenys, inkstai, blužnis ir plaučiai,
mononuklearidinės fagocitinės sistemos (MFS) aktyvinimo metu, dėl nepageidaujamo baltymų
vainiko ir niekada nepasiekia numatyto taikinio. Srivastav ir jo kolegos pakeitė nanodalelių paviršių
taip, kad nevyktų fagocitozė, kuri įvyksta dėl prisijungimo prie baltymo (opsonino) ir atitinkamai
praplėtė ND biologinę sąveiką kraujyje padidinant dalelių toksiškumą, kuris gali pagerinti ZnO
veiksmingumą gydymo metu. Dar anksčiau atlikti tyrimai parodė, jog hidrofobiniai ar įkrauti ND
paviršiai turi polinkį adsorbuoti ir denatūruoti daugiau baltymų nei neutralūs ir hidrofiliniai paviršiai.
Nanodalelių paviršiaus padengimas (angl. capping) hidrofilinėmis molekulėmis, tokiomis kaip
polietilglikolis, gali reguliuoti baltymų savybes (Srivastav ir kt., 2019).
Baltymų vainiko poveikio schema pavaizduota 1.9 paveiksle. Didesnė opsoninio baltymo
adsorbcija ant b-ZnO (anijoninė ND) gali būti priežastimi kodėl nanodalelės užstringa makrofagų
ląstelėse, kurios aktyvuoja MFS ir imuninį atsaką. Mažiau opsoninio baltymo turėtų būti susieta su
c-ZnO (neutralios) nanodalelėmis (Srivastav ir kt., 2019).
Po vaistų, savo sudėtyje turinčių nanodalelių, išgėrimo, cinko nanodalelės yra
absorbuojamos ir patenka į kraujotakos sistemą, kur skyla į nanodaleles ir jonines formas, kurios
dalyvauja karūnos susidaryme. b-ZnO nanodalelės formuoja baltymų karūna su opsonino serumu su
didesne trauka nei su c-ZnO ND. Didesnis baltymų vainikas, supantis b-ZnO ND lemia didesnį
ląstelės imuninį atsaką, pavyzdžiui, taip elgiasi makrofagai. Savo toksiškumu ir greitu klirensu
anijoninės nanodalelės sukelia didesnį uždegimą (greitą kraujo apytaką), palyginus su neutraliomis
nanodalelėmis (Srivastav ir kt., 2019).
2.1 pav. Baltymų vainiko poveikio schema. (adaptuota pagal Srivastav ir kt., 2019).
19
Baltymų vainikas yra dviejų tipų: kietas ir minkštas. Kieto vainiko sudėtyje yra baltymai,
giminingesni ND, kurie gali negrįžtamai prisijungti prie ND. Priešingai, minkštame vainike esantys
baltymai yra mažiau giminingi ND, prisijungus prie ND galimas grįžtamasis procesas, dalelės gali
būti keičiamos kitomis arba lengvai atskiriamos atliekant eksperimentus išplovimo etape. Baltymų
vainikas yra dinamiškas sluoksnis, kuriame baltymų struktūra ir kiekis gali keistis atsižvelgiant į
fizikinės ir cheminės sąveikos sąlygas (Nguyen ir Lee, 2017). 1.10 paveiksle yra pavaizduotas kietas
ir minkštas baltymų vainikai: (Wolfram ir kt., 2014).
1.10 pav. Kietas ir minkštas baltymų vainikas (adaptuota pagal Wolfram ir kt., 2014)
Poveikis žinduolių organizmui. Vis dar nėra aišku ar Zn2+ jonų kiekis ląstelėje padidėja dėl
to, kad ląstelė pasisavina ND, ar ND ištirpsta terpėje. In vivo ND poveikis kvėpavimo takams kelia
didelį pavojų. Įkvėpus ar iškvėpus ND išsivysto plaučių uždegimas: kai ND nusėda plaučių alveolėse,
alveolėse esantys makrofagai paprastai fagocituoja ten patekusias daleles, šios dalelės migruoja per
gleivių eskalatorių (angl. mucociliary escalator) į tracheobronchinį regioną, kur jos sukelia kosulį ir
yra nuryjamos. Jei šis procesas neįvyksta, dalelės patenka į tarpinį sluoksnį, iš kur jos nebegali būti
pašalinamos. Tai gali sukelti lėtinį ląstelių stimuliavimą dėl kurio atsiranda uždegimas ir fibrozė
(Vandebriel ir De Jong, 2012).
Nanodalelės negali arba nedidele dalimi įsiskverbia į odą, šis metodas taikomas saulėje
nudegusios odos gydymui. ZnO nanodalelės pasižymi UV sugeriančiomis savybėmis, todėl yra
naudojamos kremų nuo saulės gamyboje. 200-400 nm dydžio dalelės atspindi ir išsklaido šviesą, todėl
kremų nuo saulės spalva yra balta. Tačiau 40-100 nm. dydžio ZnO ND absorbuoja ir išsklaido UV
spinduliuotę ir didžiąja savo dalimi absorbuoja regimosios šviesos bangų ilgius, todėl kremai nuo
saulės susigeria į odą ir tampa permatomi. ZnO yra puslaidininkis, todėl sukelia laisvųjų radikalų
gamybą ant metalų oksidų paviršiaus, esant sąveikai su vandeniu (Vandebriel ir Jong, 2012).
20
Intraperitoninis (angl. Intraperitoneal) ZnO ND vartojimas sukelia neurologinį poveikį.
Nanodalelės lemia sisteminį pasiskirstymą; tiksliniai organai yra kepenys, blužnis, plaučiai ir inkstai,
kai kuriais atvejais ir širdis. BEAS-2B bronchų epitelio ląsteles ir A549 alveolinės adenokarcinomos
ląsteles in vitro veikiant ZnO ND, yra sukeliamas citotoksiškumas, padidėja oksidacinis stresas,
viduląstelinis Ca2+ jonų kiekis, sumažinamas mitochondrijų membranos potencialas ir interleukino
(IL)-8 gamyba. Sumažėjęs kvėpavimo takų raumenų ląstelių kontraktilumas kelia papildomą pavojų.
Priešingai rezultatams gautiems su BEAS-2B ir A549 ląstelėmis, RKO gaubtinės žarnų karcinomos
ląstelėse citotoksiškumą ir mitochondrijų disfunkciją sukelia ne Zn2+ jonai, o ZnO ND (Vandebriel ir
Jong, 2012).
Makrofagai, monocitai ir dendritinės ląstelės taip pat nukenčia; yra sukeliamas
citoksiškumas, oksidacinis stresas, viduląstelinis Ca2+ jonų srautas, sumažinamas mitochondrijų
membranos potencialas, taip pat yra gaminami IL-1β ir chemokinas CXCL9. Nanodalelės yra
fagocituojamos makrofagų ir tirpdomos lizosomos (Vandebriel ir Jong, 2012).
