jurnalmikum

5/7/2018 jurnalmikum - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/jurnalmikum 1/5

BAB II

METODOLOGI

2.1. Karakteristik Strain

Strain yang digunakan pada penelitian dalam jurnal ini merupakan strain isogenik yang

memiliki genotip katG berbeda-beda. Strain yang digunakan dalam penelitian ini meliputi

H37Rv, INH34 pPD28

, INH34 pAP01

, INH34 pAP21

, INH34pAP22

, INH34pAP21

2.2. Penentuan Rata-rata Mutasi dengan Metode P0 ( Poisson Distribution)

Strain yang akan digunakan dikultur dalam media middlebrook 7H9 broth (BD) sebanyak

4 ml yang mengandung 10% albumin dextrose catalase dan 0,2 % Tween 80 (BDH) broth untuk

menjaga turbiditas yang dibutuhkan dalam pertumbuhan sebesar 0,5 konstanta MacFarland.

Volume tersebut diasumsikan memiliki sel bakteri sebanyak 5 x 103/mililiter. Setiap 1 mililiter

didistribusikan dalam 28 tabung mikrosentrifus dan diinkubasi selama 2 minggu dalam suhu 37°

C dengan agitasi secara terus menerus. Mutan kemudian diseleksi dalam cawan yang berisi

medium Middlebrook 7H10 agar dengan komposisi 0,25% gliserol, 10% asam oleat ADC

(OADC) dan 2 mg/L rifampicin. Pada akhir masa inkubasi, tiga kultur yang telah disiapkan

digunakan sebagai ulangan untuk Miles dan Misra Plate Count. Sedangkan 25 kultur sisanya

disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Pelet yang dihasilkan darisentrifugasi ini diletakkan atau diinokulasikan pada cawan agar yang telah mengandung

antibiotik. Proporsi kultur yang tidak mengandung mutan digunakan untuk memperoleh nilai

rata-rata mutasi. Penelitian ini dilakukan dengan dua perulangan untuk masing-masing strain.

2.3. Rata-rata Mutasi pada Strain Resisten setelah Penambahan Hidrogen Peroksida

Strain INH34 pAP01, INH34 pAP23 dan H37Rv dipapar dengan stres oksidatif berupa

penambahan 8 mM H2O2 selama 24 jam dan ditentukan rata-rata mutasinya

2.4. Identifikasi Genotip Koloni yang Resisten terhadap Rifampicin

Koloni yang tumbuh pada media dengan penambahan rifampicin 2 mg/L dilarutkan

dalam tabung mikrosentrifus dengan 400µL buffer TE dan dipanaskan lebih dahulu. Supernatan

disimpan pada suhu 4°C untuk analisa menggunakan PCR untuk menunjukkan adanya perluasan



fragmen yang mengalami overlapping (sekuen gen rpoB terletak pada pasangan basa urutan 451-

1735). Prosedur sekuen DNA yang digunakan sama dengan yang digunakan oleh Jenkins, dkk

(2005), yaitu menggunakan uji hibridisasi area resistensi (resistance determining hybridization

assay) yang dikenal dengan Inno LiPA. Daerah sepanjang 81bp dari gen rpoB diperluas dengan

menggunakan biotinylanted primer dan dilakukan hibridisasi dengan oligonukleotida spesifik

yang immobile pada sebuah strip parallel. Inno LiPA tersusun atas 10 probe oligonukleotida

dengan panjang yang berkisar antara 19-23 bp yang mengelilingi 81 bp dari rpoB.

BAB III

HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1. Hasil

3.1.1. Tingkat Mutasi M.tuberculosis pada rifampicin

Hipermutabilitas memiliki perbedaan 10 lipatan (fold) pada tingkat mutasinya, namun

secara keseluruhan masih termasuk dalam range antara 1.3x1027

dan 3.3x1026

mutasi per

generasi sel. Selain itu tidak terdapat perbedaan yang signifikan antara tingkat perolehan saat

membandingkan strain asli atau strain yang tidak asli menggunakan hydrogen peroksida.

Genotipe individual katG tidak berdampak pada tingkat mutasi bakteri. Saat dibandingkandengan H37Rv, hanya INH34

pAP22, strain dengan mutasi Ala-139Val dengan aktivitas enzim

katalase atau peroksidase, memiliki tingkat mutasi lebih dari 10 fold.

3.1.2. Analisis sekuen rpoB



Berdasarkan penelitian, dari 66 mutan resisten, hanya 3 yang mengalami mutasi pada rifampicin

resistance-determining region (RRDR). Selain mutasi pada RRDR, tidak ditemukan mutasi pada

bagian resistensi yang lain.