1.5. Cinko oksido nanodalelių poveikis mitochondrijoms
ATP kiekis. Adenozino-5’-trifosfatas (ATP) atlieka gyvybiškai svarbų vaidmenį daugelyje
biologinių procesų: raumenų susitraukime, ląstelėms atliekant savo funkcijas, svarbių ląstelės
junginių sintezę ir skaidymą, yra atsakingas už membraninį transportą (He ir kt., 2012). Tai
nestabilus, didele energija pasižymintis fosfatų kompleksas, sudarytas iš adenino, ribozės ir trijų
fosfato grupių. Fosfato jungtis gali būti hidrolizuojama ATP hidrolizės fermento, pagaminant daugiau
energijos ir adenozino-5'-difosfatą (ADP) arba adenozino-5’-monofosfatą (AMP). ATP yra greitai
paverčiama ADP, kai žmogus susiduria su dirgikliais, tokiais kaip bakterijų antplūdis ir gręsianti
mirtis. Tuo pačiu metu didelis kiekis energijos yra pagaminamas įtraukiant visas metabolines ir
somatines kūno funkcijas, tam, kad greitai būtų gaunama dar daugiau energijos. ATP taip pat yra
būtina molekulė daugelyje biologinių procesų. Nuo normos nukrypę ATP kiekiai gali sukelti daug
pakitimų, tokių kaip kasos, širdies, kraujagyslių ligos, hipoksiją, padidėjusį gliukozės kiekį kraujyje
ir piktybinių auglių vystymąsi. Plėtojant patikimą, švelnų ir selektyvų ATP aptikimo metodą gali būti
įvertinamas ląstelių pažeidimas, slopinimas, proliferacija ir užterštumas mikrobais ( Xiong, Cheng,
Wang, ir Li, 2018).
Deguonies išeikvojimas ar ląstelės pažeidimai lemia greitą citoplazminio ATP kiekio
sumažėjimą. Taip pat yra žinoma, jog kai ląstelė patiria stresą, ATP kiekis joje padidėja. Manoma,
kad tai įvyksta dėl didelio mitochondrijų sugerto Ca2+ jonų kiekio, kuris skatina ATP sintezę
(Brookes, Yoon, Robotham, Anders, ir Sheu, 2004).
Wang ir kiti tyrė cinko oksido nanodalelių poveikį pelių fotoreceptorinėms ląstelėms.
Tyrimo metu buvo matuotas ATP lygis prieš ir po ląstelių paveikimo ZnO ND. Nustatyta, jog
21
paveikus ląsteles nanodalelėmis yra žymiai sumažinama ATP sintezė pelių fotoreceptorinėse
ląstelėse, priklausomai nuo ND koncentracijos, kas parodo, jog ATP sintezė yra slopinama ZnO ND
(Wang ir kiti., 2018). Singh, Cheng ir Singh tyrė cinko oksido sukeliamą oksidacinį stresą
Deinococcus radiodurans ląstelėms. Nustatyta, kad vykstant ATP sintezei iš ADP, reakcijoje
dalyvaujančių genų ekspresija nėra pakankamai reguliuojama ZnO nanodalelėmis paveiktose
ląstelėse, todėl yra sukeliamas ATP išeikvojimas ir tai gali būti laikoma viena iš pagrindinių ZnO ND
sukeliamo toksiškumo priežasčių. D. radiodurans ląstelėms patyrus stresą buvo slopinamas ATP
generavimas ir taip pat apribojama medžiagų apykaita (Singh, Cheng, ir Singh, 2020).
Mitochondrijų membranos potencialas. Mitochondrijos yra vienintelės ląstelių organelės,
kurios gali sudaryti mitochondrijų membranos potencialą (Δψ), galintį siekti 180 mV ir būti neigiamu.
Δψ atlieka pagrindinę funkciją reguliuojant mitochondrijų aktyvumą. Naudojant mitochondrijų
elektrocheminį gradientą, mitochondrijos gali pernešti krūvį turinčias molekules ir jonus, Δψ yra
pirminė mitochondrijų generuojamos energijos forma. Taigi, greitas mitochondrijų membranos
potencialo sumažėjimas gali sukelti elektrocheminį protono gradiento sumažėjimą, dėl kurio
atsiranda staigi deguonies suvartojimo stimuliacija. Jei elektrocheminis protonų gradientas
neišnaudojamas metabolinės veiklos metu, pavyzdžiui, baltymų transportavimui arba ATP sintezei,
substratų energija yra švaistoma šilumos emisijos pavidalu. ΔΨ yra svarbus mitochondrijų funkcijos
parametras, kuris gali būti naudojamas kaip gyvybingų ląstelių rodiklis, nes mitochondrijos yra
neatsiejamai susijusios su apoptoniniu ląstelių procesu (Sivandzade, Bhalerao, ir Cucullo, 2019).
Buvo atliktas tyrimas, kurio metu pastebėta, jog vartojant ZnO ND mažomis koncentracijomis
(mažiau kaip 25 μg/ml) yra efektyviai sumažinamas mitochondrijų elektrocheminis gradientas ir
padidinamas deguonies suvartojimas IV kvėpavimo būsenoje, taip patvirtinant, jog ZnO ND sukelia
žalingą poveikį mitochondrijų energetinei veiklai (Li ir kt., 2012).
Tam, kad geriau suprasti mitochondrijų bioenergetinę funkciją buvo atlikti eksperimentai.
Sustabdžius kvėpavimą, kai mitochondrijų vidinės membranos pralaidumas yra maksimalus,
kvėpavimo grandinės aktyvumas lemia kvėpavimo greitį. Todėl atsiradęs slopinantis poveikis
kvėpavimo greičiui parodo, kad ZnO ND pasižymi slopinamu poveikiu mitochondrijų kvėpavimo
grandinei. Kvėpavime naudojant sukcinatą mažos cinko oksido nanodalelių koncentracijos sukelia
deguonies suvartojimo padidėjimą IV būsenoje ir sumažėjimą III būsenoje, tai parodo, kad vartojant
ZnO ND mažais kiekiais, šios veikia mitochondrijų vidinės membranos pralaidumą ir kvėpavimo
grandinę/ATP sintezę. Didelės ZnO ND koncentracijos sukelia suvartojamo deguonies kiekio
sumažėjimą tiek III, tiek IV kvėpavimo būsenose. Kvėpavimo grandinę paveikus 100 μg/ml-1 ZnO
ND, suvartojamo deguonies kiekis yra sumažinamas iki žemesnės nei kontrolė vertės. Šie rezultatai
rodo, jog didelis ZnO ND kiekis pažeidžia kvėpavimo grandinę (Li ir kt., 2012). ZnO ND sukeliamas
mitochondrijų kvėpavimo slopinimas tiesiogiai sutrikdo mitochondrijų energetinę veiklą, o
22
susidariusi mitochondrijų nespecifinio pralaidumo pora (MPTP) išsklaido elektrocheminį protonų
gradientą, taip prisidėdama prie pakenkimo. Kai MPTP susiformuoja, mitochondrijų vidinė
membrana tampa pralaidžia iki 1500 Da molekulinės masės junginiams. Taigi, nebaltyminiai
mitochondrijų užpildo komponentai greitai ima kauptis tarpmembraninėje erdvėje. Tačiau, kadangi
užpilde esantys baltymai yra didesnės koncentracijos nei terpėje ar ląstelės citozolyje, jie sudaro
koloidinį osmosinį slėgį, kuris padidina mitochondrijų užpildo kiekį – mitochondrijos išbrinksta.
MPTP taip gali sukelti ląstelės apoptozę. Mitochondrijos yra pilnos gyvybiškai svarbių junginių,
tokių kaip citochromas c, kuris tik išėjęs iš mitochondrijos tampa apoptozės signalu. Per MPTP minėti
junginiai išeina į ląstelės citozolį ir sukelia apoptozę (Li ir kt., 2012).
Poveikis mitochondrijų funkcijoms. Kaip jau minėta anksčiau, mitochondrija yra ląstelės
organelė, kurios pagrindė funkcija yra energijos gamyba ląstelėje, o mitochondrijų funkcijų
pastovumas yra svarbiausias ląstelės veiklai. Mitochondrijų funkcijų sutrikimai, veikiant jas
toksinėmis medžiagomis, šiuo atveju nanodalelėmis, lemia ir ląstelės funkcijų sutrikimus. Dėl
funkcijų sutrikimų žmones suserga įvairiomis ligomis, kurios yra susijusios su neurodegeneraciniais
procesais (Mayevsky ir Barbiro-Michaely, 2009).
Daug informacijos apie mitochondrijų atliekamas funkcijas yra gauta iš atliktų eksperimentų
in vitro ir lyginant su minėtais tyrimais, in vivo stebėjimų yra atlikta gerokai mažiau. Siekiant įvertinti
mitochondrijų kvėpavimo grandinės aktyvumą in vivo, galima stebėti mitochondrijoje esančių
NADH, FAD lygius arba citochromo oksidazės lygio mažėjimą įvairiais eksperimentiniais metodais.
NADH lygio stebėjimas suteikia pagrindinę informaciją apie metabolinę būseną mitochondrijose –
energijos gamybą ir viduląstelinį deguonies kiekį. Pagrindinė mitochondrijų funkcija yra potencialią
energiją, sukauptą įvairiuose substratuose, paversti į ATP. Vidinė mitochondrijų membrana turi 5
kompleksus, dar vadinamus integraliaisiais kompleksais, įskaitant ir NADH dehidrogenazę, laikomą
pirmuoju kompleksu. Keturi iš minėtų kompleksų dalyvauja kvėpavimo grandinės veikloje.
Pagrindinė kvėpavimo grandinės funkcija yra palengva perkelti elektronus nuo NADH ir FADH2 ir
perduoti juos deguoniui. Pridėjus H+ protonų, vandens molekulės yra gaminamos IV komplekse.
NADH yra substratas arba kofermentas fermentinei dehidrogenazės veiklai, o minėta dehidrogenazė
yra kvėpavimo grandinės dalis ir yra vidinėje mitochondrijos membranoje. Norint įvertinti
mitochondrijų atliekamų funkcijų veiklą, yra matuojama NADH fluorescencija. Fluorescencijos
intensyvumo padidėjimas yra rodiklis, parodantis, jog mitochondrijose yra padidėjęs redukuotų
NADH kiekis ir sumažėjęs elektronų grandinės aktyvumas (Mayevsky ir Barbiro-Michaely, 2009).
Bet koks junginys, kuris keičia mitochondrijų membranos potencialą, gali sukelti laisvųjų
radikalų susidarymą ir su šiuo procesu susisijusią ląstelių mirtį. Mokslininkai Li ir kt., analizavo ZnO
ND poveikį mitochondrijų membranos potencialui, membranos ultrastruktūrai, pralaidumui H+ ir K+
jonams, mitochondrijų kvėpavimui ir citochromo c išsiskyrimui kaip apoptoninio signalo žymeniui.
23
Tyrimui buvo naudojamos kepenų mitochondrijos, kurios buvo išskirtos iš Wistar rūšies žiūrkių ir
paveiktos fluorescensiniu dažu tetrametilrodamino etilo esteriu (TMRE). Nustatyta, jog iš ZnO ND
išsiskyrę Zn2+ jonai kritiškai paveikė mitochondrijų kvėpavimo grandinę ir membranos pralaidumą,
galiausiai sukėlė padidėjusį ROS susidarymą bei su šiuo procesu susijusią ląstelės mirtį. Tyrimas
patvirtino mitochondrijų membranos potencialo sumažėjimą jas paveikus ZnO ND, kuris priklauso
nuo ND koncentracijos (Li ir kt., 2012).
Gausėjantys tyrimai parodė, kad mitochondrijos yra svarbus ZnO nanodalelių taikinys, o jų
pažeidimas – viena iš ND citotoksiškumo priežasčių. Buvo atliktas tyrimas, kurio metu buvo siekama
įvertinti ZnO ND poveikį ląstelės bioenergetikai. Tyrimui buvo naudojamos HiPSCs kultūros
ląstelės, gautos iš sveiko vyro inksto. Mitochondrijų masei nustatyti buvo naudojamas MitoTracker
GREEN dažas. Po dažymo gauti rezultatai parodė, jog ląsteles paveikus 50 ir 100 μg/ml
koncentracijos ZnO suspensijomis mitochondrijų kiekis sumažėjo atitinkamai 85 % ir 65 %, lyginant
su kontroline grupe. Tokie pakitimai minėtose organelėse gali sutrikdyti ląstelės bioenergetiką, taip
sukeliant ląstelės disfunkciją, oksidacinį stresą ir netgi mirtį (Li ir kt., 2020).
Chevallet ir kiti tyrė cinko sukeliamą mitochondrijų disfunkciją. Pastebėta, jog žmogaus
bambos venų epitelio ląsteles (HUVECs) paveikus 120 μM koncentracijos ZnO ND suspensija, arba
ZnCl2, yra skatinama agregracija ir endoplazminio retikulumo tinimas, suaktyvinamas oksidacinis
stresas bei ženkliai sumažėja mitochondrijų kiekis. Į oksidacinį stresą reaguojantys keliai priklauso
nuo ląstelių tipo. Cinko kaupimasis ląstelėje buvo stebimas naudojant selektyvų fluorescencinį dažą,
prieš tai leukemijos Jurkat ląsteles ir žmogaus plaučių karcinomos ląsteles H1355 paveikus tokiomis
pat ZnO ND koncentracijomis. Didesnės ZnO nanodalelių dozės sukėlė mitochondrijų membranų
depoliarizaciją, fermento kaspazės aktyvaciją ir ląstelės apoptozę. Mokslininkai taip pat ištyrė
mitochondrijų vientisumą matuojant transmembraninį mitochondrijų potencialą. Naudojant
Rhodamine 123 dažo įsisavinimo tyrimą buvo pastebėtas potencialo mažėjimas, taip dar kartą
patvirtinant, jog ZnO ND pažeidžia mitochondriją. Taip pat įrodyta, kad neuronų ląstelėse susikaupęs
cinko perteklius sukelia padidėjusią ROS gamybą, mitochondrijų membranos potencialo mažėjimą ir
ATP kiekio sumažėjimą (Chevallet ir kiti., 2016).
24
2. METODAI IR MEDŽIAGOS
2.1 . Medžiagos
Eksperimentams atlikti naudojami reagentai buvo analitinio švarumo. Cinko oksido
nanodalelės ZincOx10 (d50 = 20 nm) iš Nanogate AG (Quierschied-Göttelborn, Vokietija). Jaučio
serumo albumino frakcija V, ląstelių DMEM auginimo terpė, 2-propanolis, 3-(4,5-demetiazol-2-il)-
2,5-difeniltetrazolio bromidas (MTT), fetalinis jaučio serumas (FBS), penicilino/streptomicino (10
kU/ml/10 mg/ml) tirpalas, tripsino/EDTA (0,25 %/0,02 %) tirpalas buvo iš Biochrom AG (Berlynas,
Vokietija). Mitochondrijų indikatorius MitoTracker® Green FM buvo iš Molecular Probes
(Vokietija), JC-1 iš Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Vokietija).
2.2 . Cinko oksido nanodalelių paruošimas
2.2.1. Cinko oksido ND suspensijos paruošimas
ZnO nanodalelių suspensija (20 mg/ml), ruošiama 10 mg nanodalelių užpilant 0,5 ml
dejuonizuoto vandens (18,2 M) ir laikant 30 min. ultragarso vonelėje. Naudojant šią suspensiją
buvo gaminamos skirtingų koncentracijų ZnO nanodalelių suspensijos tolimesniems tyrimams.
2.2.2. Cinko oksido nanodalelių su baltymų vainiku (ZnO-BSA) suspensijos
paruošimas
100 µl cinko oksido nanodalelių suspensijos (20 mg/ml) sumaišoma su 100 µl BSA tirpalo
(0,8 mg/ml dejonizuoto vandens), tirpalas laikomas ultragarso vonelėje 30 min, 4 ºC. Gautas tirpalas
naudojamas eksperimentui reikiamų koncentracijų tirpalų paruošimui.