3.2. Pembahasan

Hipotesis dari penelitian menyatakan strain bakteri yang mengandung mutasi katGmungkin memiliki kenaikan tingkat mutasi yang disebabkan oleh aktivitas enzim katalase atau

peroksidase. Tingkat mutasi dari strain tanpa aktivitas enzim katalase atau peroksidase,

INH34 pAP01 dan INH34 pAP21, dengan strain yang memiliki aktivitas enzimatis, INH34 pAP21,

INH34 pAP23,INH34 pPD28 dan H37Rv. Selain itu, tidak ada perbedaan pada tingkat mutasi pada

strain lain dibandingkan dengan INH34 pPD28

yang merupakan strain dengan wild-type katG dan

katalase dan peroksidase fungsional. INH34 pAP01

merupakan strain yang memiliki gangguan

delesi katG namun tidak mengalami peningkatan tingkat mutasi. Penggunaan definisi Werngren

dan Hoffner tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan terhadap strain-strain tersebut.

Penggunaan poisson distribution pada jurnal tidak cukup sensitif dalam menentukan perbedaan

yang kurang dari 10 lipatan. M. tuberculosis akan bermutasi pada saat dilakukan kondisi stress

hydrogen peroksida dengan dosis dua kali lipat, namun tidak ada bukti bahwa perlakuan ini

berefek pada tingkat mutasi dari strain INH34 yang dibandingkan dengan H37Rv. Compensatory

mutation mungkin menjadi pengimbang terhadap hilangnya katG. Isolasi INH34 memiliki

bagian promoter up-regulated ahpC, sehingga dapat mengkompensasi defisiensi katalase atau

peroksidase sebagai hasil dari mutasi katG. Gen lain melibatkan resistensi isoniazid seperti ndh

yang merupakan nukleotida tunggal polimorf yang terdapat pada M. tuberculosis.

Temuan penting dari penelitian ini adalah hanya 4,5% dari isolat resisten rifampisin

yang mengalami mutasi pada RRDR (Rifampicin Resistance Determining Region), dibandingkan

dengan 90% dari isolat resisten rifampisin yang diisolasi secara klinis. Hasil yang mengejutkan

dari penelitian ini adalah adanya persamaan dengan data yang telah diperoleh sebelumnya dari



sebuah studi klinis yang menunjukkan pola mutasi rpoB yang berbeda pada saat terjadi wabah

akibat strain resisten isoniazid di London utara. Tidak ada dari jenis isolat dilaporkan dalam

penelitian tersebut yang mengalami mutasi umum di RRDR, tiga isolat yang memiliki pola

mutasi langka di RRDR (dua dengan Ser-531 trp dan satu dengan His-526 Arg) dan tiga

memiliki mutasi di luar RRDR (Val-146 Phe), yang sebelumnya telah dijelaskan dalam isolat

klinis.

Sampel mutan diisolasi pada 2 mg/L rifampisin (dua kali MIC untuk M. tuberculosis

H37Rv). Hubungan antara kerentanan terhadap rifampisin dan pola mutasi pada rpoB telah

diamati. Strain resisten rifampisin dengan MIC 32 mg/L terbukti mengalami 11% mutasi di

RRDR, dan seluruh strain dengan perlakuan MIC 64 mg/L mengalami mutasi dalam RRDR.

Oleh karena itu, diperoleh kemungkinan kadar MIC yang rendah dapat mempengaruhi distribusi

lokasi mutasi. Hal yang serupa pernah dilakukan oleh Morlock, dkk (2000) dengan konsentrasi

MIC 2 mg/L untuk mengisolasi koloni tahan rifampisin dan menemukan pola yang serupa

dengan yang diamati dalam isolat tahan rifampisin pada studi klinis. Peran pompa efflux dengan

resistensi obat telah dilaporkan M. Tuberculosis, sebagian pada efpA. Perubahan effl ux pump

kemungkinan dapat menyebabkan dinding sel mikobakteri tahan dengan akumulasi rifampicin.

Kemungkinan mutan tahan rifampicin tanpa mutasi rpoB juga mengalami peningkatan efflux.

BAB IV

PENUTUP

4.1. Kesimpulan

Kesimpulan dari penelitian ini adalah, strain M. tuberculosis dengan gangguan

oksidatif tidak mengalami peningkatan mutasi dan mampu mengimbangi kondisi lingkungannya,

mengikuti penambahan hidrogen peroksida. Pola mutasi yang tidak biasa diamati dalam mutan

tahan rifampicin, yang hanya 4,5% yang terjadi di dalam RRDR tersebut.



DAFTAR PUSTAKA

Morlock GP, Plikaytis BB, Crawford JT. 2000. Characterization of spontaneous, in vitro-

selected, rifampin-resistant mutants of Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv.

Antimicrob Agents Chemother 2000; 44: 3298±301.

Jenkins C, Claxton AP, Shorten RJ , Timothy, D. M. dan Stephen, H. G. 2005. Rifampicin

resistance in tuberculosis outbreak, London, England. Emerg Infect Dis 2005; 11: 931±4.

Documents

jurnalmikum