2.3 . Ląstelių auginimas
Eksperimentams atlikti buvo naudojamos kininio žiurkėnuko kiaušidžių ląstelės (CHO).
Ląsteles auginamos DMEM auginimo terpėje, į kurią papildomai pridedama 10 % karščiui atsparaus
fetalinio jaučio serumo, 1 % penicilino/streptomicino (10 kU/ml / 10 mg/ml) tirpalo, ampB.
Ląstelės persėjamos kas 3-4 dienas: nupilama auginimo terpė, ląstelės 3 kartus praplaunamos
naudojant PBS. Ant ląstelių pilama 0,5 ml 0,25 % tripsino/EDTA tirpalo, tuomet inkubuojama
termostate, kurio temperatūra 37 ºC apie tris minutes tol, kol ląstelės atšoka nuo flakono paviršiaus.
Atšokusios ląstelės resuspenduojamos su 5 ml auginimo terpės: dalis ląstelių suspensijos perkeliama
į flakoną, kuriame yra supilta šviežia terpė tam, kad būtų palaikoma ląstelių kultūra, o likusi
suspensija naudojama eksperimentams atlikti. Ląstelės auginamos 37 ºC temperatūros inkubatoriuje,
esant 5 % CO2 ir 90 % drėgmės.
25
2.4 . Ląstelių gyvybingumo nustatymas naudojant MTT metodą
Ląstelių gyvybingumui nustatyti vienas iš metodu yra naudojamas MTT metodas. Šiuo metu
kolorimetriniai tyrimai, naudojant MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2il-)-2,5-difeniltetrazolio bromidas) yra
naudojami jau minėtam gyvybingumo nustatymui, kurio metu tetrazolio druska virsta kolorimetriškai
nustatomu junginiu. MTT yra redukuojamas ląstelių dehidrogenazių iki stipraus chromoforo
formazano, kurio netirpūs kristalai kaupiasi ląstelėse ir jų kiekis yra tiesiogiai proporcingas ląstelių
gyvybingumui (Stockert ir kt., 2012). MTT redukcija iki formazano yra pateikiama 2.1 pav.
2.1 pav. MTT redukavimas iki formazano (adaptuota pagal Stockert ir kt., 2012).
Po 30 l ląstelių buvo užsėta į 4 skaidrias 96 šulinėlių plokšteles. Ląstelės auginamos 24 h.
Po auginimo ant ląstelių buvo užpilama po 100 l auginimo terpės su atitinkamos koncentracijos ZnO
ir ZnO-BSA ND, į kontrolinę grupę pilama 100 l auginimo terpės, inkubuojama 3 h 37 ºC
temperatūroje. Po inkubacijos, terpė nusiurbiama ir užpilama po 100 µl paruošto 0,5 mg/ml MTT
tirpalo auginimo terpėje, tuomet inkubuojama 1 h 37 ºC temperatūroje. Praėjus nustatytam laikui
terpė su MTT dažu nusiurbiama, ląstelės du kartus yra praplaunamos PBS tirpalu, jis sausai
nusiurbiamas ir užpilama 50 µl izopropanolio, kuris ištirpina po redukcijos proceso susidariusi
formazaną. Šviesos absorbcija yra matuojama naudojant TECAN GeniosPro multifunkcinį
mikrolėkštelių skaitytuvą, esant 535 nm bangos ilgiui.
2.5 . Mitochondrijų membranos potencialo tyrimas, panaudojant
lipofilinį katijoninį JC-1 dažą
Mitochondrijų elektrocheminis protonų gradientas atlieka pagrindinę funkciją reguliuojant
mitochondrijų aktyvumą ir jo pasikeitimas yra žinomas kaip ankstyvosios ląstelės žūties reiškinys.
JC-1 tai membranai pralaidus dažas, naudojamas nustatyti mitochondrijų membranos potencialą ir
mitochondrijų būklę.
26
JC-1 dažas, kai potencialas yra didelis, kaupiasi mitochondrijų užpilde, sudaro J-agregatus
(λsuž = 535 nm, λem = 590 nm), kurie fluorescuoja raudona spalva. Kai mitochondrija yra pažeidžiama,
potencialas krenta, susidaro J-monomerai, fluorescuojantys žalia spalva (λsuž = 492 nm, λem = 535
nm). Mitochondrijų depoliarizaciją rodo raudonos/žalios fluorescensijų santykio sumažėjimas (2.2
pav.) (Sivandzade, Bhalerao ir Cucullo, 2019).
2.2 pav. JC-1 dažo patekimas į mitochondriją ir J-agregatų susidarymas (adaptuota
pagal Sivandzade, Bhalerao ir Cucullo, 2019)
Į juodas 96 šulinėlių plokšteles buvo užsėta po 30 l CHO ląstelių, ląstelės auginamos 24 h.
Po auginimo terpė nusiurbiama, į šulinėlius pilama po 100 l 1, 10, 25, 50, 100 ir 150 g/ml
koncentracijų ZnO ir ZnO-BSA nanodalelių suspensijų, paruoštų naudojant auginimo terpę. Į
kontrolę pilama po 100 l auginimo terpės. Inkubuojama 3h, 37 ºC temperatūroje. Pasibaigus
inkubacijai nustatytam laikui, terpė nusiurbiama, užpilame 100 µl 1 mM JC-1 dažo, dažoma 20 min.,
po jo ląstelės praplaunamos 100 µl PBS tirpalu 3 kartus ir šio tirpalo užpylus 50 µl dviguba
fluorescensija yra matuojama TECAN GeniosPro fluorimetru esant λsuž = 535 nm, λem = 590 nm ir
λsuž = 492 nm, λem = 535 bangos ilgiams.
27
2.6 . Mitochondrijų kiekio nustatymas naudojant mitochondrijoms
atrankų fluorescencinį dažą MitoTracker® Green FM
Mitochondrijų potencialas gali būti įvertinamas remiantis fluorescencinių dažų įvedimu į
mitochondrijas. MitoTracker® tipo (Molecular Probes Invitrogen GmbH, Vokietija) į ląsteles
patenkantys dažai kaupiasi gyvose ląstelėse, aktyviose jų mitochondrijose ir čia išlieka ir po ląstelių
fiksacijos, dėl savo sudėtyje esančios chlormetilo grupės, kuri reaguoja su tiolinėmis grupėmis. Šie
dažai vandeninėje terpėje nefluorescuoja, tačiau patekę į lipidinę mitochondrijų aplinka ima
intensyviai švytėti žalia spalva. Ši savybė leidžia tyrėjams pamatyti gyvų ląstelių mitochondrijas iš
karto po dažymo (Baker ir kt., 2015).
MitoTracker® Green FM gali būti naudojamas gyvų, taip pat ir fiksuotų mitochondrijų
vaizdinimui, tačiau neužsilaiko įvykus ląstelės permeabilizacijai. Dažas sužadinamas esant 490 nm
bangos ilgiui, o emisijos bangos ilgis yra lygūs 516 nm. Norint atlikti mitochondrijų vaizdinimą,
ląstelės yra inkubuojamos su MitoTracker® dažu, kuris pasyviu būdu difunduoja per plazminę
membraną ir yra akumuliuojamas aktyviose mitochondrijose. Matavimai po dažymo yra atliekami
mikroplokštelių skaitytuvu (Agnello, Morici, ir Rinaldi, 2008).
Po 30 µl suspensijos buvo užsėta į juodą 96 šulinėlių plokštelę. Ląstelės auginamos 24 h. Po
inkubacijos ant ląstelių užpilama po 100 µl atitinkamai auginimo terpės su 20 µg/ml ZnO ND arba
20 µg/ml ZnO-BSA ND, inkubuojama 24 h 37 ºC temperatūroje. Pasibaigus inkubacijos laikui, nuo
šulinėliuose esančių ląstelių terpė nusiurbiama, ląstelės 2 kartus praplaunamos PBS tirpalu. Tuomet
ant ląstelių užpilama po 100 μl terpės su 2 μM MitoTracker Green dažo, inkubuojama 15 min., 37 ºC
temperatūroje. Ląstelės po inkubacijos praplaunamos 100 μl PBS tirpalo, užpilama po 50 μl PBS
tirpalo ir naudojant TECAN GeniosPro multifunkcinį mikrolėkštelių skaitytuvą matuojama
fluorescencija esant λsuž = 490 nm, λem = 535 nm.
Po matavimo ant ląstelių yra užpilama po 50 µl 0,05 % kristalinio violetinio (KV) tirpalo 20
% etanolyje. Ląstelės inkubuojamos 30 min., kambario temperatūroje. Po inkubacijos dažas
nusiurbiamas, ląstelės 2 kartus praplaunamos vandeniu – 100 µl šulinėliui. Vanduo nusiurbiamas ir
užpilama 100 µl eliucinio skysčio – 50 % etanolio su 0,1 % acto rūgštimi. Gauto tirpalo absorbcija
matuojama esant 612 nm bangos ilgiui TECAN GeniosPro multifunkciniu mikrolėkštelių skaitytuvu,
eliucinį skystį naudojant nulinės vertės nustatymui.
2.7. Statistinė analizė
Darbe pateikti eksperimentų vidurkiai su standartine paklaida. Nanodalelių poveikio
mechanizmai tiriami ląsteles paveikus tuo pačiu atitinkamos nanodalelių grupės kiekiu, vidurkiai
gauti atlikus 3 kiekvieno matavimo pakartojimus. Statistiniam patikimumui įvertinti naudojamas
porinis Stjudento t-testas. Pasirinktas reikšmingumo lygmuo p ≤ 0,05.
28
3. REZULTATAI IR APTARIMAS
Tyrimų metu buvo siekiama įvertinti ZnO ND ir ZnO-BSA ND komplekso poveikį CHO
ląstelių gyvybingumui bei nustatyti, ar poveikis gyvybingumui gali būti siejamas su poveikiu
mitochondrijų membranos potencialui ir mitochondrijų kiekio pokyčiais.
3.1. ZnO ir ZnO-BSA nanodalelių poveikis ląstelių gyvybingumui
Pradiniu tyrimo etapu buvo tiriamas ZnO ir ZnO, padengtų modeliniu BSA vainiku,
nanodalelių poveikis CHO ląstelių gyvybingumui, taikant MTT metodą. Šiuo metodu per ganėtinai
trumpą laiką gali būti įvertinamas ląstelės gyvybingumas. Minėtas dažas yra lengvai pasisavinamas
ląstelių ir fermentiniu būdu redukuojamas į formazaną - intensyvios purpurinės spalvos medžiagą,
besikaupiančią citoplazmos granulėse. MTT testas koreliuoja su gyvybingų ląstelių skaičiumi,
remiasi ląstelės redukcinės būsenos vertinimu ir gali būti naudojamas įvertinti ląstelių mirčiai ar
proliferacijai (Diaz ir kt., 2007).
Po 3 valandų ląstelių inkubacijos su ZnO ir ZnO-BSA suspensijomis nustatyti gyvybingumo
pokyčiai pateikti 3.1 paveiksle.
3.1 pav. Ląstelių gyvybingumas po 3 h inkubacijos su ZnO ND ir ZnO-BSA,
įvertintas naudojant MTT metodą. Vidurkis (n = 3) ± SE, * - statistiškai patikimas ND poveikis,
lyginant su kontrole, # - statistiškai patikimas baltymų vainiko poveikis, lyginant su atitinkamos
koncentracijos ZnO ND (p ≤ 0,05).
ZnO ND, be modelinio BSA baltymų vainiko, ląstelių gyvybingumą mažino priklausomai
nuo ND koncentracijos jau pradedant 1 g/ml koncentracija (4 %) ir esant 150 g/ml koncentracijai
pasiekiamas minimalus 77 % gyvybingumas. Įvertinant poveikį ZnO-BSA ND 50-150 g/ml
0
20
40
60
80
100
120
K 1 10 25 50 100 150
Gyvybin
gu
mas,
%
Koncentracija, μg/ml
ZnO
ZnO-BSA
* ** * **
***
##
#
29
koncentracijų ribose matome, jog CHO ląstelių gyvybingumas statistiškai reikšmingai sumažėja 20
%. Lyginant ZnO ir ZnO-BSA ND grupes, esant 10 μg/ml koncentracijai, pastebima, jog nanodalelių
padengimas modeliniu BSA baltymų vainiku, statistiškai reikšmingai sumažina ZnO ND
citotoksiškumą 11 %, esant 25 μg/ml - 12 %, o esant 100 μg/ml - 10 %. Paveikus ląsteles 150 μg/ml
ZnO-BSA ND suspensija, pasiekiamas minimalus, 79 % gyvybingumas.
ZnO ND neigiamą poveikį ląstelės gyvybingumui taip pat pastebėjo Prajitha, Athira ir
Mohanan (2019). Jie nustatė, jog veikiant CHO ląsteles skirtingos koncentracijos (5-100 μg/ml)
maždaug 6-8 nm dydžio ZnO ND, gyvybingumas mažėja, priklausomai nuo ND koncentracijos. Taip
pat, Li ir kiti (2020) po 3h inkubacijos su ZnO ND, esant 50 μg/ml koncentracijai, pastebėjo tokį patį
poveikį: ląstelės gyvybingumas sumažėja iki 92 %, lyginant su kontroline grupe.
3.2. ZnO ir ZnO-BSA ND poveikis mitochondrijų membranos potencialui
Mitochondrijų elektrocheminis protonų gradientas atlieka pagrindinę funkciją reguliuojant
mitochondrijų aktyvumą ir jo pasikeitimas yra žinomas kaip ankstyvosios ląstelės žūties reiškinys.
Nustatant mitochondrijų membranos potencialą yra naudojami JC-1 dažai, kurie į mitochondrijų vidų
patenka pagal vidinės membranos potencialą. Kai membranos laidumas ima didėti, potencialas ima
mažėti, dėl šios priežasties JC-1 į minėtų organelių vidų patenka mažiau ir tuo pačiu metu mažėja ir
fluorescensijos intensyvumas. Dar viena iš priežasčių kodėl šiam poveikiui tirti yra naudojamas JC-
1 dažas yra tai, jog matavimų metu ląstelėse ši medžiaga fluorescuoja dviejų spalvų spektru. Kai
potencialas yra normalus, tuomet JC-1 dažas mitochondrijose kaupiasi J-agregatų pavidalu ir švyti
raudona spalva, esant potencialo sumažėjimui, dažas kaupiasi citozolyje monomerų pavidalu ir švyti
žalia spalva (Perelman ir kt., 2012). Atsižvelgiant į raudonos/žalios spalvos santykį, galime apibūdinti
mitochondrijų vidinės membranos potencialą, jo pokytį, bei atsiradusias galimas membranos
pažaidas. Kaip jau minėta anksčiau, potencialo pokytis yra žinomas kaip ankstyvosios ląstelės žūties
reiškinys.
Šiuo tyrimu buvo stebėtas ZnO ir ZnO-BSA ND poveikis JC-1 dažo sudaromų agregatų ir
monomerų fluorescencijos santykio pokyčiams. Gauti rezultatai pateikiami 3.2 paveiksle.
30
3.2 pav. JC-1 dažo agregatų ir monomerų fluorescencijos santykis (R/G) paveikus
CHO ląsteles ZnO ND ir ZnO-BSA ND. Vidurkis (n = 3) ± SE, * - statistiškai reikšmingas
skirtumas (p ≤ 0,05), lyginant su kontrole, # - statistiškai reikšmingas skirtumas (p ≤ 0,05) lyginant
su ZnO ND.
Tyrimo metu nustatyta, jog tiek ZnO, tiek ZnO-BSA ND nežymiai slopina mitochondrijų
potencialo generavimo sistemą. Mitochondrijų membranos potencialas yra išreikštas JC-1 agregatų
ir monomerų fluorescencijos santykiu R/G. Didžiausia ZnO-BSA koncentracija (150 μg/ml), lyginant
su kontrole, statistiškai reikšmingai sumažina mitochondrijų membranos potencialą 7 %, o didžiausia
ZnO ND koncentracija, lyginant su kontrole, potencialą sumažina 1 %. Toliau analizuojant gautus
rezultatus taip pat, pastebėta, jog tiek ZnO, tiek ZnO-BSA ND grupėse yra stebimas hormezės
reiškinys, kuris literatūroje yra apibūdinamas kaip reiškinys, kurio metu bet kokia toksiška medžiaga
gali turėti stimuliuojantį ar tiesiog teigiamą poveikį ląstelei, aktyvinant ląstelės atsistatymo
mechanizmą (Mattson, 2008). ZnO ND grupėje 1 μg/ml mitochondrijų membranos potencialas
padidėja 2 %, 10 μg/ml grupėje 4 %. Analizuojant ZnO-BSA ND grupes 1-10 μg/ml ribose
potencialas atitinkamai padidėja 0,3 % ir 0,2 %. Lyginant ZnO ir ZnO-BSA grupes 1, 10, 100 ir 150
μg/ml koncentracijų grupėse pastebėta, jog baltymų vainikas didina ND neigiamą poveikį
mitochondrijų membranos potencialui.
Li ir kiti (2012) taip pat atliko tyrimus ZnO nanodalelių poveikiui mitochondrijų membranos
potencialui nustatyti. Atlikti tyrimai parodė, jog paveikus ZnO ND (5-50 μg/ml) izoliuotas
mitochondrijas, jų membranos potencialas stipriai sumažėja didinant koncentraciją, kas sukelia
mitochondrijų disfunkciją. Tačiau tiesiogiai palyginti mūsų ir minėtų mokslininkų rezultatų negalima,
nes jų tyrime mitochondrijos buvo veikiamos tiesiogiai, ne ląstelėse, membranos potencialo
0
20
40
60
80
100
120
K 1 10 25 50 100 150
R/G
, %
Koncentracija, μg/ml
ZnO
ZnO-BSA
****
**** ###
##*
31
sumažėjimas buvo vertinamas pagal sugerto fluorescencinio indikatoriaus tetrametilrodamino etilo
esterio (TMRE) išėjimą ir buvo naudojamos apie 5 kartus didesnės (100 nm) ZnO ND.
Atlikus koreliaciją tarp MTT tyrimo, parodančio gyvybingų ląstelių kiekį po poveikio ZnO
ir ZnO-BSA ND ir tyrimo, parodančio ZnO ir ZnO-BSA ND poveikį mitochondrijų membranos
potencialui, nustatyta stipri teigiama korialiacija, kai buvo naudojama ZnO-BSA ND suspensija (R2
= 0.93).
3.3. ZnO ir ZnO-BSA ND poveikis mitochondrijų kiekiui CHO ląstelėse
MitoTracker® Green FM dažas nefluorescuoja vandeninėje terpėje, šis dažas ima
fluorescuoti tik tuomet, kai patenka į mitochondrijų lipidinę aplinką, nepriklausomai nuo
mitochondrijų membranos potencialo, todėl gaunami rezultatai, kurie yra susiję tik su mitochondrijų
mase. Dažas yra sužadinimas 419 nm bangos ilgio šviesa, o fluorescencija registruojama žaliojoje
spektro srityje - 516 nm. Į ląstelėje esančių mitochondrijų vidų patekęs dažas yra akumuliuojamas
aktyviose mitochondrijose.
Mitochondrijų fluorescencija buvo įvertinta kiekybiškai fluorimetru po 24 h inkubacijos su
20 g/ml ND, gauti rezultatai pateikiami 3.3 pav.:
3.3 pav. Mitochondrijų fluorescencija po CHO ląstelių dažymo MitoTracker Green
dažu. Ląstelės 24 h inkubuotos su ZnO (20 g/ml) ir ZnO-BSA ND (20 g/ml, pagal perskaičiuotą
ZnO kiekį). Vidurkis ± SE, * – statistiškai patikimas skirtumas, lyginant su kontrole (p ≤ 0,05); # –
statistiškai patikimas skirtumas, lyginant su baltymu nepadengtomis ZnO ND.
Po fluorescencijos matavimo mitochondrijų kiekis ląstelėse buvo normalizuojamas ląstelių
kiekiui, nustatytam naudojant dažymą kristaliniu violetiniu, rezultatai pateikiami 3.4 pav.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
K ZnO ZnO-BSA
Mit
och
on
dri
jų f
luo
resc
enci
ja,
s.v.
f **
32
3.4 pav. Mitochondrijų kiekis, nustatytas pagal MitoTracker Green dažo
fluorescenciją, normalizuotą ląstelių kiekiui naudojant kristalinį violetinį dažą. Ląstelės 24 h
inkubuotos su ZnO (20 g/ml) ir ZnO-BSA ND (20 g/ml, pagal perskaičiuotą ZnO kiekį). Vidurkis
± SE, * – statistiškai patikimas skirtumas, lyginant su kontrole (p ≤ 0,05); # – statistiškai patikimas
skirtumas, lyginant su baltymu nepadengtomis ZnO ND.
Nagrinėjant gautus rezultatus, pastebėta, jog ZnO ND suspensija statistiškai reikšmingai 18
% sumažino mitochondrijų kiekį, lyginant su kontrole, o ZnO-BSA ND - 23 %, be to, ZnO-BSA ND
statistiškai reikšmingai labiau mažina mitochondrijų kiekį, lyginant su ZnO ND.
Li ir kiti (2020) atlikdami tyrimą su ZnO ND taip pat pastebėjo mitochondrijų kiekio
sumažėjimą ląsteles paveikus 50 ir 100 μg/ml koncentracijų suspensijomis. Minėti pokyčiai sukelia
ląstelės disfunkciją. Chevallet ir kiti (2016) taip pat tyrė ZnO sukeliamą mitochondrijų disfunkciją ir
pastebėjo, jog žmogaus bambos venų epitelio ląsteles (HUVECs) paveikus 120 μM koncentracijos
ZnO ND suspensija yra skatinama agregracija ir endoplazminio retikulumo tinimas, suaktyvinamas
oksidacinis stresas bei ženkliai sumažėja mitochondrijų kiekis.
Taip pat, Li ir kiti (2012) atlikdami tyrimą pastebėjo, jog baltymu padengtos ZnO ND
suteikia neigiama ND poveikį kvėpavimo grandinei ir mitochondrijų veikimui, minėti veiksniai gali
skatinti nespecifinio laidumo poros susidarymą, kuri gali sukelti ląstelės apoptozę.
0
20
40
60
80
100
120
K ZnO ZnO-BSA
MIt
och
on
dri
jų k
ieki
s, % *#*
33
4. IŠVADOS
1. ZnO ND mažina ląstelių gyvybingumą 4-23%, priklausomai nuo koncentracijos. Baltymų
vainikas mažina ZnO ND sukeltą citotoksiškumą 10-12%, esant 10, 25, 100 μg/ml ND
koncentracijai.
2. ZnO ir ZnO-BSA ND 1-10 μg/ml koncentracijų ribose stimuliuoja, o 50-150 μg/ml
koncentracijų ribose nežymiai slopina mitochondrijų membranos potencialą. Pastebėta, kad
1, 10, 100 ir 150 μg/ml koncentracijų grupėse baltymų vainikas didina ND neigiamą poveikį
mitochondrijų membranos potencialui.
3. ZnO ir ZnO-BSA ND mažina mitochondrijų kiekį, inkubuojant 24 h esant 20 μg/ml ND
koncentracijai. Baltymų vainikas sustiprina ZnO ND neigiamą poveikį.
34
5. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Agnello, M., Morici, G., ir Rinaldi, A. M. (2008). A method for measuring mitochondrial
mass and activity. Cytotechnology, 56(3), 145–149, doi:10.1007/s10616-008-9143-2
2. Akbarzadeh, A., Rezaei-Sadabady, R., Davaran, S., Joo, S. W., Zarghami, N., Hanifehpour,
Y., Samiei, M., ir kiti (2013). Liposome: Classification, preparation, and applications.
Nanoscale Research Letters, 8(1), 102, doi:10.1186/1556-276x-8-102
3. Aula, S., Lakkireddy, S., Swamy, A. V. N., Kapley, A., Jamil, K., Tata, N. R., ir Hembram,
K. (2014). Biological interactions in vitro of zinc oxide nanoparticles of different
characteristics. Materials Research Express, 1(3), 0–23, doi:10.1088/2053-1591/1/3/035041
4. Baghaban-Eslaminejad, M., Oryan, A., Kamali, A., ir Moshiri, A. (2017). The role of
nanomedicine, nanotechnology, and nanostructures on oral bone healing, modeling, and
remodeling. Nanostructures for Oral Medicine, 777–832. doi:10.1016/b978-0-323-47720-
8.00026-2
5. Baker, N., Hamilton, G., Wilkes, J. M., Hutchinson, S., Barrett, M. P., ir Horn, D. (2015).
MitoTracker® Mitochondrion-Selective Probes. Proceedings of the National Academy of
Sciences, Prieiga per internetą: https://assets.thermofisher.com/TFS-
Assets/LSG/manuals/mp07510.pdf.
6. Battig, M. R., ir Wang, Y. (2014). Nucleic Acid Aptamers for Biomaterials Development.
Natural and Synthetic Biomedical Polymers, 287–299. doi:10.1016/b978-0-12-396983-
5.00018-1
7. Bei, D., Meng, J., ir Youan, B. B. C. (2010). Engineering nanomedicines for improved
melanoma therapy: Progress and promises. Nanomedicine, 5(9), 1385–1399.
doi:10.2217/nnm.10.117
8. Brookes, P. S., Yoon, Y., Robotham, J. L., Anders, M. W., ir Sheu, S.-S. (2004). Calcium,
ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle. American Journal of Physiology-Cell
Physiology, 287(4), C817–C833. doi:10.1152/ajpcell.00139.2004
9. Champion, J. A., Katare, Y. K., ir Mitragotri, S. (2007). Making polymeric micro- and
nanoparticles of complex shapes. Proceedings of the National Academy of Sciences, 104(29),
11901–11904. doi.org/10.2307/25436221.
10. Chevallet, M., Gallet, B., Fuchs, A., Jouneau, P. H., Um, K., Mintz, E., ir Michaud-Soret, I.
(2016). Metal homeostasis disruption and mitochondrial dysfunction in hepatocytes exposed
to sub-toxic doses of zinc oxide nanoparticles. Nanoscale, 8(43), 18495–18506.
doi:10.1039/c6nr05306h
11. Diaz, G., Melis, M., Musinu, A., Piludu, M., Piras, M., ir Falchi, A. M. (2007). Localization
35
of MTT formazan in lipid droplets. An alternative hypothesis about the nature of formazan
granules and aggregates. European Journal of Histochemistry, 51(3), 213-8.
12. Ekielski, A. (2018). Interactions between food ingredients and nanocomponents used for
composite packaging. Encyclopedia of Food Chemistry. doi:10.1016/b978-0-08-100596-
5.21850-7
13. García, M. C. (2018). Drug delivery systems based on nonimmunogenic biopolymers.
Engineering of Biomaterials for Drug Delivery Systems, 317–344. doi:10.1016/b978-0-08-
101750-0.00012-x
14. Gatoo, M. A., Naseem, S., Arfat, M. Y., Mahmood Dar, A., Qasim, K., ir Zubair, S. (2014).
Physicochemical Properties of Nanomaterials: Implication in Associated Toxic
Manifestations. BioMed Research International, 1–8. doi:10.1155/2014/498420
15. Hasnain, S., Ali, S. S., Uddin, Z., ir Zafar, R. (2013). Application of Nanotechnology in Health
and Environmental Research : A Review, 5(3), 160–166. doi:10.19026/rjees.5.5653
16. He, X., Zhao, Y., He, D., Wang, K., Xu, F., ir Tang, J. (2012). ATP-responsive controlled
release system using aptamer-functionalized mesoporous silica nanoparticles. Langmuir,
28(35), 12909–12915. doi:10.1021/la302767b
17. Huang, Y. W., Cambre, M., ir Lee, H. J. (2017). The Toxicity of Nanoparticles Depends on
Multiple Molecular and Physicochemical Mechanisms. International journal of molecular
sciences, 18(12) , 2702. doi:10.3390/ijms18122702
18. Khan, I., Saeed, K., ir Khan, I. (2017). Nanoparticles: Properties, applications and toxicities.
Arabian Journal of Chemistry, 1878-5352 .doi:10.1016/j.arabjc.2017.05.011
19. Krishnaswamy, K., ir Orsat, V. (2017). Sustainable Delivery Systems Through Green
Nanotechnology. Nano- and Microscale Drug Delivery Systems , 17–32. doi:10.1016/b978-
0-323-52727-9.00002-9.
20. Kumar, S. S., Venkateswarlu, P., Rao, V. R., ir Rao, G. N. (2013). Synthesis, characterization
and optical properties of zinc oxide nanoparticles. International Nano Letters, 3(1), 30.
21. Li, J., Liu, X., Zhang, Y., Tian, F., Zhao, G., Yu, Q., Jiang, F., ir kiti. (2012). Toxicity of nano
zinc oxide to mitochondria. Toxicology Research, 1(2), 137. doi:10.1039/c2tx20016c
22. Li, Y., Li, F., Zhang, L., Zhang, C., Peng, H., Lan, F., Peng, S., ir kiti. (2020). Zinc oxide
nanoparticles induce mitochondrial biogenesis impairment and cardiac dysfunction in human
ipsc-derived cardiomyocytes. International Journal of Nanomedicine, 2669-2683.
23. Mattson, M. P. (2008). Hormesis defined. Ageing Research Reviews, 7(1) , 1–7.
10.1016/j.arr.2007.08.007
24. Mayevsky, A., ir Barbiro-Michaely, E. (2009). Use of NADH fluorescence to determine
mitochondrial function in vivo. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology,
36
41(10), 1977–1988. doi:10.1016/j.biocel.2009.03.012
25. Mielcarz-Skalska, L., ir Smolińska, B. (2017). Zinc and nano-ZnO – influence on living
organisms. Biotechnology and Food Sciences, 81(2), 93–102.
26. Prajitha, N., Athira, S.S., ir Mohanan, P.V. (2019). Zinc Oxide Nanoparticles Enhance
Oxidative Stress in CHO Cells. Reactive Oxygen Species, 8(24), 341–357.
27. Ng, C. T., Yong, L. Q., Hande, M. P., Ong, C. N., Yu, L., Bay, B. H., ir Baeg, G. H. (2017).
Zinc oxide nanoparticles exhibit cytotoxicity and genotoxicity through oxidative stress
responses in human lung fibroblasts and Drosophila melanogaster. International Journal of
Nanomedicine, Volume 12, 1621–1637. doi:10.2147/ijn.s124403
28. Nguyen, V. H., ir Lee, B.-J. (2017). Protein corona: a new approach for nanomedicine design.
International Journal of Nanomedicine, Volume 12, 3137–3151. doi:10.2147/ijn.s129300
29. Olusanya, T., Haj Ahmad, R., Ibegbu, D., Smith, J., ir Elkordy, A. (2018). Liposomal Drug
Delivery Systems and Anticancer Drugs. doi:10.3390/molecules23040907
30. Perelman, A., Wachtel, C., Cohen, M., Haupt, S., Shapiro, H., ir Tzur, A. (2012). JC-1:
Alternative excitation wavelengths facilitate mitochondrial membrane potential cytometry.
Cell Death and Disease, 3(11) , e430–e430. doi:10.1038/cddis.2012.171
31. Pund, S., ir Joshi, A. (2017). Nanoarchitectures for Neglected Tropical Protozoal Diseases:
Challenges and State of the Art. Nano- and Microscale Drug Delivery Systems: Design and
Fabrication, 439–480. doi:10.1016/b978-0-323-52727-9.00023-6.
32. Setyawati, M. I., Tay, C. Y., ir Leong, D. T. (2015). Mechanistic Investigation of the
Biological Effects of SiO 2 , TiO 2 , and ZnO Nanoparticles on Intestinal Cells. Small, 1(28),
3458–3468. doi:10.1002/smll.201403232
33. Siddiqi, K. S., ur Rahman, A., Tajuddin, ir Husen, A. (2018). Properties of Zinc Oxide
Nanoparticles and Their Activity Against Microbes. Nanoscale Research Letters, 13(1), 141.
34. Singh, R., Cheng, S., ir Singh, S. (2020). Oxidative stress-mediated genotoxic effect of zinc
oxide nanoparticles on Deinococcus radiodurans. 3 Biotech, 66(10), 1-13. doi:
10.1007%2Fs13205-020-2054-4
35. Sirelkhatim, A., Mahmud, S., Seeni, A., Kaus, N. H. M., Ann, L. C., Bakhori, S. K. M., Hasan,
H., ir kiti. (2015). Review on Zinc Oxide Nanoparticles: Antibacterial Activity and Toxicity
Mechanism. Nano-Micro Letters, 7(3), 219–242. doi:10.1007/s40820-015-0040-x
36. Sivandzade, F., Bhalerao, A., ir Cucullo, L. (2019). Analysis of the Mitochondrial Membrane
Potential Using the Cationic JC-1 Dye as a Sensitive Fluorescent Probe. BIO-PROTOCOL,
9(1), 1-13. doi:10.21769/bioprotoc.3128
37. Smita, S., Gupta, S. K., Bartonova, A., Dusinska, M., Gutleb, A. C., ir Rahman, Q. (2012).
Nanoparticles in the environment: assessment using the causal diagram approach.
37
Environmental Health, 11(1), S13. doi:10.1186/1476-069x-11-s1-s13
38. Sorokin, A. V., Zabolotskii, A. A., Pereverzev, N. V., Yefimova, S. L., Malyukin, Y. V., ir
Plekhanov, A. I. (2014). Plasmon Controlled Exciton Fluorescence of Molecular Aggregates.
The Journal of Physical Chemistry C, 118(14), 7599–7605. doi:10.1021/jp412798u
39. Srivastav, A. K., Dhiman, N., Khan, H., Srivastav, A. K., Yadav, S. K., Prakash, J., Arjaria,
N., ir kiti. (2019). Impact of Surface-Engineered ZnO Nanoparticles on Protein Corona
Configuration and Their Interactions With Biological System. Journal of Pharmaceutical
Sciences, 108(5), 1872–1889. doi:10.1021/jp412798u
40. Stockert, J. C., Blázquez-Castro, A., Cañete, M., Horobin, R. W., ir Villanueva, Á. (2012).
MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid
droplets. Acta Histochemica, 114(8), 785–796. doi:10.1016/j.acthis.2012.01.006
41. Thomas, S., Harshita, B. S. P., Mishra, P., ir Talegaonkar, S. (2015). Ceramic Nanoparticles:
Fabrication Methods and Applications in Drug Delivery. Current Pharmaceutical Design,
21(42), 6165–6188. doi: 10.2174/1381612821666151027153246
42. Vandebriel, R., ir De Jong, W. (2012). A review of mammalian toxicity of ZnO nanoparticles.
Nanotechnology, Science and Applications, 61.
43. Viswanathan, P., Muralidaran, Y., ir Ragavan, G. (2017). Challenges in oral drug delivery: a
nano-based strategy to overcome. Nanostructures for Oral Medicine, Elsevier. Prieiga per
internetą:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780323477208000080?via%3
Dihub
44. Wang, E. C., ir Wang, A. Z. (2014). Nanoparticles and their applications in cell and molecular
biology. Integrative Biology, 6(1), 9–26. doi:10.1039/c3ib40165k
45. Wang, L., Chen, C., Guo, L., Li, Q., Ding, H., Bi, H., ir Guo, D. (2018). Zinc oxide
nanoparticles induce murine photoreceptor cell death via mitochondria-related signaling
pathway. Artificial Cells, Nanomedicine and Biotechnology. 1–12.
doi:10.1080/21691401.2018.1446018
46. Wolfram, J., Yang, Y., Shen, J., Moten, A., Chen, C., Shen, H., Ferrari, M., ir kiti. (2014).
The nano-plasma interface: Implications of the protein corona. Colloids and Surfaces B:
Biointerfaces, 124, 17–24. doi:10.1016/j.colsurfb.2014.02.035
47. Xiong, H.-M. (2013). ZnO Nanoparticles Applied to Bioimaging and Drug Delivery.
Advanced Materials, 25(37), 5329–5335. doi:10.1002/adma.201301732
48. Xiong, Y., Cheng, Y., Wang, L., ir Li, Y. (2018). An ‘‘off-on’’ phosphorescent aptasensor
switch for the detection of ATP. Talanta, 190, 226–234. doi:10.1016/j.talanta.2018.07.060
49. Xu, X.-H. N., Brownlow, W. J., Kyriacou, S. V., Wan, Q., ir Viola, J. J. (2004). Real-Time
Probing of Membrane Transport in Living Microbial Cells Using Single Nanoparticle Optics
38
and Living Cell Imaging . Biochemistry, 43(32), 10400–10413. doi.org/10.1021/bi036231a
50. Zhang, G., Morikawa, H., Chen, Y., ir Miura, M. (2013). In-situ synthesis of ZnO
nanoparticles on bamboo pulp fabric. Materials Letters, 97, 184–186.
doi:10.1016/j.matlet.2013.01.096
51. Žukiene, R., ir Snitka, V. (2015). Zinc oxide nanoparticle and bovine serum albumin
interaction and nanoparticles influence on cytotoxicity in vitro. Colloids and Surfaces B:
Biointerfaces, 135, 316–323. doi:10.1016/j.colsurfb.2015.07.054
